腺苷酸环化酶（精选12篇）
腺苷酸环化酶 篇1
1 研究背景
腺苷酸环化酶 (adenylyl cyclase, AC) 作为第二信使c AMP (3'-5'-cyclic adenosine monophosphate) 信号通路的重要组分, 催化ATP生成c AMP并释放出焦磷酸, 参与多种细胞生物活动, 在细胞增殖、分化以及发育过程中发挥重要作用[1]。现已发现10种不同AC亚型, 即AC1-AC10, 其中AC1-AC9为膜结合蛋白, AC10为胞内可溶性蛋白[2]。
骨髓间充质干细胞 (bone marrow stromal cells, BMSCs) , 也称骨髓基质来源干细胞, 是存在于骨髓中除造血干细胞以外另一类具有多向分化潜能的干细胞, 参与骨造血微环境构成[3]。在一定诱导条件下, 这类细胞可定向分化为多种造血以外的组织, 特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞, 例如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞 (例, 心肌细胞[4,5]、骨骼肌细胞[6]) 、神经细胞[7,8]等, 进而参与骨量调节[9]等机体的生长与损伤的修复过程。由于BMSCs具有贴壁生长的特性, 易在体外分离和增殖, 并易于外源基因的转入和表达, 因此, 被认为是一种理想的细胞治疗工具和基因治疗的靶细胞, 在理论和应用上具有重要意义[10]。
c AMP信号通路在哺乳动物BMSCs的成骨/成脂细胞分化过程中具有重要作用。在不同物种之间, 特别是人类间充质干细胞 (human marrow stromal cells, h MSCs) 与啮齿类动物BMSCs之间, c AMP信号通路在向成骨细胞/脂肪细胞分化过程中的调控作用相似[11—15]。被AC激活剂毛喉素 (forskolin) 处理的小鼠BMSCs, c AMP表达上调, 成骨分化增强[11,13]。研究表明, 毛喉素处理的人类MSCs可加强体内的成骨分化。虽然c AMP信号通路在哺乳动物BMSCs分化过程中具有重要调节作用, 特别是对分化方向决定 (mesenchymal cell fate decision) 具有重要作用[12,14,15], 但具体哪些AC亚型通过c AMP信号通路参与BMSCs分化过程的调节并不明确。
尽管大鼠肺外周动脉平滑肌细胞 (PASMCs) [16]、神经元细胞系 (CAD) [17]、血管平滑肌细胞 (VSMC) [18]、大鼠主动脉平滑肌细胞 (RASMC) [19]等细胞中AC家族成员表达已经确定, 但小鼠BMSCs中AC家族成员表达情况, 尚待确定。
通过优化BMSCs原代培养条件, 对纯化培养的BMSCs进行纯度初步检测后, 提取其总RNA反转录。通过反转录PCR和测序比对, 初步确定有6种AC亚型表达于小鼠BMSCs, 分别为AC2、AC3、AC4、AC6、AC7和AC9。
2 材料与方法
2.1 试剂、材料
所用试剂和抗体为:FITC标记的抗鼠单克隆抗体CD45 (BD Pharmingen公司) ;FITC标记的抗鼠单克隆抗体Sca-1 (BD Pharmingen公司) ;DAPI (ROCHE 236276) ;青/链霉素 (上海杰美基因医药科技有限公司) ;胎牛血清 (FBS, 上海生工有限公司) ;EDTA和胰酶 (上海生工公司) ;DMEM培养基 (高糖) (GIBCO公司产品) ;Trizol (Invitrogen) ;氯仿 (北京化标源科技有限公司) ;异丙醇 (北京化标源科技有限公司) ;95%乙醇 (北京化标源科技有限公司) ;RNA反转录试剂盒 (宝生物工程 (大连) 有限公司) ;以及Fluorgel With Tris Buffer (Electron Microscopy Sciences) 。
2.2 动物
研究所用3月龄雄性C57/BL6小鼠最初引进自美国华盛顿大学 (西雅图分校) Daniel.R.Storm实验室, 饲养并繁殖于河北大学标准动物房。实验动物的所有处理方法和操作程序均符合中华人民共和国科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》, 并得到河北大学动物伦理及关爱委员会的批准。
2.3 小鼠BMSCs原代培养
采用全贴壁法培养小鼠BMSCs。颈椎脱臼法处死雄性C57BL/6小鼠, 在医用酒精中浸泡5 min。收集小鼠四肢的股骨和胫骨, 在预冷PBS中除净股骨和胫骨上附着的软组织, 剪除骨两端骨骺, 暴露骨髓腔。用1 m L注射器吸取DMEM培养液 (高糖) 冲洗骨髓腔。收集骨髓并用1 m L注射器分散, 筛网过滤除去块状肌肉组织和骨渣, 得到单细胞悬液。用自动细胞计数器 (美国Invitrogen公司) 计数有核细胞总数。调整悬液中骨髓单核细胞浓度为2.0×106~4.0×106cell/m L, 在37℃、5%CO2条件下静置培养3~5 d。换液以去除漂浮细胞碎片和血细胞等杂质, 并保持骨髓间充质细胞贴壁。所用高糖DMEM培养液含10%FBS、100 U/m L青霉素、100 U/m L链霉素。每2 d更换细胞培养液1次, 8~10 d细胞生长至覆盖度达到70%~90%后传代培养。
2.4 细胞免疫荧光染色
将原代细胞于5%CO2、37℃细胞培养箱培养, 待细胞覆盖度达到90%~100%, 用PBS洗3次, 加入4%PFA固定细胞30 min, 吸出后再用PBS清洗3次, 每次15 min。用0.2%Triton X-100通透10min, PBS清洗3次。封闭液 (5%BSA+0.05mol/L Glycine) 37℃封闭1 h。加入FITC标记的抗鼠单克隆抗体 (1∶1 000) , 4℃孵育过夜 (湿盒中) 。用DA-PI进行细胞核复染色, Fluorgel With Tris Buffer封片。荧光显微镜 (Olympus BX53, JPN) 下观察, O-lympus Fluoview1000采集照片。
2.5 细胞总RNA提取及RT-PCR
培养细胞至覆盖度>90%, Trizol法提取细胞总RNA, Nano Drop 2000 (Thermo) 检测且琼脂糖凝胶电泳验证合格后, 用Prime ScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser (Takara) 除去基因组DNA, 并将RNA反转录成c DNA。PCR反应条件及各AC亚型基因正、反向引物序列 (南京金斯瑞生物科技有限公司合成) 见表1。
2.6 不同AC亚型序列比对
将不同AC亚型的RT-PCR产物委托 (北京) 华大基因测序, 所得序列分别与Gene Bank中鼠的各AC亚型序列进行比对分析。
注:不同AC亚型PCR反应中变性温度和时间均采用94℃30 s, 延伸温度和时间均采用72℃40 s。
3 结果
3.1 小鼠BMSCs原代培养条件
与人和大鼠的BMSCs形态不同, 小鼠BMSCs体形小, 最初几代形态多样[20]。原代培养在接种72 h后可见贴壁细胞, 形态为小圆形、多角形、梭形和扁平形。通过调节单细胞悬液中骨髓单核细胞浓度以及贴壁时间, 使用含10%FBS的高糖DMEM培养基 (100 U/m L青霉素、100 U/m L链霉素) 对细胞进行传代。发现当单细胞悬液中骨髓单核细胞浓度为4.0×106cell/m L, 贴壁时间为4 d时, 传代2次, 细胞生长状态较好 (图1) 。
(BMSCs) 生长状态。调整单细胞悬液中骨髓单核细胞浓度为4.0×106cell/m L, 细胞完全静置贴壁时间分别为3 d (图A、图B) 、4 d (图C、图D) 和5 d (图E、图F) , 首次换液时细胞生长状态如图A (3 d) 、图C (4 d) 和图E (5 d) 。传代培养后, 贴壁4 d的细胞 (图D) 生长速度较快, 且生长状态较均一。标尺长度:20μm adherented for different time.Through regulateing the concentration of nucleated cells to 4×106, the cells are incubated for 3 days (fig.A, B) , 4 days (fig.C, D) and 5 days (fig.E, F) differently.The growth states of the cells replaced with fresh medium are shown in fig.A (3 d) , fig.C (4 d) and fig.E (5 d) , respectively.After subculturing, the cells adherented for 4 days (fig.D) grow faster than the cells adherented for 3 days (fig.B) and are more uniform than the cells adherented for 5 days (fig.F) .Scale bar, 20μm
小鼠BMSCs特异性高表达干细胞抗原Sca-1和特异性低表达造血系抗原CD45[10]。使用小鼠BM-SCs表面特异性表达抗体Sca-1和CD45, 所培养BMSCs细胞能够高表达Sca-1 (图2A) , 特异性低表达CD45 (图2B) 。对特异性高表达抗原Sca-1和特异性低表达造血系抗原CD45的细胞数进行统计分析表明, 特异性表达抗原Sca-1的细胞占所统计细胞总数的100% (总细胞数n=1 656) , 特异性表达抗原CD45细胞占所统计细胞总数的4.31% (总细胞数n=1 687, 特异性表达抗原CD45细胞数n=73) 。统计数据表明所培养的细胞纯度达到90%以上, 符合实验要求。
3.2 小鼠BMSCs中AC表达种类
收集3月龄雄性小鼠BMSCs细胞并提取总RNA, RNA进行反转录后, 用表1中的引物和反转录PCR条件, 分析各AC亚型基因的表达。结果发现, 小鼠骨髓间充质干细胞中共有6种AC亚型表达, 分别是AC2, AC3, AC4, AC6, AC7和AC9 (图3) 。对PCR产物进行测序, AC2, AC3, AC4, AC6, AC7和AC9的RT-PCR产物长度分别为311 bp, 526bp, 387 bp, 494 bp, 355 bp和423 bp, 序列比对结果与目的基因一致。
小鼠BMSCs细胞特异性高表达干细胞Sca-1 (图A) 和特异性低表达造血系抗原CD45 (图B) 。标尺长度:10μmThe results show that the measured cells express stem cell antigen Sca-1 highly (fig.A) and specific hematopoietic antigen CD45 lowly (fig.B) .Scale bar:10μm
4 讨论
骨髓细胞中含有造血和骨髓间充质两种干细胞。目前用于分离BMSCs的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式分选法、免疫磁珠分离法[20]以及骨片培养法[10,21]。相对骨髓中其他种类细胞, 骨髓间充质干细胞的数量极少, 约每10万个有核细胞中才含有一个BMSCs[20]。相对于密度梯度离心法、流式分选法和免疫磁珠分离法, 全骨髓贴壁法可以通过换液及传代, 去除造血系细胞, 从而得到符合纯度要求的足量原代细胞[20,22]。
首次换液时间及原代贴壁培养细胞浓度对骨髓间充质干细胞的生长影响很大。从细胞生长情况和纯度综合考虑, 单细胞悬液中骨髓单核细胞浓度为4.0×106cell/m L, 贴壁时间为4 d时, 传代2次, 获得的细胞生长状态较好。
BMSCs主要通过对Cbfa1/Runx2的调节[24]分化为成骨细胞, 而该调节又受第二信使c AMP信号通路调控[12, 24—26]。有文献报道, AC基因家族的AC2和AC5基因在细胞的生长、增殖过程中有重要的调节作用[16]。当AC5基因敲除后, 骨量上调[27], 推断AC5可能参与骨量调节。但在本研究结果中却未能检测到AC5的表达。而抑制人类h MSCs成骨分化的AC8[28]在研究中亦未发现表达。作为感知胞外机械信号和化学信号刺激与嗅觉信号成分的AC3[29]、在小鼠肾上腺皮质细胞中表达并受特异性蛋白-1 (specificity protein-1, SP1) 和类固醇生成因子-1 (steroidogenic factor 1, SF-1) 调节的AC4[30]、主要在大鼠肾上腺皮质表达且在受到维持肾上腺正常形态和功能的重要激素促肾上腺皮质激素 (ACTH) 刺激后表达增加的AC9[31]在BMSCs中均有一定的表达。可能物种不同, 或者AC亚型表达具有组织特异性, 致使不同实验结果有所差异。
总之, 本研究发现, 体外培养的小鼠原代骨髓间充质干细胞中通过c AMP信号通路参与调控BMSCs分化的AC亚型有6种, 分别是AC2, AC3, AC4, AC6, AC7和AC9。但这6种AC亚型参与调节BM-SCs分化的具体分子机制有待深入研究。
摘要：骨髓间充质干细胞 (bone marrow stromal cells, BMSCs) 是骨髓中具有多向分化潜能的干细胞, 腺苷酸环化酶 (adenylyl cyclase, AC) 作为第二信使c AMP信号通路的重要组分, 在BMSCs的成骨/成脂分化中具有重要作用, 但BMSCs中AC亚型表达种类, 尚待明了。通过对小鼠BMSCs原代培养条件优化, 获得最适培养条件下生长良好的细胞, 提取其总RNA并反转录;采用RT-PCR和序列比对分析, 鉴定了小鼠BMSCs中AC亚型的表达种类。研究发现:1小鼠BMSCs原代培养:以4.0×106cell/m L的骨髓单核细胞浓度培养, 并于4 d首次换液, 增殖速度快, 可以达到后续实验要求;2原代小鼠BMSCs中AC亚型表达种类分别为AC2、AC3、AC4、AC6、AC7和AC9。
关键词：骨髓间充质干细胞 (BMSCs) ,原代培养,腺苷酸环化酶 (AC)
腺苷酸环化酶 篇2
复方消化酶胶囊有什么作用?复方消化酶胶囊对促进消化效果较好。复方消化酶胶囊对胰脏功能不全引起的腹部胀满，上腹不适，鼓胀，泄泻，脂肪便等各种消化不良症均有疗效。那么，那么，复方消化酶胶囊有什么作用?
复方消化酶胶囊由胃蛋白酶,木瓜酶,淀粉酶等组成。有促进食物消化,驱除肠内气体和利胆的作用,可提高胆汁分泌,加强消化吸收,对胰脏功能不全引起的腹部胀满,上腹不适,鼓胀,泄泻,脂肪便等各种消化不良症均有疗效.千红怡美中胃蛋白酶能使蛋白质分解成胨和多肽;木瓜酶可水解动植物蛋白，提高蛋白质利用率，淀粉酶能直接使淀粉分解为易于吸收的糊精与麦芽糖;熊去氧胆酸能增加胆汁酸分泌，提高胰酶活性，促进食物中脂肪乳化。
复方消化酶胶囊能促进胆汁分泌作甩因而可促脂肪和脂肪酸分解，抑制肝细胞内脂肪沉积，提高胆色素排泄，治疗黄疸。因含有胃蛋白酶、木瓜酶淀粉酶、熊去氧胆酸、纤维素酶、胰酶、胰脂酶。可以促进各种植物纤维分解，促进蛋白质，脂肪分解，促进蛋白质，脂肪及碳水化合物适消化吸收。排除肠内气体,消除胆部胀满涨。
关于单胺氧化酶的药理分析 篇3
[关键词]单胺氧化酶；药用分析
[中图分类号]R97 [文献标识码]A [文章编号]1672-5158（2013）06-0460-01
一、单胺氧化酶的理化性质
单胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）的分类名为单胺：氧氧化还原酶，是含Fe2+、Cu2+和磷脂的结合酶，主要作用CH2NH2基团催化各种单胺类脱胺生成相应的醛，然后进一步氧化成酸；或使醛转化为醇再进一步代谢。MAO是一种上具多个结合部位的单一分子酶，故对底物的特异性不高，可使多种胺类氧化脱氨。MAO广布于体内各组织器官，尤以肝、肾、胃和小肠含量最多，主要位于线粒体膜外表面，并与膜紧密结合，以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅酶；另一类存在于结缔组织，不含FAD，以磷酸吡哆醛为辅酶。
脑组织中的MAO随年龄增加、神经胶质细胞的增多其活性增强。MAO能分解儿茶酚胺类激素，可间接反映心脏交感神经结功能。现已证实，不同来源的MAO的相对分子质量相差很大，小者约100，000，大者可达1，000，000以上，是由于同一亚基的聚合程度不同所致。
二、单胺氧化酶的实验室检测方法
最早检测MAO是用荧光测定法和醛偶氮萘酚法，目前常用方法包括以下几种。
1、醛苯腙比色法该方法通过MAO氧化苄胺，再与2，4二硝基苯肼作用生成的醛苯腙在碱性条件下产生棕红色，于470nm比色测定，计算MAO的浓度。
2、MCDP比色法该法是通过MAO氧化苄胺产生过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶存在下与McDP作用生成有色的甲烯蓝，于660nm处比色测定，计算MAO的浓度。此法需要加入终止液后测定，不宜于大批量标本的检测，而且MCDP见光易分解。
3、连速监测法该方法是通过MAO催化苄胺生成氨，氨在Ⅸ酮戊二酸、NADPHfIIGLDH的存在下生成谷氨酸，同时NADPH还原成NADP+，引起340nm处吸光度的下降，通过监测其下降的速率即可得出样本中MAO的活性。此方法快捷、操作简单、适合自动化分析，可减少人为误差，具有良好的准确度与精密度，适合大多数临床实验室应用。
三、单胺氧化酶测定的临床应用
1、血清单胺氧化酶活性高低能反映肝纤维化的程度，是诊断肝硬化的重要指标。肝硬化病人MAO活性升高的阳性率在80%以上，最高值可达对照值的3.5倍（n=30）。酶活性与腹腔镜所见肝表面的结节变化，以及与活组织镜检所见的纤维化程度相平行。纤维变仅限于汇管区或小叶中心者，其MAO活性大致正常；纤维变侵入肝实质内时，MAO升高率为30%；汇管和汇管区之间有架桥性纤维化时，则有83%升高；如在假小叶周围有广泛纤维化形成时，则几乎全部均升高，且升高幅度最大。国内报道阳性率均在85%（天津公安医院：17例，88%，高玑山等：32例，85.7%；薛德义等：71例，87.05%；黄泽伦：20例，85%；刘览等：30例，86.7%），其升高幅度及阳性率均超过急性或慢性肝炎。同工酶分离证实，慢性肝病SMAO-III有增高趋势；肝硬化代偿组MAO-III占总活性的（23.9+3.0）%，其阳性率为72.2%（13/18）；肝硬化失代偿组MAO-III占总活性的（34.6+4.0）%，其阳性率为92.3%，故检测MAO同工酶有助于肝硬化的早期诊断（陈道宏等）。
虽然肝硬化时，结缔组织纤维释放MAO增多，但在纤维化甚为明显的血吸虫肝病，患者SMAO并不一定升高，故纤维化并非MAO活性升高的唯一原因。现已知大动脉和肺组织内MAO的浓度比血清高100150倍，血中MAO可能部分来自血管内皮细胞。肝硬化时，病人体内的水分增加，末梢扩张和高动力型循环等有可能促使血管壁内MAO释放人血。由于胃肠组织也含有丰富的MAO，因此门体静脉短路时，肠内MAO可经短路进入体循环。
2、各型肝炎：各型肝炎急性期患者的MAO活性多数不升高，但在暴发型重症肝炎时，因肝细胞坏死，线粒体释放大量的MAO，可致MAO活性升高，阳性率可达73.3%，其升高幅度与病情轻重程度成正相关；急性肝炎经久不愈，病程超过3个月者，MAO活性亦可升高；活动型慢性肝炎有半数左右病例MAO活性升高。肝炎与肝硬化病人MAO活性差别显着，而各型肝炎之间的MAO活性无显着差异。
3、糖尿病可因合并脂肪肝，充血性心力衰竭可因肝郁而继发肝纤维化，以至人MAO活性增高；甲状腺功能亢进可因纤维组织分解与合成旺盛，肢端肥大症可因纤维过度合成等原因，从而引起MAO活性不同程度的升高。有些无纤维增生的结缔组织疾病的病人MAO活性不升高。原发性肝癌、继发性肝癌、畸胎瘤、胆汁性肝硬化、血吸虫性肝硬化、慢性胆汁郁积型肝炎等患者的SMAO活性不变。
测定血小板MAO活性发现，正常对照组女性大于男性。
慢性精神分裂症患者血小板MAO活性明显低于正常组，而急性精神分裂症与对照组无明显差别，但抗精神病药物能引起MAO活性升高。双向情感性障碍患者，血小板MAO活性显着低于对照组，且男性低于女性；躁狂型患者显着低于抑郁型患者患者，单相抑郁症患者显着公共开支对照组。但美国学者最近研究认为，血小板MAO活性与精神病学检查结果没有明显关系。酒精中毒者男性血小板MAO与女性有明显差异。
此外，测定肿瘤组织匀浆MAO和二胺氧化酶的活性，有助于区别前肠和中肠的类癌瘤肿瘤，前肠类癌肿组织中MAO活性[（1850+342）m01/mg，min，n=16]明显高于中肠类癌肿瘤[（407+43）mol/mg，min]。
参考文献
[1]叶应妩，等，全国临床检验操作规程式[M]，北京：人民卫生出版社。1997：229-231
禽类消化酶的研究进展 篇4
禽类消化酶的研究内容主要包括:①禽类消化酶的种类与分布;②个体发育与消化酶的发生和演变的关系;③环境条件的变化与消化酶的关系。
1 禽类消化酶的种类与分布
国内外学者主要采用测定禽类消化酶活力的分析法确定消化酶是否存在, 根据消化对象的不同, 目前已经测定的禽类消化酶的种类主要有蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。此外, 有些禽类, 比如鸵鸟, 其肌胃、腺胃和结肠中有挥发性脂肪酸生成, 并且能够消化纤维素, 因此认为消化道中可能有纤维素酶。
1.1 蛋白酶
(1) 胃蛋白酶。
禽类的胃由腺胃和肌胃组成。胃蛋白酶原主要由腺胃中的主细胞产生, 由于肌胃中的pH为2.0～3.5, 为胃蛋白酶提供最适宜条件, 所以胃蛋白酶经常存在于肌胃的内容物中。有些胃蛋白酶的消化作用在肠中进行, 但由于肠中的pH通常为6～7, 所以在肠中胃蛋白酶并不起主导作用, 主要的消化由胰蛋白酶等来完成。
(2) 胰蛋白酶。
胰蛋白酶由胰腺的腺泡分泌, 通过3条分离的胰管, 再运输到十二指肠襻。
(3) 糜蛋白酶。
糜蛋白酶由胰腺分泌, 分布于十二指肠、空肠、回肠中。
1.2 淀粉酶
(1) 口腔、食道和嗉囊的淀粉酶。
淀粉酶一般存在于禽的唾液和口腔与食道中, 但在鸡和火鸡的唾液腺里没有淀粉酶;有些淀粉在嗉囊中的降解是来自饲料中的酶和细菌的发酵作用, 而嗉囊中的淀粉酶可能是源于腺胃、肌胃和十二指肠内容物的回流。
(2) 胰淀粉酶。
胰腺是淀粉酶生成的中心器官, 它分泌机能的强弱直接影响禽类对食物的消化能力。胰淀粉酶由胰腺的腺泡分泌, 通过3条分离的胰管, 再运输到十二指肠的襻端。此外, 胰淀粉酶的活性还受日粮成份的影响, 增加日粮中碳水化合物和脂肪的含量会提高胰淀粉酶的活性。
(3) 肝脏和胆汁中的淀粉酶。
肝脏的主要消化机能和胆汁的生成有关系。肝脏和胆汁都能分泌淀粉酶, 胆汁中的淀粉酶能促进糖类的消化;鸡胆汁中淀粉酶的活性要高于肝脏淀粉酶的活性, 而且所有8周龄以上的鸡胆汁中都有淀粉酶。
1.3 脂肪酶
脂肪酶是能切断脂键的酯酶, 它能水解甘油酯、磷脂和蜡酯。通常把以磷脂为水解底物的脂肪酶称为脂肪酶, 而把以甘油脂为水解底物的脂肪酶称为酯酶。禽类的脂肪酶由胰腺和肝脏分泌, 且分泌量受日粮的影响。
2 禽类个体发育与消化酶的发生和演变的关系
禽类消化酶的活性变化与生长发育不同阶段的新陈代谢水平有关, 研究消化酶的发育规律, 可以更加了解禽类各阶段的营养需求, 以及给它们在不同阶段对饲料的要求提供理论依据。
Kulka 和 Duksin[1] , Marchaim和Kulka[2]对鸡胚胎期及出生后体内的胰淀粉酶和糜蛋白酶的活性进行了检测, 结果发现:胰淀粉酶和糜蛋白酶的活性都随着鸡胚龄的增加而逐步增加, 在出雏后达到最大值, 随后随着鸡日龄的增加其活性却逐步下降;安永义等[3]在研究0～3周龄雄性肉仔鸡消化道酶发育规律时发现 , 当酶活用U/g胰重表示时, 胰淀粉酶和胰蛋白酶在4日龄后开始升高, 在17日龄时达到峰值;糜蛋白酶活力在0～10日龄间下降, 随后逐步升高, 至21日龄达到峰值;而脂肪酶从0～21日龄一直呈上升趋势, 其中0～4日龄上升较快, 21日龄达到峰值;当酶活用 U/kg 体重表示时, 胰腺中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶分别在10、7、21和10日龄达到峰值;张铁鹰等[4]在研究0～49日龄肉仔鸡消化参数的变化规律时发现, 胃蛋白酶随肉仔鸡日龄的增加而逐渐增加, 并于28日龄达到峰值;空肠内淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶随日龄增加而增加, 并分别于35、21和14日龄达到峰值, 随后根据日龄的增加逐渐降低。由此可以得出一个结论:禽类在个体发育过程中, 不同时期存在着相应的消化生理特点。因此要根据禽类不同时期不同消化生理特点研制人工配合饲料。
3 环境条件的变化与禽类消化酶的关系
外界环境 (温度, 应激) 对消化酶活性也有影响。林海等[5]在研究环境温度对Arbor Acres肉鸡消化酶的影响时发现, 高温处理 (32 ℃) 使小肠液中的酶活性显著低于对照组 (20 ℃) 。阮晖等[6]在研究热应激对艾维茵肉鸡消化酶活性的影响时发现, 在热应激条件下, 肉鸡小肠内总蛋白水解酶活性、脂肪活性和淀粉酶活性均显著下降。
4 展 望
(1) 禽类消化酶的分泌、储存机制、对饲料的适应程度、活力的变化因素等研究得比较少。
(2) 尽管人们在酶制剂能提高禽类的生产性能方面已达成共识, 但总的来说目前对饲料酶制剂的研究还处在初级阶段。有关饲料中酶制剂的研究前景还相当广阔, 有待进一步去深入研究。
参考文献
[1]KULKA R G, DUKSI N D.Pallerns growth andа-amylase ac-tivity in the developing chick pancreas[J].Biochim.Biophys.Acta, 1964, 91:506-514.
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[3]安永义, 周毓平, 呙于明, 等.0～3周龄肉仔鸡消化酶发育规律的研究[J].动物营养学报, 1999, 11 (1) :17-21.
[4]张铁鹰, 汪儆, 李永清.0～49日龄肉仔鸡消化参数的变化规律研究[J].中国畜牧兽医, 2005, 32 (1) :6-10.
[5]林海, 杜荣.环境温度对肉仔鸡消化道内食糜排空和消化酶活性的影响[J].动物营养学报, 2001, 13 (1) :49-53.
草鱼和青鱼消化酶的分布特性 篇5
草鱼和青鱼消化酶的分布特性
选择草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和青鱼(Mylopharyngodon piceus)作试验鱼,对它们消化道的酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、淀粉酶以及三酰基甘油脂酶沿消化道及肝脏和胰腺中的活性分布进行了比较研究.研究表明:这些酶在消化道中呈现不同的分布规律,在肝脏和胰腺中酶的活性高于在消化道中相应酶的活性;同种鱼不同消化酶的分布有所差别;两种鱼消化组织中的.各种酶活性分布规律也有差别;青鱼和草鱼的主要消化酶在不同消化器官中的分布有较大差别.
作 者：刘忠义 王璋 LIU Zhong-yi WANG Zhang 作者单位：江南大学食品科学研究所,江苏无锡,214036 刊 名：淡水渔业 ISTIC PKU英文刊名：FRESHWATER FISHERIES 年，卷(期)：2006 36(1) 分类号：Q48 关键词：草鱼 青鱼 消化酶 蛋白酶 淀粉酶 脂酶腺苷酸环化酶 篇6
关键词：籽瓜;微波;多酚氧化酶;正交试验
中图分类号： TS209 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）04-0279-03
收稿日期：2014-05-15
作者简介：李永春（1980—），男，山东临沂人，硕士，讲师，主要从事生物资源的开发与利用研究。E-mail：yongchun008@qq.com。
籽瓜（Citrullus lanatus var.megulasnemus Lin et Chao），别称打瓜，葫芦科一年生草本植物，因拳打而食和含籽量多而得名。其瓜圆形，表皮光滑，浅绿色，有深绿色条纹，瓜肉白色或淡黄色，属低糖瓜类，具有较高的营养价值和医用保健价值，是一种极具地域特色的农产品[1-2]。目前对籽瓜的利用只限于取籽加工，对籽瓜副产品的开发利用主要集中在籽瓜汁的加工方面。然而，籽瓜汁产品的开发和深加工中尚存在很多问题，如籽瓜饮料加工过程中产生褐变速度快、生产过程不易控制、容易产生煮熟味和各种异味等[3]。籽瓜汁加工中的褐变主要以酶促褐变为主。在打浆、取汁等工序中，由于果肉组织破碎，细胞质膜破裂，酶与底物的区域化分布被打破，在有氧条件下，籽瓜中的多酚氧化酶（PPO）催化酚类物质氧化，形成褐色物质，这是引起酶促褐变的主要原因[4-5]。因此，在加工过程中，要避免或尽量降低酶促褐变的发生，就必须采取有效的方法杀灭或抑制多酚氧化酶的活性[6]。
抑制籽瓜汁酶褐变的传统方法是加热，但加热灭酶容易使产品过分受热，会造成营养物质的破坏，并且产生煮熟味和各种异味，同时会促进非酶褐变的发生。有研究表明，微波处理具有电磁场的热效应和非热效应2种作用，与一般的水浴、水蒸气等加热灭酶法相比能使酶更容易失活[7]。本试验通过微波结合维生素C溶液预处理籽瓜，分析微波处理对籽瓜多酚氧化酶活性的影响，以期为籽瓜汁生产加工提供理论指导和技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
敖汉籽瓜，购于内蒙古赤峰市农贸市场;聚乙烯吡咯烷酮、邻苯二酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等试剂均为国产分析纯。
1.2 主要仪器
PL203型电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司），DEKW-4型电热恒温水浴锅（江西南昌市恒顺化验设备制造有限公司），3K18型高速冷冻离心机（德国Sigma公司），UV-9600型紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司），NJL07-3型实验专用微波炉（江苏南京市杰全微波设备有限公司），PHS-3TC型精密数显酸度计（上海天达仪器有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 多酚氧化酶（PPO）活性测定 酶液的制备参考张少颖等的方法[8]略有改进。取处理后的样品1 g，加入10 mL提取介质（0.2 mol/L磷酸缓冲液，pH值为6.0;0.4 g 聚乙烯吡咯烷酮），冰浴研磨，4 ℃下4 000 r/min 离心15 min，上清液用于酶液活性测定。
酶活性测定参考Montgonery 等的方法[9]，反應体系为01 mol/L邻苯二酚溶液3 mL和0.2 mol/L、pH值为6.0的磷酸缓冲溶液1 mL，再加0.5 mL酶提取液，以蒸馏水为空白对照，于波长420 nm处比色测定，酶活性以1 minΔD值增加0.001为1个活力单位（U）。
1.3.2 单因素试验 称取一定质量的籽瓜瓤，分别以不同的微波功率、微波处理时间、载样量、维生素C预处理浓度做单因素试验，分析不同因素对籽瓜多酚氧化酶活性的影响。
1.3.3 正交试验 根据单因素试验结果，选择影响籽瓜多酚氧化酶活性各主要因素做正交试验，采用L9（34）正交表，以籽瓜多酚氧化酶（PPO）活性为指标，分析微波处理工艺对多酚氧化酶活性的影响，探索最佳的抑制酶活性条件。正交试验的因素水平如表1所示。
表1 正交试验因素水平表L9（34）
水平 A：微波功率
（W） B：微波时间
（min） C：维生素C浓度
（%）
1 400 1 0.05
2 500 2 0.10
3 600 3 0.15
2 结果与分析
2.1 微波功率对籽瓜多酚氧化酶活性的影响
称取6份50 g的籽瓜瓤，分别置于250 mL的烧杯中，分别用100、200、300、400、500、600 W的微波功率处理1 min，然后分别测定多酚氧化酶的活性。结果如图1所示，随着微波功率的增加，籽瓜瓤中多酚氧化酶活性表现为先升高随后降低的趋势。在微波功率400 W时，多酚氧化酶的活性出现一个峰值，达到最高，而后随着微波功率的增大，酶活性快速降低。
这一结果表明，在较低功率的条件下，微波处理可能激活了籽瓜中相关的酶系，促进褐变;而在较高功率条件下，微波处理明显抑制酶活性，能够抑制褐变。
2.2 微波时间对籽瓜多酚氧化酶活性的影响
称取6份50 g的籽瓜瓤，分别置于250 mL的烧杯中，用500 W的微波功率分别处理1、2、3、4、5 min，然后分别测定多酚氧化酶的活性。结果（图2）表明，微波处理时间对籽瓜酶活性有较大的影响。随着处理时间的延长，籽瓜瓤中的多酚氧化酶活性先迅速下降，然后趋于平缓直至最低，在3 min时，酶活性基本钝化。
nlc202309051143
一般来说，微波处理时间越长灭酶效果越好，但处理时间过长，微波热效应加剧，可能会改变产品品质。因此，由本试验结果可知，微波处理3 min，可使籽瓜样品达到较好的灭酶效果。
2.3 载样量对籽瓜多酚氧化酶活性的影响
分别称取50、100、150、200、250、300 g的籽瓜瓤，置于250 mL的烧杯中，分别用500 W的微波功率处理1 min，然后分别测定多酚氧化酶的活性。载样量对籽瓜多酚氧化酶活性的影响见图3。
由图3可知，在不同载样量的微波处理条件下，籽瓜瓤中多酚氧化酶活性随着载样量的增加略有上升，当载样量达到一定值后，多酚氧化酶的活性基本保持不变，这一结果表明，载样量不影响微波处理对多酚氧化酶活性的抑制效果，可能由于微波的穿透性和均一性所致。
2.4 维生素C预处理对籽瓜多酚氧化酶活性的影响
称取6份50 g的籽瓜瓤，分别置于质量浓度为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的维生素C溶液中浸泡 30 min，沥干水分后，置于250 mL的烧杯中，在功率500 W的条件下进行微波处理1 min，然后分别测定多酚氧化酶的活性。由图4可知，经过维生素C溶液预处理后再经微波处理，在低浓度条件下，籽瓜瓤中的多酚氧化酶活性随着维生素C浓度的增加而升高，在浓度为0.10%时酶活性最高，而后随着维生素C浓度的增加迅速降低，在浓度为0.15%时，酶活性基本钝化，然后趋于平缓直至最低。经0.15%浓度的維生素C预处理后微波处理1 min，与不经过维生素C预处理的微波处理3 min的灭酶效果基本相同，说明一定浓度的维生素C预处理可节约微波处理时间，能更有效地抑制籽瓜中多酚氧化酶的活性。
2.5 正交试验结果
以籽瓜多酚氧化酶（PPO）活性为指标，选择微波功率、微波时间、维生素C浓度3个因素进行正交试验，正交试验结果见表2，试验结果的方差分析见表3。
由表2、表3可见，影响籽瓜多酚氧化酶活性的因素大小顺序依次为微波时间>微波功率>维生素C预处理浓度，在设置水平范围内，微波时间和微波功率对籽瓜多酚氧化酶活性有显著性影响（P<0.05），而维生素C预处理浓度对其无显著影响，确定最优组合为A3B3C3，即微波功率 600 W、微波处理时间3 min、维生素C预处理浓度0.15%。
根据正交试验所得最优条件因素做验证试验，经过试验测定籽瓜中多酚氧化酶活性为0，在此微波处理条件下，籽瓜中多酚氧化酶的活性能够得到较好抑制，理论上已可以防止酶促褐变的发生。
3 结论
微波处理可有效抑制或钝化籽瓜多酚氧化酶的活性，微波功率越大，微波处理时间越长，多酚氧化酶越易失活，载样
表2 正交试验结果
试验号
因素
A B C 空列
PPO活性
（U）
1 1 1 1 1 5.47
2 1 2 2 2 6.27
3 1 3 3 3 0.67
4 2 1 2 3 5.40
5 2 2 3 1 3.87
6 2 3 1 2 0.40
7 3 1 3 2 1.80
8 3 2 1 3 3.53
9 3 3 2 1 0.50
k1 4.14 4.22 3.13 3.28
k2 3.22 4.56 4.06 2.82
k3 1.94 0.52 2.11 3.20
R 2.20 4.04 1.95 0.46
表3 正交试验方差分析
变异来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值
微波功率 7.283 2 3.642 20.412 0.047
微波时间 30.069 2 15.034 84.269 0.012
维生素C浓度 5.669 2 2.835 15.889 0.059
误差 0.357 2 0.178
量对微波处理灭酶的影响不明显，由于微波的均一性和及时性特点，可实现籽瓜整瓜的快速均匀灭酶。
籽瓜样品预先在质量浓度为0.15%的维生素C溶液中浸泡30 min，然后在微波功率为600 W的条件下处理3 min，可以有效抑制籽瓜中多酚氧化酶的活性，减少褐变的发生。
参考文献：
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丁二磺酸腺苷蛋氨酸冻干工艺研究 篇7
关键词：丁二磺酸腺苷蛋氨酸,冻干工艺
腺苷蛋氨酸(简称SAM)是存在于机体细胞中的一种生理活性物质,参与诸多生化反应(如转甲基、转氨丙基、转硫基等),是半胱氨酸、牛磺酸、谷胱甘肽、辅酶A等重要物质的前体物质,对机体正常细胞的成活及功能具有重要的意义。SAM可以治疗多种疾病:①SAM具有抗炎、缓解疼痛和帮助组织再生的功能,对治疗关节炎颇有疗效[1,2]。SAM与非类固醇类抗炎药相比,既不抑制前列腺素合成,也不会损伤胃肠道,副作用小,见效快。②SAM可以治疗抑郁症[3]。大量研究表明SAM可以提高脑内5’-羟色氨和5’-羟吲哚乙酸的水平,可以有效治疗各种抑郁症,尤其是产后抑郁症。早在20世纪80年代,SAM在欧洲首先被推荐为抗抑郁症的精神疾病药物。③SAM对各种原因引起的慢性肝炎、原发胆汁肝硬化等各种原因引起的肝功能异常有良好的疗效[4]。有报道表明SAM对60%的慢性肝病患者有效,对急性肝炎及慢性肝病患者伴胆汁郁积病例的生化指标和临床症状改善显著,而且安全性和耐受性也好,是目前临床上治疗肝病的理想药物之一。
SAM自1975年起就已经使用于德国、意大利、俄罗斯以及西班牙等国家。美国雅培制药公司生产的丁二磺酸腺苷蛋氨酸,英文商品名Transmetil,中文商品名为“思美泰”已于1997年进入中国市场。上市剂型为丁二磺酸腺苷蛋氨酸肠溶片和注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸,注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸规格为0.5 g(以腺苷蛋氨酸计)。
1 材料与方法
1.1 主要材料与设备
丁二磺酸腺苷蛋氨酸:开平牵牛生化制药有限公司生产。
真空冷冻干燥机(Lyo-5):上海东富龙科技有限公司生产。
1.2 样品的制备
蛋氨酸与三磷酸腺苷二钠等底物在腺苷蛋氨酸合成酶的作用下生成腺苷蛋氨酸,然后经提取,纯化,成盐,浓缩成含丁二磺酸腺苷蛋氨酸为15%~25%的浓缩液;或直接称取一定量的丁二磺酸腺苷蛋氨酸,用注射用水溶解成含丁二磺酸腺苷蛋氨酸为15%~25%的溶液;除菌过滤后即得。
1.3 冷冻干燥方法
将制备好的样品分装于西林瓶中,半加塞,放在冷冻干燥机搁板上,启动压缩机对前箱样品按预定的程序进行预冻,并保证冻结完全,然后启动真空系统抽真空,并在10~30 Pa真空度下加热使样品升华干燥,然后解吸干燥使样品水分含量小于2.5%。
1.4 产品溶液共晶点的测定[5]
溶液共晶点采用简易的电阻法来测量,用二根粗细适当而又互相绝缘的铜丝插入盛有样品溶液的容器中,作为电极。在铜电极附件插入一支温度计,然后放入-80 ℃的冰箱中冷冻至完全冻结,取出,将电极接入万用电表电阻档,缓慢对样品进行升温,记录升温过程中的样品温度及对应的电阻值。开始电阻很大,近无限大,当样品温度升高后,电阻值开始变小,当升到某一温度时,电阻值大幅下降,并接近于0值,这时对应的温度即为样品的共晶点温度。
1.5 冻干产品质量的评价
① 目检外观应为白色疏松块状物,表面平整,与西林瓶直径等大,无萎缩。
② 水分按卡尔费休法测定,(S,S)异构体含量按HPLC方法测定,参见中国药典[6]。产品水分不得大于2.5%,在冻干过程中(S,S)异构体会转变为(R,S)异构体,变化值不应大于2.5%。
2 结果与分析
2.1 产品溶液共晶点的测定
冻结后升温过程的电阻值如表1,其电阻值与温度的关系曲线如图1。
度为横座标,电阻值为纵座标作温度电阻值关系曲线,如图1。
从图1中电阻变化转折点可以看出,丁二磺酸腺苷蛋氨酸溶液的共晶点约为-23 ℃。本方法是采用万用表读数,灵敏度不够,所测共晶点可能存在较大误差,但仍有一定的参考价值。
2.2 西林瓶及配液浓度的选择
本品规格为500 mg腺苷蛋氨酸,合丁二磺酸腺苷蛋氨酸1 000 mg 左右。配制15%、20%、25%丁二磺酸腺苷蛋氨酸溶液,分别灌装在10 mL、15 mL、20 mL的西林瓶中,每瓶含丁二磺酸钠均为1 000 mg,进行冻干试验,冻干周期40 h左右。结果见表2。
*异构体变化值是指配制溶液中(S,S)异构体与冻干产品的(S,S)异构体含量差值,下同。
从表2的结果可能看出,冻干效果与瓶中的液面高度有直接的关系,超过11 mm高度的冻干粉外观都有不同程度的萎缩,水分均大于2.5%,不合格;而小于10 mm高度的冻干粉表面均平整,水分小于2.5%,符合质量要求;各种规格的异构体变化没有明显差异。综上结果,液面高度小于10 mm的装量,冻干效果较佳,我们可选择15 mL西林瓶,配25%的溶液进行分装冻干,也可选用20 mL西林瓶,配20%~25%的溶液进行冻干。但15 mL西林瓶外径为26 mm,每平方米冻干机可放1 479瓶,而20 mL的西林瓶外径为28 mm,每平方米冻干机只可放1 275瓶,比15 mL西林瓶少200瓶,因此选用15 mL瓶具有更高的冻干效率。
2.3 预冻温度及预冻程序的选择
将丁二磺酸腺苷蛋氨酸灌装在15 mL西林瓶中,放入冻干机中,分别冻至-30 ℃,-35 ℃,-40℃,-50 ℃并保持0.5 h,然后取出样品,碎瓶,切开冻结物,观察冻结情况,结果如表3。
从表3可以看出,选择-50 ℃为预冻温度更能保证产品的冻结。
本品含有较多的游离丁二磺酸,我们发现在冻结过程中易在液体表面形成一层薄膜,对升华过程有较大的影响。为消除或减少薄膜的影响,我们采用反复冻熔的方法对样品进行预冻,并完成冻干程序,结果如表4。
程序1:将样品直接预冻到-50 ℃;
程序2:将样品降温至-40 ℃,然后升温到-5 ℃,保温0.5 h,然后降温至-50 ℃;
程序3:将样品降温至-40 ℃,然后升温到-10 ℃,保温0.5 h,然后降温至-50 ℃;
程序4:将样品降温至-40 ℃,然后升温到-15 ℃,保温0.5 h,然后降温至-50 ℃。
从表4结果可以看出,回温至-10 ℃左右较合适,回升温度太高,产品熔化太多,与直接降温效果相同,起不到反复冻融效果;而回温太低,不能使冰晶产生变化,也达不到反复冻融的效果,因此预冻程序选择为:将样品降温至-40 ℃,然后升温到-10 ℃,保温0.5 h,然后降温至-50℃
2.4 升华温度的选择
升华温度是冻干过程中一个非常重要的参数,选择不同的温度作为丁二磺酸腺苷蛋氨酸的升华温度,完成冻干程序(40 h),依法检查相关项目,结果见表5。
从表5结果可以看出,在温度高于-20 ℃条件进行升华,产品会出现萎缩现象,水分不合格,升华温度越高,产品萎缩越严重。在温度低于-25 ℃条件下升华,产品不出现萎缩现象,并且各项目均合格,但温度过低进行升华,会增加冻干成本,因此本产品升华温度选择为-25 ℃。
2.5 升华真空度的选择
升华真空度是冻干过程中另一个重要的参数,选择不同的真空度作为丁二磺酸腺苷蛋氨酸的升华真空度,完成冻干程序(40 h),依法检查相关项目,结果见表6。
从表6结果可以看出,升华真空度小于30 Pa,产品外观好,不萎缩,但在5 Pa以下即极限真空条件下升华,干燥速度较慢,在规定的冻干周期内,水分不合格;而在高于50 Pa条件下升华,产品会出现不同程度萎缩现象,冻干过程冷阱温度也较高;控制升华真空度为10~30 Pa,产品外观好,水分合格,因此选择升华真空度为10~30 Pa。
2.6 解吸干燥温度的选择
丁二磺酸腺苷蛋氨酸是热敏性物质,选择合适的解吸干燥温度是非常重要的,选择不同的温度作为丁二磺酸腺苷蛋氨酸的解吸干燥温度,完成冻干程序(40 h),依法检查相关项目,结果见表7。
从表7结果可以看出,解吸干燥温度对产品外观没有影响,升高解吸干燥温度能将产品水分控制得更低,解吸干燥温度小于30 ℃,在规定的冻干周期内,水分合格,需延长解吸干燥时间;解吸干燥为40 ℃时,产品异构体变化较大,有可能造成异构体不合格;解吸干燥温度选为30~35 ℃合适。
3 结论
通过对丁二磺酸腺苷蛋氨酸冻干工艺的研究,确定丁二磺酸腺苷蛋氨酸的最适冻干工艺为:选用15 mL西林瓶,配液浓度为25%,每瓶灌装4 mL;预冻程序采用:将样品降温至-40 ℃,然后升温到-10 ℃,保温0.5 h,然后再降温至-50 ℃;升华真空度控制在10~30 Pa之间;升华温度选择-25 ℃; 解吸干燥温度选为30~35 ℃,总冻干时间为40 h。按此冻干工艺制备的丁二磺酸腺苷蛋氨酸外观为白色疏松块状物,表面平整,水分小于2.5%,异构体含量变化很小,产品质量符合国家标准。
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鱼类消化酶研究及存在的问题分析 篇8
1 鱼类消化酶研究进展
1.1 鱼类食性和消化酶的关系
鱼类的食性与其它动物一样, 常因种类不同而异, 即使是同一种类, 在不同的环境条件或不同的生长发育阶段也不尽相同, 但它们的食性总是与其本身的消化酶组成状况密切相关。Hofer等[1]研究了6种鲤科鱼类和2种丽科鱼类食性与消化酶的关系, Agrawal[2]比较了肉食性、杂食性、草食性鱼类的淀粉酶和脂肪酶的活性差异;黄耀桐等[3]研究了草鱼肠道和肝胰脏蛋白酶活性与饲料的关系;这些研究显示:一般说来在蛋白酶活性比较中, 肉食性鱼类最高, 杂食性鱼类次之, 而草食性鱼类最低;而淀粉酶活性比较, 草食性鱼类最高, 杂食性鱼类次之, 而肉食性鱼类最低;鱼类脂肪酶活性与食性的关系与蛋白酶活性与食性的关系相类似, 肉食性鱼类明显高于杂食性鱼类, 而杂食性鱼类高于草食性鱼类。可见鱼类的食性与消化酶的组成有着密切的关系, 而且消化酶活力大小变化程度与食物组成的变化程度也是相关的, 这是鱼类本身对所处生态环境的一种适应, 是长期自然选择的结果。
1.2 环境因素与消化酶的关系
消化酶是一类高效的生物催化剂, 但它的催化作用易受外界环境因素的影响, 影响鱼类消化酶活性的环境因素主要有水温、水体中的金属离子等。鱼类属变温动物, 环境温度变化将直接影响鱼体内的生理生化过程。因此, 水温对于鱼类的消化酶活性具有重要的作用。Hofer等[4]研究了拟鲤、红眼鱼的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的季节变化;陈品健等[5]研究了真鲷幼鱼消化酶活性与饲养水温的关系;从他们的研究中可以看出水温对于鱼的消化酶活性的影响是巨大的。而消化酶活性的强弱, 又直接影响到鱼类对于营养物质的消化吸收, 从而对鱼类的生长起着至关重要的作用。在鱼类生活的水体中还存在着许多化学物质, 如各种金属离子等。这些物质在浓度较低时一般是不会对鱼类的消化酶活性产生影响的, 但在人工养殖环境中, 这些成份的含量变化是比较大的;此时, 它们可能会对鱼类的消化酶活性产生影响。鱼类的消化酶活性易受到其所生活的环境中的各种理化因子的作用, 特别是受生长环境的水温的影响尤为突出, 但其中确切的机理目前并不是很清楚。
1.3 鱼类消化酶酶促反应与酶动力学等方面的研究
鱼类酶动力学是研究酶催化反应速度的问题, 它主要是研究温度、p H值、酶浓度、离子浓度等因素对酶促反应速度的影响;酶的蛋白质本性决定了温度和p H值是酶促反应的两个最重要的因素。因此, 对于鱼类酶动力学的研究报导, 大多也是关于温度、p H值对酶反应速度的影响。这方面的研究, 在鱼类的消化酶研究方面占有的比例最大。Bitterlich等[6]研究了鳙鱼和鲢鱼消化酶酶促反应的最适p H值;陈品健等[5]研究了真鲷幼鱼消化酶活性与温度的关系;这些研究显示:对于不同的鱼类、或是同种鱼的不同器官、或是同一器官里不同的消化酶具有不同的最适温度和最适p H值, 同时最适温度和最适p H值随不同的反应条件 (时间、底物浓度等) 而有所不同;并且从酶促反应中的得出的对于消化酶活性的最适温度和最适p H值与鱼类所生活的水温和其本身消化道的p H值常常是不一致的, 甚至有时有很大的差别。对于这种现象, 其内在机理还有待于科学家进一步的研究探索。因此, 目前关于鱼类消化酶活性的最适温度和最适p H值是相对的。
1.4 外源消化酶、饲料和饲料添加剂对鱼类消化的促进作用
外源消化酶主要是指水体中天然饵料所含有的消化酶和经微生物发酵提取后加入配合饵料中的消化酶。Das[7]在研究草鱼的消化酶时, 发现并阐述了外源性纤维素酶和细菌产生的纤维素酶的作用;同时他还发现草鱼消化酶的形式和活力依赖于其所摄取的饵料种类;汤伏生等对鲤鱼肠道细菌及其淀粉酶对宿主消化的影响进行了研究, 发现细菌淀粉酶对鲤鱼消化淀粉起到了明显的促进作用;邹师哲等对饲料中蛋白质、脂肪、碳水化合物对鲤消化酶的影响影响研究, 结果表明饲料中的营养成分会对鲤的各种消化酶的活性产生明显的影响;由这些研究可知, 当鱼类本身分泌的消化酶还不能够满足鱼体快速生长发育的需要, 则会造成饲料系数较高, 饲料浪费, 甚至造成水体严重污染。此时, 可在饲料中添加适量外源酶, 将会促进鱼类生长发育, 提高饲料的利用率, 从而减轻水体的有机污染。另外, 依据这些研究, 我们可以根据不同的鱼类, 在它们不同的生长发育阶段使用不同的饲料成分及添加剂, 从而使得鱼类能产生较高的生长率而使养殖能获得较好的经济效益。
1.5 鱼类消化酶在个体发育中的发生和演变
研究分析鱼类各个发育阶段的过程中消化酶活力的出现与变化规律, 有助于了解各阶段的营养需求, 以及各期鱼体如何利用饵料, 使我们能进行科学的投饵。Hofer等[8]研究了拟鲤胰蛋白酶、淀粉酶在各发育阶段的变化, 研究结果表明, 随着肠道的发育完善, 消化酶的种类和活力也在发生着变化;白东清等对不同生长阶段鲤肠、肝胰脏的蛋白酶活性进行了研究, 得出鲤鱼蛋白酶活性依生长阶段及部位的不同而不同;蔡克瑕等研究了花尾胡椒鲷仔稚鱼期消化酶活性的变化, 发现其蛋白酶比活力在仔稚鱼转变期和稚鱼向幼鱼转变时明显下降, 淀粉酶活性随日龄增加呈下降趋势;从他们的这些研究中我们可以发现鱼类的各种消化酶的发生并不是完全同步的, 而是随着个体的生长发育在进行着逐步的演变和完善;在这个过程中, 其各种消化酶的特性也在发生着变化。因此, 在生长实践中, 我们要根据鱼类生长发育的不同时期, 研制、投喂相应的人工配合饵料, 以获得较好的效果。
1.6 鱼类消化酶在体内的分布状况
鱼的体内是否存消化酶, 生物学家主要是采用测定其消化酶活力的方法来确定的。李瑾等[9]研究了中华鲟消化酶活性的分布, 结果表明:不同的消化酶, 在体内各个消化器官的分布是不一样的。通过这些研究可以清楚地了解鱼类肠道是何部位消化吸收何种营养成分, 同时也为研究消化酶的分泌、贮存机制提供了依据。
1.7 鱼类消化酶的分离、纯化
消化酶的分离、纯化对于了解其特性是极其重要的;只有获得较高纯度的消化酶, 在此基础上产生的研究结果才能更准确地代表了它的特性。但是相对而言, 对各种消化酶的分离、纯化, 国内外的研究报导相对较少;并且这些研究主要是集中在蛋白酶的分离纯化上的。已发表的文献主要有陈清西等[10]用硫酸铵分级分离, 再经透析、离心的方法对鲨鱼的肠道蛋白酶进行了分离, 然后再用CM-Cellulose柱层析法纯化并对其性质进行了初步的研究;江信红等对黄鳝的肠道蛋白酶进行分离纯化。
2 消化酶研究中存在的问题分析
虽然鱼类消化酶的研究取得了很多的成果, 但在其研究过程中还有很多的问题和不足, 这主要有以下几个方面:
2.1 消化酶的最佳反应条件与实际生存环境存在较大差别
从桂明远、陈品健等发表的研究报导可知:鱼类的消化酶活力的最适反应温度与鱼类所栖息的水体环境温度相比较, 均高于其生存的水体环境温度, 其内在的确切原因还有待进一步研究和探讨。但作者认为, 这有可能是由于实验本身的设计造成的。目前已发表的研究报导, 不管是哪种关于消化酶活性的定义, 从这些定义中我们可发现, 这些消化酶活力的测定是以活体组织或是蛋白质来表示的, 而这种实验, 它的消化酶纯度是比较低的, 因此, 当样本中的消化酶含量较高时, 这时单纯从消化酶来说虽未达到其最适的温度, 但它的催化作用也能达到较佳的效果。另外, 生物的新陈代谢过程是一个很复杂的过程, 它的最佳进行是需要各个方面统一协调地进行。鱼类生长的水温, 对于消化酶来说虽不是最佳的, 但由于长期的适应环境, 这个温度对于鱼整个新陈代谢来说却是最佳的, 因此这才导致了鱼类的消化酶在实验室得出的最佳反应条件与其实际生存的环境条件存在较大的差别。
2.2 消化酶活性的定义及测定方法比较混乱
对于消化酶活性的定义及测定方法比较混乱, 至今没有统一, 不同的学者以及不同的试验条件所采用的标准的定义往往不相同;而通过以往的研究可知消化酶的活性比较是需要在特定的条件下才有意义;由于鱼类的种类、生长发育各阶段不同, 消化酶组成和活性也不同, 这样给借鉴和比较带来很多不便, 造成不必要的重复和浪费。而且, 在未分离纯化的条件下, 不管是哪一种消化酶活性的定义, 人们所研究的对象并不全是消化酶, 而是含有大量其它成分的消化酶混合物, 而它们对于实验结果的影响我们并不清楚;因此, 这些实验所取得的结果, 在实验样本较少的情况下, 可能会产生比较大的误差, 因此, 对于消化酶活性的研究, 不管是采用哪一种消化酶活性的定义来进行研究, 都应当选取比较大的样本。否则, 因其它因素的干扰, 会使所取得的实验结果与实际情况存在较大的误差, 甚至可能产生与实际情况相反的结论。
2.3 消化酶的分离纯化
消化酶的分离纯化, 是目前研究较为薄弱的环节, 消化酶主要包括了蛋白酶, 淀粉酶, 脂肪酶等, 而目前所取得的成果, 由于酶的易失活的生物特性, 因此主要是集中在蛋白酶 (分离纯化蛋白酶原) 方面的, 而对于其它种类消化酶的分离纯化研究则报导非常少;这对于全面了解消化酶的特性是一个很大的欠缺, 有关这方面的研究应当是今后消化酶研究的重要补充。
3 小结
随着鱼类消化酶研究的不断深入, 对鱼类消化酶的组成和活力及与外界因素的关系越加清楚;相关的消化酶的研究结果在生产实践中发挥了巨大的作用。如在饲料中添加外源蛋白酶和淀粉酶等复合酶制剂, 可以弥补内源酶的不足, 提高蛋白质和淀粉的利用率, 达到增产的作用;同时又能减少鱼类粪便中的氮、磷排泄量, 减轻水体有机负荷, 保护水质。因此, 对鱼类消化酶的进一步研究, 将会越来越受到人们的重视, 在养殖生产上具有广阔的应用前景。另外, 生物学家在对消化酶进行研究时, 大多只是注重实验前和实验后的比较结果, 而对于实验过程中鱼体的代谢、消化机能等生理的动态变化则研究较少, 因而对于所取得的实验结果很难给予很科学的解释。从这些研究报道中可以看出, 许多生物学家所进行的有关消化酶活性的比较研究, 确切地说, 他们的研究对象, 并不全是消化酶, 而是含有大量其它成分的消化酶混合物, 而它们对于实验结果的影响我们并不清楚;因此, 对于生物学家所取得的实验结果在生产实践中的指导作用还有待于进一步的验证。
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腺苷酸环化酶 篇9
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Hitachi-F4500荧光分光光度计 (日本日立公司) ;Shimadzu UV-2450紫外-可见分光光度计 (日本岛津仪器公司) ;Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪 (日本岛津仪器公司) ;Glamour-1800全自动生化分析仪 (美国MD仪器公司) ;PB-20 (PB-S) 型精密酸度计 (Sartorius Co.Ltd) 。
1.2 试剂
腺苷 (99%, AR, 美国Amresco公司) 标准储备液:准确称取0.0267 g标准品, 用灭菌双蒸水溶于100.0 ml容量瓶中, 并定容至刻度, 此浓度为1.0 mmol/L;1.0μmol/L腺苷标准工作液:准确吸取1.0 ml腺苷标准储备液于1000.0 ml容量瓶中加水定容至刻度;鸟苷、胞苷和尿苷溶液 (0.9×10-6mol/L) ;DNA制品均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成:DNA1 (腺苷适体) :5’-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT-FAM-3’;DNA2:5’-HS-ACC TTC CTC CG-3’;DNA3:5’-DABCYL-ACC TTC CTC CG-3’;氯金酸 (HAu Cl4·4H2O) , 柠檬酸三钠均购自国药集团化学试剂有限公司;PBS缓冲液 (0.1 mol/L, p H=7.4) ;Tris缓冲液 (20 mmol/L, p H=7.4) , 其中含1 mmol/L Mg Cl2, 0.15 mol/L Na Cl和5 mmol/L KCl;实验用水为灭菌双蒸水 (电阻为18 MΩ) 。
2 方法
2.1 制备金纳米粒子
采用经典的Frens法[7]制备金纳米粒子:100 ml 0.1 g/L的氯金酸加热至沸腾, 迅速加入3.5 ml 10 g/L柠檬酸三钠, 加热搅拌, 15 min后移去热源, 冷却至室温。
2.2 双链体准备及与金纳米粒子的偶联
将DNA1与DNA 2/3 (100μmol/L) 按1∶4的比例混合, 在0.1 mol/L Na Cl, 4 mmol/L Mg Cl2条件下, 94℃变性2 min, 55℃复性2 min, 然后置于4℃冰箱中过夜, 使DNA1复性完全。将复性好的双链体与上一步制备的金纳米粒子混合, 在37℃水浴条件下反应8 h, 加入PBS缓冲液, 37℃水浴24 h, 然后于12 000 r/min离心15 min, 除去上清液, 再加PBS缓冲液重新混悬, 如此离心-重悬清洗两次, 以除去剩余的DNA2和未结合的双链体, 最后重悬于灭菌双蒸水中待用。
2.3 腺苷检测
在2 ml的EP管中, 加入DNA1-GNPs复合物使腺苷适体 (DNA1) 的终浓度为1μmol/L, 及含150 mmol/L Na Cl, 1 mmol/L Mg Cl2和5 mmol/L KCl的Tris缓冲液 (20 mmol/L, p H=7.4) , 再加入不同体积的腺苷标准液, 最后加入灭菌双蒸水使总体积为250μl。置于45℃水浴箱中5 min, 冷却至室温, 测各管的荧光强度值。
3 实验原理
实验原理如图1所示, DNA1为腺苷适体序列[8], 在其3’端修饰了荧光基团 (6-FAM) 。DNA2为与DNA1完全互补的11个寡核苷酸序列, 其5’端修饰了巯基。DNA3的序列与DNA2相同, 只是其5’端修饰的是猝灭基团 (DABCYL) , 用来与金纳米粒子的猝灭效率作比较。当DNA1与DNA2复性之后, 荧光强度变化很小, 而当与金纳米粒子偶联之后, 金纳米粒子猝灭了荧光素的荧光, 荧光强度变得很微弱。体系中加入腺苷之后, 荧光强度增加, 并与腺苷的浓度呈良好的线性关系。当DNA1与DNA3复性之后, 荧光即变得很微弱。本文比较了金纳米粒子和生物分析中的常用猝灭基团DABCYL对6-FAM的荧光猝灭效率, 并依据金纳米粒子猝灭荧光效率更高的特点建立了更灵敏的腺苷检测新方法。
4 结果
4.1 光谱特征
图2为金纳米粒子的吸收光谱和6-FAM的荧光光谱图。根据Förster荧光共振能量转移原理 (FRET) [2,3,9], 如果两个荧光团相距在1~10 nm, 且一个荧光团 (供体) 的发射光谱与另一个荧光团 (受体) 的吸收光谱有重叠, 当供体被入射光激发时, 可通过偶极-偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受体分子, 供体分子衰变到基态而不发射荧光, 受体分子由基态跃迁到激发态, 再衰变到基态同时发射荧光。而如果受体荧光量子产率为零, 则发生能量转移荧光熄灭。由图可知, 6-羧基荧光素 (6-FAM, 供体) 的最大发射峰在520.0 nm (虚线部分) , 而金纳米粒子 (受体) 的吸收光谱峰位于518.0 nm (实线部分) , 供体发射光谱与受体吸收光谱有足够的重叠。
图3-A为DNA1与DNA2所形成的双链体偶联金纳米粒子之后未加入腺苷的三维荧光图。由图可知, 体系在520.0 nm的荧光强度非常微弱, 因为偶联的金纳米粒子猝灭了6-FAM的荧光。而当体系中加入腺苷之后, 腺苷与适体的亲和力足以破坏双链体结构, 从而形成腺苷-适体复合物, DNA2游离出来, 体系的荧光显著增强 (图3-B) 。
4.2 体系检测条件的优化
4.2.1 反应温度和时间
温度和反应时间对本实验腺苷检测体系的影响较大, 因此实验研究了30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等五个温度下加入9.0×10-7mol/L腺苷, 体系的荧光达到最大值所需要的时间。温度越高体系的荧光值达到最大所需要的时间越短。为避免过高的温度对适体及腺苷的影响因素, 本实验选择45℃, 加热5 min作为反应的孵育温度和时间。
4.2.2 p H值优化
体系的p H值对腺苷检测的影响也比较大, 因此本实验选择了20 mmol/L的磷酸盐缓冲液和20 mmol/L的Tris-HCl缓冲液优化体系的p H值。当体系的p H值在7.0~8.0时, 体系的荧光强度较大且相对稳定, p H值7.2~7.6时体系的荧光强度最大, p H值增加或者减少都会导致体系的荧光强度显著降低。造成这种现象的原因可能是因为腺苷适体在筛选时严格的筛选条件决定的。因此, 本实验选择p H值7.4的Tris-HCl缓冲液调节体系的酸度。
4.3 腺苷检测体系的选择性
在确定的最佳实验条件下, 本实验还考察了其他核苷及一般尿样中可能存在的共存离子或其他物质对测定腺苷的影响, 详见表1。干扰物质的选择参照文献[10]配置。由表1可见, 在干扰物质存在下, 腺苷检测结果均在误差允许的范围内, 即本方法的选择性良好, 这一方面来源于腺苷适体筛选条件的严格性[11], 另一方面来源于腺苷-适体与适体-双链体的竞争性结合机制。
4.4 腺苷测定的线性范围、检出限和精密度
在确定的最佳实验条件下腺苷浓度为2.0×10-8~1.8×10-6mol/L时与体系△F呈良好的线性关系 (图4) 。测定腺苷的线性回归方程为△F=-6.5+674.33 c (mol/L) , 相关系数为r=0.9961。根据IUPAC[12]定义检出限:LOD=3Sb/m, 即3倍空白标准偏差Sb除以工作曲线的斜率 (灵敏度m) 。经计算, 腺苷的检出限为6.0×10-9mol/L。分别把腺苷标准溶液加入选定的干扰物质混合溶液中, 使低、中、高终浓度分别为5.0×10-8mol/L, 5.0×10-7mol/L和1.5×10-6mol/L, 进行6次平行测定。表1显示, 相对标准偏差分别为5.25%、3.64%、5.36%;腺苷测定的回收率分别为97.6%、102.1%、105.8%, 结果充分表明本方法精密度良好。
注:1.DNA-GNPs;2-6.DNA-GNPs-AD;cAD (×10-6mol/L) :0.3、0.6、0.9、1.2、1.5
4.5 样品测定
在确定的实验条件下, 用新建立的方法检测了3例肺癌术前病人的尿腺苷。尿肌酐值采用临床自动生化分析仪 (Glamour-1800, 美国) 测定, 测定方法为苦味酸法 (Jaffe’s method[13]) , 见表2。测定出的值与高效液相色谱法作比较, 用t检验分析所得数据, 在95%置信水平没有超过理论值 (t0.05/2, 2=4.303) , 表明新方法与高效液相色谱法之间差异无统计学意义。
5 讨论
传统的荧光标记共振能量转移体系在DNA检测方面, 都采用荧光有机染料作为能量供受体。本文基于核酸适体结构开关偶联6-羧基荧光素和金纳米粒子作为荧光能量供受体对, 建立了荧光共振能量转移检测腺苷新方法, 并应用于实际尿样中腺苷的检测, 结果准确可靠。新方法的灵敏度优于传统的基于核酸适体信标荧光法[6]。利用金纳米粒子作为荧光受体使荧光猝灭效率更高, 也提高了荧光共振能量转移检测方法的灵敏度。本实验初步解决了适体分子信标检测技术能量转移效率偏低的问题, 促进建立更灵敏的新检测方法。
摘要：目的:利用荧光共振能量转移原理和适体分子信标探针技术开发腺苷检测体系。方法:以金纳米粒子作为荧光共振能量转移受体。结果:在最适条件下, 腺苷浓度在2.0×10-8~1.8×10-6 mol/L范围内线性关系良好 (r=0.9961) , 腺苷的检出限为6.0×10-9 mol/L, 腺苷测定的回收率分别为97.6%、102.1%、105.8%。结论:将新方法应用于实际尿样中腺苷的检测, 与高效液相色谱法比较差异无统计学意义。
腺苷酸环化酶 篇10
关键词：脂肪氧化酶,比色法,薄层等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳法
大豆制品在发达国家越来越被重视, 具有很大的市场潜力。然而大豆油的高度不稳定性以及大豆蛋白产品的强烈豆腥味, 影响对大豆加工和利用。许多研究发现, 这种不稳定性和豆腥味是由于亚麻酸等不饱和脂肪酸的氧化产生的短链醛、酮等引起的, 而控制该氧化反应的主要是三种脂肪氧化酶, 即:Lox1, Lox2, Lox3。因此排除三种脂肪氧化酶的影响及降低亚麻酸含量, 可以大大降低豆腥味, 提高大豆产品的耐贮性和食味品质, 从而进一步拓宽我国大豆产品市场, 加快我国特用大豆出口创汇。
育种工作不仅要求后代不含几种脂肪氧化酶, 而且农艺性状要符合要求。要使这些性状综合到某一个体中, 需要相当大的群体, 要鉴定的量成千上万。因此, 找到一种简单明了的鉴定方法将是脂肪氧化酶基因缺失材料在育种上迅速得到应用的关键。
本研究的目的是对测定缺失脂肪氧化酶的方法进行比较, 寻找一种行之有效并廉价的方法, 更快速更准确地测定脂肪氧化酶, 同时筛选出农艺性状优良, 缺失脂肪氧化酶的稳定新品系, 提高大豆的氧化稳定性, 大大降低大豆制品的腥味, 以改善大豆产品的营养品质和食味品质。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究利用脂肪氧化酶缺失品系Century验证反应的准确性, Century为不缺失材料, Century1、Century2和Century3分别缺失Lox1、Lox2和Lox3, Century1, 3、Century1, 2和Century2, 3则分别缺失Lox1, 3、Lox1, 2、和Lox2, 3;利用当地品种合丰25、东农42、东农46和东农47作为不缺失对照。检测自国外引入的品系L-2、L-5、L-11、L14和L15是否缺失脂肪氧化酶基因。
利用缺失的材料与合丰25杂交, 对其后代进行缺失体检测和农艺性状分析。
1.2 试验方法
1.2.1 比色法检测脂肪氧化酶缺失体
采用Suda等的方法, 通过三个比色实验检测每种酶活性的缺失来选择三个隐性脂肪氧化酶基因型。实验利用种子中均匀的豆粉并用底物染料溶液去筛选这些脂肪氧化酶。L-1、L-2、L-3 (分别鉴定Lox1、Lox2、Lox3) 实验的特异性是以测试溶液的pH为基础的, 在相对应pH条件下每种酶拥有最适活性。L-1、L-2和L-3的最适pH分别为9.0、6.5和7.0。实验的底物是亚油酸, 染料被用来检测脂肪氧化酶的氧化反应。L-1、L-2实验的染料是亚甲蓝, L-3的是β-胡萝卜素, L-3对亚油酸和β-胡萝卜素的氧化作用比L-1和L-2的活性更强, 这能分别鉴别出具有相似的pH范围的L-2和L-3的不同。对于每个试验, 如果酶不缺失, 则亚油酸被氧化, L-1和L-2实验染料被还原, L-3实验染料被氧化, 测试溶液被漂白至澄清。如果由于隐性基因使酶缺失, 则无反应发生, 测试溶液不变色。
实验流程:取2.5～5.0 mg豆粉放到3个干净的试管中, 加入0.5 mL超纯水, 静置3～10 min, 分别加入L-1、L-2、L-3反应溶液, L-1于3 min后观察, L-2于5 min后观察, L-3于1 h后观察, 脂肪氧化酶缺失的样本不褪色 (Lox1缺失则L-1溶液仍保持兰色, Lox2缺失则L-2溶液仍保持兰色, Lox3缺失则L-3溶液保持黄色不变) , 脂肪氧化酶不缺失则溶液褪色。
1.2.2 薄层等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳 (IEF-PAGE) 检测脂肪氧化酶缺失体
(1) 样品制备:15 g豆粉加入150～200 μL提取缓冲液 (0.05MTris, 0.02 mol·L-1CaCl2·2H2O或无水CaCl2溶液, pH8.0) , 震荡均匀, 放置4℃提取2～4 h, 期间剧烈震荡多次, 4℃ 12 000 r·min-1离心20 min, 取上清备用。 (2) 制胶:制胶前在一块玻璃板涂上2%Repel;在另一块玻璃板涂上0.5%Binding Silane, 然后晾干。把胶用注射器沿灌胶口边沿灌进, 待胶流动至底部边沿。1 h后胶凝备用。 (3) 预电泳:加电极条 (正极0.5 mol·L-1 H3PO4, 负极0.5 mol·L-1 NaOH) , 预电泳30 min (2 000V, 50 mA, 4W) 。 (4) 点样:取8 μL样品加在凝胶上, 2 000 V、50 mA、4W电泳2 h。电泳结束后用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液 (pH7.8～8.0) 缓冲5 min。 (5) 酶染:29℃用酶染液40～60 min。 (6) 缓冲、洗脱:各5 min。 (7) 染色:用稀释的考马斯亮兰染液65℃染色15 min。 (8) 洗脱至酶带清晰, 晾干, 照相。 (9) 溶液制备:①胶溶液 Acr+ Bis (21.9%, 0.9%) 5.25 mL、水 19 mL、Ampholine (pH 5～8) 1 mL、APS (2%) 200 μL、TEMED 400 μL。②酶染液:a邻联茴香胺38 mg+18 mL无水酒精, b亚油酸0.3 mL+1.2 mL无水酒精+1.2 mL吐温20, c使用前混合a、b液, 用磷酸缓冲液定容至180 mL, ③染色液3.5 g考马斯亮兰溶于300 mL脱色液中, 30～40℃时边加热边搅拌, 使其充分溶解后置于4℃冰箱中保存 (棕色细口瓶中) , 使用前8倍稀释。
2 结果与分析
2.1 比色法鉴定脂肪氧化酶缺失体
如图1所示, 本研究尝试用显色反应鉴定脂肪氧化酶 (Lox) , 脂肪氧化酶缺失的材料反应溶液不褪色, 与对照颜色相同 (即:A管保持兰色, B管保持兰色, C管保持黄色) , 反之, 脂肪氧化酶不缺失的材料, 则颜色完全褪去。
利用脂肪氧化酶缺失品系Century来验证此反应的准确性, Century为不缺失材料, Century1、Century2和Century3分别缺失Lox1、Lox2和Lox3, Century1, 3、Century1, 2和Century2, 3则分别缺失Lox1, 3、Lox1, 2、和Lox2, 3。得到结果为检测Lox1的实验 (L-1) 最快速、最稳定、最便宜;检测Lox3的实验 (L-3) 反应最慢, 最不稳定。同时, 利用当地品种合丰25、东农42、东农46和东农47作为不缺失对照, 结果表现为褪色, 所以均不缺失脂肪氧化酶;自国外引入的L-2、L-5和L-11缺失Lox1和Lox2;L-14和L-15缺失Lox2。
2.2 等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳 (IEF-PAGE) 鉴定脂肪氧化酶缺失体
在本实验条件下, 脂肪氧化酶有4种电泳类型 (见图2) :Lox1, Lox2, Lox3a和Lox3b, 这与Hildebrand和丁安林、傅翠真等的报道相符。结果表明, Century标样不缺失脂肪氧化酶基因, 合丰25不缺失脂肪氧化酶基因, 而L-14缺失Lox2。
L-1:Lox1, L-2:Lox2, L-3a、L-3b:Lox3的两个亚基, 1:Century标样, 2、3、4、5、6:F2后代个体, 7:L-14 (lx2) , 8:合丰25
本研究以不缺失脂肪氧化酶合丰25作为母本, 而缺失Lox2的品系L-14作为父本, 对二者杂交后自交所得F2种子进行检测。结果表明, F2群体中后代缺失体的分离比率约为3∶1, 符合单基因控制的质量性状显性分离规律。如图2所示, 其中F2代个体3、4、5缺失Lox2, 与父本一致;2、6不缺失Lox, 与母本一致。
2.3 优良缺失脂肪氧化酶基因品系的鉴定
本研究鉴定了F2群体的脂肪氧化酶缺失体, 其中F2-5缺失Lox2, 并且品质性状和农艺性状优良, 蛋白质含量为41.02%, 脂肪含量为19.23%, 百粒重较高, 平均达到21.5 g, 生育期为125 d, 适合黑龙江省第一、二积温带种植, 是一个拥有较好的农艺性状和品质性状并缺失脂肪氧化酶的单株。该单株进一步衍生出F3代家系, 经检测仍表现为缺失脂肪氧化酶Lox2, 目前已经南繁加代得到较稳定的F4高世代品系, 因为该品系缺失催化能力最强的Lox2, 因此非常有希望育成理想的加工型品种。
3 讨论与结论
利用比色法测定脂肪氧化酶缺失体的方法, L-1实验无疑是成功的。L-1反应最快速、最稳定、最便宜, 平均反应时间为3 min, Suda 等报道了分析均一豆粉材料时与之有相似的反应时间。但不同种子样本反应时间不完全相同, 为解释这种现象, 加入反应溶液15 min后再观察反应结果, 增加时间并没有影响实验结果, L-1的实验溶液能保持兰色超过1 h。L-2平均反应时间为5 min, 与Suda等报道的反应时间相似, 为解释种子间观察的反应时间上的不同, 反应时间也增加到15 min, 样本一定要在1 h之内记录结果, 因为无论Lox2存在与否, 1 h后溶液都会变清, 这可能是由于DTT非特异漂白作用的影响。L-3反应最慢, 最不稳定, 平均反应时间15 min, 但结果非常不稳定, 此方法的主要缺点是在Lox3存在时β-胡萝卜素的漂白不完全, 用L-2提取液代替水, Lox2对β-胡萝卜素漂白也有轻微的活动, 所以Lox2的存在会影响L-3的测定结果。
利用等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳来鉴定大豆脂肪氧化酶具有分辨率高、特异性强等优点。所以综合考虑, 利用IEF-PAGE鉴定脂肪氧化酶缺失体的方法更为有效和准确, 检测费用也不高, 是一种值得推荐的方法。
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腺苷酸环化酶 篇11
【关键词】：刺山柑 腺苷 薄层层析-紫外分光光度法
【中图分类号】R92; 【文献标识码】B【文章编号】1007-8517(2008)4-0014-03
刺山柑(Capparis spinosa L.)为白花菜科山柑属植物，又称野西瓜､老鼠瓜､瓜儿菜､槌果藤､菠里克果和伯格-塔乌孜等。维吾尔语称刺山柑果为开派，喜生于荒漠戈壁和低山坡石质沙土地处，新疆､西藏等地有分布。国外阿富汗､巴基斯坦､前苏联中亚及北非和地中海沿岸均有分布。刺山柑果性温，主要功能有祛风､散寒､除湿､消肿､止痛，维吾尔医主要用于治疗风寒湿痹，脾胃寒痛，浮肿等疾病[1]。在地中海地区刺山柑果是一种常见的用于烹饪的芳香食品，当地居民将刺山柑果醋制和盐制后进行食用。刺山柑在西班牙､意大利､土耳其等国家已经成为一种重要的经济作物[2]。国内学者姜薇等对刺山柑果的化学成分研究表明其含有6-Hydroxy-12-caboxy-blumenolA-β-D-glucopyranoside(I)，1H-吲哚-3-乙腈-4-O-β-葡萄糖苷(Ⅱ)，(6S)-Hydroxy-3-oxo-α-ionol(Ⅲ)，3-醛基吲哚(Ⅳ)，腺苷(Ⅴ)，次黄嘌呤核苷(Ⅵ)，对苯甲酸鼠李糖苷(Ⅶ)，蔗糖(Ⅷ)，β-谷甾醇(Ⅸ)，胡萝卜苷(Ⅹ)[3]。M.ózcan1; C. Aydin 对新鲜刺山柑果的分析得出其含水81.61%､粗蛋白17.4%､灰分5.17%､粗油3.27%､粗纤维12.72%，还含Na57.17mg/kg､K14.33mg/kg､P 6784mg/kg[4]。1999年Ihsan Calis等从刺山柑分离出了两种葡萄糖配基：1H-吲哚-3-乙腈-4-O-β-吡喃型葡萄糖苷和1H-吲哚-3-乙腈-4-O-β(6-O-β-吡喃葡萄糖基)-吡喃型葡萄糖苷[5]。2002年Ihsan Calis从刺山柑果中分离出3种(6S)-Hydroxy-3-oxo-α-ionol glucosides和一种prenyl glucosides[6]。季宇彬等采用苯酚-硫酸法及毛细管电泳法对刺山柑果多糖测定发现，刺山柑果粗多糖及除蛋白后多糖含量分别为39.95%，66.42%，主要多糖组分比为：鼠李糖∶木糖∶葡萄糖∶阿拉伯糖∶半乳糖=3∶5∶48∶100∶21∶19[7]。腺苷是一种存在人体内的所有细胞中的内源性核苷，是一种很强的心血管活性物质，它使体循环血管扩张，引起血压下降[8];腺苷有镇静､催眠､抗癫痫､作用[9];内源性腺苷对脂肪组织就有生理调节作用，可抑制交感神经刺激引起的脂解。在心血管方面，腺苷是一种可靠的生理调节剂。在临床上，腺苷可被有效的作为一种血管舒张剂，亦可作为一种抗心律不齐的药物。在诊断学上，腺苷可以被用来区分室上性心动过速于室性心动过速，以暴露心房扑动与心房纤维性颤动[10]。国内外有关刺山柑果中腺苷的研究未见报道，笔者采用薄层层析分离，紫外分光光度法测定刺山柑中腺苷的含量，为刺山柑的药用开发提供质量控制依据，现报道如下。
1 仪器与试药
1.试药：腺苷标准品(中国药品生物制品鉴定所879-200001)，乙酸乙酯(AR)，异丙醇(AR)，氯仿(AR)，无水乙醇(AR)，刺山柑果实干品(2007年4月购于新疆二道桥药材市场，经新疆医科大学中医学院李永和主任药师鉴定)。
1.仪器：Spectrumlab 54紫外分光光度计 (上海棱光技术有限公司)､RE52CS-2旋转薄膜蒸发仪(上海亚荣仪器厂)､YOKO-SY紫外分析摄影仪(武汉药科新技术有限公司)､KQ-400DBC超声清洗仪(昆山市超生仪器有限公司)､BS110S分析天平(北京，赛多利斯)､TGL-16B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)､薄层层析硅胶板GF254(青岛海洋化工厂)､DZF-6021型真空干燥箱(上海精宏实验设备厂)､CS101型电热鼓风干燥箱(重庆实验设备厂)。
2 方法与结果
2.标准样品的制备：精密称取腺苷标准品8.2mg，加入70%得乙醇溶解，定溶到50ml容量瓶中即得。
2.测试样品的制备：将刺山柑果实捣碎并过40目和60目的药典筛，取中间粉末放在真空干燥箱内(50℃，24h)烘干至恒重，精密称取刺山柑粉末5g，置250ml的容量瓶中，并用8倍量的70%的乙醇超声三次，每次20min，过滤并合并滤液，浓缩至1g/ml备用。
2.3 定性鉴别：用定量点样器吸取15μL样品液，点于10x20cm薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-水(8：2：6：0.5)为展开剂，以腺苷标准品为对照，直立上行展开。在紫外灯254nm下检测后，发现在相同的位置有相同颜色的斑点(见图1)，刮取与标准品Rf值一致的斑点，置于10mL的带盖试管中，精密加入4mL70%的乙醇，剧烈震荡2min后，以10000r/min离心10min小心吸取上清液，得测试样品液，以同样的方法制的标准品液。测试样品液和标准品液在200-600nm范围内进行紫外扫描的紫外图谱(见图2)，由图2可知样品紫外吸收图和标准品重合良好，确定最大吸收波长为260nm。
2.4 标准曲线的制定：精密量取标准品溶液，配制成浓度分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0μg/mL的腺苷溶液，以70%的乙醇为参比，于260nm处测定吸光度，以浓度(μg/mL)为Y，吸光度为X，回归后得浓度-吸光度的回归方程为：Y=0.1030X+0.037r=0.9995显示在1.0～6.0μg/mL的范围内，腺苷的浓度和吸光度呈现良好的线性关系。
2.5 精密度与稳定性实验：取腺苷标准品溶液，加70%乙醇配制成浓度为5μg/mL，以70%的乙醇为参比，于260nm处测定吸光度。重复平行测定5次，得吸光度值的RSD为0.64%。另取该腺苷标准品溶液，以70%乙醇为参比，每隔1h测定吸光度，平行测定9次，得吸光度的RSD为0.62%。结果显示本实验方法精密度良好，标准品溶液在8h内有较好的稳定性。
2.6 样品测定：按定性鉴别中样品溶液的制备方法制备5批样品，以70%乙醇为参比，在260nm处测定吸光度，并将其代入标准曲线回归方程分别计算出测试样品中腺苷的浓度，经换算刺山柑中腺苷的含量为14.19μg/g，含量的RSD%为2.8(见表1)。
2.7 加样回收率：精密量取已知腺苷浓度的测试样品溶液3份，分别加入标准品，按定性鉴别中样品的制备法制备试液，按样品测定方法测定吸光度并求得腺苷含量，计算加样回收率，平均回收率为96.1%，RSD为1.5%。结果见表2。
3 讨论
本文采用硅胶薄层层析结合紫外分光光度法测定了刺山柑果中腺苷的含量。刺山柑果经超声提取，薄层层析分离得到的测试样品溶液和标准品溶液的紫外吸收图谱完全一致，表明测试样品中含有腺苷，并从文献中获得支持，同时利用薄层分离可以排除其它成份干扰。本法灵敏度高，设备简单，操作简便易行，可用于刺山柑果的质量控制。刺山柑的药理研究表明有降血糖血脂，抗菌，杀虫，保肝，抗炎，抗氧化等作用[11]。维吾尔医主要用刺山柑治疗痛风､风湿性关节炎等疾病，有较好的疗效[12～14]。从国外的相关研究报道可知，刺山柑有较广泛的药学用途和经济价值，有待于我们进行深入研究。
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腺苷酸环化酶 篇12
人体体液中的葡萄糖定量检测方法和仪器手段一直是生命科学、临床医学和医学传感器技术研究关注的热点,为此,各国开展大量的研究,提出无损检测体内葡萄糖的偏振光测定法、拉曼光谱法、近红外吸收及散射法、中红外发射光谱法、荧光法、无线电射频法等[1,2,3,4,5,6]。这些技术虽然有着美好的前景,但离实用仍有相当的距离。
目前,临床上广泛使用的葡萄糖测定方法仍然是葡萄糖氧化酶比色法和酶电极法,其中,氧化酶比色法由于特异性好,灵敏度高,成本低,一直作为经典的葡萄糖定量方法被广泛应用,基于该原理的微型葡萄糖传感器和便携式高灵敏葡萄糖检测仪器有广阔的应用前景,初步研究表明,唾液中葡萄糖的含量与血糖有相关性[7],如果唾液糖能替代血糖作为糖尿病患者的另一个“生命体征”的话,必将给糖尿病患者带来福音,但唾液中葡萄糖的含量仅为血糖含量的1/50～1/100,显然,对唾液糖的测定需要有更高的灵敏度和精度。应用氧化酶比色法测定葡萄糖时,一般要求将反应物置于一定温度(如37℃)的恒温水浴中反应指定的时间(一般为10～30min),然后在指定的波长下进行比色。由于联酶反应及氧化还原反应是一个动力学反应的过程,参与反应的各个组分的含量及其对环境温度的敏感性以及测量的时间等都将影响到定量的精度,这些问题的研究对新型葡萄糖酶传感器的设计具有指导意义。而对于市售的某种氧化酶试剂,在实际测量过程中,对于规定的测试条件(如时间、温度、波长等)的偏离将对结果造成怎样的误差和影响,反过来,当葡萄糖定量要求达到一定的精度时,对应的测试条件需要控制在怎样的水平,也是一个非常值得研究探讨的问题,这对于广大的酶试剂用户具有参考价值。
此外,氧化酶法葡萄糖定量若以LED为光源进行比色测量,无需分光,可设计成掌上型专用仪器,将是非常有意义的。但是LED可提供的波长有限,不一定恰好在吸收峰,并且都有一定带宽(20～50nm)。所以,有必要探讨测量波长和带宽对氧化酶法葡萄糖定量精度的影响。
本文对于浙江东瓯生物工程有限公司的氧化酶试剂在葡萄糖定量过程中的实验条件如温度、时间、波长、带宽等进行探讨,分析讨论这些实验条件对葡萄糖定量精度的影响。
1 测量原理与方法
1.1 测量原理
葡萄糖分子与氧在葡萄糖氧化酶的作用下,生成葡萄糖酸与过氧化氢,过氧化氢通过过氧化物酶催化放出氧,并与4-氨基氨替比林结合,生成红色醌类化合物,其反应式如下:
葡萄糖undefined葡萄糖酸+H2O2
H2O2+4-氨基安替比林undefined
1.2 测量方法
根据人体血糖和尿糖的浓度范围,将分析纯葡萄糖粉末(上海分析试剂厂)与蒸馏水配制成浓度分别为2.03mmol/L、8.10mmol/L、 14.18mmol/L、20.26mmol/L、26.34mmol/L、 32.42mmol/L和 38.49mmol/L的7组葡萄糖溶液样品,先将葡萄糖氧化酶试剂(浙江东瓯生物工程有限公司)置于一定温度的恒温水槽中水浴10min,然后加入待测样品,开始反应后,每隔2min的时间间隔,用紫外可见分光光度计(UV1900,上海亚研电子科技有限公司)测量其吸收光谱,以空气作为参照,所用比色皿的光程为5mm,测量波段为450～700nm,带宽1nm,测量16次,测量过程中保持样品温度不变。观测不同浓度样品在不同温度下450～700nm可见光范围内吸收光谱的动力学变化过程。
2 实验结果与分析
2.1 定标波长的选择
图1为32℃下8min时测得的不同浓度葡萄糖溶液的光谱曲线,由图中可以看出,在450～700nm可见光谱波段内溶液的吸收峰位于550nm处,在同一波长处,浓度越高,吸光度越大,用最小二乘法对1nm带宽下450～700nm各个波长处的吸光度与葡萄糖浓度逐点进行拟合,图2(a)是相关系数与波长的关系曲线, 可见480～650nm波段内均有很好的相关性。图2(b)显示550nm处的拟合曲线,相关系数为0.9998。实验结果表明,即使偏离吸收峰550nm(如偏离70nm)进行比色,也能获得相关系数大于0.998的满意结果。
2.2 温度的影响
图3是浓度为20.26mmol/L的葡萄糖溶液在不同温度下在550nm处的吸光度随时间的变化关系曲线,可见反应开始初期,吸光度随时间快速变大,大约8min后变化趋缓,达到最大值,然后吸光度逐渐减小。比较32℃与37℃两种不同温度下的变化情况,由曲线可知, 在0～10min内,吸光度均随时间逐渐增大, 但37℃情况更快达到最大值,维持相对稳定的时间较短,之后吸光度下降的速度较快,而较低温度的32℃情况下达到最大吸光度的时间稍长一些,而且维持最大值稳定的时间较长,之后吸光度的下降也较慢。可见,在不同的温度下进行定量的最佳时间是不同的,找到吸光度较稳定的时段十分关键,结果还表明,对于该种氧化酶试剂,32℃是较合适的应用温度。
图4是两种不同温度下在550nm处用最小二乘法拟合不同浓度得到的相关系数与时间的关系曲线,由图4中得知,在32℃与37℃下不同时刻葡萄糖溶液吸光度与浓度550nm均有较好的相关性,相关系数R>0.998,相比之下,在32℃时相关性更好一些,而且在葡萄糖溶液与氧化酶反应10min以后相关系数约为0.9998,结合图3中低温下葡萄糖与酶作用后较长时间内吸光度保持相对较为稳定的结果,说明在32℃下,在10～20min内测量有利于获得更加精确的测量结果。
2.3 测量时间的影响
图5为32℃下,550nm处7种不同浓度葡萄糖样品的吸光度随时间的变化关系曲线,由图中可以看出,在0～10min内,吸光度逐渐变大,表明葡萄糖与酶的反应正在进行之中;大约10min后达到峰值并维持一段时间,然后吸光度开始逐渐变小,这与实验过程观察到的葡萄糖样品的颜色变化:颜色逐渐加深——保持不变几分钟——逐渐变淡的现象相符,浓度越高的样品颜色衰退的现象较明显。从图5中可以看出,在大约10～15min时测量吸光度相对较为稳定,较适合于对葡萄糖进行定标。
按定义undefined
其中,SEP为标准预测误差,np为样品数,Yi为葡萄糖浓度理论值,Ypi为测量值。
在32℃情况下,以反应10min时不同浓度的葡萄糖水溶液的吸光度与浓度间作最小二乘法线性定标,得到定标方程,计算各浓度的预测值以及预测误差。考虑到实际应用中测量时间可能出现误差,为考察因测量时间的误差引起的预测误差,以10min时所作的定标方程为参考标准,分别计算各浓度样品在6min、8min、12min、14min时的预测值及标准预测差(见表1)。
由表1可见,当测量时间偏离10min时,误差增大,当测量时间不足10min,如6min和8min时,预测误差较大,而当测量时间超过10min,如12min和14min时,预测误差较小,由前述32℃下溶液的吸光度在小于10min时变化较快,而在10～15min时间段保持相对稳定的实验现象很容易解释这个结论。
2.4 光谱带宽的影响
定量分析32℃下10min的测量光谱,以550nm为中心,分别取1nm,10nm,20nm,30nm带宽范围内吸光度的光谱面积与浓度作相关性分析及面积定量,利用最小二乘法拟合,得到的不同的预测模型,利用如下相对误差公式:
相对误差为undefined
上式中Yi为葡萄糖浓度的理论值,Ypi为葡萄糖浓度的测量值,△为相对误差。
在不同光谱带宽范围作面积定量得到的测量值的相对误差(见表2)。
结果表明,不同光谱带宽范围作面积定量得到的测量值的相对误差差别很小,即使带宽增大到30nm,相关系数仍然大于0.9999。该结果说明,氧化酶法葡萄糖定量可以采用有一定带宽的光源(如带宽30nm的发光二极管),无需分光,无需滤光,可设计成掌上型专用仪器,取代传统的分光光度计,这已在我们研制的“便携式多功能比色仪”中得到验证(见另文报道)。
3 结论
由以上实验结果可知,葡萄糖与酶的反应是一个动力学过程,对于某种氧化酶试剂,选择合适的测量时间和测量温度对提高葡萄糖定量精度极为重要。实验结果表明,本文所用的氧化酶试剂在32℃下葡萄糖氧化酶与葡萄糖作用约10～15min后在550nm峰值附近进行定量,效果较好,相关系数0.9999,预测标准误差SEP可达到0.626mmol/L。结果还表明,用葡萄糖氧化酶法进行葡萄糖定量时,如果测量时间和温度偏离指定值,将产生较大误差,然而,即使定量波长偏离吸收峰,并在一定带宽范围内(如30nm)进行定量,仍能得到比较理想的结果(相对误差<1.4%),该结果显示,氧化酶法葡萄糖定量装置可以采用有一定带宽的光源(如带宽30nm的发光二极管),无需分光,甚至无需滤光,可设计成掌上型专用仪器,取代传统的分光光度计,这是很有实际应用意义的。
摘要：依据人体尿糖、血糖的浓度范围,研究从2.038.5mmol/L不同浓度的葡萄糖水溶液在不同温度下与葡萄糖氧化酶试剂反应的动力学过程,在可见光谱区,结合分光光度法和最小二乘法对溶液中的葡萄糖含量进行定量分析,分析波长,光谱带宽,反应温度及反应时间等对定量精度的影响。实验结果表明,对于本文所用的葡萄糖氧化酶试剂,在32℃下葡萄糖氧化酶与葡萄糖反应10m in后在550nm处进行定量,相关系数超过0.9999,预测标准误差(SEP)0.626mmol/L。如果测量时间和温度偏离指定条件,将产生较大的测量误差;但如果定量波长偏离吸收峰,并在一定带宽(如30nm)范围内进行定量,仍能得到满意的结果。
关键词：葡萄糖氧化酶,光度法,温度,最小二乘法
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