腺苷酸环化酶蛋白-1（精选7篇）
腺苷酸环化酶蛋白-1 篇1
急性心肌梗死已成为心血管事件中致死率很高的疾病, 其主要治疗方法是将闭塞的血管快速恢复血流供应, 减轻心肌组织损伤。然而, 大量动物及临床实验证明, 缺血心肌再灌注可发生心律失常、梗死面积扩大及心肌功能障碍。因此, 在恢复缺血心肌血流供应的同时能减轻缺血再灌注损伤已成为国内外研究的主要课题。本实验通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型, 观察腺苷对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及材料
雄性Wistar大鼠24只, 体重250 g±30 g, 山西医科大学生理学教研室提供。大鼠随机分为假手术组 (iv组) 、缺血再灌注模型组 (I/R组) 、缺血再灌注后腺苷处理组 (AD组) 。iv组只进行手术不处理;I/R组缺血30 min, 再灌注2 h;AD组缺血30 min, 再灌注2 h, 经股静脉缓慢注射腺苷[305 μg/ (kg·min) ], 持续5 min。腺苷 (美国Sigma公司) ;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) 试剂盒均购自武汉博士德公司。HX-200动物呼吸机 (成都泰盟科技有限公司) ;RN6240B 型多道生理信号聚集处理系统 (成都仪器厂) ;BI-200 医学图像分析系统 (成都泰盟科技有限公司) 。
1.2 制备动物模型
取称重后Wistar大鼠, 应用25%乌拉坦腹腔注射麻醉, 将大鼠仰卧位固定手术台上, 经气管插管连接呼吸机, 以针形电极置于四肢皮下记录标准肢体Ⅱ导联心电图。于胸部左侧第3～4肋骨处开口, 并暴露纵膈及心脏, 于左心耳下2 mm处穿6-0丝线, 结扎左冠状动脉前降支 (iv组只穿线不结扎) , 观察肢体Ⅱ导联心电图ST段抬高大于0.2 mV, 结扎30 min后松开血管, 可见ST段回落, 再灌注2 h (AD组经股静脉注射腺苷5 min) 将大鼠处死, 取出心脏浸泡于10%甲醛溶液中。
1.3 标本检测
1.3.1 TUNEL法检测心肌细胞凋亡
取梗死心肌组织, 固定后石蜡包埋、切片, 按照试剂盒提供方法操作, DAB显色, 光镜下观察凋亡细胞核呈棕黄色 (TUNEL阳性) , 每张切片在400高倍镜下随机选取10个非重叠视野, 计算凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数, 心肌细胞凋亡指数 (AI) =凋亡心肌细胞数/心肌细胞总数×100%。
1.3.2 RT-PCR技术检测miRNA-1
取100 mg心肌组织, Trizol法提取总RNA, 紫外吸收测定法检测RNA纯度, 变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量, 再进行反转录成cDNA, Realtime PCR仪进行PCR检测, 以U6作为内参, miRNA-1的上游引物5′GGGGTGGAATGTAAAGAAG3′, 下游引物5′TGCGTGTCGTGGAGTC3′。内参U6的上游引物5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′, 下游引物5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′, 数据采用2-△△Ct法进行计算。
1.3.3 免疫组化 (SP) 法测IGF-1
取左心室前壁组织经10%多聚甲醛固定, 石蜡包埋、切片, 严格按SP试剂盒说明书进行SABC法染色, DAB显色, 切片封固。400高倍镜下观察以细胞浆出现棕黄色颗粒为IGF-1蛋白表达阳性。采用BI-200图像分析系统测量平均光密度值, 其光密度大小与IGF-1蛋白表达水平呈正相关。
1.4 统计学处理
采用SPSS16.0软件包进行分析, 计量资料以均数±标准差
2 结 果
2.1 心肌细胞凋亡检测
I/R组凋亡心肌细胞明显增加, 呈弥漫分布, AD组凋亡细胞较少, iv组偶见凋亡的心肌细胞。I/R组有较高的心肌细胞凋亡率, 较iv组明显增高 (P<0.05) 。与I/R组比较, AD组心肌细胞凋亡率明显降低 (P<0.05) 。详见表1。
2.2 IGF-1蛋白表达比较
与iv组相比, I/R组IGF-1蛋白表达率明显增多 (P<0.05) ;与I/R组相比, AD组IGF-1蛋白表达率增多 (P<0.05) 。详见表1。
2.3 心肌组织中miRNA-1的表达变化
与空白组相比, I/R组、AD组miRNA-1表达水平升高, 升高后为原来的4.42倍和2.06倍。与I/R组相比, AD组miRNA-1表达水平降低, 降低后为原来的2.15倍。
3 讨 论
心肌缺血再灌注损伤是指缺血的心肌细胞经恢复供血后产生更为严重的损伤。现已经证实细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤有着非常密切的关系[1]。其作用机制极为复杂, 主要包括生成大量氧自由基, 再灌注细胞内钙超载, 血管内皮细胞损伤, 细胞凋亡及白细胞与血小板之间相互作用的关系等[2]。心肌持续性缺血导致组织损伤及细胞死亡, 早期再灌注能够有效减轻心肌缺血的损伤程度, 但大量实验和临床观察, 再灌注后改善心肌供血的同时又加重了单纯心肌缺血造成的损伤, 出现再灌注心律失常、梗死面积扩大、心室收缩功能降低等情况。研究发现, 腺苷可以通过多种途径保护心肌缺血再灌注损伤, 舒张冠状动脉, 加强心肌缺血预处理, 减少心肌梗死范围, 减轻炎性反应[3]等。腺苷使心肌的梗死面积明显减少的同时增加了心肌缺血后的功能恢复, 减轻了再灌注损伤, 增强了心脏的保护作用[4]。腺苷通过作用于效应器官上的腺苷受体完成生理功能, 目前已知的受体亚型有四种, 分别是A1、A2A、A2B、A3受体。其保护机制可能通过以下几种方式:A1受体介导的抗亲脂效应稳定细胞膜, 减少细胞内乳酸产量和酸中毒, 阻止脂质过氧化;腺苷激活A1受体开放心肌钾通道, 引起心肌细胞超极化, 减少钙离子通过电压门控通道, 同时, 抑制腺苷酸环化酶的激活, 减少慢钙通道的磷酸化, 减少钙离子通过该通道。最终减少心肌细胞钙超载, 起到心肌保护作用。腺苷激活A2A受体抑制中性粒细胞产生超氧阴离子, 减少中性粒细胞的附壁作用, 并减轻由中性粒细胞聚集和中性粒细胞产生的缩血管物质的释放, 减少活化的血小板;腺苷激活A2受体明显抑制肿瘤坏死因子α, 可能有助于腺苷对再灌注后心肌保护的作用。Zhao等[5]证实, 在再灌注阶段使用腺苷激活A2A受体抑制细胞凋亡。A2受体的激活使活性氧的产生下降, 继而减少活性氧簇诱发的细胞凋亡, 可能是抑制细胞凋亡的途径。Masakatsu等[6]研究表明, 心肌梗死后腺苷A2B受体长期兴奋使非梗死区心肌的纤维化降低, 改善了心肌重塑, 改善心脏功能。腺苷保护心肌的途径有很多, 但通过影响IGF-1蛋白含量来减轻心肌缺血再灌注损伤未见报道。本研究结果显示, AD组较I/R组心肌组织中IGF-1蛋白含量明显增加, 细胞凋亡指数降低, 验证了腺苷通过增加IGF-1蛋白含量对心脏起保护作用。 Shan等[7]研究显示, miRNA-1转录后抑制IGF-1蛋白表达削弱了心肌细胞的抗凋亡作用。提示miRNA-1有促进心肌细胞凋亡的作用。在大鼠心肌缺血再灌注损伤时, miRNA-1的水平会升高。在对比I/R组与AD组心肌组织中miRNA-1的表达及IGF-1蛋白含量变化时, 发现AD组较I/R组IGF-1蛋白含量增加的同时miRNA-1表达下调, 这表示腺苷有可能通过抑制miRNA-1的表达机制使IGF-1蛋白含量增加, 从而达到减少心肌缺血再灌注损伤的作用, 但由于样本量较小其作用机制尚待大样本实验进一步证实。本实验有助于认识miRNAS在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制, 并为腺苷防治和减轻心肌缺血性损伤提供新的研究资料和实验依据。
摘要：目的 观察腺苷对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡与胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) 蛋白的关系。方法 取Wistar大鼠24只, 随机分成3组, 随机分为假手术组 (iv组) 、缺血再灌注模型组 (I/R组) 、缺血再灌注后腺苷处理组 (AD组) , 每组8只。通过结扎大鼠左冠状动脉前降支 (LAD) 30min和灌注2h造成心肌缺血再灌注损伤。采用TUNEL法观察心肌细胞凋亡;利用免疫组化法检测IGF-1蛋白的表达。结果 I/R组心肌细胞凋亡指数和IGF-1蛋白表达较iv组升高 (P<0.05) ;与I/R组相比, AD组心肌细胞凋亡指数明显降低, 而IGF-1蛋白表达明显升高 (P<0.05) 。结论 腺苷可抑制心肌细胞凋亡, 明显提高IGF-1蛋白表达水平, 对缺血再灌注损伤心肌有保护作用。提示腺苷可减轻心肌缺血再灌注损伤, 作用机制与提高IGF-1蛋白表达水平和抗心肌细胞凋亡作用有关。
关键词：腺苷,缺血再灌注,胰岛素样生长因子-1
参考文献
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腺苷酸环化酶蛋白-1 篇2
关键词：组蛋白去乙酰化酶1,胃癌,癌前病变,免疫组织化学
在我国, 胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一, 5年生存率不足20%, 因此提高胃癌的早期检出率尤为重要。大量的研究表明, 胃癌的发生、发展是多基因、多步骤的复杂过程。早在30多年前, Affrey等已经发现核心组蛋白的N-端乙酰化能调节多种反式作用因子与核小体结合, 从而影响基因转录。此后研究不断深入, 发现组蛋白可有多种共价修饰方大式:泛素化、磷酸化、乙酰化、甲基化等, 它们单独 (协同) 调节基因转录, 在肿瘤的发生中起到重要中所用。其中组蛋白乙酰化是解除核小体抑制作用的主要机制, 组蛋白乙酰化水平受组蛋白乙酰基转移酶 (histone acetyltransferases, HATs) 和组蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylases, HDACs) 的调控[1]。组蛋白去乙酰化酶1是1996年由美国哈佛大学的Taunton等发现的第一个哺乳动物的组蛋白去乙酰化酶, 它是多种蛋白质复合物的催化亚单位, 参与组蛋白和非组蛋白的去乙酰化[2]。近年来研究表明其在结肠癌, 肝癌, 胰腺癌, 前列腺癌中均高表达, 提示可能与肿瘤的发生发展有关。Choi[3]等研究了人胃癌细胞中HDAC1的表达, 发现68% (17/25) 的标本中有HDAC1 m RNA的高表达;61% (11/18) 的标本有HDAC1蛋白的高表达, 但关于HDAC1的表达与胃癌临床病理进程的关系的报道较少。本研究通过免疫组织化学法检测HDAC1在胃癌, 癌前病变 (萎缩性胃炎伴肠化生、不典型增生) 的表达, 探讨HDAC1在胃癌发生、发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
选取青岛大学医学院附属医院2008年8月至2010年2月存档的胃镜活检及胃癌根治术后标本蜡块120例, 其中大致正常胃黏膜组、慢性萎缩性胃炎伴肠化生组、不典型增生组各20例, 胃癌组60例。胃癌病例术前均未接受放疗及化疗, 年龄29~85 (平均60.7±15.2) 岁。实验选用与HE染色一致的蜡块制成4µm切片行免疫组织化学染色。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学 (PV6000) 法
兔抗人HDAC1多克隆抗体, p21和p53单克隆抗体 (即用型) , PV6000试剂盒, 柠檬酸抗原修复缓冲液、DAB染色剂分别购自北京博奥森生物技术有限公司及北京中山金桥生物技术有限公司, 切片染色前根据抗体要求行柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复, 余具体操作过程按试剂盒说明书完成。
1.3 结果判定
采用二级计分法, 阳性细胞计分标准为:≤5%为0分;6%~25%为1分;26%~50%为2分;51%~75%为3分;>75%为4分。染色强度分级计分标准为:无显色为0分;淡黄色为1分;黄或深黄色为2分;褐或棕褐色为3分。两者计分的乘积≥1者为阳性。
1.4 统计分析
采用SPSS17.0软件进行统计学处理, HDAC1在不同胃黏膜组织中的表达之间的关系、与胃癌的临床病理特征之间的关系及与p53和p21的关系用χ2检验和Fisher确切概率法, 以P<0.05认为有统计学差异。
2 结果
2.1 HDAC1在不同胃黏膜组织中的表达
HDAC1的表达位于细胞核中, 为棕黄色颗粒。HDAC1在萎缩性胃炎伴肠化生、不典型增生及胃癌各组表达均高于正常组 (45.0%, 60.0%, 63.3%vs 5%, 均P<0.05) , 差别有统计学意义。萎缩性胃炎伴肠化生、不典型增生、胃癌三者间差别无统计学意义 (表1) 。
注:Pa<0.05 vs正常为黏膜组
2.2 HDAC1的表达与临床病理特征的关系
胃癌组中HDAC1的表达在淋巴结转移组高于无淋巴结转移组 (χ2=8.086, P<0.05) , 高中分化组高于低分化组 (χ2=8.735, P<0.05) , 而与患者的年龄, 性别, 肿瘤的浸润程度, 临床分期及远处转移无关 (表2) 。
2.3 胃癌组中HDAC1的表达与p21、p53的关系
HDAC1阳性组中, p21的阳性表达率低于HDAC1阴性组 (χ2=6.332, P<0.05) ;而p53的阳性表达率高于HDAC1阴性组 (χ2=10.790, P<0.01) 。HDAC1与p21的表达呈负相关, 而与p53的表达呈正相关 (表3和表4) 。
3 讨论
研究表明, 组蛋白乙酰化和基因的激活或抑制密切相关, 组蛋白乙酰化由乙酰化酶和去乙酰化酶共同催化。正常状态下, 这两种酶通过对核心组蛋白尾部的赖氨酸残基进行可逆的乙酰化修饰来调控转录的起始, 并由此介导基因的激活或抑制。在细胞异常状态下, HDAC的活性明显增强, 组蛋白处于低乙酰化状态, 基因表达平衡状态被打破, 使一些影响细胞增殖、分化等的分子表达失衡, 导致肿瘤形成[4]。HDACs属于去乙酰化酶超家族, 共有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三型。HDAC1是目前为止发现的与肿瘤关系最密切的组蛋白去乙酰化酶, 其蛋白质含有482个氨基酸, 相对分子量约为5.5万。HDAC1通过介导核小体改变和调节基因表达, 参与细胞分化和细胞周期进程, 已经发现HDAC1可介导位点特异DNA结合的转录抑制子的转录抑制作用[5]。HDAC1还可以通过线粒体转位 (Chromospmaltraslocations) 促进癌基因合成, 导致细胞凋亡抑制与分化障碍[6]。研究表明HDAC1mRNA水平和蛋白水平在乳腺癌[7]及结直肠癌[8]组织中均高表达, 并和肿瘤的TNM分期及淋巴结转移相关。本研究通过免疫组织化学方法HDAC1蛋白在不同胃黏膜 (正常, 萎缩性胃炎伴肠化生, 不典型增生, 胃癌) 的表达, 结果发现HDAC1在萎缩性胃炎伴肠化生, 不典型增生, 胃癌组的表达较正常组均明显升高, 表明HDAC1参与了胃黏膜肠上皮化生、不典型增生和恶性转化的过程, 可能是胃黏膜癌变过程中的早期分子事件。本研究虽未发现HDAC1的表达与患者的年龄, 性别, 肿瘤的浸润程度, 临床分期及远处转移存在统计学差异, 但研究结果显示, HDAC1在胃癌组织中不但呈现异常的高表达, 且HDAC1表达也随着肿瘤的分化程度的升高、肿瘤淋巴结转移的发生而增高, 这提示HDAC1可以通过促使组蛋白乙酰化, 抑制抑癌基因的转录, 从而在胃黏膜癌变后的恶性演进过程中起重要作用。
p21WAF1基因是1993年被克隆出的一个新的抑癌基因, 它通过与Cylin-CDK复合物结合, 使后者激活活性丧失, 并可影响PCNA、c-myc、bcl-2的表达, 从而抑制DNA的复制, 阻断细胞周期。Shin[9]用HDAC抑制剂TSA分别干预8种胃癌细胞系, 发现HDAC抑制剂能活化全部胃癌细胞系中的p21WAF1基因, 证明组蛋白去乙酰化是胃癌细胞中p21WAF1失活的主要机制。本研究中胃癌组中HDAC1与p21WAF1的表达呈负相关, 提示HDAC1可能通过组蛋白去乙酰化的作用下调p21WAF1的表达, 导致并促进胃癌的发生发展, 这可能用来作为胃癌治疗的新靶点, 针对p21WAF1基因治疗可能为胃癌的化学治疗策略开辟一条新途径。
p53基因分为野生型和突变型, 前者是肿瘤的抑癌基因, 后者是致癌基因。在细胞中免疫组化法检测到的p53蛋白均为突变型, 具有促癌效应。研究表明肺癌中HDAC抑制剂可以减少突变型p53的表达[10]。本研究中胃癌组中HDAC1与p53的表达呈正相关, 提示HDAC1与p53在胃癌的发生过程中具有协同作用。
综上, 通过本研究我们可以明确看到HDAC1在胃癌及癌前病变组织中表达增高, HDAC1的表达与胃癌的分化程度淋巴结转移有关, 而与患者的年龄, 性别, 肿瘤的浸润程度, 临床分期及远处转移无关, 同时还发现HDAC1与p53、p21的表达具有相关性, HDAC1可能通过调节癌基因与抑癌基因参与胃癌的发生、发展, 对胃癌的早期诊断及预后的判断具有一定的意义。同时, 本研究为胃癌的分子治疗提供一定的理论依据, 提示HDAC1可以成为胃癌的治疗靶点。
参考文献
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腺苷酸环化酶蛋白-1 篇3
抵抗素(resistin)是近来发现的一种脂肪因子,初期的研究表明它是联系肥胖和胰岛素抵抗的因子之一[1],而后来的研究发现抵抗素与机体炎症状态的联系更为密切,如人炎症细胞中抵抗素m RNA的表达大大高于脂肪细胞[2],正常人和糖尿病患者血浆抵抗素水平均与C反应蛋白呈正相关。活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)是致血管损伤炎症环境一个重要成分,内皮细胞暴露于ROS的时间和强度影响到内皮细胞的增殖和凋亡。那么,抵抗素作为一种炎症因子是否影响内皮细胞ROS的生成,以及是否具有促进内皮凋亡的作用,本文对此进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 材料
行剖宫产的健康产妇的挺直、无扭曲、无凝血块堵塞的脐带。
1.2 主要试剂
人重组resistin(Phoenix Inc.),内皮细胞生长支持物(endothelial cell growth factors,ECGs,Santa Cruz公司),抗人冯布兰特因子抗体(anti-human Von Willebrand factor IgG,Gibco公司),phospho-AMPK-α(Thr172)抗体(CST公司),anti-actin(CST公司),anti-rabbit-IgG-HRP(CST公司),H2DCFDA(Anaspec公司),5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷酸(5-amino-4-imidazolecarboxamide ribonucleotide,AICAR)(CST公司),annexin V-FITC apoptosis kit(BD公司)。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
取脐带,PBS液灌洗脐静脉后将胰酶灌入静脉腔消化,收集消化液,离心沉淀细胞。用含20%胎牛血清的M199培养液(75μg/m L ECGS,0.1 mg/m L肝素)培养,每3～5 d传代1次。第3～5代的细胞用于实验。采用观察内皮细胞典型形态学特点和VWF抗原免疫显色法对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)进行鉴定。
1.3.2 细胞分组及干预
实验分为四组。(1)对照组(Co组):resistin 0 ng/m L干预细胞。(2)Res50组:resistin 50 ng/m L干预细胞。(3)Res100组:resistin100 ng/mL干预细胞。(4)Res50+AI组:resistin 50ng/mL和10μM AICAR共同干预细胞。培养板中的HUVECs生长至80%融合时,用含1%胎牛血清的M199培养基过夜同步处理。之后,各组不同因素干预24 h。
1.3.3 HUVEC凋亡和R OS生成的检测
细胞干预完成后,0.05%胰酶+0.43 m M EDTA消化细胞。用含血清培养基中止消化。2 m L PBS漂洗细胞,1 000rpm离心5 min,弃上清液。0.5 m L PBS重悬细胞。37℃细胞避光负载H2DCFDA(5μM)30 min。用流式细胞仪检测ROS生成。凋亡检测按照试剂盒说明书进行。
1.3.4 HUVEC的AMPK-α(Thr172)磷酸化水平检测
处理后的各组细胞用预冷的PBS冲洗2遍,加入细胞裂解液5 min,于120 000 rpm,低温离心15 min,BCA法检测总蛋白量,每样品取20μg上样,SDS-PAGE电泳。转膜,100 V恒压维持通电80 min。TBS漂洗。室温封闭1 h。加一抗(1∶1 000稀释),4℃过夜孵育。HRP标记的特异性二抗(1∶2 000)及HRP标记的抗生物素抗体(1∶1 000)室温下孵育1 h。显影、定影、洗片。结果用凝胶成像软件定量扫描条带灰度,以p-AMPK蛋白条带/β-actin蛋白条带的比值反映各自的磷酸化水平。
1.4 统计学分析
数据以均数±标准差表示。组间比较采用方差分析,以P<0.05为差异有显著性。统计分析在SPSS for windows 11.0统计软件包上完成。
2 结果
2.1 HUVEC凋亡分析
Annexin V-FITC/PI染色,流式细胞仪分析,Res50、Res100组细胞凋亡率与Co组相比差异无显著性(P>0.05)。Res50+AI组细胞凋亡率低于Res50组,差异有显著性(P<0.05),见表1。
TUNEL法检测细胞凋亡指数,光镜下可见正常细胞的胞浆着棕黄色,细胞核呈蓝色,凋亡细胞的细胞核呈棕褐色致密浓染、核固缩。随机计数500个细胞及凋亡的细胞,计算凋亡指数(凋亡细胞数/总细胞数×100%),见表1。
2.2 HUVEC ROS生成检测
H2DCFDA是一种细胞渗透性荧光染料,进入细胞后可被H2O2氧化为发光物质。因此,可用来检测细胞内ROS生成量。本实验结果显示,50 ng/mL和100ng/mL resistin干预内皮细胞24 h后,与对照组相比细胞内ROS生成的差异无显著性(P>0.05)。而添加AMPK特异激动剂AICAR组(Res50+AI组)与未添加AICAR组(Res50组)相比,细胞内ROS生成降低,差异有显著性(P<0.05),见表2。
注:覮与Res50比较,P<0.05
2.3 re s is tin对HUVECs AMP K磷酸化水平的影响
Res50组、Res100组经抵抗素干预24 h后,HU-VECs AMPK磷酸化水平降低,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。Res50+AI组细胞AMPK磷酸化水平高于Res50组,差异有显著性(P<0.05),见表2。
注:1)与Co比较,P<0.05;2)与Res50比较,P<0.05
3 讨论
本文研究发现,抵抗素并不能增加内皮细胞的凋亡和ROS生成,但可抑制内皮细胞AMPK的磷酸化激活,且AMPK的激活能够对内皮细胞凋亡起保护作用。
内皮细胞凋亡在血管损伤的机制中起重要作用。胰岛素抵抗、2型糖尿病等目前被认为是机体的一种慢性非特异性炎症状态,高血糖、高氧化低密度脂蛋白、氧化应激等情况诱导内皮细胞凋亡增加,血浆中炎症标志物的增加预示着冠状动脉粥样硬化性心脏病等血管疾病的发生。抵抗素近来也发现可参与内皮激活,导致内皮细胞功能紊乱[3]。临床研究也发现它与内皮功能的相关性[4]。ROS生成的调节是血管再生和内皮细胞存活过程中的必需条件之一,因为ROS生成增加可导致氧化应激,进而促进血管疾病的发生,因此,在多种刺激因子导致的细胞凋亡过程中常可观察到细胞内ROS生成的增加[5]。KOUGIAS等[6]研究发现40 ng/mL抵抗素干预猪冠状动脉可导致O2-的生成增加,而抗氧化剂Se Met可逆转抵抗素导致的O2-生成增加。本实验采用的H2DCFDA是一种细胞内荧光染料,主要用于检测细胞内H2O2产生量,内皮细胞产生的ROS包括O2-、H2O2等,它们具有重要的病理生理作用,包括灭活重要的内皮源性血管舒张因子一氧化氮(NO)等,分析本文结果与既往研究不一致的原因可能在于所采用细胞种类的不同、检测ROS成分的差异等。
既往有多家有关抵抗素影响内皮细胞功能的报道,如抵抗素对内皮细胞NO生成、内皮黏附分子生成的影响等[7],但鲜有对内皮细胞凋亡影响的研究,本研究发现抵抗素干预内皮细胞并不能增加其凋亡,但伴随有AMPK磷酸化的降低,AMPK特异的激动剂AICAR可保护细胞凋亡和降低ROS生成。研究发现AMPK活性改变可能参与了抵抗素的病理生理机制,抵抗素基因缺失小鼠肝细胞中AMPK磷酸化水平明显增高,而高抵抗素血症大鼠的肝脏、肌肉、脂肪组织中AMPK磷酸化水平显著降低[8]。内皮细胞的AMPK能直接磷酸化激活内皮型一氧化氮合酶,导致内皮NO合成增加,从而介导拮抗由于血流应力等因素造成的内皮凋亡的增加。多种抗糖尿病药物的作用机制包括二甲双胍、罗格列酮等也有部分是AMPK介导的。在生理作用与抵抗素似乎相反的另一脂肪因子脂联素的作用机制中,AMPK也占相当重要地位,如脂联素能通过激活AMPK诱导内皮NO生成[9]。
过去已有报道AICAR能抑制成纤维细胞、心肌细胞等凋亡,提示了AICAR能影响细胞凋亡过程中的起始或者终末事件如氧化应激产生等。本研究的结果提示,AICAR的抗凋亡作用与其激活内皮AMPK有关,然而,除了可激活AMPK外,AICAR可导致细胞阿糖腺苷产生增加和细胞内AICAR代谢产物如ZMP(AICAR一磷酸盐)的聚集[10],如AICAR在内皮细胞抑制糖酵解作用的原因就在于ZMP细胞内的聚集。因此,需要更加深入的研究来解决AICAR的作用是否是依赖于对AMPK的激活。在高糖诱导的内皮细胞损伤研究中,高糖作用可增加内皮细胞凋亡率,伴随有AMPK活性降低,随后采用AICAR干预则可完全逆转高糖所致内皮功能改变,与本文结果有类似之处。笔者推测,AICAR在内皮细胞激活被抵抗素抑制的AMPK后,导致内皮NO等内皮保护因子生成增加,从而起到降低ROS生成和拮抗细胞凋亡的作用。
总之,笔者发现在抵抗素对内皮细胞的作用机制中AMPK可能占重要地位,虽然抵抗素不能引起内皮ROS生成和细胞凋亡的增加,但可抑制内皮AMPK磷酸化,且AICAR激活AMPK后对内皮细胞损伤起保护作用,这些也有助于为发展防治糖尿病相关血管病变的药物提供理论基础。
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腺苷酸环化酶蛋白-1 篇4
蛋白质是水产动物有机体结构和功能必不可少的营养物质,在各类营养素中,具有特别重要的地位,不仅是各组织器官可用于生长和修复的构成物质,也是酶、激素和抗体等生物活性物质的组成成分[12]。饲料蛋白质含量对保持水生动物正常生长和健康有至关重要的作用。本研究开展了蛋白水平对方格星虫稚虫日增重和消化酶影响的研究,以期为星虫类消化生理学及规模化养殖方格星虫的人工配合饲料的研制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物与饲料
试验用稚虫为广西海洋研究所自主研发培育的同一批受精卵孵化的人工苗种,规格为(39.20±0.24)mg/条。试验饲料以鱼粉、酪蛋白和明胶为蛋白源,鱼油为脂肪源,并补充矿物质、维生素配制9种等能试验饲料。经测定,9种试验饲料中蛋白的实际含量分别为25.21%、29.87%、35.03%、40.67%、45.47%、50.12%、55.29%、60.38%和64.85%,以D1-D9表示。饲料配方及营养成分见表1。配制饲料前,所有原料粉碎后过400目筛网,然后将原料混合均匀,再与鱼油和水充分混匀,微粘合饲料加工参照Blair等[13]介绍的方法,将饲料制成过150目筛的颗粒,装袋备用。
注1:复合维生素,每kg复合维生素含:VD480 000 IU,VE20.00 g,VK0.20 g,VC14.00 g,VB10.10 g,VB21.40 g,VB61.20 g,VB120.20 g,泛酸钙6.521 g烟酸5.60 g,生物素0.20g,肌醇88.00 g。注2:复合矿物盐,每kg复合矿物盐含:Fe SO4·7H2O(19.74%Fe)152.00 g,Cu SO4·5H2O(25.22%Cu)2.40 g,Zn SO4·7H2O(19.25%Zn)31.20 g,Mn SO4·H2O(31.89%Mn)8.20 g,Na Se O3·5H2O(28.54%)0.18 g,KI(75.73%)0.16g,Ca CO3805.86 g。
1.2 饲养试验
试验在广西海洋研究所海水增养殖试验基地进行。选用体重相近、健康无病的方格星虫稚虫13 500条,随机分成9组,每组3个重复,分别饲喂九组等能的不同蛋白人工微颗粒饲料。试验用的27个水槽均为65 cm×55 cm×45 cm的水族箱,水槽底部铺-薄层(约3~4 cm)的细沙以供试验稚星虫栖息。试验为期8周,每天换水2次(9:00和17:00),每次换水约1/3,然后投喂,采用稍过量投喂,保持底层沙表面有少量剩饵,每星期彻底清理试验水槽1次。养殖所用海水经室外蓄水池沉淀,二级砂滤池过滤,进水槽前再经滤袋过滤。试验期间采用自然光照周期,水温维持在24~28℃,盐度维持在18~22,溶解氧>5.0 mg/L。
1.3 样品采集与处理
养殖试验结束后,将试验稚星虫转移至底部无沙的水族箱内2~3 d,期间停止投喂,待其消化道内完全排净沙子后,对每个水族箱内的稚虫进行称重,并记录稚虫条数。然后从每个水族箱里随机取出60条稚虫,称重后于液氮中快速冷冻,随后转移至-80℃超低温冰箱中保存用于消化酶指标的测定。
1.4 消化酶活性的测定
所有待测样品在分析前均放在4℃冰箱中解冻,分次加入10倍于样品重量的冷却去离子水,然后用置于冰水混合物中的玻璃匀浆器匀浆,匀浆液于4℃条件下以4 000 r/min离心20 min,取上清液用于消化酶指标的测定。蛋白酶活性的测定采用Folin-酚法;脂肪酶活性和淀粉酶活性的测定采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒;酶液蛋白含量以牛血清蛋白作标准,用考马斯亮蓝法测定;酶活力用比活力(U/mg prot)表示。
1.5 评价指标及数据分析
平均终末体重(Wt,mg)=W/n
日增重(WG,mg/d)=(Wt-Wo)/t
式中:W和n分别为试验结束时每个水族箱中稚虫的总重量和总数量,mg;Wo和Wt分别为稚星虫初始体重和终末体重,mg;t为试验天数,d。
采用SPSS 13.0对所得数据进行方差分析,若差异为显著,则进行Tukey多重比较,显著性水平为P<0.05。根据WG数据,按二次曲线模型确定饲料蛋白的最适需要量。
2 结果
2.1 饲料蛋白水平对方格星虫稚虫日增重的影响
从表2可知,饲料蛋白水平对方格星虫稚虫的日增重有显著影响(P<0.05)。随着饲料中蛋白添加水平的提高,方格星虫稚虫的日增重呈先增后降的趋势,D5组最高,并显著高于较低蛋白水平组(D1、D2和D3)和较高蛋白水平组(D8和D9)(P<0.05)。根据稚星虫的日增重和饲料蛋白水平拟合需求量模型,选泽拟合优度最好、离差平方和最小的二次曲线模型,确定出稚星虫对蛋白的最适需要量为46.69%。
x±s
注:同行数据上标字母不同者之间表示存在显著差异(P<0.05)。
日增重(y)与饲料蛋白水平(x)的二次曲线回归方程为:
2.2 饲料蛋白水平对方格星虫稚虫消化酶活力的影响
从表3可知,饲料蛋白水平可以显著影响方格星虫稚虫的消化酶活性(P<0.05),稚星虫蛋白酶活性随着饲料蛋白水平的增加呈先增后降的趋势,在饲料蛋白水平为50.12%(D6)时达到最大值,显著高于D1~D5组(P<0.05);淀粉酶和脂肪酶活性随着饲料蛋白水平的上升有显著降低的趋势,D9组稚星虫的两种酶活性都达到最小值,D9组稚星虫的淀粉酶活性显著低于D1~D4组(P<0.05),D9组稚星虫脂肪酶活性显著低于除D8组外的其他各蛋白水平组(P<0.05)。
3 讨论
3.1 饲料蛋白水平对日增重的影响
一般来说,随着饲料蛋白水平的升高,水产动物的生长会逐渐提高。一些学者对鱼类的研究发现,当饲料中蛋白水平能够满足需求时,生长则保持在一个稳定的水平[14,15,16]。但另一些学者对对爪哇鲤(Puntius gonionotus)[17]、条纹鲈[18](Morone saxatilis)、鲻鱼[19](Mugil cephalus)和罗非鱼[20](O.niloticu)等的研究发现,最适蛋白水平组的鱼的增重显著高于蛋白水平高于或低于该水平的其它饲料组,说明当饲料中蛋白水平超过鱼类需求时,鱼的生长率会逐渐下降[21]。本研究中,随着饲料蛋白水平的不断上升,日增重显著地升高,当蛋白水平达到45.47%时,日增重达到最大值,然后随着饲料蛋白水平的上升,体增重缓慢下降,这一结果与上述学者[18,19,20,21]的研究结论是一致的。通过对日增重和饲料蛋白水平进行二次回归分析表明,方格星虫稚虫在饲料蛋白水平为46.69%时达到最大日增重。
x±s
注:同行数据上标字母不同者之间表示存在显著差异(P<0.05)。
饲料中的蛋白质在肠道中水解成氨基酸后被吸收进入血液及其他组织中,用来合成新的组织及用于组织蛋白的更新,因此动物在组织器官的生长和更新过程中,必须从食物中不断获取蛋白质。已有研究得出方格星虫体组织中蛋白质含量一般占其体干重的65%~80%[22,23,24]。如果投喂蛋白含量过低的饲料,饲料蛋白用以满足合成新的体组织及组织蛋白更新需要的比例增大,而用于生长的蛋白相对减少,体增重较慢[25]。这可能也是本研究中过低的饲料蛋白水平降低了方格星虫稚虫日增重的原因。但当饲料中蛋白质含量过高时,方格星虫稚虫的日增重表现出一定程度的下降,原因可能是饲料中过量的蛋白被转化成能量代谢掉,这样会降低蛋白的转化率[26],并导致向水环境中氨氮等排泄物的排放增加[27,28],从而显著降低增重[17,29]、威胁养殖环境。
3.2 饲料蛋白水平对消化酶的影响
消化酶是消化系统分泌的具有催化食物分解的一类酶,根据其消化对象的不同,可以分为蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等几种。通过消化酶的化学性消化作用,水产动物尤其是无胃动物将摄入的食物消化分解成能被动物消化吸收的小分子物质,再经过循环系统运输到组织细胞里面,从而获得用于维持其自身生长发育和繁殖后代等生命活动的物质和能量。因此,消化酶对于水产动物的生长发育具有极其重要的作用。
Pedersen等[30]认为蛋白酶活性与所摄取的食物的性质和数量有关。邵庆均等[31]对宝石鲈(Scortum bacooo)的研究中发现,鱼胃肠蛋白酶活性均随着饲料中蛋白水平的增加而增加。Mohanta等[17]对爪哇鲤(P.gonionotus)的报道认为,蛋白酶活性随着饲料中蛋白水平的增加而增加,但达到最适蛋白水平后又开始下降。董晓慧等[32]对奥尼罗非鱼(O.niloticus×O.aureus)仔稚鱼研究发现,饲料中蛋白含量为25%~45%时,蛋白酶活性随着饲料蛋白水平的增加而增加,在饲料蛋白水平为45%时活性最高,高于45%后,蛋白酶活性下降。本试验以9种不同蛋白水平的饲料饲喂方格星虫稚星虫,蛋白酶活性随着饲料蛋白水平的升高也是呈先增后降的趋势,在饲料蛋白质含量为50.12%时活性最高,这与上述研究结果一致,说明一定蛋白含量范围内,随饲料中蛋白水平的增加,试验动物能够通过提高体内消化酶的活性来适应,以提高对饲料蛋白的消化吸收[33];但当饲料中蛋白水平过高时,饲料中过高的蛋白质浓度会抑制蛋白酶的活性。
有关饲料蛋白水平对淀粉酶活性的影响的研究,Moitra等[34]研究表明,蓝点石斑(Channa punctatus)淀粉酶活性随着饲料蛋白水平的增加而降低;宋理平[35]发现随着饲料蛋白水平从25.1%增加到45.6%,宝石鲈淀粉酶活性呈显著下降的趋势。本研究中,同样发现方格星虫稚虫淀粉酶活性随着饲料蛋白水平增加而显著降低,其中的机制还有待于进一步的研究。从淀粉酶活性的检测数据来看,相较于蛋白酶和脂肪酶,方格星虫具有较高的淀粉酶活性,说明方格星虫能够有效地利用饲料中的淀粉。
饲料蛋白水平对水产动物脂肪酶活性的影响已经有了较多的研究,但是结果却不一致。以在鱼类中的研究为例,鱼的脂肪酶活性随着蛋白水平的增加而升高[17,29],但董晓慧等[32]在对奥尼罗非鱼(O.niloticus×O.aureus)仔稚鱼的研究中发现,脂肪酶活性随着饲料中蛋白水平的增加而下降;Sá等[36]在对黑尾重牙鲷(Diplodus sargus)的研究中发现,脂肪酶活性不受饲料中蛋白水平的影响。本研究中,方格星虫稚虫的脂肪酶活性随着饲料中蛋白水平的增加而下降。之所以会造成结果差异,可能是由于水产动物的种类与食性不同等原因所造成的。
腺苷酸环化酶蛋白-1 篇5
Takasaki研究表明, 小麦醇溶蛋白在PPO的催化作用下, 其分子内部和分子之间会发生交联[2], Dabbous等也研究发现, 蘑菇PPO能催化胶原蛋白发生交联作用[3]。Burzio等采用蘑菇PPO交联棱纹贻贝、智利贻贝和合唱壳菜蛤3种蚌类中的多酚类蛋白质进行了试验, 结果表明:蛋白质交联效果最好的是棱纹贻贝, 智利贻贝和合唱壳菜蛤的交联效果次之。对交联后的蛋白质进行氨基酸分析, 发现交联的形成可能仅限于蛋白质分子中多巴衍生物的氧化[4]。另外, Mattinen等研究发现, 里氏木霉PPO在3 h内可使β-酪蛋白发生交联, 而牛血清白蛋白在24 h内都不能产生交联, 说明PPO对不同结构的蛋白交联作用差异较大[5]。采用PPO交联蛋白, 不同种类的蛋白质交联条件不一样, 如溶菌酶交联的最适p H值为7.0, α-乳白蛋白和β-乳球蛋白交联的最适p H值为4~5, 并且α-乳白蛋白经交联后能产生分子量大于300 k Da的聚合物[6]。该文采用多酚氧化酶对牛乳蛋白进行交联, 研究交联条件对牛乳蛋白起泡性和起泡稳定性的影响, 为牛乳蛋白在食品工业中的应用提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
脱脂奶粉:伊利高蛋白高钙脱脂奶粉;茄子:购自当地市场;咖啡酸:购自BBI公司;邻苯二酚、丙酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
TV1800紫外可见分光光度计:上海美谱达仪器有限公司;Allegra 64R高速冷冻离心机:美国Backman公司;FJ-200高速分散均质机:上海标本模型厂。
1.3 试验方法
1.3.1 PPO粗酶液的制备。
在研钵中放入切碎的茄子, 茄子需要将皮去除。将液氮加入切碎的茄子中, 迅速研磨至粉末状。加入-20℃预冷丙酮, 用布氏漏斗进行抽滤后进行真空冷冻干燥, 即得茄子丙酮粉, -20℃保存备用。取冷冻干燥丙酮粉0.2 g, 加入4℃预冷的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液 (p H值7.0) 10 m L, 磁力搅拌25~30 min, 7 000 r/min离心20 min后取上清, 即为粗酶液[7]。
1.3.2 PPO交联对牛乳蛋白起泡性及起泡稳定性影响的试验方案。
采用0.1 mol/L Na OH或HCl调整牛乳蛋白的p H值, 使其p H值分别为6、7、8、9、10。在牛乳蛋白溶液中加入100mmol/L咖啡酸使其终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L, 然后加入PPO粗酶液, 使酶与溶液比分别达到100、200、300、400、500 U/m L, 最后补充蒸馏水使牛乳蛋白溶液终浓度为1%, 混匀。15~40℃分别反应0~10 h后, 80℃加热5 min灭酶, 测定牛乳蛋白的起泡性及起泡稳定性, 空白对照为不加酶和咖啡酸。
1.3.3 蛋白起泡性及其稳定性的测定[8]。
取蛋白溶液10 m L, 以10 000 r/min高速均质2 min, 然后分别测定0、30、60、90、120 min后溶液的总体积, 起泡性及其稳定性采用以下公式进行计算:
式中:A—均质后溶液的总体积, B—均质前溶液体积。
起泡稳定性 (%) = (A-B) /B×100
式中:A—均质后30、60、90、120 min后溶液的总体积, B—均质前溶液的体积。
1.3.4 PPO活力测定[9,10]。
采用0.05 mol/L、p H值7.0的磷酸盐缓冲液配制0.04 mol/L邻苯二酚溶液, 取2.8 m L该溶液, 加入0.2 m L酶液, 混匀后在420 nm处进行比色, 每30 s记录1次OD420, 以最初直线段的斜率计算酶活。1个酶活力单位定义为在测定条件下, 每分钟引起光密度值改变0.001所需的酶量。
2 结果与分析
2.1 PPO活力对交联后牛乳蛋白起泡性及其稳定性的影响
p H值对交联后牛乳蛋白起泡性及其稳定性的影响见图1。PPO交联后牛乳蛋白起泡性均比对照组要高。当PPO活力为300 U/m L时, 交联后牛乳蛋白起泡性达到了160%, 而对照组仅为98%, 比CK提高了63%。均质30 min后, CK起泡稳定性仅为33%, 而交联后的牛乳蛋白起泡稳定性均比CK高, 特别是当PPO活力为300 U/m L时, 起泡稳定性为52%左右。均质60 min后, 交联前后牛乳蛋白的起泡稳定性均较低。
2.2 p H值对交联后牛乳蛋白起泡性及其稳定性的影响
PPO活力对交联后牛乳蛋白起泡性及其稳定性的影响见图2。当p H值为10时, 交联前后牛乳蛋白的起泡性几乎没有变化, 但是均质30~90 min后交联牛乳蛋白的起泡稳定性得到显著提高。当p H值分别为6、7、8、9时, 交联后牛乳蛋白的起泡性均比对照组高, 而起泡稳定性差异不明显。特别是在p H值为8、9的条件下, 交联后牛乳蛋白的起泡性分别为对照组的2.9、2.4倍, 但是起泡稳定性相差不大。
2.3 反应温度对交联后牛乳蛋白起泡性及其稳定性的影响
反应温度对牛乳蛋白起泡性及其稳定性的影响见图3。在试验温度范围内 (15~40℃) , 交联后牛乳蛋白的起泡性及起泡稳定性均比CK高。当温度为25℃时, 交联后牛乳蛋白的起泡性最高, 达到了452%, 均质后30~120 min的起泡稳定性分别为192%、150%、103%和75%, 均远远高于CK。其次为40℃, 起泡性为411%。
2.4 反应时间对交联后牛乳蛋白起泡性及其稳定性的影响
反应时间对交联后牛乳蛋白起泡性及其稳定性的影响见图4。当反应时间为2 h时, 交联后牛乳蛋白的起泡性最高, 达到了341%;而后随着反应时间的延长, 牛乳蛋白的起泡性均比对照组要低。但是, 交联后牛乳蛋白在30~120 min的起泡稳定性均比未交联的牛乳蛋白要高。
2.5 咖啡酸浓度对交联后牛乳蛋白起泡性及其稳定性的影响
咖啡酸浓度对牛乳蛋白起泡性和起泡稳定性的影响见图5。在不加咖啡酸的情况下, 牛乳蛋白的起泡性仅为142%, 稳定性也较差。当加入0.1~1.0 mmol/L咖啡酸时, 牛乳蛋白的起泡性及其稳定性显著提高。当咖啡酸为0.6 mmol/L时, 牛乳蛋白的起泡性最好, 达到了469%, 其次为0.2 mmol/L, 起泡性为453%, 两者没有显著差异。而咖啡酸浓度为0.6mmol/L时, 牛乳蛋白的起泡稳定性整体没有0.2 mmol/L时高。因此, 选用0.2 mmol/L的咖啡酸浓度即能满足交联的需要。
3 结论与讨论
利用多酚氧化酶交联牛乳蛋白, 可显著改善牛乳蛋白的功能特性。在小分子酚类物质的介导下, 通过改变PPO活力、咖啡酸浓度、溶液p H值、反应温度和时间等交联条件, 可以充分地改变牛乳蛋白的起泡性和起泡稳定性。当PPO活力为300 U/m L, 咖啡酸浓度为0.2 mmol/L, p H值为8~9, 25℃反应2 h时, 交联后牛乳蛋白的起泡性和起泡稳定性显著提高, 其中起泡性比交联前提高了2.3倍。
摘要：多酚氧化酶可催化蛋白发生分子内和分子间交联反应, 从而改善蛋白质的功能特性。利用多酚氧化酶交联牛乳蛋白, 当PPO活力为300 U/m L, 咖啡酸浓度为0.2 mmol/L, p H值为89, 25℃反应2 h时, 交联后牛乳蛋白的起泡性和起泡稳定性显著提高, 其中起泡性比交联前提高了2.3倍。
关键词：多酚氧化酶,蛋白,交联,功能特性
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腺苷酸环化酶蛋白-1 篇6
1资料与方法
1.1 临床资料
70例肝硬化病例的诊断均依照2000年在西安召开的全国肝病学术会议所修订的肝硬化诊断标准[3] , 并排除具有以下情况者: (1) 恶性肿瘤; (2) 肾脏疾病; (3) 感染性疾病; (4) 蛋白消耗性疾病等相关方面疾病。所有检验对象检验前1个星期均未服用影响肝肾功能的相关药物, 未使用烟酒及高蛋白食物等。本组70例中, 男53例, 女17例;年龄40～77岁。同时选取来自我院门诊健康体检及无特殊疾病史的健康者 92例作为正常对照组。正常对照组均经实验室检验和相关影像学检查, 其肝肾功能均无异常, 以排除心脑血管、肝炎、肾功能不全等方面疾病。正常对照组92例中, 男48例, 女44例, 年龄18～65岁。
1.2 方法
1.2.1 试剂和仪器:
上午空腹抽取检测对象静脉血液放于无菌干燥管中进行单胺氧化酶和前白蛋白检测。单胺氧化酶和前白蛋白的试剂盒由苏州艾杰生物科技有限公司提供, 实验室检验严格按照说明书操作流程执行。采用TOSHIBA-40FR全自动生化分析仪进行检测, 按照说明书进行操作。单胺氧化酶正常参考值为0～40U/L。
1.2.2 统计学处理:
两组计量资料数据以
2结果
70例肝硬化患者有64例单胺氧化酶活性升高, 异常率为91.43%;前白蛋白降低为56例, 异常率为80%。92例对照组患者中, 血清单胺氧化酶和前白蛋白均处于正常范围内。肝硬化患者的单胺氧化酶明显增高, 前白蛋白明显减低, 与对照组比较, 两组差异均有统计学意义 (P<0.01) 。结果见表1。
注:与对照组比较, P<0.01。
3讨论
单胺氧化酶为反映肝纤维化的酶, 肝、脑、肾等器官的线粒体和结缔组织中均含有单胺氧化酶。血清中单胺氧化酶能促进结缔组织的成熟, 参与胶原形成最后阶段的架桥构建。当纤维形成后单胺氧化酶从中脱离出来, 从而导致血清单胺氧化酶活性增高。根据检验结果分析表明当肝硬化发生时, 单胺氧化酶的活性明显增高, 在70例肝硬化患者检验血清中有64例单胺氧化酶活性增高明显, 异常率达91.43%, 与相关的文献报道[4]基本一致, 单胺氧化酶异常率均达到80%以上。因此, 单胺氧化酶活性的测定能反映肝脏是否存在纤维化改变, 对于临床医生早期诊断肝硬化有着重要的参考价值。
血清前白蛋白是在肝脏中由肝细胞合成的蛋白之一, 对其进行电泳分离时, 常显示在白蛋白的前方, 其半衰期短, 仅1.9d。当肝脏受损导致肝细胞合成蛋白出现障碍时, 由于血清前白蛋白半衰期短, 其在血清中的含量变化较白蛋白在血清中的含量更为敏感, 从而能快速地、早期地反映肝细胞存在损伤。本文检验结果提示, 肝硬化组有56例患者的血清前白蛋白水平明显低于正常对照组患者, 说明血清前白蛋白能正确反映肝脏的合成功能, 可成为临床医生早期判断患者出现肝损害提供科学依据, 也为早期治疗肝硬化赢得宝贵的时间。
综上所述, 单胺氧化酶和血清前白蛋白的联合检测对肝硬化的早期诊断具有重要的临床价值, 实验室对两个指标的联合检验能为快速诊断早期肝硬化提供条件, 临床医生应给予重视。
关键词：单胺氧化酶,前白蛋白,肝硬化,检验
参考文献
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腺苷酸环化酶蛋白-1 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料:
选择2010年2月至2010年12月在我院进行治疗的急性脑梗死患者128例作为研究对象, 诊断标准符合全国第四届脑血管病学术会议脑血管疾病的诊断标准, 经颅脑CT或MRI证实, 随机分为两组, 观察组64例, 对照组64例。纳入标准:均明确诊断为脑梗死, 发病48 h内, 有明显的神经功能缺损体征;排除标准:年龄在80岁以上, 有意识障碍, 有严重心、肝、肾功能损伤。两组患者性别、年龄、梗死面积、梗死区域等一般资料比较无显著性差异 (P>0.05) , 具有可比性。两组之间一般资料比较见表1。
1.2 治疗方法:
所有患者入院后均给予控制血压, 血糖, 脑细胞活化剂, 根据梗死面积大小, 给予不同剂量的扩血管、脱水剂治疗。观察组在上述常规治疗的基础上加用鼠神经生长因子36μg加入0.9%氯化钠注射液2 mL肌内注射, 1次/天, 1个疗程为21 d, 连续使用1个疗程。
1.3疗效评价:
两组治疗前后均采用欧洲脑卒中量表 (European Stroke Scale, ESS) 和日常生活活动能力 (activity of daily living, ADL) 进行评分。
1.4 血清NSE和S100β蛋白的测定:
治疗前后分别抽取患者空腹血5 m L, 1500 r/min离心5 min, 提取血清, 统一待测。血清NSE和S100β蛋白的浓度均采用酶联免疫吸附法测定。
1.5 统计学方法:
本研究所有数据处理均采用统计学软件SPSS13.0进行, 计数资料采用χ2检验, 计量资料采用 (±s) 表示, 首先进行正态检验, 本研究中计量资料均符合正态分布, 两组间均数比较采用t检验, P<0.05表示两组间均数有显著性差异。
2 结果
2.1 两组ESS和ADL评分的比较:
经比较, 两组治疗前ESS和ADL评分无明显差异 (P>0.05) ;两组治疗后ESS和ADL评分均有明显升高 (P<0.05) , 并且与对照组治疗后比较, 观察组治疗后升高更明显 (P<0.05) 。见表2。
2.2 两组血清NSE和S100β蛋白的比较:
经比较, 两组治疗前患者血清NSE和S100β蛋白无明显差异 (P>0.05) ;两组治疗后患者血清NSE和S100β蛋白均明显降低 (P<0.05, P<0.01) , 并且与对照组治疗后比较, 观察组治疗后降低更明显 (P<0.05) , 见表3。
注:与本组治疗前比较*P<0.05;观察组与对照组治疗后比较#P<0.05
注:与本组治疗前比较*P<0.05, **P<0.01;治疗后观察组与对照组比较#P<0.05
3 讨论
脑梗死是临床上的常见病、多发病, 如果患者得不到积极有效的治疗, 可以遗留有后遗症, 严重影响患者预后。脑梗死早期, 在梗死部位的脑组织血流发生急剧下降, 脑组织局部氧代谢下降明显, 邻近梗死区的脑组织结构虽然正常, 但是常表现出循环代谢也相应降低, 当脑血管出现闭塞, 表现为脑卒中突发, 相应脑组织缺血6 h后, 神经损伤将表现为不可逆性, 由于条件限制以及患者对此种知识的缺乏, 患者就诊时多已在6 h后, 因此, 目前治疗急性脑梗死的热点是脑梗死6 h后的治疗, 脑梗死6 h后梗死区域周围的神经组织虽然已表现为功能障碍、代谢损伤, 但是如能及时治疗, 其神经功能有可能得到恢复。因此, 挽救缺血半暗区神经元的功能, 及时实施神经保护治疗, 延迟神经细胞死亡, 减少缺血后的细胞损害, 是治疗脑梗死的重要环节[3]。神经生长因子 (NGF) 是一种在神经系统最早发现的重要的神经营养因子, 鼠神经生长因子 (MNGF) 是一种纯化的神经生长因子, 从小鼠颌下腺中提取[4], 具有多种生物特性, 可以促进神经系统神经元生长发育、分化、存活、再生作用, 可以促进病变纤维的愈合、加速髓鞘的修复、维持神经细胞的生存等, 具有神经保护和修复的双重作用[5]。在生理状态表现正常时, 鼠神经生长因子不能从血脑屏障透过, 但在急性脑梗死时, 因缺氧损伤了血管内皮细胞, 开放了血脑屏障, 神经生长因子可以透过血脑屏障, 进入中枢神经系统, 从而发挥作用[6]。笔者采用ESS和ADL评分综合评价疗效, ESS评分包括意识、视力或视野、肢体肌力、感觉、语言功能等, 主要评价患者客观指标;ADL评分包括患者日常生活活动能力, 主要评价患者的主观指标。本研究显示, 两组治疗前ESS和ADL评分无明显差异 (P>0.05) ;两组治疗后ESS和ADL评分均有明显升高 (P<0.05) , 并且与对照组治疗后比较, 观察组治疗后升高更明显 (P<0.05) 。
目前对于各种治疗的评价多采用微观指标, NSE是一种神经内分泌细胞和神经元的标志酶, 对于神经元损伤的敏感性和特异性均较高[7], 其大部分存在于中枢神经系统内, 当患者发生脑梗死时脑组织局部急性缺血坏死, 破坏了神经细胞的完整性, 导致大量的NSE通过破损的神经系统进入脑脊液, 进一步扩散进入外周血循环, 因此, 神经元损伤程度可以通过测定血清中的NSE水平而进行评价, 且脑损伤程度与血清NSE浓度有明显正相关系[8]。Sl00β蛋白主要在哺乳动物的少突胶质细胞和星形胶质细胞合成和分泌。在正常生理状态下, S100β蛋白具有神经营养作用, 以低浓度存在, 参与到神经细胞的修复和再生中, 可以参与细胞内信号传导, 调节细胞能量代谢, 促进神经生长[9]。在病理状态下, 血脑屏障被破坏, S100β蛋白进入血液循环, 浓度急剧升高, 能够被刺激产生大量一氧化氮胶质细胞和致炎因子, 并通过一氧化氮依赖途径损伤了神经元, 导致其功能障碍或死亡, 并且其对神经细胞有直接毒性作用[10]。本研究显示, 两组治疗后患者血清NSE和S100β蛋白均明显降低 (P<0.05, P<0.01) , 并且与对照组治疗后比较, 观察组治疗后降低更明显 (P<0.05) 。因此, 从微观方面, 鼠神经生长因子也可以明显改善急性脑梗死患者病情。
摘要：目的 探讨鼠神经生长因子对急性脑梗死血清神经元烯醇化酶 (NSE) 和S100β蛋白的影响。方法 128例急性脑梗死患者随机分为两组, 观察组64例, 对照组64例, 对照组采用常规治疗, 观察组在常规治疗的基础上加用鼠神经生长因子。治疗前后测定血清NSE和S100β蛋白。结果 两组治疗前ESS和ADL评分无明显差异 (P>0.05) ;两组治疗后ESS和ADL评分均有明显升高 (P<0.05) , 并且与对照组治疗后比较, 观察组治疗后升高更明显 (P<0.05) 。两组治疗前患者血清NSE和S100β蛋白无明显差异 (P>0.05) ;两组治疗后患者血清NSE和S100β蛋白均明显降低 (P<0.05, P<0.01) , 并且与对照组治疗后比较, 观察组治疗后降低更明显 (P<0.05) 。结论 鼠神经生长因子可以明显降低急性脑梗死血清NSE和S100β蛋白的表达。
关键词：脑梗死,神经生长因子,神经元烯醇化酶,S100β蛋白
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