米糠蛋白提取工艺（精选4篇）
米糠蛋白提取工艺 篇1
米糠是一种价廉、营养丰富的稻米加工副产品, 我国年产米糠1000万t以上, 是一种量大面广可再生资源。米糠含有丰富营养物质, 其中脱脂米糠中蛋白质含量可达18%。目前, 大部分米糠仍用作动物饲料, 资源浪费严重, 因此, 从米糠中寻求新的蛋白质资源, 增加米糠附加值具有重要现实意义。米糠蛋白是公认优质植物蛋白质, 其必需氨基酸组成平衡合理, 接近FAO/WHO推荐模式;其中赖氨酸含量较高, 为其他植物蛋白无法比拟, 米糠蛋白生物效价很高其营养价值可与鸡蛋和牛乳相媲美, 消化率可达90%以上;且米糠蛋白是低过敏性蛋白, 不会产生过敏反应, 因此, 米糠蛋白非常适合作为婴幼儿和特殊人群营养食品。
目前米糠蛋白的提取方法主要有3种, 包括碱溶酸沉法、酶法和物理提取法。碱溶酸沉法是最常见的米糠蛋白提取方法, 该方法简单易行, 且提取较为完全。碱液可使米糠紧密结构变得疏松, 同时碱液对蛋白质分子次级键特别是氢键具有破坏作用, 并可使某些极性基团发生解离, 使蛋白质分子表面分子具有相同电荷, 促进结合物与蛋白质分离, 从而对蛋白质分子有增溶作用, 并随着碱性增加, 米糠中蛋白质提取率增加。但须注意避免碱液浓度过高, 较高浓度碱溶液会促使蛋白质中赖氨酸与丙氨酸、胱氨酸发生缩合反应, 生成有毒化合物, 使赖氨酸营养价值大大降低。另外, 高碱条件下还会产生一些不利反应, 如蛋白质变性和水解;增加美拉德反应促使产品颜色加深;增加非蛋白成分提取, 降低提取效率。
酶法提取米糠蛋白反应条件温和, 蛋白质提取得率较高, 且能更多保留蛋白质营养价值;同时也避免传统碱法提取米糠蛋白所带来负面效应, 因此酶法提取米糠蛋白为米糠利用开辟新的途径。
Anderson等人将全脂或脱脂米糠采用胶体磨粉碎和均质, 通过破碎米糠细胞结构, 使米糠蛋白溶出而进行提取米糠蛋白方法。全脂米糠经微粉碎和均质后, 蛋白质溶出浓度比单纯水溶液提取率提高75%, 脱脂米糠经物理方法处理, 其蛋白质溶出浓度可提高18.7%, 且磨浆和均质可使溶出组分分子量差别很大, 所以利用物理方法增进米糠蛋白提取率也是可行的。
在米糠蛋白的纯化方面还很少见到相关报道, 本研究在酶辅助碱溶酸沉法提取米糠蛋白的基础上, 利用糖化酶对米糠蛋白进行纯化, 提高了产品的蛋白质含量。
1 试验材料与方法
1.1 试验原料
脱脂米糠, 试验室制备, 过40目筛备用;碱性蛋白酶, 庞博生物工程有限公司。
1.2 仪器与设备
TD5Z台式离心机, 湖南凯达科学仪器有限公司;电子分析天平 (AB204-E) 、p H计, METTLERTOLEDO, Switzerland;数显恒温水浴锅 (HH-6型) , 常州市国华电器有限公司;数显鼓风干燥箱 (101-1-S) 、真空干燥箱 (101-1-S) , 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;集热式恒温磁力搅拌器 (FS-1) 、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器, 巩义市英峪予华仪器厂;FZ102型微型植物粉碎机, 天津泰斯特仪器有限公司;RE52CS旋转蒸发器, 上海亚荣生化仪器厂;超级恒温水浴, 金坛市精达仪器制造厂;冷冻干燥机 (Freezone 6) , 美国Labconco公司。
1.3 试验方法
1.3.1 原料基础数据测定
水分的测定采用105℃恒重法, GB/T 5009·3-2003;蛋白质的测定采用微量凯氏定氮法, GB/T 5009·5-2003;粗脂肪的测定采用索氏抽提法, GB/T 5009·6-2003;粗纤维的测定采用GB/T 5009·10-2003;灰分的测定采用灼烧重量法, GB/T 5509.4-2003。
蛋白质提取率=产品中蛋白质的量 (g) /原料中蛋白质总质量 (g) ×100%
1.3.2 碱溶酸沉法制备米糠蛋白
脱脂米糠→加水搅拌→Na OH调节p H值、温度→搅拌碱提→离心分离→上清液→HCl调节p H值→等电点酸沉→离心分离→冷冻干燥→米糠蛋白
按照上述工艺流程, 先将脱脂米糠加水混合, 用Na OH调节p H值至10.5, 在50℃下保温搅拌2h。碱提完成后, 在4 000r/min下离心分离10min, 将上清液加酸调节p H值至米糠蛋白等电点, 50℃下保温酸沉0.5h。酸沉完成后离心分离, 得到浆状米糠蛋白, 冷冻干燥后得到粉末状米糠蛋白。称量米糠蛋白, 计算提取率。
1.3.3 酶辅助碱溶酸沉法制备米糠蛋白
脱脂米糠→加水搅拌→调节p H值、温度→加酶水解→灭酶→调节p H值→碱提→离心分离→上清液→调节p H值→酸沉→离心分离→冷冻干燥→米糠蛋白
按照上述工艺流程, 先将脱脂米糠加水混合, 在恒温搅拌水浴锅中调节温度至40℃, 加Na OH调节p H值至10.5左右, 加入碱性蛋白酶水解0.5h, 调节温度至100℃灭酶20min。维持p H值在10.5左右, 调节温度至55℃, 继续搅拌碱提2h, 在4 000r/min下离心分离15min。将上清液调节p H值至4.7使米糠蛋白沉淀。在4 000r/min下离心分离25min, 之后将浆状沉淀物冷冻干燥得米糠蛋白。称量米糠蛋白, 计算提取率。
1.3.4 米糠蛋白的纯化
浆状米糠蛋白→加水搅拌→调节p H值和温度→糖化酶酶解→灭酶→离心→冷冻干燥→纯化米糠蛋白
将碱溶酸沉所得的浆状米糠蛋白加水搅拌均匀, 调节p H值和温度, 加入糖化酶进行酶解反应。反应完成后90℃高温灭酶, 离心分离得浆状米糠蛋白, 冷冻干燥后得粉末状米糠蛋白产品。用凯氏定氮法测定产品的蛋白质含量。
2 试验结果与讨论
2.1 传统碱溶酸沉与酶辅助碱溶酸沉法的比较
经过计算得知, 传统碱溶酸沉法得到的米糠蛋白提取率为46.28%, 而酶辅助碱溶酸沉法得到的米糠蛋白提取率为61.73%。
如图1所示, 在传统的碱溶酸沉法提取米糠蛋白基础上, 先通过碱性蛋白酶处理浸提物料, 可以使米糠蛋白提取率提高约18%。
2.2 糖化酶处理纯化米糠蛋白
2.2.1 酶解温度的影响
调节酶解温度分别为50、55、60、65和70℃, 按试验方案进行米糠蛋白的提取, 结果如图2所示。
由图2可知:温度在60℃左右时, 所得产品的蛋白含量最高。温度过低过高都会抑制酶的活性, 导致反应速率变慢, 糖类杂质得不到很好的去除, 从而使蛋白质含量偏低。
2.2.2 p H值的影响
调节p H值分别为3.5、4.0、4.5、5.0和5.5, 按试验方案进行米糠蛋白的提取, 结果如图3所示。
由图3可知:p H值在4.5左右时, 所得产品的蛋白质含量最高。p H值过高或过低都会抑制糖化酶的活性, 导致蛋白质含量偏低。
2.2.3 酶解时间的影响
酶解时间分别设置为60、90、120、150和180min, 按照试验方案提取米糠蛋白, 结果如图4所示。
由图4可知:在120min之前, 随着酶解时间的延长, 蛋白质含量显著上升。但到了120min之后, 延长酶解时间蛋白质含量不会有太大变化, 这可能是由于酶解一定时间后, 蛋白液中的糖类杂质大部分已被去除, 再延长酶解时间已很难再提高蛋白含量。因此试验确定酶解时间在120min左右为宜。
2.2.4 加酶量的影响
将加酶量分别确定为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%, 按照试验方案提取米糠蛋白, 结果如图5所示。
由图5可知:加酶量在0.4%之前, 随着加酶量的增加, 蛋白质含量不断升高。随后蛋白质含量出现下降, 原因可能与酶解时间过长导致蛋白质含量很难再提高类似。
2.2.5 液料比的影响
将液料比分别确定为6∶1、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1, 按照试验方案提取米糠蛋白, 结果如图6所示。
由图6可知:在液料比4∶1以下时, 随着液料比的升高, 蛋白质含量升高, 随后蛋白质含量降低。这是因为液料比太小, 不利于可溶性糖的溶解分离, 导致蛋白质含量偏低;液料比太大, 则底物浓度太小, 不利于酶的作用, 导致蛋白含量下降。
2.2.6 糖化酶处理提高蛋白质含量的正交试验优化
选取酶解温度、p H值、酶解时间、加酶量和液料比5个因素进行正交试验, 在单因素试验的基础上, 确定正交试验因素水平。确定的L16 (45) 正交试验, 以产品的蛋白质含量为考察指标, 试验结果见表1。
由表1可知:各因素对糖化酶提高米糠蛋白含量的影响大小次序为:酶解温度>p H值>酶解时间>液料比>加酶量。糖化酶处理提高米糠蛋白含量的最佳条件为A3B3C2D3E3, 即酶解温度60℃、p H值4.5、酶解时间90min、加酶量0.3%和液料比3∶1, 在此条件下所做验证试验得到米糠蛋白的蛋白质含量为82.43%。
由于米糠原料的蛋白质含量较低, 用酶辅助碱溶酸沉法提取的米糠蛋白其蛋白质含量也较低, 通常在60%~70%。1次糖化处理能够显著提高产品的蛋白含量, 但经过正交试验优化其含量仍然只能达到80%左右。因此, 考虑在一次糖化酶处理的基础上, 再次利用糖化酶对糖类物质进行酶解。酶解步骤如下:
浆状米糠蛋白→加水搅拌→调节p H值和温度→糖化酶酶解→灭酶→离心→冷冻干燥→纯化米糠蛋白
酶解的条件根据正交试验优化后的参数确定为:酶解温度60℃、p H值4.5、酶解时间90min、加酶量0.3%和液料比3∶1。2次糖化酶处理米糠蛋白所得产品的蛋白质含量可以达到88.74%。
3 结论
(1) 碱溶酸沉法是一种较好的蛋白质提取方法, 但其提取率不是很高, 且所得蛋白含有较多的杂质, 纯度较低。本研究利用酶辅助碱溶酸沉法将米糠蛋白的提取率提高到70%左右。
(2) 由于酶辅助碱溶酸沉法制备的米糠蛋白其蛋白质含量较低, 本研究利用糖化酶对制得的米糠蛋白进行纯化, 1次糖化酶处理能使产品的蛋白质含量达到82%。在此基础上, 对米糠蛋白进行2次糖化酶处理能使产品的蛋白质含量接近90%。
米糠蛋白提取工艺 篇2
米糠是大米加工过程中的一种重要的副产物,我国盛产稻米,因此米糠资源也非常丰富。米糠中含有丰富的膳食纤维、蛋白质、淀粉、维生素、肌醇等营养物质。其中蛋白质在米糠中的含量高达12%~16%。米糠蛋白含有的人体必需氨基酸比较齐全,营养价值甚至可以与鸡蛋蛋白相媲美,并且,米糠蛋白具有低过敏性的特点,被广泛应用于婴幼儿食品中[1,2]。尽管米糠蛋白具有优异的营养性,但是其蛋白产品却很难商业化,原因主要包括:(1)米糠蛋白中的四种蛋白溶解性差异大,很难通过单一溶剂获得高纯度的蛋白产品;(2)蛋白分子之间含有大量的二硫键,导致蛋白的溶解性很差,给提取增加了难度;(3)米糠中丰富的植酸盐、半纤维素和纤维素与蛋白紧密结合在一起,增加了提取难度,影响了蛋白纯度[3]。从上世纪60年代起,国外研究者开始了对米糠蛋白提取的研究,主要的提取方法有碱法提取、酶法提取以及物理法提取[1]。碱法是提取米糠蛋白最常见的一种方法,碱能够作用于蛋白分子间的氢键、酰胺键和二硫键,使更多的蛋白分子溶出,并且碱法提取简单易操作。但是此方法获得的蛋白颜色较深且风味不佳[4];物理法被广泛应用于大米胚乳蛋白的分离、大豆蛋白分离等蛋白产品的生产上。但是米糠蛋白的特别之处在于其蛋白分子与植酸、纤维素等通过化学键紧密的结合在一起,这种结构很难通过物理方法破坏,并且物理提取设备投资大且工艺复杂[5];目前来看,酶法是生产高品质蛋白的最佳方法。生物酶法提取米糠蛋白具有条件温和,米糠蛋白不易变性等优势,但是仅用蛋白酶提取的方法会导致蛋白的提取率和纯度都较低。这是因为米糠蛋白不仅有大量的分子间的二硫键,同时还与米糠中的淀粉、纤维素等组分形成共价键。这些结构大大阻碍了蛋白酶的作用[6]。
本文利用不同种类的酶制剂,对两步酶解提取米糠蛋白工艺进行了系统的研究和优化。首先利用复合纤维素酶对米糠原料进行预处理,破坏米糠细胞结构,使米糠蛋白充分暴露,进而利用碱性蛋白酶对暴露的米糠蛋白进行充分水解,形成可溶于水的小分子多肽,最终实现米糠蛋白的提取。文中在系统考察各阶段酶解反应单因素影响的基础上,进一步运用响应面法对碱性蛋白酶水解工艺进行了优化,得到两步酶解提取米糠蛋白的最优工艺条件,以期为生物酶法生产米糠蛋白工业化生产提供理论基础数据。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
新鲜米糠:湖北宏凯工贸有限公司;复合纤维素酶(celluclast 1.5L):诺维信酶制剂公司;碱性蛋白酶(alcalase 2.4LFG):诺维信酶制剂公司;考马斯亮蓝染液:天根生化科技有限公司;牛血清白蛋白(BSA)标准溶液:天根生化科技有限公司
1.2 仪器与设备
DELTA320pH计:梅特勒-托利多中国;中草药粉碎机:天津市泰斯特仪器有限公司;电子天平BT224S:赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;DF-1型集热式磁力搅拌器:江苏金坛市金城国际实验仪器厂;SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵:巩义市予华仪器有限责任公司;SiGMA 6-16大容量离心机:德国CHRIST冻干机有限公司;DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司;Synergy HT SIAFRTD酶标仪:美国BioTek仪器有限公司;96孔酶标板:美国Corning公司。
1.3 实验方法
1.3.1 评价标准
本文将蛋白提取率作为双酶法提取米糠蛋白提取效果的评价标准。
复合纤维素酶的作用是将米糠细胞壁破坏,从而将蛋白质暴露出来,溶于水的蛋白多即蛋白提取率高说明破壁效果较好,从而有利于进一步对蛋白的提取。蛋白酶是将蛋白质水解为小分子的蛋白,蛋白提取率高说明水解效果好。所以可以用蛋白提取率作为复合纤维素酶和碱性蛋白酶作用效果的评价标准。
1.3.2 复合纤维素酶单因素试验
(1)考察酶用量:取10g去淀粉残渣,加入90g水(10%醪浓度),调pH至5.5,控制温度在55℃,复合纤维素酶用量分别为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%,反应3h后,抽滤,得到滤液冷冻干燥,测蛋白含量,并计算蛋白提取率。
(2)考察温度:取10g去淀粉残渣,加入90g水(10%醪浓度),调pH至5.5,控制温度分别在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃,复合纤维素酶用量为0.2%,反应3h后,抽滤,得到滤液冷冻干燥,测蛋白含量,并计算蛋白提取率。
(3)考察pH:取10g去淀粉残渣,加入90g水(10%醪浓度),pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5,控制温度在55℃,复合纤维素酶用量为0.2%,反应3h后,抽滤,得到滤液冷冻干燥,测蛋白含量。
(4)考察醪浓度:分别取10g去淀粉残渣,加入一定量的水,分别控制醪浓度为5%、10%、12%、16%和20%,pH为5.5,控制温度在55℃,复合纤维素酶用量为0.2%,反应3h后,抽滤,得到滤液冷冻干燥,测蛋白含量,并计算蛋白的提取率。
1.3.3 碱性蛋白酶单因素试验
预处理:取10g去淀粉残渣,加入73g水(12%的醪浓度),在pH为6.0,温度60℃。复合纤维素酶用量为0.2%(0.2%×10=0.02g)条件下,作用3h,即可得到经过预处理的浆料。
(1)考察温度:将经过预处理的浆料调至醪浓度为10%,pH至8.5,控制温度分别在60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃,加入2.5%碱性蛋白酶(2.5%×10=0.25 g)反应5 h,5 000rpm离心,得到滤液,滤液冷冻干燥,元素分析法测总蛋白含量,并计算蛋白提取率。
(2)考察pH:将经过预处理的浆料调至醪浓度为10%,调pH分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,控制温度在90℃,加入2.5%碱性蛋白酶(2.5%×10=0.25g)反应5h,5 000rpm离心,得到滤液,滤液冷冻干燥,元素分析法测总蛋白含量,并计算蛋白提取率。
(3)考察时间:将经过预处理的浆料调至醪浓度为10%,pH至8.5,控制温度在90℃,加入2.5%碱性蛋白酶(2.5%×10=0.25g)。分别反应1、2、3、4、5、6h。反应结束后,5 000rpm离心,得到滤液,滤液冷冻干燥,元素分析法测总蛋白含量,并计算蛋白提取率。
(4)考察酶用量:将经过预处理的浆料调至醪浓度为10%,pH至8.5,控制温度在90℃,加入碱性蛋白酶,酶用量分别为1%、1.5%、2%、2.5%、3%,反应5h,5 000rpm离心,得到滤液,滤液冷冻干燥,元素分析法测总蛋白含量,并计算蛋白提取率。
1.3.4 响应面实验设计
根据碱性蛋白酶单因素试验结果,选取温度、pH、酶用量作3因素3水平实验,以蛋白提取率为响应值,利用Design Expert 8.0.6软件中的BoxBehnken实验对蛋白提取工艺进行响应面优化。Box-Behnken实验设计见表1。
2 结果与分析
2.1 去淀粉米糠残渣中蛋白含量测定结果
通过元素分析法测得去淀粉米糠残渣中蛋白含量约为23.35%。
2.2 纤维素复合酶单因素试验结果及分析
2.2.1 酶用量对复合纤维素酶作用的影响
酶用量对复合纤维素酶作用影响结果如图1所示。由图可知,当酶用量在0.05%~0.2%之间时,随着复合纤维素酶用量的增加,米糠蛋白提取率逐渐增加,这时因为酶作用于细胞壁上,逐渐将蛋白释放出来。当酶用量为0.2%时,蛋白提取率达到最大值。继续增加酶用量时,蛋白提取率有下降的趋势,这可能是因为随着酶添加量的增加,溶液中的纤维素含量增加,导致蛋白含量有所降低。因此,复合纤维素酶用量确定为0.2%。
2.2.2 温度对纤维素复合酶作用的影响
温度对复合纤维素酶作用的影响结果如图2所示。由图可知:当温度在45~60℃之间时,随着温度的升高,蛋白提取率逐渐增加,当温度达到60℃时,提取率达到最大值,继续升高温度,提取率降低。这是因为继续升高温度,超出了复合纤维素酶的最佳使用温度,因此酶的活性会有所降低,导致蛋白提取率降低。因此,纤维素复合酶较优作用温度为60℃。
2.2.3 pH对纤维素复合酶作用的影响
pH对复合纤维素酶作用的影响结果如图3所示。由图可知,当pH值在4.5~6.0之间时,随着pH值的增加,蛋白提取率逐渐增加,当pH值达到6.0时,提取率最大,继续增加pH值,会超出复合纤维素酶的最佳pH,使复合纤维素酶的活性降低,蛋白提取率下降。因此,纤维素复合酶较优作用pH值为6.0。
2.2.4 醪浓度对蛋白提取率的影响
醪浓度对复合纤维素酶作用的影响结果如图4所示。由图可知:当醪浓度在5%~12%之间时,随着醪浓度的增加,蛋白提取率增加,当醪浓度为12%时,提取率达到最大值,继续增加醪浓度时,提取率降低。因此,复合纤维素酶的较优作用醪浓度为12%。
图3 pH对复合纤维素酶的影响Fig.3 Influence of pH on celluclast 1.5L
2.3 碱性蛋白酶单因素实验结果及分析
2.3.1 温度对碱性蛋白酶作用的影响
温度对碱性蛋白酶作用的影响如图5所示。由图可知,当温度在60℃~85℃之间时,随着温度的升高,蛋白提取率提高;当温度超过85℃时,蛋白提取率降低。这可能是因为,随着温度的升高,分子运动逐渐加剧,碱性蛋白酶与底物之间的碰撞更加频繁,从而增加了酶与底物的接触机率,蛋白提取率增加;当温度达到85℃时,达到酶的最适温度,提取率达到最大值,继续升高温度时,逐渐超过了酶的最适温度,酶活力逐渐降低,水解能力减弱,提取率降低[6]。因此,碱性蛋白酶的较优作用温度为85℃。
2.3.2 pH对碱性蛋白酶的影响
pH值对碱性蛋白酶的影响如图6所示。由图可知,pH值对蛋白提取率的影响较大,当pH在6.5~8.5之间时,蛋白提取率随着pH值的增大而增大;当pH值=8.5时,蛋白提取率达到最大值;当pH值超过8.5时,蛋白提取率降低。这可能是因为随着pH值的增大,逐渐接近碱性蛋白酶的最适pH,酶的活性逐渐增大,从而蛋白提取率增大;当pH值为8.5时,达到碱性蛋白酶的最适pH,酶活性最大,水解能力最强,继续增大pH值时,超过了酶的最适pH,酶活性降低,水解能力降低,从而导致提取率降低。因此,碱性蛋白酶的较优pH为8.5。
图5碱性蛋白酶使用温度对蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of temperature on extraction rate of protein
2.3.3 水解时间对碱性蛋白酶作用的影响
水解时间对碱性蛋白酶作用的影响如图7所示。由图可知:当反应时间为2h时,蛋白提取率达到最大值,当继续增加反应时间时,蛋白提取率变化不大。这可能是因为当反应时间为2h时,水解已基本完全,因此继续水解时提取率变化不大。因此,碱性蛋白酶的较优水解时间为2h。
2.3.4 酶用量对碱性蛋白酶作用的影响
酶用量对碱性蛋白酶作用的影响如图8所示。由图可知:当酶用量在1%~2%之间时,蛋白提取率随着酶用量的增加而增加;当酶用量为2%时,蛋白提取率达到最大值;当继续增加酶用量时,蛋白提取率变化不大。这可能是因为当酶用量为2%时,酶与底物的结合达到饱和,继续增加酶用量时,酶浓度过高,抑制了一部分酶与底物的结合,从而使蛋白提取率有下降趋势[7]。因此,碱性蛋白酶的较优酶用量为2%。
2.4 响应面实验结果及分析
2.4.1 实验结果及方差分析
通过碱性蛋白酶单因素实验得到的较优的蛋白提取工艺条件为温度85°C、pH 8.5、酶用量为2%。在单因素的基础上,利用Design Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken实验对米糠蛋白提取工艺进一步优化,在固定碱性蛋白酶作用时间为2h条件下,选取温度(A)、pH(B)、酶用量(C)进行3因素3水平实验,以蛋白提取率作为响应值。Box-Behnken实验设计及结果如表2所示。利用Design Expert软件对表2中的实验结果进行回归分析,得到二次多项回归方程:蛋白提取率=84.30-2.67A+3.45B+1.43C-2.58AB+1.02AC+2.04BC-4.26A2-7.19B2-3.89C2,方差分析如表3所示,回归项中p<0.000 1,说明所选择模型极为显著。失拟项P=0.760 5>0.05,这说明失拟项p差异不显著;决定系数R2=0.995 6,校正决定系数R2adj=0.99,说明该模型能够解释99%的变化,以上参数表明该二次回归模型能够拟合温度、pH、酶用量对蛋白提取率的影响,因此,可用此模型对蛋白提取率进行分析和预测。由表3可以看出:A、B、AB、A2、B2、C2对蛋白提取率影响极显著,由F值可知因子贡献率为B>A>C,即pH>温度>酶用量。
注:p值<0.05为显著,p值<0.000 1为极显著,p值<0.05为不显著Note:p<0.05means difference,p<0.000 1means signifi-cant difference,p<0.05means insignificant
2.4.2 曲面图及等高线分析
通过Design Expert 8.0.6软件可以得到曲面图及等高线图,如图9~图11所示。通过曲面图可以直观的看出各因素及其交互作用对蛋白提取率的影响,曲面越陡表明因素对响应值的影响越显著[8]。等高线的形状可以看出两因素之间交互作用的强弱,椭圆形表示两因素之间的交互作用较强,圆形则表示两因素之间的交互作用较弱[9,10]。图9和图10中的等高线为椭圆形,在温度以及酶用量一定时,pH值对蛋白提取率影响显著。图9、10、11可知,在考察因素范围内,pH、温度以及酶用量都对蛋白提取率呈现二次函数关系,最大值分别出现在8.5、88℃以及2.1%左右。
2.4.3 最优工艺条件的预测及验证
运用Design Expert 8.0.6软件对实验数据进行优化预测,得到米糠蛋白提取工艺最优条件为:温度88.04℃、pH=8.67、酶用量2.11%,在此条件下预测蛋白提取率为85.57%。
根据实际实验的可操作性,将米糠蛋白提取工艺条件改为:温度88℃、pH 8.5、酶用量2.11%,在此条件下对模型的预测参数进行了两次平行验证实验,得到米糠蛋白提取率平均值为85.3%,与模型预测值较接近,说明Box-Behnken设计优化得到的米糠蛋白提取工艺条件是可靠的。
3 结论
本文首先考察了酶用量、温度、pH值、醪浓度对纤维素复合酶作用的影响,得到了纤维素复合酶处理米糠的较优条件:酶用量为0.2%、温度为60℃、pH 6.0、醪浓度为12%。在纤维素复合酶作用的基础上,进一步考察了温度、pH值、酶用量对碱性蛋白酶作用的影响,得到了碱性蛋白酶水解米糠蛋白的较优条件:温度为85℃、pH 8.5、酶用量为2%。在碱性蛋白酶作用单因素试验的基础上,利用Design Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken实验设计对碱性蛋白酶提取米糠蛋白工艺进行进一步的优化,得到了最优的提取条件为:温度88℃、pH 8.5、酶用量2.11%,在该条件下,进行了两次平行验证实验,得到米糠蛋白提取率平均值为85.3%。该值与模型预测值较接近,说明Box-Behnken设计优化得到的米糠蛋白提取工艺条件是可靠的。
摘要：以去除淀粉后的米糠残渣为原料,对复合酶法提取米糠蛋白工艺进行了研究及优化,以期提高米糠蛋白的产品得率和品质。首先利用复合纤维素酶破坏米糠细胞壁结构,充分释放并暴露米糠蛋白,其较优条件为:复合纤维素酶用量为0.2%、温度为60℃、pH=6.0、醪浓度为12%。在此基础上,利用碱性蛋白酶进一步水解米糠蛋白,并在单因素试验的基础上,通过响应面法进一步优化得到最优的水解条件为:温度88℃、pH=8.5、酶用量2.11%。通过上述两步酶解工艺,米糠蛋白的提取率为85.3%。
关键词：米糠蛋白,两步酶解,复合纤维素酶,碱性蛋白酶,响应面法
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米糠蛋白提取工艺 篇3
米糠油及其提取方法概述
米糠油概述
我国是农业大国, 稻米生产量位居世界前列。在稻米加工成精米的过程中, 会产生米糠、米胚芽、糊粉层以及种皮等, 这些占到整个稻米质量的7%左右。在这个背景下, 我国每年产量十分惊人的米糠, 只有其中很小一部分会被用到米糠油的生产中, 绝大部分都只会被当成饲料使用, 利用率十分低下。但是, 米糠油中含有丰富活性脂肪醇、鱼鲨烯、谷维素等营养物质, 对于治疗肿瘤、预防高血压以及减少胆固醇来说都具有非常重要的良好功效。米糠的主要成分为脂肪 (15.32%) 、蛋白质 (16.72%) 、水分 (14.86%) 以及灰分 (7.34%) 。
米糠油的提取方法
在以往对于米糠油的提取中, 主要利用压榨法与有机溶剂浸出法, 而关于本文提出的微波辅助水酶提取方法却很少有研究。微波法作为近些年来逐渐发展起来的一种方法, 其主要原理是微波与被分离物直接作用, 微波的激活作用使被分离物快速与样品机体分离, 并达到较高产率。酶法提油工艺主要原理是通过酶对油料组织细胞壁进行破坏, 以及对脂蛋白、脂多糖的分解作用, 从而提高油脂得率, 该技术条件温和, 可同时提取油脂和蛋白质。基于此, 本文对相关内容进行了探讨。
微波辅助水酶法提取米糠油及蛋白的实验研究
实验材料、仪器及工艺过程
本文的实验材料主要有市售的米糠、纤维素酶 (1.5×104u/g) 、碱性蛋白酶 (5×105u/g) 、果胶酶 (3×104u/g) , 其他试剂则为分析纯。
实验仪器主要有:数量酸度计、家用微波炉以及蛋白质测定仪。
主要的工艺要点如下所示:
过筛:将米糠过60目筛, 得到粒度较细且均匀的米糠;
蒸汽处理:采用蒸汽处理的方法对米糠进行处理, 使得米糠内的脂肪酶失活, 从而最大限度地降低脂肪酶对油脂的分解作用, 从而提升米糠油品质;
酶解:在一定的料液比、温度以及p H下, 加入一定量的酶, 降解米糠中的脂多糖、脂蛋白复合成分, 释放油脂, 继而提高米糠游离油得率;
微波提取:将酶解完成后的混合液在一定功率和时间下进行微波提取;
破乳:采用冷冻法进行破乳, 以提高米糠游离油得率。
实验结果及分析
首先对提取米糠油的单因素进行实验, 主要选取酶添加量、酶解时间、微波时间以及微波功率, 作为影响微波辅助水酶法提取米糠油得率的研究对象, 在分析过程中改变不同的参数, 从而测得米糠游离油得率。
单因素的影响实验结果主要如下。
①酶添加量。游离油得率与酶的用量呈现正比上升关系, 而当添加的酶量接近0.6%时, 游离油得率的上升速度开始变慢, 然后逐渐平稳下来。
②酶解时间。随着酶解时间的延长, 游离油得率也在相应提高, 但是3h之后, 游离油得率的上升变化趋势变得并不明显, 即在这个时间点酶解的效果最好。
③微波功率。游离油得率与微波功率的增加也呈现出正比上升关系, 而当其功率达到600 w时, 游离油得率的上升趋势开始变得不明显, 可见, 该值是最为恰当的功率值。同时, 还需要注意的是, 如果时间继续延长, 就有可能会破坏油脂中的营养物质, 从而给米糠油的精炼带来困难。
④微波时间。微波时间与游离油得率的关系和以上几种因素的整体趋势相似, 只是当微波时间达到4 min之后, 游离油得率不仅不会上升, 反而开始呈现出下降趋势, 因此, 这个值比较符合最佳工艺条件。
通过对上述四个关键单因素实验内容和结果的考察来看, 从游离油得率这个设计的重要指标入手, 结合正交实验方法确定了如下最佳工艺条件:酶添加量 (0.7%) 、酶解时间 (3 h) 、微波功率 (600W) 以及微波处理时间 (5 min) 。
结语
米糠蛋白提取工艺 篇4
米糠油的主要成分有不饱和脂肪酸、蛋白质、角鲨烯、活性脂肪酶、谷维素、维生素E、生育三烯酚、谷甾醇、甾醇［2］等,其中脂肪酸和蛋白质是人体必需营养物质,谷维素、维生素E、生育三烯酚具有抗氧化性对米糠油稳定性起到重要作用, 角鲨烯能够增强人体的免疫功能,米糠油还可以促进血液循环,调节内分泌,促进生命体生长发育［3］,是一种很有发展潜力的油品。
米糠的合理加工开发不仅可以减少农业生产的废弃物还可以增加农民收入来源以提高人民的生活水平,尤其是米糠油的开发对我国食用油供求紧张的状况可以起到一定的缓解作用［4 － 5］。通过使用响应曲面法来优化陕北小米米糠油的提取工艺,为米糠变废为宝提供一些理论数据及前期工作基础。
1实验部分
1. 1材料与仪器
小米糠,购于陕北榆林市。
无水乙醇( AR) 、冰醋酸( AR) ,天津市致远化学试剂有限公司; 碳酸氢钠( AR) ,西安化学试剂厂。
HH - 2数显恒温水浴锅,金坛市丹阳门石英玻璃厂; 小型高速粉碎机,潍坊市北方制药设备制造有限公司; 电子天平, 沈阳龙腾电子有限公司; 202 - 1A型电热恒温干燥箱,天津市通利信达仪器厂; 标准检验筛40目,浙江省上虞市大亨桥化验仪器厂; KQ - 300VDE超声波清洗机,江苏省昆山市淀山湖镇; 电炉、SHZ - D循环水式真空泵、RE - 201D旋转蒸发仪, 巩义市宇翔仪器有限公司; HH - 2数显恒温水浴锅,金坛市丹阳门石英玻璃厂。
1. 2陕北小米糠中提取小米糠油的工艺流程
小米糠→干燥→粉碎过筛→称取样品→配料液→超声波处理→抽滤→旋转蒸发→小米糠油→称量→计算
1. 3超声波辅助提取陕北小米糠中小米糠油的操作步骤
将处理干净后的小米糠进行干燥,干燥后碎过筛备用,准确称取适量的干燥小米糠样品放入合适的锥形瓶中,并添加一定量的无水乙醇作为溶剂,配成料液。取配好料液的锥形瓶, 放入超声波清洗机中,按每组实验要求调好超声温度,超声时间和超声功率,然后进行超声波提取。将超声波处理过的料液进行抽滤,并将得到的滤液在旋转蒸发仪上进行旋转蒸发,得到小米糠油,将得到的小米糠油进行称量并计算提取率。
2结果与讨论
2. 1小米糠油提取率计算方法
2. 2小米糠油提取率响应曲面分析
利用Design Expert. V8. 0. 6分析系统的试验设计程序对表1数据进行二次多元回归拟合,获得了小米糠油提取率的预测值对编码自变量料液比、超声温度和超声时间的二次多项回归方程［6］,而回归方程系数显著性检验见表2。
利用Design Expert. V8. 0. 6软件对表1试验数据进行多元回归拟合,得小米糠油提取率对料液比( X1) 、超声时间( X2) 、 超声温度( X3) 的二次多项回归模型方程:
提取率= -57. 66120 +10. 62113 × 料液比+0. 46777 × 超声时间+ 0. 116159 × 超声温度+ 0. 09235 × 料液比 × 超声时间- 0. 096925 × 料液比 × 超声温度+ 0. 032 × 超声时间 × 超声温度- 0. 91143 × 料液比 × 料液比- 0. 014607 × 超声时间 × 超声时间- 0. 073 × 超声温度 × 超声温度
注: P < 0. 0100表示该指标极显著; P < 0. 0500表示该指标显著; P > 0. 0500表示该指标不显著。
如果要用回归模型解释所反映的现象,那么其响应变量的R2至少要大于0. 80。由表2方差分析可以看出: F = 13. 54 > F0. 05( 3,4) = 6. 59,P = 0. 0012 < 0. 05,表示该模型方程显著, 不同处理间的差异显著。预测的R2为0. 9457,校正的R2为0. 8758,证明所选的数学拟合模型与试验实际值拟合较好,可以充分体现各变量之间的关系。且该二次回归方程的模型一次项C( P = 0. 0012) 、B( P = 0. 0056) 极显著,A( P = 0. 1155) 不显著,二次项A2( P = 0. 0123) B2( P < 0. 0010) 极显著,C2( P = 0. 0363) 显著。由F值大小比较可知,影响小米糠油提取率的主要因素排序为: 超声温度> 超声时间> 料液比。
2. 3小米糠油提取率影响的响应曲面分析
为形象描述交互项对小米糠油提取率的影响,在其它因素条件固定不变的情况下,考察交互项对小米糠油提取率的影响,对模型进行分析,经Design Expert. V8. 0. 6软件分析,所得的响应曲面和等高线见图1。
等高线图的形状为椭圆表示两因素交互作用显著,而圆形则与之相反。在靠近椭圆区域中心,提取率有最大值; 等高线密集的地方,表明因素的变化对提取率影响非常大。图1就是利用Design - Expert. V8. 0. 6系统得到的响应曲面图和等高线图,从图1中可直观地看出响应曲面都为凸面,表示该模型在试验范围内存在稳定点,而料液比与超声时间的交互作用明显. 其它两个交互作用图与之相似,不在重复。
2. 4响应曲面优化结果
本试验的最终目的是得到小米糠油的最大提取率,通过软件自动分析得到的试验方案得出小米米糠油提取的最佳工艺为在超声功率为300 W、超声频率为45 k Hz、以无水乙醇为提取溶剂的前提下料液比为4. 51、超声时间为36. 88 min、超声温度为60 ℃ ,在这一条件下小米米糠油提取率为9. 75% ,考虑到可操作性,将最优提取条件定为料液比1∶2. 5、超声时间37 min、超声温度60 ℃ 。用此最优提取条件进行验证,得到小米糠油的提取率是9. 74% ,与理论值较为接近,说明数学模型对优化小米糠油的提取工艺可行。
3结论
以陕北小米糠为原料,在单因素试验的基础上,采用响应曲面设计,以料液比、超声时间、超声温度为自变量,小米糠油提取率为响应值,用Design - Expert. V8. 0. 6软件进行试验, 综合分析确定超声波辅助提取小米糠油的最佳工艺条件。
摘要：为了研究提取小米糠油的最佳工艺条件,以陕北小米米糠为原料,用超声波法并通过响应曲面法(RSM)来分析并优化出最佳工艺条件。实验结果表明米糠油的最佳提取工艺条件为:料液比1∶4.5(g/m L)、超声时间37 min、超声温度60℃,在此条件下得到小米糠油的提取率是9.74%。