表达状态（精选7篇）
表达状态 篇1
杨一江说:“影响我的不是脚下的这片土地, 而是文脉, 你跟谁学就有谁的基因。”杨一江从十多岁开始, 到晋江当知青, 被派到学习班学习农民画, 杨一江说, “在学习班学习, 不用干重活, 每天可以画画, 还有人管饭。没想到会有那么好的事情。”但他当时万万没想到的是, 这种对生活的低标准, 和绘画的热情, 一直延续了好几十年。
1978年恢复高考后, 中央民院到云南招生, 罗贻先生挑中了初出茅庐的杨一江。罗贻先生年轻时在布拉格美院留学, 主要研究塞尚及印象派风格的肖像、风景, 属于地道欧陆风格, 他对杨一江的严格要求, 也造就了杨一江画画踏实严谨的作风。
1982年, 大学毕业, 杨一江被分配到昆明装潢研究所工作, 后来, 因绘画的特长, 杨一江被调到《青年与社会》杂志社当了3年的美编, 再后来又到云南艺术学院附中教书。但杨一江对绘画的追求并没有随时光而褪色, 他常常感觉到自己一直没悟到绘画的真谛, 甚至一度认为自己是个永远学不会画画的人。随着对绘画的迷恋愈发激烈, 杨一江的困惑也越来越多。1992年杨一江重返母校, 再投罗贻先生、刘秉江先生名下读研。
“倘若一个人把他自己做的事视为无止境的, 倘若他认为自己的作品具有存在的价值, 并在今后加以继续发展, 那么他就会更加心平气和的工作。”——文森特梵高
研究生三年, 杨一江除了画画, 没想太多别的东西。临近毕业, 别人忙着找工作, 那时没手机, 学校宿舍的电话都被打坏了。杨一江还是每天泡在画室中, 大有一副与世隔绝的感觉。
1995年研究生毕业, 杨一江被分配到云南艺术学院本院教书。因教学的关系, 杨一江有了去欧州观摩大师原作的机会。油画原作所能带给观众的震撼是画册无法比拟的, 呼吸着欧洲浓厚的艺术历史气息, 杨一江几乎不能自已, 又一次甚至因为在博物馆看画时离画作太近, 引发了报警器材, 可谓是热情不能自已。
对绘画的不懈追求终于结成硕果, 杨一江四十多岁时一举考上了清华美院的美术学博士, 师从陈丹青。陈丹青被认为是中国写实油画脱离苏联模式转向溯源欧洲绘画传统的转折点的大师, 并且曾对当时长期盛行并严重教条化的创作模式进行了强烈抨击。陈丹青与杨一江可谓亦师亦友, 他离群索居的态度, 自由主义的思想都深深地影响了杨一江。陈丹青对弟子要求之高全国皆知, 但即便是陈丹青也曾在一次接受媒体采访时表示, 他对这个来自云南的白族学生的作品感到满意。
“凡画人最难, 次山水, 次狗马。”——东晋顾恺之《论画》
“人体, 由于他的力, 或她的美, 可以唤起不同的意向。”——奥古斯特·罗丹
很多人都说:人体是所有画里面最难画好的, 不仅因为人体的造型比较复杂, 而且人体的色彩变化多端, 要在画布上完美地展现一个人实属不易。反观杨一江的作品, 色彩上主次分明, 层次清楚, 具有节奏感, 给观者一种充满力度, 稳重如山的感觉。
人类始发之时, 无须包装, 很少掩饰, 生活得自然而真实。与古典主义, 表现主义不同, 杨一江的画中人物不再是刻画人物的地位与角色, 画中人物穿戴怎样的衣帽, 佩戴怎样的饰品, 又或是从事怎样的工作, 处于怎样的社会阶级, 这些都不再是画面引人关注的焦点, 表达的重心转移到“人”本身。每个人都单纯地表演着“人”的角色。
对于人的脆弱与存在, 数学家巴斯卡说过:“人类只是一颗芦苇, 原是时间最脆弱的东西, 但那是一棵有思想的芦苇。用不着全宇宙武装起来把人类轧碎, 一股气流, 一滴流水, 足以灭亡他。然而, 即使宇宙轧碎他, 他也比灭亡他的宇宙更高贵:因为他知道自己的死亡, 知道宇宙的优势, 而宇宙却什么也不知道。”
杨一江说:“如果没有大量写生基础, 光对着照片画是不行的。”在这个数码技术方兴未艾的时代, 照片对绘画的影响早已波及到各个方面。而就在这个时代, 杨一江依然坚持依照模特进行写生, 写生的原意, 就是书写生命。经历了岁月的洗礼, 杨一江的画风早已自成一体, 他笔下的人物不是写那个纯粹的人物, 也不是纯粹的自我思想的表达, 而是他用哲学家一样思辨的眼光, 深度的进入, 将对象外在的容貌, 和自己内在的精神世界两样一同反映出来, 是物我同一后激发出的艺术感悟。卢西安弗洛伊德也说:“我画人, 并非完全因为他们的摸样, 而是关注他们的特别情况下的样子。”
可以看到, 在杨一江的作品里, 呈现出了某种矛盾性的特点。一方面, 素描和油画功底扎实, 写实技巧成熟, 另一方面, 受到自由主义, 表现主义的熏陶, 在写实的同时, 很难摆脱表现的困扰。
常常有人问, 一张小幅的油画真的需要画一年甚至几年那么久吗?
为纪念小说家——巴尔扎克, 罗丹花了七年的时间进行准备, 他研究作家的生平及作品, 找到与作家相貌接近的模特量体定制衣服。然而罗丹的最终目的并不是追求与巴在形体上如何相似, 而是要捕捉他的思想和精神以及他那富于创造性的生命力。
罗丹说, “我想到他辛勤的劳作, 想到他生活的困窘, 坚持不懈地斗争, 还有他伟大的勇气, 我要表现所有这一切!”
每次去杨一江的画室, 都能看到杨一江先面对模特沉思许久, 然后佳思忽来, 走到画布前, 用小笔添上一两笔。对人体形态色彩的长期观察, 促使了杨一江的绘画在反应模特形态的同时, 靠笔触堆叠出形象的块面结实感, 并带有一种雕塑式的崇高之感。
法国画家库尔贝谈到艺术作品与金钱时说:“一时一刻也不违背我的良心, 一分一寸也不画仅仅为了取悦于人、易于出售的东西。”
杨一江庆幸自己不必为生存而卖画。“我现在当个老师, 领工资画画, 我觉得已经很满足了。”在这个纷乱吵杂的社会, 人人都为了金钱地位而疲于奔命, 而杨一江在这个环境中, 可以不用为了生计而奔波, 可以对外界的喧嚣浮躁毫无知觉, 别无他顾, 别无所想, 只是埋头画画, 乐此不疲。
作为一个有着历史使命感的画家和学者, 必定是自觉, 主动地将艺术追求放在他所生长的, 可触及的环境里去的。杨一江的人物画正是在中西文化融合的背景下应运而生的, 为本土油画的艺术实践作出了宝贵的探索。
参考文献
[1]《在场——王林论当代艺术家》[M]河北美术出版社.
[2]《蜕变——鲁虹艺术批评文集》[M]河北美术出版社.
[3]《写生的恩赐》杨飞云[J]美术大观
[4]赫谢尔B奇普编著.吕澎译.《塞尚、梵高、高更通信录》[M].
浅谈影响绘画表达状态的几个因素 篇2
首先什么是表达?在文学上, 表达是指将思想的成果用语言的方式呈现出来的一种行为。以交流、传播为目的, 以物、事、情、理为内容, 以语言为手段, 以听者、读者为接收对象。换而言之, 绘画表达即是用绘画语言的手段将画家对整个世界的观察、感受、思考, 以及个人的看法以画面的形式呈现出来, 让观赏者通过画面产生一种视觉的、心理的触动和震撼, 从而引起人们对生活和人生产生更多的关注和思考。表达存在于我们生活的方方面面, 从衣食住行, 到文学艺术, 一切行为、一切言语、一切表露出来的快乐或者不快乐的情绪, 都是我们在进行自我欲望的表达。表达是观察、记忆、思维、创造、想象力的综合运用, 也是一个人学习能力、智力的高端反映。艺术的力量, 本质上是一种生命的张力, 是生命不甘平庸、顽强追求的创造。艺术作为高等动物——人类特有的精神活动, 是艺术家对自己可触可感的世界的认识和理解, 然后画家通过手中的画笔表达自己对这个世界感情和态度。一个人面对生命的敬畏、感慨、想法都可以艺术的状态呈现。
一、打好基本功不等于表达
众所周知, 文学上的表达有记叙、议论、说明、描写、抒情等方式。在水墨画上, 也相应地有丰富的表达方式和表达方法, 艺术形式所表达的不仅仅是外在物象, 更高的艺术是直指人心的, 是感情的自然流露, 是真善美的高度统一, 甚至是凌驾于造型、技法等基本功之上的一种精神内涵。而我们自身却一直沉陷在打好造型基本功才能画好水墨画的误区里, 不能否认, 基本功的锤炼对于我们的中国画创作是一种必要的辅助手段, 然而技法追求往往是没有极限的, 到头来甚至会发现真正能作用于表达的基本功其实就在表达的过程中, 根据表达的需要自然而然就会诞生。不注重真情实感的宣泄而一味地在形式感、基本功上大做文章, 到头来犹如制造了大堆的零件, 到组装机器的时候, 才发现很多都是没有用也用不上的。甚至还存在一种现象, 感觉在对技法的过度迷恋中逐渐弱化, 因为能力不等于表现力、创造力, 较真也不是认真, 到最后自己反而把自己给困住了。这一点, 可以在儿童画上得到验证, 尽管孩子技法笨拙, 由于情感真挚, 对材料敏感, 因此, 一点都不影响他对事物独特的观察方法和表达, 比起受过绘画系统教育的人, 反而在表达上更主观、更直接、更生动、更耐人寻味, 在某种层面上说, 感受大于基本功。
二、一味追求再现表象就弱化了感受真实
一流的艺术作品是看不到技巧的。“炫技”正是承认自己无能的一种表现, 力图哗众取宠的追求技法层面的能力, 丢掉了自己最真实、最可贵的思想和灵魂, 是令人惋惜的。那什么又是真实?真实就像一个人的性格、脾气、精神气质, 而我们往往首先看到的只是他身高、年龄、胖瘦、高矮的表象。就像我们面对模特儿写生的时候, 总是沉浸于怎么画, 用什么方法能画得像。我们关注更多的是“表象”的结构, 甚至是衣着等对一个人性格、气质不起关键作用的东西。基本上是面对着活生生的人, 画的是素描的、笔墨的关系, 而忽略了模特儿的精神状态和我们面对模特儿时自己的主观感受。面对大师的水墨作品, 我们常常惊叹他们的“表现力”“创造力”“想象力”, 而我们缺乏的或许并不是想象力, 缺乏的是自己对物象清楚的认识、透彻的理解和敏锐而真挚的感受。我们受过的美术教育, 已经让我们形成了一套对一切实物都习以为常的思维方式。我们所做的大量的工作只是如何选择运用技术解决再现想象的问题, 久而久之, 使我们的感觉变得迟钝, 变得不敢面对并尊重自己感觉的真实和物象本身的真实。由此可见, 我们必须把关注点重新拉回到对真实本质的追求上, 调动自己的一切经验, 为更好地感受真实、表达真实服务, 借助水墨载体, 用艺术的手段使不可见的变为可见, 使表现出的事物更能说明和代表其本身, 这样的表达才是我们不应该回避的。
三、观察方法和思维方法影响创作
思维大不过自己的认识, 每个人都只能感受他所见, 画他所能感觉到的东西。如果一个人的表达方式发生了改变, 那么他一定是先改变了他观察世界的方法。一个人观察世界、感受生活、理解文化的方式, 在一定程度上又决定了他创作及思维活动的方向。作为一个水墨画家我们理应毫不犹豫地相信自己的心、眼、手, 相信自己的主观认识, 而不是人云亦云式地盲从。水墨画的风格、气韵、境界的生成, 是先于作品生成于画家自身的个性、气质和精神境界的。一个艺术家自身的审美取向, 对事物的感受力是具有个性化和习惯性的, 这些也直接影响着他的艺术追求和艺术理想, 看到的是什么就是什么, 自己造不了自己的假, 也骗不过自己。“画如其人”说的也是这个道理, 自己的修养功力、审美品位、艺术作品的气息是不会说谎的。
结语
艺术是生命的一种表达形式, 当旧有的艺术形式无法满足新时代人们的思想表达和审美期待时, 就会有新的艺术作品应运而生。一个画家在创作和表达上能够介入他所处的时代, 创造出属于这个时代特有的, 而又不低于其他任何时代的艺术, 这样的艺术家才是真正意义上对传统有所继承和发展的。由此可知, 对于一个水墨画家来说, 能找到适合自己的艺术表达方式和绘画语言, 他的作品就具有艺术价值和创作意义。
参考文献
[1][英]约翰伯格.抵抗的群体[M].何佩桦, 译.桂林:广西师范大学出版社, 2008.
[2]吕胜中.造型原本 (讲卷) [M].北京:生活·读书·新知三联书店, 2002.
表达状态 篇3
1 不同应力状态下的徐变试验
1.1 单轴应力状态下的徐变
有试验研究表明,混凝土在单轴拉、压应力状态下,单位应力作用下的轴向徐变(徐变度)基本相同,如图1所示[9]。
在单轴应力状态下的轴向徐变可按式(1)计算:
undefined
式中:t表示龄期,τ表示加载龄期,τ0为第一次加载时的龄期,Δσ(τ)表示τ龄期施加的应力,E(τ)为τ龄期的弹性模量,εc1(t)表示t龄期的轴向总徐变,φ(t,τ)为徐变系数。
前文已定义徐变泊松比为横向徐变与轴向徐变之比,因此,在单轴应力状态下的横向徐变可由式(2)计算。
εc2=εc3=μcuεc1 (2)
式中:εc1表示轴向徐变,εc2、εc3表示与轴向垂直的2个横向徐变,μcu为单轴应力作用下的徐变泊松比。徐变泊松比的大小可根据试验得到,一般为0.17～0.20[1]。
1.2 双轴应力状态下的徐变
图2是混凝土在双轴压应力状态下的典型徐变试验结果。
由图2可以看出,在应力大小相同(σ1=σu)的情况下,双轴应力状态下的徐变比单轴应力状态下的徐变小,且在σ3方向(σ3=0)产生拉伸徐变[1]。假定徐变符合叠加原理,则混凝土在双轴应力状态下的空间徐变可按式(3)计算。
εc1=εcu1-μcuεcu2
εc2=εcu2-μcuεcu1
εc3=-μcu(εcu1+εcu2) (3)
式中:εc1、εc2、εc3表示3个方向的徐变,εcu1、εcu2分别表示在σ1、σ2单独作用下产生的轴向徐变。
1.3 三轴应力状态下的徐变
图3是混凝土在三轴压应力状态下的典型徐变试验结果。从图3可以看出,三轴应力状态下的徐变也比单轴应力状态下的徐变小[1]。
同样,假定徐变符合叠加原理,则混凝土在三轴应力状态下的空间徐变可按式(4)计算。
εc1=εcu1-μcu(εcu2+εcu3)
εc2=εcu2-μcu(εcu1+εcu3)
εc3=εcu3-μcu(εcu1+εcu2) (4)
式(4)中,εc1、εc2、εc3表示3个方向的徐变,εcu1、εcu2、εcu3分别表示在σ1、σ2、σ3单独作用下产生的轴向徐变。
2 空间徐变的统一表达式
2.1 基于有效徐变泊松比的计算方法
多轴徐变试验表明,混凝土在双轴、三轴应力状态下某方向的徐变泊松比(有效徐变泊松比)与单轴应力状态下的徐变泊松比并不相等,双轴、三轴应力状态下的有效徐变泊松比小于单轴应力状态下的徐变泊松比。因此,混凝土在多轴应力状态下的徐变并不完全符合叠加原理,由式(3)、式(4)计算的双轴、三轴应力状态下的空间徐变往往与实际情况存在较大偏差,可以做如下改进:
εc1=εcu1-μc1(εcu2+εcu3)
εc2=εcu2-μc2(εcu1+εcu3)
εc3=εcu3-μc3(εcu1+εcu2) (5)
式中:μc1、μc2、μc3分别表示示在σ1、σ2、σ3方向的有效徐变泊松比。在多轴应力状态下,有效徐变泊松比的大小与3个方向的应力组合相关,可用式(6)表示[9]:
undefined
按式(5)、式(6)计算混凝土在多轴应力作用下的空间徐变实际上也是采用叠加原理,只是在不同应力状态下采用了不同的徐变泊松比。
2.2 基于双徐变系数的统一表达式
在直角坐标系中,任一点的空间应力可由9个应力分量表示,如式(7)所示。
undefined
σij称为应力张量,可分解为应力球张量和应力偏张量两部分,如式(9)所示。其中,σm为3个正应力的平均应力,即σm=(σx+σy+σz)/3。
undefined
引入克罗内克记号δij,则应力球张量表示为σmδij,若用δij表示应力偏张量,则式(8)可以简记为:
σij=σmδij+sij (9)
式(8)、式(9)中,第一部分为应力球张量,在弹性力学意义上只产生体积改变;第二部分为应力偏张量,在弹性力学意义上只产生形状改变。由此可以设想混凝土在球应力状态和偏应力状态下的徐变特征也会明显不同。假设在球应力作用下的徐变也只产生体积变形,在偏应力作用下的徐变也只产生形状改变,则混凝土的空间徐变可用式(10)表示。
εc,ij=φmσmδij+φdsij (10)
式中:εc,ij表示徐变张量,由9个徐变分量组成,φm为球应力徐变系数,φd为偏应力徐变系数。
根据弹性力学,任意应力张量都可以通过坐标变换到主应力坐标轴,则可只用3个主应力σ1、σ2、σ3表示该应力张量,且在主应力坐标系下的应力张量同样可以分解为应力球张量和应力偏张量:
σi=σm+si(i=1,2,3) (11)
因此,式(10)在主应力坐标系下可表示为:
εci=φmσm+φdsi(i=1,2,3) (12)
同样,仍假设多轴应力状态下的徐变符合叠加原理,即式(3)、式(4)成立,可由式(1)-(4)和式(12)推导得到:
φm=(1-2μcu)φ (13)
φd=(1-μcu)φ (14)
多轴应力状态下的徐变并不完全符合叠加原理,因此,式(13)、式(14)仅适用单轴应力状态。多轴应力状态下的球应力徐变系数φm和偏应力徐变系数φd与应力组合有关,应通过试验获得。
3 结语
(1) 混凝土在单轴应力状态下的空间徐变可根据徐变泊松比准确计算,在双轴、三轴应力状态下各方向徐变将相互影响,采用叠加原理按式(3)、式(4)计算的空间徐变与实际情况存在较大差异。(2) 混凝土在双轴、三轴应力状态下的有效徐变泊松比与单轴应力状态下的徐变泊松比不相等,有效徐变泊松比与3个主应力的组合有关。如果有效徐变泊松比已知,可以按式(5)计算混凝土在双轴、三轴应力状态下的空间徐变。(3) 本实验提出了基于双徐变系数的混凝土空间徐变计算统一表达式,可计算单轴、双轴及三轴等各种应力状态下的空间徐变。表达式中引入了球应力徐变系数φm和偏应力徐变系数φd,并赋予了二者不同的意义,即在球应力作用下的徐变只产生体积变形,在偏应力作用下的徐变只产生形状改变,二者的取值通过试验获得,其影响因素及变化规律还需进一步研究。
摘要：单轴、双轴和三轴徐变试验结果表明,混凝土的徐变与弹性变形一样具有空间特性,但根据单轴徐变试验得到的徐变系数、徐变泊松比以及采用叠加原理计算的双轴、三轴应力状态下的空间徐变与实际情况存在较大偏差。为了准确计算不同应力状态下混凝土的空间徐变,介绍了应力组合对有效徐变泊松比的影响和基于有效徐变泊松比的空间徐变计算方法。另外,根据应力张量的弹性力学意义,引入了球应力徐变系数φm和偏应力徐变系数φd,提出了基于这两个徐变系数的空间徐变计算统一表达式,可计算混凝土在单轴、双轴和三轴等不同应力状态下的空间徐变。
表达状态 篇4
缺氧是牙周炎形成的关键因素, 在缺氧状态下牙周组织不能进行有效的气体交换, 一些有毒物质堆积, 引起牙周组织炎症。另外缺氧也影响着人牙周膜细胞 (human periodontal ligament cells, HPDLCs) 的生物学活性。有研究证实基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMPs) 在细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 的降解与重塑方面起着重要的作用[3,4]。既往研究表明[5], MMPs在牙周组织中发挥着至关重要的作用, 但miRNAs对MMP-2的调控作用尚未见报道。本实验在体外缺氧环境下培养HPDLCs, 探讨miR-520h对缺氧状态下HPDLCs中MMP-2表达的影响。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
miRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光实时定量PCR试剂盒 (Ta KaRa, Japan) ;miR-520h前体Pre-miR-520h、阴性对照miRNA negative control (ABI, USA) ;转染试剂Lipofectamine 2000、双荧光素酶活性检测系统 (Promega, USA) ;MMP-2一抗 (Abcam, USA) ;HRP标记的二抗和β-actin一抗 (北京中杉金桥生物技术公司) ;DMEM高糖培养基及胎牛血清 (Gibco, USA) ;GV272载体、Xba I/Xba I酶切 (上海吉凯生物技术公司) 。
1.2 实验方法
1.2.1 HPDLCs的培养与鉴定
收集12~18岁因正畸拔除的健康无龋前磨牙, 参照文献[6]进行原代培养, 取第3代HPDLCs用免疫组化鉴定细胞来源。
1.2.2 qRT-PCR和Western blot检测缺氧状态下MMP-2表达
将细胞放入含有1%O2、5%CO2及94%N2的三气孵箱里培养12、24、48和72 h, 以低氧培养0h作为对照。抽提总RNA和总蛋白, 反转录后进行qRT-PCR (引物序列见表1) 及Western blot蛋白检测。
1.2.3 预测靶向MMP-2基因的miRNA
通过Pic T-ar、Target Scan和miRanda 3种预测软件预测可能靶向于MMP-2 3'UTR的miRNA。
1.2.4 荧光素酶报告质粒的构建
野生型及突变型MMP-2 3'-UTR载体构建及鉴定由上海吉凯生物技术有限责任公司完成。
1.2.5 双荧光素酶报告基因检测
取对数生长期的HPDLCs, 于转染前一天按5×103个细胞/孔的密度接种于24孔板中, 利用Lipofectamine 2000试剂进行转染, 将荧光报告载体与miR-520h前体共同转染于HP-DLCs, 以单转野生型和突变型荧光报告载体为标准内质控, 以校正各实验组间的差异 (即实验组:野生型或突变型MMP-2荧光报告载体分别+miR-520h前体Pre-miR-520h;对照组:野生型或突变型MMP-2荧光报告载体分别+miR-520h无关序列miRNA negative control) 。按照双荧光酶素检测试剂盒说明书检测双荧光素酶活性值, 计算相对荧光值。
1.2.6 qRT-PCR和Western blot检测miR-520h对MMP-2表达的调控
HPDLCs转染Pre-miR-520h和miRNA negative control 24 h后qRT-PCR法检测miR-520h的转染效率。 (实验组:单转miRNA前体PremiR-520h;对照组:单转miRNA无关序列组miRNA negative control;空白对照组:未转染组Blank control) 。转染Pre-miR-520h 48 h后, 用qRT-PCR和Western blot法检测MMP-2在缺氧和常氧中mRNA和蛋白表达, 结果用2-ΔΔCT法分析样品中目的基因的相对表达率和Quantity One软件分析灰度值。
1.3 统计学分析
统计学分析使用SPSS 18.0软件包, 数据表示为±s, 各组间均数比较采用t检验或单因素方差分析。以P<0.05为差异, 具有统计学意义。
2 结果
2.1 HPDLCs的培养与鉴定
原代培养的细胞呈梭形, 经免疫组化检测, 抗波形丝蛋白染色阳性, 抗角蛋白染色阳性, 证实HPDLCs来源于外胚间充质。第4~6代细胞用于实验。
2.2 qRT-PCR和Western blot检测在缺氧状态下MMP-2的表达
和对照组相比, 缺氧刺激下MMP-2 mRNA和蛋白表达明显降低 (图1) (P<0.01) 。
2.3 筛选靶向MMP-2 3'-UTR的miRNA
使用miRNAs预测软件预测作用于MMP-2基因的3'非编码区的miRNA, 选取3个预测软件的交集, 取miR-520h为目的miRNA (图2) 。
2.4 MMP-2 3'-UTR载体及突变载体的鉴定
将目的载体进行酶切后连接到载体GV272上, 构建含MMP-2全长3'-UTR的报告基因载体 (GV272-WT-MMP-2-luc) 及突变载体 (GV272-MUT-MMP-2-luc) 测序正确, 测序结果省略。
2.5 双荧光素酶报告基因检测
Pre-miR-520h和野生型MMP-2共转染HPDLCs荧光素酶活性下降约60% (P<0.05) , 而突变型转染组荧光素酶活性无明显变化 (P>0.05) (图3) 。提示miR-520h作用于MMP-2基因的3'非编码区。
1:GV272-WT-MMP-2-luc;2:GV272-WT-MMP-2-luc+miR-control;3:GV272-WT-MMP-2-luc+pre-miR-520h;4:GV272-MUT-MMP-2-luc;5:GV272-MUT-MMP-2-luc+miRNA negative control;6:GV272-MUT-MMP-2-luc+pre-miR-520h
2.6 miR-520h对MMP-2基因表达的调控
未转染细胞和空载体转染细胞不表达miR-520h, 而pe-miR-520h转染的细胞高表达miR-520h (图4) , 表明载体构建及转染成功。qRT-PCR和Western blot法检测miR-520h对MMP-2 mRNA和蛋白水平的影响, 结果表明实验组能够明显抑制MMP-2 mRNA (图5) 和蛋白 (图6) 的表达水平, 且缺氧状态下更能有效抑制其表达 (P<0.05) 。以上结果均证实了MMP-2是miR-520h的靶基因。
a:未转染组;b:miRNA无关序列转染组;c:pre-miR-520h转染组a:Non-transfected cells;b:Empty vector transfected cells;c:pre-miR-520h transfected cells
a:未转染组;b:miRNA无关序列转染组;c:pre-miR-520h转染组a:Non-transfected cells;b:Empty vector transfected cells;c:pre-miR-520h transfected cells
a:未转染组;b:miRNA无关序列转染组;c:pre-miR-520h转染组a:Non-transfected cells;b:Empty vector transfected cells;c:pre-miR-520h transfected cells
3 讨论
缺氧是引起牙周炎的重要因素之一。在缺氧环境下, 牙周组织的血流量减少, 造成供氧不足, 从而引起牙周组织炎症。已有报道证明, 机体对缺氧的反应可能是由于细胞对缺氧的反应所致。HPDLCs是牙周组织中主要再生功能细胞, 且缺氧情况下HPDLCs中炎症细胞因子 (IL-1, IL-6, TNF-α) 表达增高[7], 该研究为模拟细胞缺氧可以引起细胞炎性反应提供可靠依据。
MMP-2是一种明胶酶, 由多种细胞产生。有研究表明, 在牙周炎患者牙龈组织和龈沟液中MMP-2表达水平与牙周炎的严重程度密切相关, 经牙周炎治疗后的MMP-2表达水平明显降低[7,8,9,10]。而在缺氧条件下, 细胞外基质过度沉积导致细胞中的MMP-2表达下降。造成这种现象的原因可能是细胞在缺氧环境下通过缺氧敏感转录因子对MMP-2的表达起作用。据报道, MMPs可在缺氧时导致NF-κB、AP-1转录活性的改变因其含有NF-κB (nuclear factor-κB) 、AP-1 (dactivator protein-1) 等转录因子的结合位点[11,12]。缺氧也可使TNF-β (tumor necrosis factorβ) 表达增强, 促进TIMPs的表达和分泌, 抑制MMPs的表达[13]。本实验证实在缺氧条件下可引起MMP-2表达下降, 这与细胞外基质过度沉积时, MMP-2表达降低的趋势一致, 证明MMP-2在牙周炎发病机制中具有重要意义。
自2000年以来, Reinhart等[14]发现1个具有转录后调节功能的小分子miR-let-7之后, microRNA一直备受关注。有研究表明, miRNA在炎症反应中起关键作用, 动脉粥样硬化疾病中[15]miR-34a、miR-146a、miR-146b-5P、miR-210表达显著增高, 提示miRNAs可能为炎症发生提供必要的微环境。Xie等[16]检测牙周炎患者和健康人牙周组织中miRNAs的表达差异, 结果发现牙周炎患者组织中某些miRNAs的表达量与对照组有很大差异。由此推断, microRNA与牙周炎发生发展密切相关。
miR-520/373家族[17]可以通过抑制NF-κB信号通路减少炎症细胞因子IL-6和IL-8的分泌, 证实miR-520参与炎症信号的传导, 但是其是否参与牙周炎发病机制, 还未见相关报道。
本实验通过模拟缺氧HPDLCs, 探讨MMP-2的表达变化, 结果表明MMP-2 mRNA和蛋白表达均降低, 说明MMP-2参与牙周炎的发生发展。使用生物信息学方法预测靶向MMP-2 3'-UTR的miRNA, 选取miR-NA-520h进行验证。将野生型和突变型MMP-2 3'-UTR荧光素酶载体与pre-miR-520h和miR-520h inhibitor共转染于HPDLCs中, 用双荧光素酶验证了miR-520h作用于MMP-2的3'非编码区。经qRT-PCR检测转染效率, 证实miR-520h表达明显增高。HP-DLCs转染后用qRT-PCR和Western blot法分别检测常氧和缺氧状态下MMP-2 mRNA、蛋白水平表达变化, 显示miR-520h对MMP-2 mRNA和蛋白水平均有抑制作用, 且缺氧状态下更能有效抑制其表达。上述结果表明靶向MMP-2的miR-520h表达载体构建成功, miR-520h可负性调控常氧和缺氧HPDLCs中MMP-2基因的表达。因此, 下调MMP-2表达很可能是miR-520h加重牙周炎发病机制之一。然而, miR-520h是否还存在其他的靶基因参与高原牙周病发病机制还有待深入研究。
表达状态 篇5
关键词：卵巢上皮性癌,HER2,组织学分型,靶向治疗
卵巢上皮性癌(epithelial ovarian carcinoma,EOC)是女性生殖器官发病率列居第三位的肿瘤,但病死率却为首位,其五年生存率仅为25%～30%。目前卵巢上皮性癌治疗效果不显,寻找新的分子靶点,以提高患者生存率仍然是妇科肿瘤学者们亟待解决的问题。HER2/neu/erbB2是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族成员之一,在许多肿瘤中的过表达和(或)突变,与许多肿瘤发生发展及预后密切相关。以HER2为肿瘤靶向,采用独立或联合传统的药物治疗在乳腺癌、胃癌等已取得了一定的效果[1,2]。针对HER2在卵巢癌中的靶向治疗,国外处于小样本的临床试验阶段[3,4,5]。本研究的目的是观察中国人群大样本卵巢上皮性癌病例中HER2蛋白过表达状态,并分析其临床病理意义,为今后治疗提供基础数据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2008～2012年我院卵巢上皮性肿瘤病理标本322例,其中,卵巢上皮性癌242例,交界性上皮性肿瘤65例,良性上皮性肿瘤15例。所有患者术前均未接受过放疗、化疗或激素治疗。初次手术方式为卵巢癌分期手术或肿瘤细胞减灭术,并收集相关临床病理参数。
1.2 标本制作和免疫组化染色
所有标本均用中性福尔马林固定并石蜡包埋,4μm厚切片。HER2抗体购自DAKO公司的A0485多抗;雌激素受体(ER,克隆号:1D5)和孕激素受体(PR,克隆号:Y85)购自于GENEMED Biotechnologies公司。ER、PR和HER2的工作浓度分别为1∶120、1∶100和1∶450。采用免疫组化二步法测定卵巢上皮性肿瘤中HER2、ER和PR的表达情况。
1.3 结果判断标准
免疫组化中HER2蛋白在全部瘤细胞中均无染色或<10%瘤细胞染色者结果为0;瘤细胞>10%细胞膜不完整弱染色者结果为1+;瘤细胞>10%细胞膜轻度至中度完整染色者结果为2+;瘤细胞>10%细胞膜完整染色者结果为3+;0～1+为阴性,2+～3+为阳性,即过表达(图1～4)。ER和PR阳性为肿瘤细胞中细胞核着色≥10%。ER和PR任意一种受体阳性为激素受体(hormonal receptor,HR)阳性;ER和PR均阴性,为HR阴性。
1.4 统计学方法
本研究采用SAS 9.1软件进行统计分析。计数资料采用百分率表示,HER2蛋白在良性、交界、恶性卵巢上皮性肿瘤组织中表达差异及其与临床病理参数的关系,组间对比采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
注:“*”为卵巢透明细胞腺癌组织学不分级
2 结果
2.1 临床病理资料
242例卵巢上皮性癌患者平均年龄为51.6岁,近80%在40～65岁范围。65例交界性卵巢上皮性肿瘤患者的平均年龄为38.9岁,较恶性肿瘤患者平均年轻10岁。242例卵巢上皮性癌患者的临床病理资料见表1。
2.2 HER2在卵巢上皮性肿瘤中的表达
HER2在卵巢良性、交界性和恶性的上皮性肿瘤的阳性率分别为0、21.54%(14/65)以及16.12%(39/242),在卵巢交界性及恶性中的阳性表达显著高于良性肿瘤,但交界性和恶性肿瘤间表达差异无统计学意义。卵巢上皮性癌中HER2在激素受体表达、组织学分型和组织学分级中的各组表达率差异有统计学意义;HER2表达与FIGO分期、患者年龄、淋巴结转移以及肿瘤发生侧别无关(表1)。卵巢交界性肿瘤的组织亚型有浆液性肿瘤40例,HER2过表达为11例(27.5%);黏液性肿瘤22例,其过表达为2例(9.09%);子宫内膜样交界性肿瘤为3例,其过表达1例(33.33%)。
2.3 HER2在卵巢透明细胞腺癌中的表达
HER2在卵巢透明细胞腺癌表达较其他组织学分型均高,为42.11%(16/38)(表1),其患者平均年龄51.1岁。透明细胞腺癌FIGO分期分别为Ⅰ期67.5%,Ⅱ期10.0%,Ⅲ期22.5%。卵巢透明细胞腺癌中激素受体阴性占79.5%,16例HER2阳性透明细胞腺癌中HR阴性为75%。
3 讨论
卵巢上皮性癌是妇科肿瘤中死亡率居首位的肿瘤,目前各种传统治疗方法效果不明显,处于“瓶颈”期,需要新的治疗途径来改善患者的长期生存率和清除耐药肿瘤细胞,因此,个体化靶向治疗愈显重要。
HER2是一种原癌基因,控制细胞增殖和能动性,其突变和扩增已被发现和许多肿瘤相关,如乳腺、卵巢、肺、前列腺和结肠癌[6]。它启动一系列信号转导通路(包括MAPK和PI3K-Akt通路等),介导细胞的增殖、分化、抗凋亡等过程。针对HER2蛋白的药物主要有抗HER2蛋白抗体、酪氨酸激酶抑制剂和肽疫苗等。针对HER2的肿瘤靶向药物在卵巢癌中多还处于临床实验阶段,样本量不大,部分取得了一定的效果[3,4,5]。国内HER2在卵巢癌中的表达的大样本量研究不多,未见其相应药物治疗的报道。了解中国人中HER2过表达状况,为今后可能的靶向治疗提供基础依据。
近年来国外大宗病例研究HER2在卵巢癌中表达的结果总结,结论不尽相同,范围为5%～35%[7,8,9,10,11,12];而国内的研究结果阳性率多高于这一比例。本研究中HER2蛋白在卵巢上皮性癌中的表达较低,多数为“1+”,242例卵巢上皮性癌中其过表达率为16.17%,与国外文献一致。HER2在卵巢癌中表达结果差异大的原因可能与不同实验室、种族、肿瘤临床病理分期评定标准、HER2阳性评定标准以及小样本量等相关;另外,卵巢上皮性癌中各组织亚型间表达的差异,以及样本量中各型比例的差异可能是导致HER2在卵巢上皮性癌中表达有差异重要原因之一。HER2在卵巢上皮性癌和卵巢交界性肿瘤中均有表达,但由于交界性肿瘤数量少,仅有三种组织学分型,无法进行统计学分析,有待于今后增大样本量再行分析。
卵巢上皮性癌是由一组异质性肿瘤,目前肿瘤治疗主要是取决于肿瘤的分期、分级,而不是组织分型。近年来研究发现不同的组织分型不仅是形态学的差异,从分子遗传学就有其各自特点,表现不同的生物学行为和预后[13],所以与之相应的治疗方式亦具有差异。本研究中HER2蛋白过表达在常见的四种卵巢上皮性癌组织学亚型(浆液性、黏液性、子宫内膜样和透明细胞腺癌),以及其他少见上皮性癌中的各组表达差异具有统计学意义。四种常见卵巢上皮性癌中,卵巢子宫内膜样腺癌表达最低,为5.41%,而透明细胞癌中表达最高,为42.11%。HER2在卵巢上皮性癌各分型表达的差异,一定程度说明了肿瘤发生的分子机制差异,同时也提示了针对HER2蛋白的靶向药物使用是应该具有选择性。
卵巢透明细胞腺癌可能起源于宫颈内膜腺上皮或是子宫内膜异位病灶[14],由于其常伴发子宫内膜异位,高发的化疗耐药和预后差的特殊临床特征区使其别于其他卵巢上皮性癌。卵巢透明细胞腺癌目前属Ⅰ型卵巢癌,但较同期浆液性腺癌生存率低,目前关于肿瘤细胞的排列方式、细胞类型、分裂指数、核的分级是否可以做为预后的判断指标,尚无统一意见。文献中HER2在卵巢透明细胞腺癌中表达的研究结果也不尽相同,国内还未见相应多量病例的报道。本研究中透明细胞腺癌HER2过表达远高于其他亚型,HER2的高表达是否提示给透明细胞腺癌这一高耐药、预后差的肿瘤治疗带来新的契机,有待于进一步研究。本研究中未发现卵巢透明细胞腺癌中HER2蛋白过表达在各项临床病理参数中的统计学差异,这可能与样本量不大有关,这将是我们今后研究的一个方向。
HER2蛋白表达与多种肿瘤的不良预后有关[15,16,17,18],文献中对HER2在卵巢癌的研究结果不一致。本研究结果显示卵巢上皮性癌中HER2过表达病例中,激素受体表达各组差异有统计学意义,激素受体阴性的比例较高。乳腺癌中HER2与激素受体(ER、PR)的表达对肿瘤的治疗和预后都密切相关。卵巢上皮性癌中HER2过表达,同时ER、PR阴性是否和乳腺癌相似,为预后不良的表现还不得而知。同时,本研究结果显示了HER2过表达与FIGO分期以及淋巴结是否转移无关。在组织学分级中HER2过表达虽然在各组中差异有统计学意义,但并未表现为组织分化高低与HER2过表达的相关性,而在交界性肿瘤也可见HER2表达,可能是HER2在肿瘤细胞的分化中作用不大,或是由于各组间病例数不均衡造成。以上结果表明就卵巢上皮性癌而言,HER2可能不是影响预后的独立危险因子。
表达状态 篇6
1 材料与方法
1.1 实验试剂
15-HETE酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒购自美国Roche公司;超氧化物歧化酶 (SOD) 活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自美国invitrogen公司;细胞培养试剂购自美国Hyclone公司;siRNA引物由美国QIAGEN公司合成, 引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成;siRNA沉默构建试剂盒购自美国Amaxa Biosystems Technology公司。
1.2 实验动物
选取健康雄性Wistar大鼠, 月龄2个月, SPF级, 体重 (250±20) g, 购于哈尔滨医科大学附属二院实验动物中心 (合格证号2001024) 。本研究遵循本单位实验动物保护和使用指南, 并经哈尔滨医科大学实验动物伦理委员会批准进行。
1.3 方法
1.3.1 肺动脉平滑肌细胞培养和分组
取出大鼠肺动脉, 进行PASMCs体外原代培养[7]。取3～8代对数生长期PASMCs细胞用于实验, 随机分为4组, 分别为正常对照组、缺氧组、scramble组和15-LOX-2 siRNA组。缺氧组细胞置于细胞乏氧箱中, 通入含92%N2、3%O2、5%CO2的混合气体, 37℃条件下培养24 h。
1.3.2 转染15-LOX-2 siRNA
15-LOX-2 siRNA引物序列:5′-ATA TCT GCC AAC GTG CTA CGT-3′, siRNA阴性对照引物序列:5′-ACT TCC GTA ATG GAC CTA CGT-3′, 转染步骤依照试剂盒说明进行。转染后放入细胞乏氧箱中培养24 h后进行后续试验。
1.3.3 实时定量荧光聚合酶链反应 (Real time PCR) 检测15-LOX-2 mRNA的表达
用Trizol试剂提取各组PASMCs细胞, 进行Real-time PCR检测。引物序列见表1。反应条件:55℃1 min, 循环条件为92℃30 s, 50℃45 s, 72℃35 s, 共进行35个循环。进行数据收集, 利用PCR反应仪软件, 将磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 作为参照, 根据荧光定量, 计算出所有样品以及标准品的起始循环数 (CT) , 以标准品Ct值为依据, 绘制出标准曲线, 再根据2-△Ct法进行半定量分析。
注:GADPH:磷酸甘油醛脱氢酶;15-LOX-2:15脂氧酶-2
1.3.4 15-HETE和氧化应激指标检测
利用ELISA法检测15-LOX-2产物15-HETE表达。分光光度法检测各组SOD活性和活性氧 (ROS) 含量变化。
1.3.5 噻唑蓝比色法 (MTT) 法检测PASMCs增殖变化
利用MTT法检测各组PASMCs增殖的变化。收集对数生长期PASMCs细胞, 用含10%胎牛血清DMEM培养液以5×103个的细胞数接种于96孔培养板, 培养24 h后弃去上清, 随机分为4组:正常对照组、缺氧组、scramble组、15-LOX-2 siRNA组, 处理方法同上。24 h后待测孔中加入20μL无菌MTT, 每个时间点设3个复孔;继续培养4 h后, 彻底去除上清, 加入DMSO 150μL/孔, 摇床振荡10 min, 至紫色结晶充分溶解后, 置酶标仪于570 nm波长处测定其吸光度 (A) 值, 计算各组增殖率。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差 表示, 多组样本均数的比较应用单因素方差分析, 组间两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组15-LOX-2 mRNA的表达变化
缺氧可上调PASMCs中15-LOX-2 mRNA表达, 与正常对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。15-LOX-2 siRNA可降低缺氧PASMCs中15-LOX-2, 与缺氧组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图1。
与正常对照组比较, *P<0.05;与缺氧组比较, #P<0.05;15-LOX-2:15脂氧酶-2
2.2 各组15-HETE的生成情况
缺氧可增加PASMCs中15-HETE生成, 与正常对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。下调15-LOX-2后, 可降低缺氧PASMCs中15-HETE生成, 与缺氧组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图2。
与正常对照组比较, *P<0.05;与缺氧组比较, #P<0.05;15-LOX-2:15脂氧酶-2;15-HETE:15-羟基-二十碳四烯酸
2.3 下调15-LOX-2对缺氧状态下PASMCs增殖的影响
缺氧可促进PASMCs显著增殖, 与正常对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。下调15-LOX-2可减少缺氧PASMCs的增殖, 与缺氧组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图3。
与正常对照组比较, *P<0.05;与缺氧组比较, #P<0.05;15-LOX-2:15脂氧酶-2;PASMCs:肺动脉平滑肌细胞
2.4 各组氧化应激指标分析
缺氧可促进PASMCs中ROS产生, 降低SOD含量, 与正常对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。下调15-LOX-2可抑制ROS的产生, 增加SOD含量, 与缺氧组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。
注:与正常对照组比较, *P<0.05;与缺氧组比较, #P<0.05;15-LOX-2:15脂氧酶-2;ROS:活性氧;SOD:超氧化物歧化酶
3 讨论
缺氧指组织供氧不足或用氧障碍, 从而引起其代谢、功能以致形态结构发生异常变化的病理过程。缺氧时机体的功能代谢发生变化, 呼吸系统、循环系统、血液系统、脑中枢、组织细胞都发生代偿性反应甚至功能障碍。缺氧可以通过直接作用于PASMC膜, 也可以直接促进PASMCs增生, 引起机体血管紧张素、一氧化氮、细胞因子以及离子浓度的变化, 促进HPV发生, 各器官代谢、功能和结构发生异常变化, 可诱发肺动脉高压、心力衰竭[8,9,10]。
15-LOX-2是20世纪90年代被新鉴定出的同工酶[11], 与其另外一种同工酶15-LOX-1在分布以及生物学特性存在不同, 15-LOX-1广泛分布于身体各组织不同, 15-LOX-2组织分布局限, 仅在mRNA水平探查到存在于前列腺、皮肤、角膜等处[12]。而在前期研究中证实15-LOX-2在正常肺组织中不表达, 但在HPV中表达显著增加[4]。15-LOX-2主要作用于花生四烯酸生成15-HETE[13]。15-LOX-2和其作用产物在炎症过程中起着重要的作用。它们不仅可以调控白三烯的形成还可以抑制白三烯的生理功能[14,15,16]。它可以调节炎性反应引起的中性粒细胞的趋化作用[13], 其催化生成的产物15-HETE不仅可以作为脂氧素的底物, 还可以抑制人类中性粒细胞超氧阴离子的产生[17,18]。因此本研究通过成组设计分析下调15-LOX-2对缺氧PASMCs的作用和机制。本研究证实利用siRNA技术干扰15-LOX-2的表达, 可显著下调15-LOX-2, 同时可抑制其产物15-HETE的产生, 而通过调控15-LOX-2和其产物的表达, 可以抑制PASMCs的异常增殖。研究表明, 15-HETE是HPV的中间环节, 同时研究提示缺氧时肺动脉内生成的15-HETE主要来源于15-LOX-2途径, 上述研究说明15-LOX-2在HPV中发挥关键作用[19,20]。因此本研究结果提示15-LOX-2在HPV中主要通过作用花生四烯酸产生产物15-HETE, 影响缺氧条件下PASMCs的增殖, 从而调控HPV。
研究报道提示, 缺氧还可引起机体氧化还原平衡紊乱, 降低SOD等抗氧化酶的活性, 增加活性氧族的生成, 如ROS等氧自由基大量生产, 进而促进HPV发生[21,22,23]。因此本研究进一步深入探讨下调15-LOX-2对缺氧条件下PASMC中氧化还原平衡的影响, 结果显示, 通过下调15-LOX-2在HPV中的表达, 可促进SOD活性恢复, 并抑制ROS氧自由基的产生, 进而调控氧化/抗氧化环节, 促进氧化还原平衡恢复, 有助于延缓HPV的病理进程。
本研究提示15-LOX-2在HPV调控中发挥重要作用, 可以为临床防控HPV治疗靶点选择提供参考和理论依据, 并有助于阐释HPV发生机制的研究。
摘要：目的 探讨下调15脂氧酶-2 (15-LOX-2) 对缺氧状态下肺动脉平滑肌细胞 (PASMCs) 的影响。方法 将PASMCs随机分为四组:正常对照组、缺氧组、scramble组、15-LOX-2 si RNA组。实时定量荧光聚合酶链反应 (Real time PCR) 检测15-LOX-2表达;噻唑蓝比色法 (MTT) 检测PASMCs增殖情况;酶联免疫吸附测定 (ELISA) 法检测15-羟基-二十碳四烯酸 (15-HETE) ;分析活性氧 (ROS) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 的表达变化。结果 缺氧增加15-LOX-2、15-HETE和ROS的产生, 促进PASMCs增殖, 减少SOD活性, 与正常对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。缺氧下转染15-LOX-2 si RNA可减少15-LOX-2、15-HETE和ROS的产生, 抑制PASMCs增殖, 增加SOD活性, 与缺氧组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 15-LOX-2下调可通过减少15-HETE产生、调节氧化/抗氧化平衡、调控PASMCs的异常增殖, 从而延缓缺氧性肺血管收缩的病理进程。
表达状态 篇7
1 材料与方法
1.1 细胞与病毒株
人宫颈癌细胞株 (He La) 由中南大学湘雅医学院肿瘤研究所惠赠。CVB3, Nancy株, 由本室保存传代[5], 在He La细胞中传代, 冻融离心3次, 上清液分装, 采用微量法测其50%组织感染量 (tissue culture infective dose, TCID50) , -80℃保存备用。
1.2 主要试剂
Trizol总RNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司, 逆转录试剂盒购自日本Toyobo公司, PCR Master Mix (2×) 及Marker 1购自北京天根生化科技有限公司, 4EBP1引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 实验模型的建立
选取100TCID50病毒浓度接种细胞。以2×105/m L的浓度将Hela细胞接种于6孔板, 随机设立对照组及病毒组, 予含10%胎牛血清培养基培养24 h, 待细胞贴壁处于对数生长期时, 饥饿组:予无血清1640培养基饥饿过夜, 非饥饿组:予含10%胎牛血清的1640培养基过夜。弃去培养基, 予PBS洗涤细胞两次。实验组加入1 m L病毒液, 对照组加入1 m L含2%胎牛血清病毒维持液 (含10%胎牛血清的1640培养液) 。将6孔板放入5%二氧化碳、37℃培养箱中培养1 h, 每隔15 min轻轻摇晃6孔板, 以保证病毒液及维持液能在细胞面上来回20~30次为宜, 使病毒液及病毒维持液能与细胞充分接触。1h后弃去6孔板中所有液体, 用PBS洗涤细胞两次, 加入病毒维持液2 m L。分别于加入病毒后3、6、9、12及24 h观察细胞形态学变化及提取RNA。
1.4 RT-PCR
按Trizol试剂盒使用说明书提取总RNA, 检测它的浓度、纯度和完整性。按照逆转录试剂盒说明书操作。RT-PCR引物序列如下:4EBP1正向引物为5'-GCAATAGCCCAGAAGATAAGC-3';反向为:5'-A ACGCCTGCCCAGTATGA-3', 产物长度为167 bp, PCR反应条件为:95℃预变性2 min;95℃×30 s, 58℃×30 s, 72℃×30 s共28个循环;72℃延伸5 min, 4℃终止。各组实验均重复3次。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计分析软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 多组间比较采用方差分析F检验, 多组间两两比较采用方差分析SNK-q检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CVB3感染饥饿后Hela细胞4EBP1的表达
对照组不同时间点比较, 4EBP1表达差异无统计学意义 (P>0.05) , 病毒组与对照组各时间点比较, 4EBP1表达均减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。6 h病毒组与3 h病毒组比较, 4EBP1表达差异无统计学意义 (P>0.05) , 9 h、12 h、24 h病毒组分别与3 h病毒组比较, 4EBP1表达减少, 且随病毒感染时间延长, 4EBP1表达逐渐下降 (P<0.05) 。见图1、2。
1) 与同时间点对照组比较, P<0.05;2) 与3 h病毒组比较, P<0.05
2.2 CVB3感染非饥饿Hela细胞4EBP1的表达
对照组不同时间点比较, 4EBP1表达差异无统计学意义 (P>0.05) , 病毒组与对照组各时间点比较, 4EBP1表达减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。6 h病毒组与3 h病毒组比较, 4EBP1表达差异无统计学意义 (P>0.05) , 9、12及24 h病毒组分别与3 h病毒组比较, 4EBP1表达减少, 且随病毒感染时间延长, 4EBP1表达逐渐下降 (P<0.05) 。见图3、4。
2.3 饥饿法与非饥饿法未加病毒对照组4EBP1表达量的比较
饥饿法与非饥饿法各对应时间点比较, 非饥饿法4EBP1表达量下降, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图5。
1) 与同时间点对照组比较, P<0.05;2) 与3 h病毒组比较, P<0.05
†与同时间点饥饿法对照组比较, P<0.05
2.4 饥饿法与非饥饿法病毒组4EBP1表达量的比较
饥饿法与非饥饿法各对应时间点比较, 非饥饿法4EBP1表达量下降, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图6。
†与同时间点饥饿法病毒组比较, P<0.05
3 讨论
细胞凋亡主要有两种途径, 一条是细胞内信号通路的激活, 另一条是通过线粒体释放凋亡酶, 将细胞内的重要蛋白降解, 引起凋亡。m TOR为一种脯氨酸调控的丝氨酸/苏氨酸 (Ser/Thr) 蛋白激酶, 可整合氨基酸、能量、生长因子所激发的信号通路, 参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体生物合成和细胞凋亡等多项细胞功能[6,7], 在细胞生长调控中起着关键性的作用。m TOR通路主要通过上游信号转导通路P13K/Akt/m TOR或Akt/TSCl-TSC2/m To R调控细胞的生长和增殖及下游信号转导通路m TOR/p70S6K和m TOR/4E-BPl调节rn RNA转录和翻译。
CVB3不仅可活化m TOR的上游分子Akt, 进而磷酸化m TOR, 提高下游信号分子的表达与活性, 同时又有利于CVB3的复制及病毒感染后宿主细胞的存活[8], m TOR的活化可影响下游的p70S6K及4EBP1功能。研究发现, 用m TOR基因转染小鼠NIH3T3成纤维细胞, 发现小鼠的心肌m TOR、p70S6K m RNA与蛋白表达水平明显增加[9];在CVB3感染大鼠的细胞模型中发现, m TOR/p70S6K、m TOR/el F-4E信号通路参与CVB3致病机制[5,9,10]。在4EBP1处于脱磷酸化状态时, 细胞处在静止期, 4EBP1和e IF-4E结合, 从而抑制后者的活性;在生长信号的刺激下, 4EBP1可以被m TOR或其他因子磷酸化而失活。磷酸化的4EBP1从e IF4E上脱离下来, e IF4E结合于m RNA 5'末端的帽结构而导致帽依赖性的翻译[11]。本课题应用RT-PCR法检测4EBP1的表达, 结果显示随CVB3感染时间延长, 可检测到的4EBP1的表达量逐渐下降。饥饿法与非饥饿法均显示病毒感染Hela细胞3 h后4EBP1的量即减少, 且随病毒感染时间的延长, 4EBP1下降明显。由此可见, CVB3可抑制m TOR/4EBP1的表达。
m TOR对细胞生长、增殖起着重要的调节作用, 它与细胞的营养状态有密切关系, 在细胞内可作为能量感受器来维持机体能量平衡。CHOTECHUANG[12]等用高蛋白饮食饲喂大鼠, 14 d后与正常蛋白饮食组相比, 检测到肝脏p-m TOR及p-4EBP1水平均增高, 说明高营养环境可促使m TOR/e IF-4EBP1/el F4E通路活化, 进而使得4EBP1表达下降。而当生长因子或营养素缺乏, 或者有m TOR抑制物存在时, 4EBP1去磷酸化, 并与e IF4E结合从而抑制翻译起始。本研究将饥饿组及非饥饿组未加病毒干预的阴性对照组比较发现, 在排除病毒的影响后, 非饥饿组4EBP1的表达较饥饿组降低, 但不同时间点间变化不大。Hela细胞在经过长达20~24 h的饥饿环境后, 因环境中氨基酸的降低, 导致m TOR/e IF-4EBP1/el F4E通路抑制, 4EBP1磷酸化减少, 蛋白质翻译合成减少;而处于高营养环境下的细胞m TOR/4EBP1/el F4E通路活化, 4EBP1磷酸化增多, 解除了对e IF4E的抑制作用, 故蛋白质合成增多, 细胞生长较快。而在将饥饿组及非饥饿组病毒干预的阳性组比较发现, 在病毒的影响下, 非饥饿组4EBP1的表达仍较饥饿组低, 且两组均随时间延长4EBP1下降明显, 当细胞处于病毒感染状态时, 病毒可激活m TOR信号通路, 从而促进细胞的存活和增殖。
摘要：目的 观察饥饿状态下柯萨奇病毒B3 (CVB3) 感染Hela细胞后对4EBP1表达的影响。方法 用RT-PCR法检测CVB3感染后非饥饿及饥饿状态下Hela细胞中4EBP1的表达。结果 饥饿与非饥饿状态下对照组及CVB3感染组 (病毒组) Hela细胞中均有4EBP1表达, 病毒组4EBP1表达降低 (P<0.05) , 随病毒感染时间延长, 4EBP1表达下降更明显 (P<0.05) ;非饥饿组4EBP1表达低于饥饿组 (P<0.05) 。结论 CVB3感染Hela细胞后4EBP1表达下降, 随时间的延长下降更明显, 饥饿促进4EBP1的表达。
关键词：柯萨奇病毒B3,Hela细胞,4EBP1,营养剥夺
参考文献
[1]杨作成.心肌炎的诊断与治疗[J].实用儿科临床杂志, 2010;25 (10) :782-784[1]YANG ZC.Diagnosis and treatment of myocarditis[J].Journal of Applied Clinical Pediatrics, 2010, 25 (10) :782-784.Chinese
[2]DEBIASI RL, ROBINSON BA, LESER JS, et al.Critical role for death-receptor mediated apoptotic signaling in viral myocarditis[J].J Card Fail, 2010, 16 (11) :901-910.
[3]VENTO L, BOURLET T, RENOIS F, et al.Enterovirus-related activation of the cardiomyocyte mitochondrial apoptotic pathway in patients with acute myocarditis[J].Eur Heart J, 2010, 31 (6) :728-736.
[4]CHEN L, LIU L, LUO Y.MAPK and m TOR pathways ale involved in cadmium-induced neuronal apoptosis[J].J Neurochem, 2008, 105 (1) :251-261.
[5]陈淳媛, 孙越女, 杨作成, 等.雷帕霉素对柯萨奇病毒B3诱导的大鼠心肌细胞m TOR和e IF-4E表达的调控作用[J].中南大学学报 (医学版) , 2008, 3 (7) :612-617.[5]CHEN CY, SUN YN, YANG ZC.Effeet of rapamycin on m TOR and e IF-4E expression incoxsackievirus B3-induced ratmyocardial cells[J].Journal of Central South University (Medical Sciences) , 2008, 3 (7) :612-617.Chinese
[6]HUYNH H.Molecularly targeted therapy in hepatocellular carcinoma[J].Biochem Pharmacol, 2010, 80 (5) :550-560.
[7]JUNG CH, JUN CB, RO SH, et al.ULK-Atgl3-FIP200 complexes mediate m TOR signaling to the autophagy machinery[J].Mol Biol Cell, 2009, 20 (7) :1992-2003.
[8]ESFANDIAREI M, LUO H, YANAGAWA B, et al.Protein kinase B/Akt regulates coxsackievirus B3 replication through a mechanism which is not caspase dependent[J].J Virol, 2004, 78 (8) :4289-4298.
[9]李小明, 杨作成, 陈淳媛, 等.m TOR/p70S6K信号通路与NIH3T3成纤维细胞增殖[J].现代预防医学, 2008, 35 (18) :3582-3584.[9]LI XM, YANG ZC, CHEN CY, et al.Effect of MTOR/P70S6kinase signal pathway on proliferation of NIH3T3 fibroblasts[J].Modern Preventive Medicine, 2008, 35 (18) :3582-3584.Chinese
[10]成亮, 陈淳媛, 杨作成, 等.CVB3对不同营养状态的He La细胞m TOR信号通路调控的影响[J].中南大学学报 (医学版) , 2013, 38 (1) :20-25.[10]CHENG L, CHEN CY, YANG ZC.Regulation of m TOR signal pathway in He La cells under different nutritional conditions by Coxsackie virus B3[J].Journal of Central South University (Medical Sciences) , 2013, 38 (1) :20-25.Chinese
[11]RONG L, LIVINGSTONE M, SUKARIEH R, et al.Control of e IF4E cellular localization by e IF4E-binding proteins, 4E-BPs[J].RNA, 2008, 14 (7) :1318-1327.