腺苷酸活化蛋白激酶（精选4篇）
腺苷酸活化蛋白激酶 篇1
糖尿病患者致死、致残的重要原因是其大血管和微血管病变,研究证实这些血管并发症的起始病变部位在血管内皮。近来有研究显示糖尿病可致血管内皮细胞凋亡增加,而凋亡的内皮细胞具有促凝血和促血栓形成的作用,从而加剧血管损伤。
抵抗素(resistin)是近来发现的一种脂肪因子,初期的研究表明它是联系肥胖和胰岛素抵抗的因子之一[1],而后来的研究发现抵抗素与机体炎症状态的联系更为密切,如人炎症细胞中抵抗素m RNA的表达大大高于脂肪细胞[2],正常人和糖尿病患者血浆抵抗素水平均与C反应蛋白呈正相关。活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)是致血管损伤炎症环境一个重要成分,内皮细胞暴露于ROS的时间和强度影响到内皮细胞的增殖和凋亡。那么,抵抗素作为一种炎症因子是否影响内皮细胞ROS的生成,以及是否具有促进内皮凋亡的作用,本文对此进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 材料
行剖宫产的健康产妇的挺直、无扭曲、无凝血块堵塞的脐带。
1.2 主要试剂
人重组resistin(Phoenix Inc.),内皮细胞生长支持物(endothelial cell growth factors,ECGs,Santa Cruz公司),抗人冯布兰特因子抗体(anti-human Von Willebrand factor IgG,Gibco公司),phospho-AMPK-α(Thr172)抗体(CST公司),anti-actin(CST公司),anti-rabbit-IgG-HRP(CST公司),H2DCFDA(Anaspec公司),5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷酸(5-amino-4-imidazolecarboxamide ribonucleotide,AICAR)(CST公司),annexin V-FITC apoptosis kit(BD公司)。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
取脐带,PBS液灌洗脐静脉后将胰酶灌入静脉腔消化,收集消化液,离心沉淀细胞。用含20%胎牛血清的M199培养液(75μg/m L ECGS,0.1 mg/m L肝素)培养,每3～5 d传代1次。第3～5代的细胞用于实验。采用观察内皮细胞典型形态学特点和VWF抗原免疫显色法对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)进行鉴定。
1.3.2 细胞分组及干预
实验分为四组。(1)对照组(Co组):resistin 0 ng/m L干预细胞。(2)Res50组:resistin 50 ng/m L干预细胞。(3)Res100组:resistin100 ng/mL干预细胞。(4)Res50+AI组:resistin 50ng/mL和10μM AICAR共同干预细胞。培养板中的HUVECs生长至80%融合时,用含1%胎牛血清的M199培养基过夜同步处理。之后,各组不同因素干预24 h。
1.3.3 HUVEC凋亡和R OS生成的检测
细胞干预完成后,0.05%胰酶+0.43 m M EDTA消化细胞。用含血清培养基中止消化。2 m L PBS漂洗细胞,1 000rpm离心5 min,弃上清液。0.5 m L PBS重悬细胞。37℃细胞避光负载H2DCFDA(5μM)30 min。用流式细胞仪检测ROS生成。凋亡检测按照试剂盒说明书进行。
1.3.4 HUVEC的AMPK-α(Thr172)磷酸化水平检测
处理后的各组细胞用预冷的PBS冲洗2遍,加入细胞裂解液5 min,于120 000 rpm,低温离心15 min,BCA法检测总蛋白量,每样品取20μg上样,SDS-PAGE电泳。转膜,100 V恒压维持通电80 min。TBS漂洗。室温封闭1 h。加一抗(1∶1 000稀释),4℃过夜孵育。HRP标记的特异性二抗(1∶2 000)及HRP标记的抗生物素抗体(1∶1 000)室温下孵育1 h。显影、定影、洗片。结果用凝胶成像软件定量扫描条带灰度,以p-AMPK蛋白条带/β-actin蛋白条带的比值反映各自的磷酸化水平。
1.4 统计学分析
数据以均数±标准差表示。组间比较采用方差分析,以P<0.05为差异有显著性。统计分析在SPSS for windows 11.0统计软件包上完成。
2 结果
2.1 HUVEC凋亡分析
Annexin V-FITC/PI染色,流式细胞仪分析,Res50、Res100组细胞凋亡率与Co组相比差异无显著性(P>0.05)。Res50+AI组细胞凋亡率低于Res50组,差异有显著性(P<0.05),见表1。
TUNEL法检测细胞凋亡指数,光镜下可见正常细胞的胞浆着棕黄色,细胞核呈蓝色,凋亡细胞的细胞核呈棕褐色致密浓染、核固缩。随机计数500个细胞及凋亡的细胞,计算凋亡指数(凋亡细胞数/总细胞数×100%),见表1。
2.2 HUVEC ROS生成检测
H2DCFDA是一种细胞渗透性荧光染料,进入细胞后可被H2O2氧化为发光物质。因此,可用来检测细胞内ROS生成量。本实验结果显示,50 ng/mL和100ng/mL resistin干预内皮细胞24 h后,与对照组相比细胞内ROS生成的差异无显著性(P>0.05)。而添加AMPK特异激动剂AICAR组(Res50+AI组)与未添加AICAR组(Res50组)相比,细胞内ROS生成降低,差异有显著性(P<0.05),见表2。
注:覮与Res50比较,P<0.05
2.3 re s is tin对HUVECs AMP K磷酸化水平的影响
Res50组、Res100组经抵抗素干预24 h后,HU-VECs AMPK磷酸化水平降低,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。Res50+AI组细胞AMPK磷酸化水平高于Res50组,差异有显著性(P<0.05),见表2。
注:1)与Co比较,P<0.05;2)与Res50比较,P<0.05
3 讨论
本文研究发现,抵抗素并不能增加内皮细胞的凋亡和ROS生成,但可抑制内皮细胞AMPK的磷酸化激活,且AMPK的激活能够对内皮细胞凋亡起保护作用。
内皮细胞凋亡在血管损伤的机制中起重要作用。胰岛素抵抗、2型糖尿病等目前被认为是机体的一种慢性非特异性炎症状态,高血糖、高氧化低密度脂蛋白、氧化应激等情况诱导内皮细胞凋亡增加,血浆中炎症标志物的增加预示着冠状动脉粥样硬化性心脏病等血管疾病的发生。抵抗素近来也发现可参与内皮激活,导致内皮细胞功能紊乱[3]。临床研究也发现它与内皮功能的相关性[4]。ROS生成的调节是血管再生和内皮细胞存活过程中的必需条件之一,因为ROS生成增加可导致氧化应激,进而促进血管疾病的发生,因此,在多种刺激因子导致的细胞凋亡过程中常可观察到细胞内ROS生成的增加[5]。KOUGIAS等[6]研究发现40 ng/mL抵抗素干预猪冠状动脉可导致O2-的生成增加,而抗氧化剂Se Met可逆转抵抗素导致的O2-生成增加。本实验采用的H2DCFDA是一种细胞内荧光染料,主要用于检测细胞内H2O2产生量,内皮细胞产生的ROS包括O2-、H2O2等,它们具有重要的病理生理作用,包括灭活重要的内皮源性血管舒张因子一氧化氮(NO)等,分析本文结果与既往研究不一致的原因可能在于所采用细胞种类的不同、检测ROS成分的差异等。
既往有多家有关抵抗素影响内皮细胞功能的报道,如抵抗素对内皮细胞NO生成、内皮黏附分子生成的影响等[7],但鲜有对内皮细胞凋亡影响的研究,本研究发现抵抗素干预内皮细胞并不能增加其凋亡,但伴随有AMPK磷酸化的降低,AMPK特异的激动剂AICAR可保护细胞凋亡和降低ROS生成。研究发现AMPK活性改变可能参与了抵抗素的病理生理机制,抵抗素基因缺失小鼠肝细胞中AMPK磷酸化水平明显增高,而高抵抗素血症大鼠的肝脏、肌肉、脂肪组织中AMPK磷酸化水平显著降低[8]。内皮细胞的AMPK能直接磷酸化激活内皮型一氧化氮合酶,导致内皮NO合成增加,从而介导拮抗由于血流应力等因素造成的内皮凋亡的增加。多种抗糖尿病药物的作用机制包括二甲双胍、罗格列酮等也有部分是AMPK介导的。在生理作用与抵抗素似乎相反的另一脂肪因子脂联素的作用机制中,AMPK也占相当重要地位,如脂联素能通过激活AMPK诱导内皮NO生成[9]。
过去已有报道AICAR能抑制成纤维细胞、心肌细胞等凋亡,提示了AICAR能影响细胞凋亡过程中的起始或者终末事件如氧化应激产生等。本研究的结果提示,AICAR的抗凋亡作用与其激活内皮AMPK有关,然而,除了可激活AMPK外,AICAR可导致细胞阿糖腺苷产生增加和细胞内AICAR代谢产物如ZMP(AICAR一磷酸盐)的聚集[10],如AICAR在内皮细胞抑制糖酵解作用的原因就在于ZMP细胞内的聚集。因此,需要更加深入的研究来解决AICAR的作用是否是依赖于对AMPK的激活。在高糖诱导的内皮细胞损伤研究中,高糖作用可增加内皮细胞凋亡率,伴随有AMPK活性降低,随后采用AICAR干预则可完全逆转高糖所致内皮功能改变,与本文结果有类似之处。笔者推测,AICAR在内皮细胞激活被抵抗素抑制的AMPK后,导致内皮NO等内皮保护因子生成增加,从而起到降低ROS生成和拮抗细胞凋亡的作用。
总之,笔者发现在抵抗素对内皮细胞的作用机制中AMPK可能占重要地位,虽然抵抗素不能引起内皮ROS生成和细胞凋亡的增加,但可抑制内皮AMPK磷酸化,且AICAR激活AMPK后对内皮细胞损伤起保护作用,这些也有助于为发展防治糖尿病相关血管病变的药物提供理论基础。
参考文献
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腺苷酸活化蛋白激酶 篇2
1 细胞骨架概述
真核细胞各种形态的维持及执行协同而有方向的运动依赖于围绕整个细胞质中的由纤维蛋白组成的复杂网络, 这种纤维网络称为细胞骨架。它是位于细胞核和细胞膜内侧面的一种纤维状蛋白基质, 这些纤维状结构在细胞内呈网状、束状或带状等不同形态。包括有微管、微丝和中间纤维。细胞骨架是一种重要的细胞成分, 在维持细胞形态、承受外力、保持细胞内部结构的有序性、物质运输、细胞收缩及细胞运动方面发挥了重要的作用, 参与细胞分裂、细胞摄粒、排粒、肌肉收缩、物质代谢等生命活动, 而且还调节受体介导的信号。
细胞骨架是由微管、微丝和中间纤维所构成。微管 (microtubule) 是由13条原纤维 (protofilament) 构成的中空管状结构, 每一条原纤维由微管蛋白二聚体线性排列而成。微管关联蛋白 (microtuble associated proteins, MAPs) 与微管蛋白共同构成了复杂的微管系统。MAPs不但影响微管的组装和稳定, 而且将微管与其他结构相连。微管参与了支架作用、细胞内运输、形成纺锤体、纤毛和鞭毛运动等。微丝 (microfilaments) 可以成束、成网或纤维状分布, 与微管共同构成细胞的骨架。它是由肌动蛋白 (actin) 组成的骨架纤维。微丝不但具有支撑功能, 还参与了肌肉的收缩与细胞运动等生物过程。
2 丝裂原活化蛋白激酶概述
MAPK是一组能被不同的细胞外刺激, 如细胞因子、生长因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。MAPK通路是一种保守的三级激酶模式, 即MKKK—MKK—MAPK激活模式。在哺乳动物细胞中, 已发现四个MAPK家族亚型, 分别是细胞外信号调节激酶 (extracellular signal-regulated protein kinase, ERK) 、cJun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK) 、p38、ERK5/BMK1 (big MAP kinase) 。ERK通路的激活与细胞增殖有密切关系, 它还可以抑制细胞的凋亡, 促进细胞的存活。此外, ERK通路在某些细胞类型中, 与细胞周期调控有关。JNK通路的生物学作用有参与细胞凋亡, 参与了Ras诱导的肿瘤的发生、发展等。p38通路能够激活与多种炎症因子的释放有关, 如白介素-1、肿瘤坏死因子-α、白介素-6等。此外还参与了细胞凋亡、转录调控、细胞骨架重组等重要生理过程。
3 细胞骨架与MAPK的相互关系
细胞骨架作为细胞内的一种重要成分, 发挥了维持细胞形态、维持细胞内部结构有序性等作用, 参与了细胞内物质运输、细胞收缩、细胞运动等细胞的生理活动, 这些过程需要细胞信号对其进行调控。而在信号转导的过程中也需要细胞骨架对一些信号分子和蛋白进行运输。MAPK作为信号转导中一条重要的通路, 通过与细胞骨架蛋白相互作用而发挥了对细胞骨架的调控作用。有些药物通过与微管结合而达到治疗相应疾病的作用。例如, 抗肿瘤药物CA-4 (考它布汀) 能与微管结合进而阻止新生血管的形成, 而防止肿瘤的增长与迁移。但这并不意味着微丝与MAPK的相互作用少于微管。
3.1 细胞骨架与ERK通路的关系
ERK通路是研究的最为透彻的哺乳动物细胞MAPK信号传导通路。该通路包括许多不同的MKKK和MKK, 被称为ERK的MAPK有5种 (ERK1~ERK5) 。ERK通路参与了细胞周期调控、凋亡、增殖、分化等细胞活动。在许多细胞系中, ERK通路通过调节细胞骨架参与多种细胞活动以及细胞的运动。
ERK通路抑制剂如PD98059和U0126可以降低MLCK和MLC的磷酸化并减少细胞的移动, 而活化的MEK1的表达可以促进MLCK和MLC的磷酸化, 并促进COS-7, MCF-7人乳癌细胞和HT1080纤维瘤细胞的移动。MLCK的激活参与了黏着斑的循环和极化细胞前部膜的突出, 这些对细胞的迁移都很重要。FAK-m-calpain的相互作用参与了靶向于m-calpain的局部黏附, calpain可以降解细胞骨架蛋白并对黏附进行降解而促进细胞迁移。ERK通路还可通过抑制整联蛋白与胞外基质配体的结合而参与细胞的迁移。Ras-Raf-MEK-ERK通路参与调控了整联蛋白的活化 (即整联蛋白对其底物的亲和力) , 但是其分子机制还有待阐明。因为整联蛋白激活的动力学参与了细胞移动, 所以ERK可能通过调节整联蛋白的活性对细胞移动发挥调节作用。
3.2 细胞骨架与JNK通路的关系
JNK通路有多种上游活化因子, 如TNF受体家族、G蛋白偶联受体、Rho家族的低分子量GTP结合蛋白等。此通路的激活与细胞凋亡有密切的关系, 还与应激、炎症有关系。一些调控了细胞迁移的信号通路 (如Rac、FAK、Src通路) , 都可以在JNK通路汇聚。JNK通路中某些靶位参与了细胞移动。在一些细胞系中, JNK的活化与细胞迁移的增多有关, 例如, 表皮生长因子介导的细胞迁移与JNK活化密切相关。
研究表明, JNK可以调控肌动蛋白。在肌动蛋白成核中心的成熟, 丝状伪足、板状伪足的形成以及果蝇背侧胸侧闭合时细胞的伸展, JNK都发挥了作用。TGF-β能刺激依赖JNK的MEKK1+/-角质细胞的中央形成应力纤维, 刺激MEKK1-/-细胞的边缘应力纤维的聚集。JNK通路的抑制剂似乎可以在某些细胞系中使细胞边缘形成应力纤维, 表明JNK在移行细胞中能抑制应力纤维在这些部位的聚集。Hamel M的研究表明, 激活的JNK能与微丝发生共沉淀。
3.3 细胞骨架与p38通路的关系
p38通路从参与了凋亡、增殖等多种细胞活动。研究表明它还参与了细胞骨架的重组和细胞迁移等。
3.3.1 p38通路与细胞骨架的相互作用
p38与微管之间的作用不仅表现在它与微管的共定位, 而且还能与微管结合蛋白相作用。有文献报道, 磷酸化的p38参与了Tau (微管结合蛋白的一种) 与微管的结合、解离。检验了阿尔茨海默症患者死后的组织后发现, Tau在发生病理性的高磷酸化后可以从微管上解离下来并自身聚合成不可溶的低聚物, 抑制p38就可以干扰此进程的发展。在阿尔茨海默病中, 激活的p38能够引起神经系统的微管稳定蛋白Tau的过度磷酸化, 从而导致微观重排及稳定性下降。p38通路中, 参与细胞骨架重组的的效应因子主要是p38的下游底物 (如低分子量热休克蛋白) 。MK2和HSP27的激活是p38通路与肌动蛋白之间相互作用的关键步骤。用微囊藻毒素LR暴露于神经内分泌细胞PC12时, 也发现过度磷酸化的Tau蛋白导致微管稳定性下降, 而Tau蛋白的磷酸化程度受p38信号通路的调节。
3.3.2 p38通路参与细胞迁移
有研究表明, p38参与了不同细胞系的细胞移动。p38抑制剂SB203580, SB202190可以抑制由PDGF、TGF-β和IL-1β介导的平滑肌细胞的迁移, 由f MLP (一种白细胞趋化肽) 介导的中性粒细胞迁移, 干细胞生长因子和抗原介导的柱状细胞的迁移, PDGF和IL-1介导的鼠胚胎成纤维细胞的移动。p38的无活性突变体p38 (AF) 可以抑制PDGF、TGF-β和IL-1β介导的平滑肌细胞移动。此外, p38还可被刺激迁移的物质所激活。p38介导的MK的激活与HSP27磷酸化在平滑肌细胞移动、内皮细胞移动中发挥了重要作用。p38引起的钙调素结合蛋白的磷酸化在尿激酶刺激的平滑肌细胞的移动中发挥了重要作用。其他的p38底物也有可能参与了细胞骨架介导的移动。
4 展望
细胞骨架与MAPK信号通路之间的关系在细胞活动中发挥了重要作用, 例如细胞分化、生长、移动等。不但MAPK能通过对细胞骨架蛋白磷酸化而调控了细胞骨架的动力学, 而且细胞骨架蛋白能直接和通过细胞骨架重组而激活MAPK通路。但是, 活化的MAPK在细胞骨架中的靶位还不是很清楚。MAPK通路的成分与细胞骨架蛋白相关联, 但还不确定MAPK能否激活这些细胞骨架蛋白。通过对细胞骨架和MAPK之间关系的进一步了解, 能更深入地了解在一些炎症反应、免疫反应、肿瘤发生、肿瘤细胞转移等病理状态下细胞的分化、生长、迁移等细胞基本活动的机制。
参考文献
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腺苷酸活化蛋白激酶 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
SPF级雌性健康BALB/c小鼠24只, 6周龄, 体重1 6~18g, 购自武汉生物制品研究所, 许可证号:SCXK (鄂) 2008-0003。
1.1.2 主要试剂及仪器
氢氧化铝 (天津双船化学试剂) ;脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS, 美国Sigma公司) ;卵清蛋白 (Albumin, Chicken Egg, OVA, 美国Sigma公司) ;抗类蛋白酶抗体 (北京博奥生物技术有限公司提供) ;p38MAPK抗体 (美国Epitomics公司) ;JSC-A型超声雾化器 (由辽宁鞍山市电子医疗仪器厂提供) ;Ultra Sensitive TM S-P超敏试剂盒 (福州迈新生物技术开发公司) ;图像采集系统 (咸宁学院中心实验室) 及Image-Pro Plus 6.0图像分析系统。
1.2 方法
1.2.1 小鼠的分组与动物模型的制备[5]
湖北科技学院中心实验室动物中心饲养1周后, BABL/c小鼠随机分为3组, A (哮喘组) 、B (0.1mg LPS+OVA组) 、C (对照组) , 每组8只。A、B两组小鼠均在第0, 7, 14天腹腔注射0.2ml OVA混悬液 (含OVA400mg+氢氧化铝20mg) 致敏, 第21天开始每天用1%OVA溶液雾化激发一次, 每次30分钟, 连续雾化激化5天。C组给予同等量生理盐水致敏和激发。B组小鼠在致敏阶段每隔2天腹腔注射1ml含0.1mg的LPS, 在激发阶段激发前1小时经腹腔注射相同剂量的LPS[6], A、C组给予等量生理盐水腹腔注射。末次激发24小时后, 处死小鼠并取右肺中叶以10%多聚甲醛固定24小时, 再进行常规的石蜡包埋、切片。
1.2.2 肺组织病理变化
石蜡切片HE染色, 每个组织块选取3张HE切片想在显微镜下观察肺组织病理变化。
1.2.3 肺组织Tryptase与p38MAPK免疫组化染色
采用SP法行肺组织Tryptase与p38MAPK免疫组化染色[4]。首先把肺组织切片行脱蜡、水化、抗原修复处理, 再严格按照Ultra Sensitive TM S-P超敏试剂盒说明书操作, 滴加内源性过氧化酶阻断剂, 室温下10分钟, 以阻断内源性过氧化酶的活性。滴加动物非免疫血清 (试剂B) , 室温下10分钟。分别滴加一抗 (p38MAPK或抗类胰蛋白酶抗体) , 4℃下过夜, 然后滴加二抗 (生物素标记的羊抗鼠/兔Ig G) , 室温下10分钟, 滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶 (试剂D) , 在室温下10分钟后, 用DAB溶液染色、苏木素复染返蓝, 经梯度酒精脱水干燥后, 二甲苯透明, 中性塑胶封固, 在显微镜下观察下所有切片, 每张切片随机化选取阳性 (呈棕色) 表达最强的5个高倍视野 (×400) , 应用图像分析软件 (即Imager-Pro Plus6.0) 测定每个视野内阳性部位的光密度值 (Optical Density, OD) , 求出每张切片的平均光密度值 (mean optical density, MOD) , 并以MOD值来表示阳性部位的蛋白表达水平。
1.3 统计学处理
数据采用SPSS17.0进行分析, 以 (±s) 表示, 各组间差异采用方差分析, 多重组间比较时方差不齐者采用Dunnett's T3检验, 方差齐者采用S-N-K、LSD检验, 组间比较采用q检验, P<0.05表示有统计学意义。
2 结果
2.1 肺组织HE染色
A组支气管黏膜下水肿, 管壁平滑肌肥大, 基底膜增厚, 黏膜皱襞增多, 气道、血管周围间质可见大量嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润。B组上述情况未减轻, 并出现肺泡腔及间质充血。C组气道周围无炎症细胞浸润, 肺泡壁结构完整 (见图1) 。
2.2 各组小鼠肺组织免疫组化染色结果
A、B、C三组小鼠肺组织类胰蛋白酶及p38MAPK阳性细胞MOD值见表1。B组小鼠肺组织中类胰蛋白酶及p38MAPK阳性细胞较A、C组多, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 主要见于血管及支气管周围、肺间质等部位。C组小鼠肺组织阳性表达较少, 仅少量表达在肺泡间隔。
图1各组小鼠肺组织病理学变化 (HE, ×400) A:哮喘组;B:0.1mg LPS+OVA组;C:对照组
与对照组比较, *P<0.005;与哮喘组比较, #P<0.005
3 讨论
肥大细胞与哮喘密切相关[7], 其分布在许多组织, 具有释放多种炎性介质和细胞因子的功能, 是Ⅰ型变态反应的初级效应细胞。在抗原等致病因素作用下肥大细胞被激活, 释放多种炎症介质和细胞因子而参与哮喘早期和晚期的整个病理生理过程。类胰蛋白酶是肥大细胞内特有的蛋白酶, 是肥大细胞内含量最丰富物质, 是肥大细胞脱颗粒的最优选指标[8], 具有增高气道对组胺的反应性、促进炎症细胞 (中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等) 聚集及刺激平滑肌细胞和成纤维细胞增殖的作用[3,9], 在哮喘炎症的发生、发展和气道重建中起到促进作用。He等研究表明, 类胰蛋白酶可促进中性粒细胞、嗜酸粒细胞、巨噬细胞等多种炎症细胞的活化及浸润[10]。Molinari等研究表明, 在给致敏绵羊吸入类胰蛋白酶后, 发现能够明显增强其气管收缩和气道高反应性[11];Brown等则发现类胰蛋白酶能够促进成纤维细胞的增殖与平滑肌细胞的增生[12];本实验发现C组Tryptase阳性表达较少, 主要分布在肺泡间隔, 而哮喘组小鼠肺组织Tryptase阳性表达显著高于C组小鼠, 主要分布在血管及支气管周围、肺间质等部位, 表明哮喘小鼠气道存在肥大细胞脱颗粒过程。
临床实践证实, 细菌感染是微生物暴露和哮喘急性发作的常见原因。LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁成分, 细菌裂解后释放, 在周围环境普遍存在, 吸入脂多糖后, 可引起哮喘的发生和恶化, 但LPS跨膜信号转导途径至今尚不清楚[13]。Candrian SS等研究发现LPS引起支气管收缩与中性粒细胞募集可通过p38MAPK介导[14]。P38蛋白激酶是MAPK家族最重要的成员之一, 该激酶可被LPS、G+细菌壁成分、应激刺激等所激活, 激活的P38蛋白激酶可由细胞浆向细胞核转位。肥大细胞是气道炎症的主要原发效应细胞, 有研究表明抑制p38 MAPK可以抑制肥大细胞的向抗原方向的定向迁移, 还可以对哮喘小鼠肺组织肥大细胞募集和活化有一定的抑制作用[5]。本实验观察到, B组哮喘小鼠肺组织类胰蛋白酶和p38MAPK表达表达水平明显增高, 此外与A组相比, B组小鼠肺组织病理变化加重。以上提示LPS可明显加重哮喘气道炎症, 部分机制可能是通过影响肥大细胞活化及p38MAPK信号通路实现的。
摘要：目的:探讨脂多糖 (LPS) 对哮喘小鼠肥大细胞活化及p38蛋白激酶 (p38MAPK) 表达的影响。方法:将24只BALB/c小鼠随机分为3组:A (哮喘组) 、B (0.1mg LPS+OVA组) 、C (对照组) , 每组8只, 采用免疫佐剂 (氢氧化铝) 与卵清蛋白 (OVA) 腹腔注射致敏及用1%OVA生理盐水雾化激发的方法制备哮喘小鼠模型。采用免疫组织化学染色SP法半定量测定肺组织中类胰蛋白酶及p38MAPK表达的情况, HE染色观察肺组织病理变化。结果:与A组相比, B组小鼠肺组织类胰蛋白酶及p38MAPK的MOD显著升高 (P<0.05) ;光镜下, A组支气管黏膜下水肿, 管壁平滑肌肥大, 基底膜增厚, 黏膜皱襞增多, 气道、血管周围间质可见大量嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润。B组上述情况未减轻, 并出现肺泡腔及间质充血。C组气道周围无炎症细胞浸润, 肺泡壁结构完整。结论:LPS可明显加重哮喘气道炎症, 表明部分机制可能是通过影响肥大细胞活化及p38MAPK信号通路实现的。
腺苷酸活化蛋白激酶 篇4
1材料与方法
采用Wistar大鼠乳鼠, 连续酶消化法提取成骨细胞并培养。根据组织形态学、改良Kaplow氏成骨细胞碱性磷酸酶染色、矿化结节茜素红染等方法进行鉴定。
SB203580是一种常用的p38 MAPK抑制剂。它可以通透细胞, 抑制p38MAPK (p38 MAP kinase) , 抑制后续MAP-KAP Kinase-2和MAPKAP Kinase-3的激活。通过抑制p38MAPK, SB203580可以有效抑制一些炎症因子 (如白介素-1β、肿瘤坏死因子-α) 诱导的部分信号转导[3]。SB203580选择性抑制p38 MAPK, 半抑制浓度 (50%inhibiting concentration, IC50) 为600 nm;对于JNK/SAPK和p44/42 MAPK (即Erk1/2) 无显著的抑制作用, IC50仅为100μm。SB203580分子量为377.43, 分子式为C21H16N3FOS, 化学文摘服务号码 (chemical abstracts service, CAS Number) :152121-47-6。本产品纯度大于99%。
PD98, 059也写作PD98059, PD98059, PD098059或PD098059, 是一种常用的MAPK kinase抑制剂或MEK抑制剂。PD98059可以通透细胞, 选择性抑制MEK1 (一种MAPK kinase) , 从而抑制MAP kinase (Erk1/2即p44/42MAPK) 的磷酸化和激活[4]。PD 98059分子量为267.28, 分子式为C16H13NO3, CAS Number:167869-21-8。本产品纯度大于98%。
实验分组:a) 正常对照组;b) PD组 (PD98059 5μmol/L;PD98059 10μmol/L;PD98059 20μmol/L) ;c) SB组 (SB203580 5μmol/L;SB203580 10μmol/L;SB203580 20μmol/L) ;d) PD+SB组 (PD98059 5μmol/L+SB203580 5μmol/L;PD98059 10μmol/L+SB203580 10μmol/L;PD98059 20μmol/L+SB203580 20μmol/L) 。
细胞计数法、MTT法检测细胞活性。RT-PCR检测成骨细胞TRPV6mRNA表达水平:使用磷酸甘油醛脱氢酶 (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH) [5]做内参, TRPV6引物使用Prim-5引物设计软件自行设计, 由上海生工生物有限公司合成, PAGE级纯度。正向引物序列为5′-TGTCTACCGCCCACTCAA-3′, 反向引物引物序列为5′-AAGGCTGAAGCAAATCCC-3, 使用Promaga公司莫洛尼 (氏) 鼠白血病病毒 (moloney murine leukemia virus, M-MLV) 逆转录酶、EX-Taq酶进行RT-PCR反应, 取5μL聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 产物电泳, 凝胶成像系统摄影并进行灰度值分析。
所得数据用x-±s表示, 采用t检验进行统计学分析。
2结果
2.1成骨细胞的培养及鉴定
倒置相差显微镜观察成骨细胞形态不规则, 呈三角形或梭形, 单核呈卵圆形, 1～3个核仁, 胞质丰富、清晰。成骨细胞ALP经钙钴法染色, 呈紫黑色细微颗粒。绝大多数的细胞胞浆中可见浅紫色至紫黑色细小颗粒或大片状黑色沉淀。计算得出ALP染色阳性率在90%以上。经茜素红染色后显微镜下可见散在红色矿化结节。用MTT法检测细胞活力的结果显示, 成骨细胞在接种后第4～5天进入对数生长期, 第10天达到生长峰值, 此后进入生长衰减期 (见图1～5) 。
2.2 SB203580阻断p38 MAPK通道对成骨细胞的影响
2.2.1 SB203580对成骨细胞增殖的影响
a) MTT法检测SB203580对成骨细胞活性的影响结果显示, 随着SB203580作用浓度增加, 细胞增殖活性有下降的趋势, 但是与空白对照相比差异无显著性, P>0.05。
细胞计数检测结果显示, SB203580 5μmol/L作用组细胞数较对照组无明显变化, 其余药物作用组细胞数较对照组明显减少, 呈剂量依赖性。
2.2.2 SB203580对成骨细胞ALP分泌功能的影响
结果显示, 正常对照组 (见图6a) 细胞密集, 成梭形、多角形, 细胞突起粗大, 细胞核浓染, 部分细胞核内可见2～3个核仁;绝大多数的细胞胞浆中可见深紫色至紫黑色细小阳性颗粒, 部分胞浆内可见大片状黑色沉淀, 10μmol/L药物刺激组 (见图6b) 与正常对照组相比细胞数量明显减少, 部分细胞突起数量减少, 变狭长, 细胞核体积变小, 多核仁细胞数减少;细胞浆呈弥散的紫黑色并偶见紫黑色颗粒。随药物作用浓度增加, 细胞数减少更加明显, 细胞突起减少, 细胞核体积明显缩小无多核仁细胞;ALP染色阳性颗粒减少, 呈弥散的淡紫色。 (见图6c～d) 。
2.2.3 SB203580对成骨细胞钙分泌功能的影响
结果显示, 正常对照组细胞密集, 可见多个大小不一的钙结节, 10、20、40μmol/L药物刺激组 (见图7) 与正常对照组相比细胞数量逐渐减少, 部分细胞仍可见突起, 钙结节与对照组比较数量减少, 体积小, 染色浅淡。
2.2.4 SB203580对成骨细胞TRPV6 mRNA表达的影响
结果显示, SB203580抑制TRPV6 mRNA的表达, 随着作用浓度增加TRPV6 mRNA的表达量逐渐减少 (见图8) 。
2.3 PD98059阻断p44/42 MAPK通道对成骨细胞的影响
2.3.1 PD98059对成骨细胞增殖的影响
a) MTT法检测PD98059对成骨细胞活性的影响结果显示, 随着PD98059作用浓度增加, 细胞增殖活性有下降的趋势, 但是与空白对照相比差异无统计学意义, P>0.05。b) 细胞计数法检测PD98059对成骨细胞增殖的影响结果显示, 对照组细胞密集并铺满板底。PD98059药物作用5μmol/L与对照组相比无明显变化, 10μmol/L组细胞数明显减少, P<0.05, 20、40、80μmol/L较对照组显著减少, P<0.01。
1-空白对照;2-5μmol/L;3-10μmol/L;4-20μmol/L
2.3.2 PD98059对成骨细胞ALP分泌功能的影响
结果显示, 正常对照组细胞密集, 成梭形、多角形, 细胞突起粗大, 细胞核浓染, 部分细胞核内可见2～3个核仁;绝大多数的细胞胞浆中可见深紫色至紫黑色细小阳性颗粒, 部分胞浆内可见大片状黑色沉淀 (见图9a～b) 。10μmol/L与正常对照组相比, 细胞数量明显减少, 部分细胞突起数量减少, 变狭长, 细胞核体积变小, 多核仁细胞数减少;细胞浆呈弥散的紫黑色并偶见紫黑色颗粒。随药物作用浓度增加, 细胞数减少更加明显, 细胞突起减少, 细胞核体积明显缩小无多核仁细胞;ALP染色阳性颗粒减少, 呈弥散的淡紫色 (见图9c～d) 。
2.3.3 PD98059对成骨细胞钙分泌功能的影响
结果显示, 正常对照组细胞密集, 成叠瓦状排列, 可见多个大小不一的钙结节 (见图10a) 。10μmol/L药物刺激组 (见图10b) 与正常对照组相比, 细胞数量明显减少, 部分细胞仍可见突起, 钙结节与对照组比较数量少、体积小;30、60μmol/L作用组细胞数减少更加明显, 细胞突起狭长, 数量减少, 无钙结节形成 (见图10c～d) 。
2.3.4 PD98059对成骨细胞TRPV6 mRNA表达的影响
结果显示, PD98059抑制TRPV6 mRNA的表达, 随着作用浓度增加TRPV6 mRNA的表达量逐渐减少 (见图11) 。
2.4 PD98059+SB203580阻断p44/42及p38 MAPK通道对成骨细胞的影响
2.4.1 PD98059+SB203580对成骨细胞增殖的影响
a) MTT法检测联合应用PD98059与SB203580对成骨细胞活性的影响结果显示, 随着PD98059和/或SB203580作用浓度增加, 细胞增殖活性有下降的趋势, 二者联合作用时细胞活性低于二者单独作用。b) 细胞计数法检测PD98059与SB203580联合作用对成骨细胞增殖的影响结果显示, 对照组细胞密集, 铺满板底。PD98059与SB20358联合作用时, 三种组合中细胞数均显著低于空白对照组, P<0.01, 同时也明显低于二者单独作用组细胞数量。
2.4.2 PD98059+SB203580对成骨细胞ALP分泌功能的影响
结果显示, 正常对照组细胞 (见图12a～b) 密集, 成梭形、多角形, 细胞突起粗大, 细胞核浓染, 部分细胞核内可见2～3个核仁;绝大多数的细胞胞浆中可见深紫色至紫黑色细小阳性颗粒, 部分胞浆内可见大片状黑色沉淀。联合用药组较单独用药细胞数明显减少, 细胞体积变小, 突起狭长, ALP染色阳性颗粒减少。随药物作用浓度增加, 上述变化更加显著 (见图12c～d) 。
2.4.3 SB203580与PD98059联合应用对成骨细胞TRPV6mRNA表达的影响
结果显示, SB203580与PD98059单独应用可以抑制TRPV6 mRNA的表达, 20μmol/L时抑制明显。二者联合应用作用显著, 5μmol/L联合作用组即可明显抑制, 随着作用浓度增加, TRPV6 mRNA的表达量逐渐减少 (见图13) 。
3讨论
钙通道存在于机体的各种类型组织细胞中, 是一种与钙离子转运有关的存在于细胞膜上的特定蛋白质, 通过构象变化成开放或关闭状态控制钙离子的流动, 发挥钙离子对细胞生物功能的调节作用。因此, 钙离子通道的存在对于成骨细胞的进一步分化、代谢、凋亡起重要作用。已经证明, TRPV5和TRPV6是促进跨细胞钙离子转运的三步过程中的一部分[6]。钙离子通过TRPV5或TRPV6进入细胞后, 钙离子结合到钙结合蛋白D28K上和/或钙结合蛋白D9K上弥散到基底外侧膜然后钙离子经钠钙交换蛋白 (Na/Ca exchanger1, NCX1) 和三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate, ATP) 依赖性质膜钙离子-碱性磷酸酶1b排出[7]。因此, 推测TRPV5和TRPV6也可能是成骨细胞钙离子信号传递的门控通道。
本实验使用MAPK通道阻滞剂PD98059和SB203580, 分别特异性的阻断p44/42和p38通路。结果显示, p44/42阻断剂PD98059能剂量依赖性地抑制成骨细胞的增殖, 减少传代培养的成骨细胞分泌ALP及钙离子, 抑制TRPV6 mRNA的表达。p38阻断剂SB203580同样能剂量依赖性地抑制成骨细胞的增殖、ALP及钙离子的分泌, 抑制TRPV6 mRNA的表达。而两种阻断剂同时应用的抑制作用更明显。
TRPV6是钙离子进入成骨细胞的分子门控通道, 在钙离子代谢平衡方面起重要作用。钙离子进入成骨细胞后, 结合到钙结合蛋白D28K和/或钙结合蛋白D9K上弥散到基底外侧膜。然后, NCX1和ATP依赖性质膜钙离子-碱性磷酸酶1b排出。可见TRPV6对成骨细胞的功能活性有重要影响。TRPV6表达减少意味着细胞内钙离子水平的降低。同时钙离子又是重要的第二信使, 在信号传导中起极其重要的作用, 它是各条信号传导途径的枢纽, 可直接或间接地影响细胞的某些基因的转录和表达, 完成生物信号的跨膜传递, 将细胞外刺激传递至细胞内, 激活不同的转录因子, 调节细胞的生长、分化和功能活性。
本实验证实了p44/42、p38MAPK途径对于成骨细胞TRPV6的表达起重要作用, 通过调节TRPV6通道从而调节细胞内钙离子的含量, 进一步调节成骨细胞的增殖和分化。本实验证实, 当增加TRPV5和TRPV6 mRNA表达量使进入成骨细胞内钙离子增加进而使成骨细胞内钙离子浓度增加时, ERK1和RANKL mRNA表达量相应增高, 当阻断TRPV5和TRPV6通道使进入成骨细胞内钙离子减少并使成骨细胞内钙离子浓度降低时, ERK1和RANKL表达量相应减少[8]。说明TRPV6通道对于MAPK信号传导途径也是有调节作用的。通过这两个实验推测, 在成骨细胞内存在着一个p44/42、p38MAPK—>TRPV6—>Ca2+—>p44/42、p38MAPK的正反馈调节通路, 促进成骨细胞的增殖、分化和成熟。
摘要：目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶对大鼠成骨细胞瞬时性受体电位香草精受体6 (transient receptor poten-tial vanilloid receptor 6, TRPV6) 表达的影响。方法 采用Wistar大鼠乳鼠, 连续酶消化法提取成骨细胞并培养。根据组织形态学、改良Kaplow氏成骨细胞碱性磷酸酶染色、矿化结节茜素红染等方法进行鉴定。实验分组:a) 正常对照组;b) PD组 (PD98059 5μmol/L;PD98059 10μmol/L;PD98059 20μmol/L) ;c) SB组 (SB203580 5μmol/L;SB20358010μmol/L;SB203580 20μmol/L) ;d) PD+SB组 (PD98059 5μmol/L+SB203580 5μmol/L;PD98059 10μmol/L+SB203580 10μmol/L;PD98059 20μmol/L+SB203580 20μmol/L) 。细胞计数法、MTT法检测细胞活性, RT-PCR检测成骨细胞TRPV6 mRNA。所得数据用x-±s表示, 采用t检验进行统计学分析。结果 随着PD98059和/或SB203580浓度的增加, 细胞增殖活性有下降的趋势, 二者联合作用时细胞活性低于二者单独作用。细胞计数法检测显示, PD98059与SB203580联合作用时, 三种组合中细胞数均显著低于空白对照组, P<0.01;同时也明显低于二者单独作用组细胞数量。碱性磷酸酶染色显示, 联合用药组较单独用药细胞数明显减少, 细胞体积变小, 突起狭长, ALP染色阳性颗粒减少, 随药物作用浓度增加上述变化更加显著。茜素红染色显示, 钙结节与对照组比较数量少、体积小;10、20μmol/L联合作用组, 细胞数减少更加明显, 无钙结节形成。SB203580与PD98059二者联合应用显著抑制TR-PV6 mRNA的表达, 5 mmol/L联合作用组即可明显抑制, 随着作用浓度增加TRPV6 mRNA的表达量逐渐减少。结论 p44/42途径阻断剂PD98059能抑制成骨细胞增殖, 明显降低成骨细胞TRPV6 mRNA表达, 减少钙结节形成。p38途径阻断剂SB203580能抑制成骨细胞增殖, 明显降低成骨细胞TRPV6 mRNA表达, 减少钙结节形成。PD98059与SB203580在抑制成骨细胞增殖、降低成骨细胞TRPV6 mRNA表达、减少钙结节形成的作用方面存在协同作用。
关键词：丝裂原活化蛋白激酶,瞬时性受体电位通道,信号传递
参考文献
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