黄小米检测（共2篇）
黄小米检测 篇1
乾安黄小米
生产环境
“乾安黄小米”系吉林省乾安县特产杂粮，中国国家地理标志保护品种。乾安县碱土面积较大，分布范围广泛，与草甸土，盐土呈复区分布，个别地方与淡黑钙土呈复区分布，碱土仅有草甸碱土一个亚类，因地处风沙干旱盐碱区，土地中富含盐碱，该土壤呈弱碱性，富含碳酸钙、氮、磷、钾等，这种土质与内蒙、黑龙江等地草原沙漠化形成的土壤有本质区别，在全国是少有的。特有的土壤特点和土地全年冻化交替，干湿更迭，杜绝了黄曲霉毒素等多种霉菌的滋生，从源头上避免了黄曲霉素毒素的污染，在我国南方土壤是很难实现的，正是在这样的土壤环境下才种植出了独具特色的乾安黄小米。乾安黄小米做为盐碱黑土地上产出的优良产品，以其独特的优良品质，上好的商品性状，成为乾安县域经济发展的一大特色产品，产品在市场上深受消费者的好评，供不应求。
黄小米检测 篇2
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗兔Ig G (蛋白含量为400μg/m L) 为Gene Script公司产品;牛血清白蛋白、四甲基联苯胺 (TMB) 、过氧化尿素均为Sigma公司产品;96孔酶标板为Costar公司生产;酶标仪 (Versa Max TM, Molecular Devices) 。茵栀黄注射液110批。
1.2 实验方法
1.2.1 间接ELISA法试验步骤
(1) 包被抗原:用包被液将金银花抗原或样品稀释成适当浓度的溶液, 包被在96孔聚乙烯酶标板上, 每孔加100μL, 同时包被阳性 (直接包被兔抗金银花抗体) 和阴性 (包被液) 对照。4℃冰箱冷藏18~20 h后, 倒尽板孔中的液体, 反复洗涤3次。 (2) 封闭:每孔加入5%牛血清白蛋白溶液 (溶剂为p H 7.4的PBS溶液) 200μL, 37℃放置1 h后, 倒尽板孔中的液体, 反复洗涤3次。 (3) 加第一抗体 (制备的抗体) :用p H 7.4的PBS溶液将所制抗体血清作适当稀释, 每孔加100μL, 37℃放置1 h后, 倒尽板孔中的液体, 反复洗涤3次。 (4) 加第二抗体:用p H7.4的PBS溶液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G稀释 (1∶5000) , 每孔加100μL, 37℃放置1 h后, 倒尽板孔中的液体, 反复洗涤3次。 (5) 加底物缓冲液:加TMB-H2O2尿素底物缓冲液100μL, 37℃暗处反应约15 min。 (6) 加终止液:每孔加终止液50μL。 (7) 观察结果:用酶标仪记录450 nm的吸光度读数。
1.2.2 兔抗金银花抗原抗体的纯化
取兔抗金银花抗原 (Ⅰ) 血清2 m L, 加饱和的硫酸铵溶液, 使硫酸铵的饱和度达到50%, 4℃静置2 h, 4℃条件下以离心力9000 g离心10 min, 弃去上清液;沉淀溶于2 m L水中, 加饱和的硫酸铵溶液, 使硫酸铵的饱和度达到50%, 4℃静置2 h, 4℃条件下以离心力9000 g离心10 min, 弃上清液;沉淀再溶于2 m L的PBS (0.01 mol/L, p H 7.4) 溶液中, 装入透析袋, 4℃对100倍的上述PBS溶液透析过夜, 其间更换4次透析液。纯化后的抗体转移到适当的容器中, 用上述PBS溶液定容至3 m L。
1.2.3 抗原、抗体浓度的确定
将金银花抗原用包被液稀释成200μg/m L的溶液, 作为起始浓度, 倍比稀释, 分别包被在96孔酶标板上, 每孔100μL, 同时包被阴性和阳性对照, 4℃放置20 h;洗涤后, 用5%牛血清白蛋白封闭;洗涤后, 加入1.2.2项下纯化的抗体, 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600稀释, 每孔100μL, 按照“1.2.1间接ELISA法试验步骤”作方阵滴定。只有当阳性对照呈阳性, 阴性对照呈阴性时, 试验结果才成立。
1.2.4 标准曲线
取包被液稀释的金银花抗原 (200μg/m L) , 倍比稀释, 包被在96孔酶标板上, 每孔100μL, 4℃冰箱放置20 h, 洗涤6遍后, 用5%牛血清白蛋白200μL封闭1.5 h, 洗涤3遍, 加入1:800的抗体100μL, 洗涤3遍后, 加入1:5000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G溶液100μL反应1 h, 洗涤3遍后, 加入TMB-过氧化尿素底物液显色15 min, 加入终止液 (2 mol/m L硫酸) 50μL, 450 nm测定吸光度。以吸光度为横坐标, 抗原浓度为纵坐标做线性回归。
1.2.5 检出限与定量限
根据AOAC的标准, 以阴性均值加3倍标准差 (n=20) 作为本方法的检测灵敏度, 以阴性均值加10倍标准差 (n=20) 作为本方法的定量限。
1.2.6 精密度实验
板内精密度:取同一样品包被在同一酶标板上, 按照“2.1间接ELISA法试验步骤”进行试验, 考察批内精密度;板间精密度:取同一样品, 在不同时间, 包被在4块酶标板上, 每板5孔, 按照“1.2.1间接ELISA法试验步骤”进行试验, 考察批间精密度。
1.2.7 加样回收率试验
将金银花抗原加入到已知抗原浓度的茵栀黄注射液中, 使其金银花抗原的加入量分别为4μg/m L、16μg/m L、32μg/m L, 按照“1.2.1间接ELISA法试验步骤”进行试验, 按照接ELISA法的步骤进行实验, 根据试验结果计算平均加样回收率。
1.2.8 茵栀黄注射液中金银花源性过敏性杂质的测定
金银花抗原用包被液溶解稀释成200μg/m L的溶液并做等比浓度稀释, 茵栀黄注射液用10倍浓度的包被液调节p H至9.6, 分别加入到酶标板上, 每孔100μL, 同时包被阳性和阴性对照, 4℃冰箱放置20 h;洗涤3遍后加入5%牛血清白蛋白的PBS溶液200μL, 37℃封闭1 h;洗涤3遍后加入1:400的兔抗刺五加抗原抗体PBS溶液100μL, 37℃孵育1 h;再次洗涤5遍后, 加入1∶5000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G PBS溶液100μL, 37℃孵育1 h;再次洗涤5遍后, 加入TMB-过氧化氢尿素底物缓冲液100μL, 37℃避光反应15 min, 加入2 mol/L的硫酸溶液50μL终止反应, 450 nm测定吸光度。
只有当阳性对照呈阳性, 阴性对照呈阴性时实验才成立。根据AOAC的标准, 以阴性均值 (X) 加3倍标准差 (SD, n=20) 的和 (X+3SD) 作为本方法的检测限, 当待测样品的测定结果> (X+3SD) 时, 被判为阳性;< (X+2SD) 时, 被判为阴性;在 (x-±2SD) 与 (x-±3SD) 之间时, 需要调整试验条件重新测试。
2 实验结果
2.1 间接ELISA方法的建立
2.1.1 抗原、抗体浓度的确定
试验显示, 当抗体浓度过高 (稀释度1∶100) 时, 阴性值明显偏高;当抗体浓度过低 (稀释度1∶1600) 时, 阴性结果差别不大;但抗体浓度较高时, 样品的吸光度值也较高, 这可能是由于抗体浓度越高, 就越容易与酶标板上的抗原结合, 其反应时间也就越快, 所以选择抗体的最终工作浓度为稀释度1∶400。
对抗体浓度为稀释度1∶400的数据进行分析, 以抗原浓度为纵坐标, 吸光度值为横坐标做折线图图1与图2, 通过对图表的分析, 我们得到了最佳的金银花抗原浓度范围为2~100μg/m L。
2.1.2 标准曲线
以吸光度为横坐标, 抗原浓度为纵坐标做线性回归, 得回归曲线为y=107.64x-9.13, R2=0.996。金银花抗原浓度在1~100μg/m L时, 抗原浓度与吸光度值呈现良好的线性关系。标准曲线见图3。
2.1.3 检出限与定量限
根据AOAC的标准, 计算方法的检出限与定量限。本方法检出限时吸光度的理论值 (cut-off值) =0.0953;定量限时吸光度的理论值=0.148。根据“标准曲线”项下的实验数据, 得到本方法的检出限约为1μg/m L, 定量限约为6μg/m L。
2.1.4 精密度实验
同一样品在同一酶标板上, 20次的RSD为4.01% (n=20) , 表明板内精密度良好;同一样品, 不同时间包被在5块酶标板上, 实验结果显示:各板间吸光度差异较大。故后续试验采取每一块板都做一条随行标准曲线进行。
2.1.5 加样回收率试验
本方法的低、中、高3个浓度的加样回收率分别为89.8%、86.9%、80.2%, 平均加样回收率为85.6%。
2.2 样品测定结果
对抽取的110批样品进行了测定, 结果未出现ELISA阳性反应, 未检出对应中检所提供的金银花抗体的过敏性物质。
3 讨论
酶联免疫吸附实验 (ELISA) 虽然具有高度的特异性和敏感性, 但是其操作包括包被、洗涤、封闭、温育、加样、显色等多个步骤, 其影响因素也较多, 为了保证实验的准确性, 必须严格按照建立的间接ELISA实验步骤进行试验。方法中的加样回收率较低, 特别是加入低浓度的标准抗原溶液, 主要是由于抗原浓度太低, 位于线性范围的下限, 测定结果的准确性较高浓度差。另一方面, 中药注射液中的成分复杂, 样品中的某些物质可能有干扰, 也会导致加样回收率低。经过多次试验发现, 同一样品在同一块酶标板上多次测定, 其精密度良好;但同一样品在不同的酶标板上多次测定, 其吸光度较大, 只有采用每一块酶标板都做一条标准曲线进行校正后, 其精密度方可达到试验目的。
通过方法学验证, 标准曲线的回归方程为y=107.64x-9.13, R2=0.996, 检出限约为1μg/m L, 定量限约为6μg/m L, RSD为4.01% (n=20) , 低、中、高3个浓度的加样回收率分别为89.8%、86.9%、80.2%, 平均加样回收率为85.6%。试验中所建立的间接ELISA法具有较高的精密度、加样回收率、高灵敏度、特异等特点, 可以用于茵栀黄注射液中金银花源性过敏性物质的定性和定量分析。
摘要：目的 采用“水煮醇沉”工艺生产的茵栀黄注射液可能无法完全去除其植物蛋白等过敏源性杂质, 本文拟建立间接ELISA方法对国家评价性抽样中的茵栀黄注射液样品进行大批量快速筛查。方法 建立快速、灵敏的间接ELISA方法检测方法, 采用该方法和中检所提供的金银花抗原抗体对茵栀黄注射液中的金银花源性过敏性杂质进行测定。结果 采用间接ELISA法检测茵栀黄注射液中过敏性杂质, 线性范围为1~100 μg/mL (R2=0.996) 检出限约为1 μg/mL, 定量限约为6 μg/mL, 平均加样回收率为85.6%, 所检测的110批样品未检出对应中检所提供的金银花抗体的过敏性物质。结论 所建立的间接ELISA方法可以用来快速、高效地检测出茵栀黄注射液中过敏性杂质。
关键词：间接ELISA,茵栀黄注射液,不良反应,过敏性杂质
参考文献
[1] 胡大豹.茵栀黄致胃肠道反应1例[J].中国实用乡村医生杂志, 2006, 13 (9) :32.
[2] 李明慧, 马烈, 陈利军, 等.茵栀黄注射液不良反应临床分析[J].药品评价, 2006, 3 (5) :355-357.