感染状态（共5篇）
感染状态 篇1
1 患者基本情况
患者, 男, 29岁, 主因“发作性抽搐17年, 频发抽搐伴意识不清7小时”入院。
患者入院前17年无明显诱因出现抽搐发作, 表现为四肢抽搐, 随之意识丧失, 呼之不应, 约数分钟后意识恢复, 抽搐发作时伴双眼上翻, 口吐白沫, 大小便失禁, 无四肢抽动。曾于当地医院就诊, 诊断为:癫痫。经对症治疗 (具体不详) 后, 患者仍间断有抽搐发作。出院后口服药物 (苯妥英钠) , 仍有抽搐发作, 具体发作形式不详。此次患者于7小时前频繁发作抽搐, 伴有意识障碍, 抽搐停止后意识一直未恢复, 口唇发绀明显, 家属遂送至急诊科。为进一步明确诊断及治疗, 将其收住重症医学科。患者自发病以来, 精神差, 意识不清, 大小便失禁。
入院查体:精神差, 意识不清, 持续低热, 无寒战。T:37.4℃, P:104次/分, R:21次/分, BP:113/75 mm Hg。神经系统查体:精神差, 意识不清, 双侧瞳孔等大等圆, 左∶右=3.0 mm∶3.0 mm, 对光反应迟钝, 眼球无震颤;脑膜刺激征阴性, 踝阵挛、髌阵挛阴性, 四肢可自主活动, 感觉、共济检查无法配合, 双侧肱二头肌、肱三头肌、桡骨膜、膝腱反射对称引出, Babinski征左侧未引出、右侧阴性;辅助检查结果见表1。
临床诊断: (1) 癫痫持续状态; (2) 肺部感染。
2 治疗过程及用药方案调整
2.1 初始治疗方案
入院后首先将患者收住重症医学科, 持续气管插管机械通气, 予以芬太尼注射液和咪达唑仑联用镇静, 丙戊酸钠与苯巴比妥钠控制癫痫症状, 头孢唑肟抗感染, 甘露醇注射液和甘油果糖氯化钠注射液联用脱水降颅压, 还原型谷胱甘肽注射液改善肝功能。同时给予肠内营养、补液等对症支持治疗及灌肠、物理降温、吸痰等治疗。复查生化全项、血常规、出凝血时间, 密切观察患者病情变化, 及时调整治疗方案。
2.2 治疗过程及方案调整
(1) 入院第3天。患者入重症医学科后经镇静、抗癫痫、抗感染、脱水降颅压、支持等综合对症治疗, 病情稳定, 癫痫再未发作, 于当日转入神经内科。
血生化复查结果示肝肾功能异常, 血常规示白细胞及淋巴细胞有所下降, 因此仍实施对症和对因治疗方案。停用甘露醇注射液, 减轻脱水降颅压力度;停用中/长链脂肪乳, 经胃管摄入食物以补充能量;调整头孢唑肟用药频度 (tid改为bid) , 在保证抗感染效果的同时尽可能降低其对肾功能的影响;调整丙戊酸钠的给药频次 (tid改为q8h) , 使其血药浓度更趋稳态。
(2) 入院第4天。患者神智转清, 故于当日拔除胃管, 鼓励其自主进食, 口服药物由“胃管入”调整为“口服”;患者咳痰增多, 为白色粘痰, 所以在积极抗感染治疗基础上雾化吸入氨溴索、糜蛋白酶, 以促进炎性分泌物排出。由于患者体温最高时达38.5℃, 为防止高热惊厥, 给予复方锌布颗粒降低体温, 同时嘱陪护加强物理降温。血生化复查示患者肝酶指标较前升高, 故加用舒肝宁注射液20 ml, qd, 静滴, 以加大保肝治疗力度。
(3) 入院第6天。患者今日未发作癫痫, 故将苯巴比妥钠调整为1次/晚, 加用拉莫三嗪25 mg, bid, 口服。
(4) 入院第7天。患者于夜间间断抽搐3次, 可能与苯巴比妥钠用法调整有关, 故静脉泵入地西泮 (1 ml/h) , 并继续给予苯巴比妥钠0.1 g, 1次/晚, 肌注, 拉莫三嗪25 mg bid, 口服;肺部感染继续给予静脉滴注头孢唑肟2.0 g, bid;氨溴索、糜蛋白酶雾化吸入化痰止咳等对症治疗。患者入院6日未解大便, 当日给予开塞露润肠通便。
(5) 入院第8天。患者前日夜间无抽搐发作, 故当日上午停用地西泮泵入, 但下午再次出现癫痫大发作, 立即予以苯巴比妥钠0.1 g, 肌注, 抢救成功后, 继续静脉泵入地西泮 (2 ml/h) 。目前, 患者咳嗽、咳痰症状明显改善, 体温自昨日开始已趋正常, 故于当日停止雾化吸入。鉴于患者颅内压已趋正常, 故调整甘油果糖氯化钠给药频次 (bid改为gd) 。
(6) 入院第9天。地西泮静脉持续泵入后癫痫发作控制较好, 当日调整静脉泵入量为2 ml/h, 同时加服氯硝西泮片2 mg, 1次/晚, 同时调整拉莫三嗪片为50 mg, 以便逐渐停用静脉用
患者肺部感染已基本控制, 体温正常超过72 h, 无咳嗽、咳痰等症状, 白细胞、中性粒细胞百分比等指标已正常, 故于当日停用头孢唑肟。
(7) 入院第13天。患者血生化复查结果示各项指标已趋于正常, 且临床症状明显改善, 再无癫痫发作, 抗癫痫药物已顺利调整为口服药物, 于当日出院。
3 分析与讨论
3.1 癫痫持续状态治疗原则
选用强有力、见效快、作用时间长、能保持有效的血浓度、对呼吸循环抑制作用最小、足量的抗癫痫药物及时控制发作;维持生命功能, 预防和控制并发症, 如脑水肿、酸碱平衡及水电解质平衡紊乱、心脑肺等多脏器功能衰竭、高热等;必须保持呼吸道通畅, 必要时行气管切开;积极查找发病原因, 针对病因治疗, 是控制和防止癫痫持续状态的根本措施;发作终止后应给予维持剂量, 进行长期抗癫痫治疗[1]。
3.2 癫痫持续状态的治疗药物[2]
3.2.1 一线药物
首选地西泮, 首次负荷剂量10~20 mg, 静脉推注, 推注速度2 mg/min。发作未终止者, 15~30 min后重复注射一次。发作仍未终止者改为二线药物治疗。
3.2.2 二线药物
选用丙戊酸钠, 首次负荷剂量15~30 mg/kg, 静脉推注, 推注速度3~6 mg/ (kg·min) , 发作终止者可给予维持剂量1 mg/ (kg·h) , 24小时后改为口服丙戊酸钠。发作未终止者改用苯巴比妥, 首次负荷剂量10~20 mg/kg, 静脉推注, 推注速度50mg/min, 发作仍持续者可追加5~10 mg/kg, 同时进入具有监测与救治条件的重症监护病房。发作终止者可给予维持剂量2~4mg/ (kg·d) , 24小时后改为口服苯巴比妥。发作仍未终止者改用三线药物治疗。
3.2.3 三线药物
首选咪达唑仑或异丙酚。咪达唑仑首次负荷剂量0.20 mg/kg, 静脉推注;维持剂量0.05~0.40 mg/ (kg·h) , 若有条件应当以脑电图 (EEG) 出现爆发抑制模式至少24 h为目标。异丙酚首次负荷剂量1~3 mg/kg, 根据发作情况和EEG结果, 必要时追加1~2 mg/kg;维持剂量4~10 mg/ (kg·h) 。EEG出现爆发抑制模式至少24 h后改为肌肉注射苯巴比妥。三线药物治疗期间, 持续监测患者呼吸、心电, 并在机械通气前提下开始用药, 必要时请麻醉师协助。
3小结
患者入院时意识不清, 在重症医学科经机械通气、药物对症治疗后转入神经内科继续治疗。在抗癫痫、抗感染、保肝等治疗过程中, 临床药师积极协助医师, 根据患者临床表现及辅助检查结果, 适时调整药品品种、给药频次、给药途径, 如地西泮静脉泵入速度的调整、苯巴比妥用药频次及雾化吸入药物频次的调整、脱水降颅压药品品种的增减等, 在此过程中, 临床药师充分发挥专业特长, 适时提出合理化建议, 并根据药物治疗情况实施药学监护, 提高了药物治疗的合理性、有效性与安全性。
参考文献
[1]金泰浩.癫痫持续状态药物治疗进展[J].中国实用医药, 2009, 4 (5) :204-205.
[2]卫生部.成人全面惊厥性癫痫持续状态临床路径[S].2010.
感染状态 篇2
关键词：威宁鸡,散养,寄生虫,感染情况调查,防治
威宁鸡属地方优良品种,具有个体大、肉质好、抗病力强、适于林下养殖等特点,已成为威宁县生产优质鸡的主要品种。威宁鸡以散养为主,寄生虫病为威胁威宁鸡鸡群健康的主要疾病之一,常常造成鸡只腹泻、消瘦甚至死亡。为确保威宁县鸡养殖业的健康发展,制订合理的驱虫方案提供依据,于2013 年7—8 月份在威宁县鸡产区开展了威宁鸡寄生虫调查工作。
1 材料
1. 1 剖解材料
剖解材料为随机购于威宁县草海、金钟、小海等8 个乡( 镇) 农户自繁自养的60 只散养鸡。
1. 2 粪检鸡粪
粪检鸡粪来自威宁县草海、金钟、小海等18 个乡( 镇) 175 个村,共780 份。
2 方法
2. 1 虫体采集方法
宰杀前寻找寄生于体表的寄生虫,发现虫体后用镊子夹取,放于75% 的乙醇溶液中保存。然后将鸡只颈部放血、干法拔毛。剖开胸、腹膛,取出全部内脏,将食管、小肠、盲肠、直肠分段结扎剪断。剪开嗉囊、肌胃,倒去内容物。剪开小肠、盲肠、直肠,内容物洗入水中。剪开食管、腺胃、气管、输卵管,分别放入装有清水的搪瓷盆中。
洗净后仔细检查黏膜表面及浅层是否有寄生虫,发现寄生虫用解剖针挑出,放入采样瓶中。将装有内脏的容器静置5 ~ 10 min,除去上清液,仔细查找粪中的寄生虫体。沿胆管剪开肝脏,检查胆管中的寄生虫,然后将其剪碎,放入生理盐水中,方法与肠道的检查相同。
采集后的样品贴上标签,并做好记录。
2. 2 虫体固定保存
线虫、棘头虫用70% 的乙醇溶液固定保存。绦虫用5% 的福尔马林溶液固定保存。吸虫洗净后放入乙醇- 福尔马林- 醋酸固定液( A. F. A) ( 95% 乙醇50 m L,甲醛10 m L,冰醋酸2 m L,生理盐水40 m L)里过夜固定,次日取出保存于70% 的乙醇溶液中。较小的虫体用薄荷脑液先松弛虫体,再保存。
2. 3 虫体检查
线虫用乳胶酸酚透明,绦虫、吸虫用盐酸洋红染色,二甲苯透明加树脂封片,在显微镜和解剖镜下进行形态学分类鉴定。
2. 4 虫卵检查
粪检采用饱和盐水漂浮法,检查当日采集送检的新鲜粪便。
3 调查结果
3. 1 剖解结果( 见表1)
共剖解鸡63 只,检出虫体7 种,即鸡异刺线虫、钩状华首线虫、鸡蛔虫、棘沟赖利绦虫、有轮赖利绦虫、鸡羽虱、鸡膝螨,感染率100% 。其中感染率最高的为鸡羽虱、鸡异刺线虫、鸡蛔虫、鸡膝螨,感染率分别为53. 33% 、40. 00% 、26. 70% 、23. 33% 。感染强度最高的为鸡异刺线虫,1 只鸡体内虫体最高达328 条,其次为鸡蛔虫,1 只鸡体内虫体最高达25 条。
3. 2 粪检结果( 见表2)
调查范围涉及18 个乡( 镇) 176 个村276 户,收集鸡粪780 份,调查所得虫种11 种,即鸡异刺线虫、有轮毛细线虫、艾美耳球虫、鸡蛔虫、有轮赖利绦虫、楔形变带绦虫、分枝膜壳绦虫、钩状华首线虫、舟形嗜气管吸虫、前殖吸虫、节片戴文绦虫。感染率较高的前4 种寄生虫为鸡异刺线虫、有轮毛细线虫、艾美耳球虫、鸡蛔虫,感染率分别为36. 15% 、29. 23% 、21.41% 、15. 13% 。鸡异刺线虫、有轮毛细线虫、艾美耳球虫、鸡蛔虫分布最广,在调查的18 个乡( 镇) 都有分布。
4 结论
通过剖解和粪检,共检出鸡寄生虫13 种,隶属6 纲8 目9 科11 属。其中体内寄生虫鸡异刺线虫( 40. 00% ) 、鸡蛔虫( 26. 70% ) 、有轮毛细线虫( 29. 23% ) 、艾美耳球虫( 21. 41% ) 感染率最高,体外寄生虫鸡羽虱( 53. 33% ) 、鸡膝螨( 23. 33% ) 感染率最高,属防治的重点虫种,与阮正祥等［1］报道的基本相符。
5 防治措施
5. 1 体外寄生虫的防治
威宁鸡的体外寄生虫主要是羽虱和膝螨,鸡羽虱吸食血液、咬食羽毛,致使鸡羽毛断裂、不安、消瘦; 鸡膝螨的寄生导致寄生部位皮肤增厚、瘙痒,渗出物形成“石灰脚”,严重时鸡跛行、产蛋下降。
采取防治措施,防治鸡羽虱。一是用0. 5% 的敌百虫或2% ~ 3% 的除虫菊酯均匀撒在病鸡全身羽毛上; 二是用3% 除虫菊酯与细沙拌匀,让病鸡沙浴。10 d后再重用药复1 次。同时对圈舍、环境和所有用具用0. 5% 的敌百虫喷洒。
发现鸡膝螨时及时隔离,患处涂擦20% 硫黄软膏或2% 石炭酸软膏,病鸡形成“石灰脚”时,先用温水浸泡患处,除去痂皮,再涂擦硫黄软膏,连用2 ~3 d。
5. 2 体内寄生虫的防治
威宁鸡的体内寄生虫有吸虫、绦虫、线虫、原虫,主要寄生在消化道,寄生虫的寄生破坏了鸡正常的消化吸收功能。表现为消化不良、食欲减退、排稀粪或带血粪便、消瘦、生长发育缓慢、产蛋量下降,严重时因极度衰弱而死亡。
1) 蠕虫的防治。育雏结束,放养20 ~ 30 d后进行第1 次驱虫,相隔20 ~ 30 d再进行第2 次驱虫,以后间隔60 ~ 90 d驱虫1 次。用芬苯哒唑驱除蛔虫等线虫,每千克体重10 ~ 30 mg,内服1 次。用吡喹酮驱除吸虫和绦虫,按每千克体重10 ~ 20 mg,内服1 次。
2) 球虫的防治。雏鸡12 日龄开始用药,42 日龄前用氨丙啉或地克珠利防治。氨丙啉混饲,100 kg饲料加药125 g; 饮水按1 000 L水加药600 g,连用2 ~4 周。或地克珠利连续用到42 日龄,混饲预防浓度为1 000 kg饲料加入1 g药物; 饮水时每1 升水中加入0. 5 ~ 1. 0 mg,42 日龄后用氨丙啉( 125 mg /kg) +地克珠利( 50 mg /kg) 预防［2］,一直用到60 日龄。
参考文献
[1]阮正祥,何虎,苟中屏,等.贵州省毕节地区鸡寄生虫病区系调查[J].中国兽医寄生虫病,2002,10(3):22-24.
感染状态 篇3
1 资料与方法
1.1 临床资料
随机选取中山大学附属第一医院2009年3月～2012年2月收治的白血病化疗后出现院内感染的患者140例随机分两组, 对照组70例, 男39例, 女31例, 平均年龄39.75±6.1岁, 急性淋巴细胞性白血病31例, 急性非淋巴细胞性白血病39例;观察组70例, 男37例, 女38例, 平均年龄41.01±5.8岁, 急性淋巴细胞性白血病29例, 急性非淋巴细胞性白血病41例。
1.2 方法
对照组给予常规护理, 观察组给予护理干预, 包括加强卫生管理和消毒隔离, 严格执行无菌操作, 并进行心理护理干预。
1.3 统计学方法
采用spss 13.0统计学软件分析数据, 计量资料采用t检验, 计数资料采用卡方检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组临床缓解率的比较
见表1。
2.2 两组焦虑评分的比较
观察组焦虑评分为34.55±5.9分, 明显低于对照组, 差异有显著性 (P<0.05) , 见表2。
3 讨论
白血病化疗后常常出现骨髓抑制导致血中性白血病减少, 患者细胞免疫和体液免疫功能受到抑制, 增加院内感染的发生率[2]。积极给予护理干预可显著提高临床缓解率, 减少院内感染的发生率及改善患者焦虑、紧张的情绪。本研究给予的护理干预措施包括以下方面:
3.1 加强基础护理, 预防内源性感染
加强患者口腔、呼吸道、外阴及肛周等的护理, 密切观察口腔黏膜, 并给予5%的碳酸氢钠漱口, 预防口腔溃疡;给予高蛋白、高热量、高维生素饮食及低盐饮食, 勿食生、冷、辣等刺激性食物, 提高患者抵抗力及预防胃肠道感染;合并腹泻患者及时给予补液;培养良好卫生习惯, 保持身体干净;给予1:5000高锰酸钾液坐浴, 预防皮肤和肛周感染。本研究结果表明, 给予护理干预后, 观察组的临床缓解率88.57%, 明显高于对照组, 具有统计学差异。
3.2 加强消毒管理, 阻断外源性感染
首选应加强病房环境的消毒管理, 保证通风、干燥, 使用氯仿消毒地面, 安装空气消毒器, 更洗空调虑过网, 杀灭空调排出的霉菌孢子[3];其次要严格执行消毒隔离制度, 加强血压计、听诊器等的消毒, 严格执行无菌操作;最后对伴有免疫功能缺损性疾病患者注意隔离病房照顾, 并定期进行致病菌检查。
3.3 加强心理护理干预
对患者进行卫生宣传教育, 与患者及家属有效沟通, 建立良好护患关系, 消除患者紧张及恐惧情绪, 鼓励患者战胜病魔的信心, 提高其接受治疗的积极性和依从性[4], 本研究结果表明, 护理干预后观察组的焦虑评分明显低于对照组, 差异有显著性。特定有效的护理干预, 有助于缓解患者紧张恐惧情绪, 提高临床治疗疗效。
参考文献
[1]庞久玲, 张静涛, 刘军, 等.心理干预对老年大面积烧伤患者焦虑、抑郁的影响[J].中国老年学杂志, 2010, 30 (3) :325-326.
[2]杜香洲, 钟巧玉, 杨红, 等.急性白血病合并感染临床分析及防治对策[J].中华医院感染学杂志, 2011, 21 (7) :1337-1338.
[3]邵剑峰, 林茂芳, 钟永根, 等.急性白血病患者医院真菌感染的临床分析[J].中华医院感染杂志, 2007, 17 (1) :29-31.
感染状态 篇4
1 资料与方法
1.1研究对象
选择2014 年3 月至2014 年9 月本院神经外科及ICU收治的脑出血术后患者。排除标准: 2 周内有细菌感染、慢性疾病( 如糖尿病、泌尿系统感染、心功能不全等) 、免疫抑制剂使用等情况。入选46 例,其中男33 例,女13例,年龄52 ~ 75 岁,平均( 57. 75 ±9. 44)岁,序贯器官衰竭估计评分( SOFA) 平均( 8. 47±2. 92) 分。
1. 2 方法
1. 2. 1 分组: 根据细菌检测( 痰培养、血培养) 结果,将患者分为非感染组( A组) 18 例( 男13 例,女5 例) 和感染组( B组) 28 例( 男20 例,女8 例) 。2 组患者性别、年龄、体温、白细胞计数( WBC) 、C反应蛋白( CRP) 、SOFA评分无统计学差异,具有可比性,见表1。
1. 2. 2 床旁PCT快速测定: 入院后第1、2、3、5、7 天采静脉血测定PCT值。血清PCT水平采用北京LEPU公司生产的Quant-GOLD-1 型免疫定量分析仪,配套LEPU科技PCT专用检测试纸,通过传感器将胶体金免疫层析试纸的色谱信号转化为光谱信号( 金标法) 进行检测( 检测范围0. 1 ~ 50 ng/ml) 。
1.3统计学分析
统计学处理均采用Stata 12 软件包,计量资料以均数 ± 标准差( ±s) 表示,2 组间比较采用t检验。P<0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 A组与B组PCT比较
2组患者各时点PCT水平差异有统计学意义( P<0. 01) 。其中B组患者PCT第1 天即升高,3 d后逐渐下降,见表2。
2.2 B组中存活亚组与死亡亚组各时点PCT比较
以14 d转归将B组患者分为存活亚组与死亡亚组,2 个亚组各时点PCT比较均存在统计学差异( P< 0. 01 ) ,见表3。
注: 与A组同时比较,**P<0. 01
注: 与存活亚组比较,**P<0. 01
3 讨论
PCT来自定位于第11 号染色体上( 11p15,4) 的单拷贝基因,该基因由2800 个碱基对组成,含6 个外显子和5个内含子。转录后在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成降钙素原前体,包括N端84 个氨基酸、活性降钙素和降钙蛋白三部分。降钙素原前体在内源多肽酶作用下剪掉n Pro-CT端单一序列,生成116 个氨基酸的PCT,分子量约为13 k D,PCT和降钙素具有一个相同的32 个氨基酸的序列( 60 ~ 91 位) 。PCT是无激素活性的降钙素前肽物质[2]。PCT在健康个体中的浓度非常低( <0. 1 ng/ml) ,几乎不能被检测到,并且在活体内外都是非常稳定的蛋白,半衰期大约20 ~ 24 h,对于重症感染患者,PCT在内毒素等细胞因子诱导下,2 ~ 3 h开始增加,内毒素产生后2 h血浆中可检测到,6 ~ 8 h体内浓度快速升高,12 ~ 48 h到达峰值,2 ~ 3d后恢复正常[3]。因此血清中PCT浓度升高可以用于早期判断是否存在全身细菌感染[4]。2001 年国际脓毒症会议已把PCT作为脓毒症诊断指标之一,并在2008 年的指南中将PCT高于正常值上限2 倍定义为感染指标[5]。本研究结果显示,入院第1 天合并感染组患者血清PCT水平显著高于非感染组( P<0. 01) ; 而传统的炎症指标( 最高体温、WBC、中性粒细胞分类) 以及CRP、SOFA之间无统计学差异( P>0. 05) ,这可能与大脑中枢受损引起中枢性高热及各类炎症因子应激性升高有关。本研究提示在重度脑出血患者中早期检测血清PCT即可区分感染与非感染状态,这与既往的文献资料一致[6,7]。
在动态监测血清PCT水平变化中,合并感染组PCT水平始终高于非感染组,在感染早期即开始升高,在感染第3 天达到高峰,后逐渐下降,随着感染的控制接近正常。这不但提示血清PCT水平升高可反映感染持续存在的状态,同时血清PCT动态变化也可反映感染控制情况,对抗生素使用具有指导意义。国外学者Briel等[8]临床研究认为PCT可指导成年患者急性呼吸道感染的抗生素治疗,因此在重度脑出血患者中动态监测血清PCT水平可能是避免滥用抗生素的一个行之有效的方法。
Nylen等[9]报道在动物脓毒症模型中PCT可能是一个潜在的致死因子,最近的研究也表明PCT水平与患者死亡率有关[10]。本研究也证实了这一点,在入院第14 天为界将合并感染患者分为存活组与死亡组,发现死亡组各时段血清PCT水平明显高于存活组,且在死亡组中血清PCT在第3 天后仍维持在较高水平无明显下降。因此我们推测血清PCT水平持续升高在此类疾病中提示预后不良,动态监测血清PCT水平对评估重度脑出血患者预后有一定帮助。
综上所述,血清PCT是早期区分脑出血患者感染与否的特异指标,明显优于传统的炎症指标( 如体温、WBC、CRP) 。同时,在重度脑出血患者中床旁动态监测其水平对指导抗生素使用、评估病情判断预后具有一定临床价值。
参考文献
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感染状态 篇5
禽流行性感冒(简称禽流感,AI)是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的以禽类为主的传染性疾病。根据病原体类型的不同,禽流感分为高致病性(HPAI)和低致病性(MPAI)禽流感,其中高致病性毒株主要有H5和H7两个血清亚型。本研究所用的毒株 (GSGD/1/96)是我国分离鉴定的第1株高致病性禽流感病毒株[4]。笔者在miRNA组学测序的基础上,分析了差异显著两组间的miRNA,其中miRNA-17a*在3月龄SPF鸭感染与非感染病毒状态下的免疫器官中的表达存在极显著差异。为了探讨该miRNA在感染和非感染病毒状态下SPF鸭不同组织中的表达规律,本研究对3月龄的SPF鸭采用滴鼻法感染H5N1亚型禽流感病毒,检测miRNA-17a*在感染与非感染H5N1亚型禽流感病毒状态下SPF鸭的各组织中的表达情况,以期为在感染H5N1亚型禽流感病毒状态下,miRNA-17a*在水禽中的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验动物和样品处理
3月龄SPF鸭和H5N1亚型禽流感病毒株(GSGD/1/96),均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。将20只SPF鸭随机分成2组,即试验组和对照组,每组10只,分别隔离饲养在负压隔离器中。试验组SPF鸭采用滴鼻法人工感染1×106EID50/0.1 mL的H5N1亚型禽流感病毒,感染病毒后每2 d采血1次,并分离血清检测SPF鸭感染H5N1亚型禽流感病毒后抗体水平的变化,当抗体水平稳定至平台期时,对试验组和对照组SPF鸭进行屠宰,采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、气管和肌肉组织,立即置于液氮中, -80 ℃冰箱中保存,备用。
1.2 cDNA的获得
采用Trizol法提取试验组和对照组SPF鸭不同组织的总RNA,样品全部在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所P3实验室内处理,同时电泳检测总RNA的质量,应用紫外分光光度计检测总RNA的浓度。按照ReverTra Ace qPCR反转录试剂盒的要求,先将RNA样品于65 ℃加热5 min备用。调整各样品总RNA的浓度均为250 ng,使反转录体系中总RNA量一致,以减少定量中的误差。反转录体系:5×RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 0.5 μL、miRNA-specific stem-loop RT primer 0.5 μL、Total RNA 250 ng,添加Nuclease-free water至10 μL。反应条件:42 ℃ 15 min;98 ℃ 5 min。所得产物于-80 ℃保存,备用。
1.3 引物设计
试验所用miRNA-17a*序列为前期鸭高通量测序工作所得结果中获得序列,同时以5S rRNA作为内参对照。根据参考文献[5]中引物设计原则设计特异性反转录引物及荧光定量PCR上、下游引物(见表1),在长春华大中天生物技术有限公司合成。
1.4 荧光定量RT-PCR反应
根据SYBR Green荧光定量PCR试剂盒的要求,研究在感染与非感染H5N1亚型禽流感病毒状态下SPF鸭不同组织中miRNA-17a*的表达情况。反应体系:2×SYBR混合物12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、cDNA(按照1∶10比例稀释)2.5 μL、RNase free H2O 8 μL。反应条件:95 ℃ 1 min;94 ℃ 1 min,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,共40个循环。同时扩增5S rRNA作为内参对照,用2-△△CT法计算miRNA-17a*的表达量,以脾脏组织的表达量作为标准进行相对表达分析,应用SPSS软件对所得数据分析。
2 结果与分析
2.1 总RNA的提取(结果见图1)
M.DNA Marker;1～6.分别为心脏、肝脏、脾脏、 肾脏、肌肉、气管。
由图1可知,各组织提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测完整性较好,基本无降解。紫外分光光度计检测发现,OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间。说明样品无DNA或蛋白污染,能够满足试验的要求。
2.2 在非感染状态下SPF鸭不同组织中miRNA-17a*的相对表达(结果见图2)
由图2可知,在SPF鸭的不同组织中均能检测到miRNA-17a*表达,其中在肺脏中的相对表达量最高,其次为心脏、肌肉、脾脏、肾脏和气管,而在肝脏中miRNA-17a*的相对表达量最低。
2.3 在感染H5N1亚型禽流感病毒状态下SPF鸭不同组织中mi RNA-17a*的相对表达(结果见图3)
由图3可知,经荧光定量PCR分析,在SPF鸭感染H5N1亚型禽流感病毒后的不同组织中均能检测到miRNA-17a*表达,其中在肌肉中相对表达量明显高于其他组织,其次为心脏、脾脏、肾脏、肺脏和气管,而在肝脏中miRNA-17a*相对表达量最低。
2.4 在感染与非感染H5N1亚型禽流感病毒状态下SPF鸭不同组织中mi RNA-17a*相对表达情况的比较(结果见图4)
由图4可知,感染H5N1亚型禽流感病毒的SPF鸭气管中miRNA-17a*相对表达量是非感染SPF鸭气管中miRNA-17a*相对表达量的1.2倍,而在其他组织中,感染H5N1亚型禽流感病毒后miRNA-17a*相对表达量相对低于非感染SPF鸭。
3 讨论
MiRNA是近年来发现的一类对基因表达调控具有重要调节作用的小分子RNA。在细胞核内,在多种酶的作用下编码miRNA的基因经过转录、加工和转运过程剪切为成熟的miRNA[6]。近年来,关于miRNA在不同生物过程中的作用越来越受到人类的关注,有学者曾报道miRNA-17能够作用于靶基因PKD2的3′非翻译区,在转录后抑制该基因的表达,从而促进细胞的增殖[7],但是研究分析miRNA-17a*的作用还未见报道。
禽流感病毒呈世界性分布,是危害养禽业健康发展的主要疫病,1997年,人们首次发现禽流感病毒能够感染人,使禽流感成为一种能够引起人类感染的新型传染病,对人类健康造成了巨大威胁。目前,人类除了从传统的编码蛋白基因及其相关通路角度研究禽流感病毒的分子作用机理,miRNA作为一类对mRNA转录后调控的非编码小RNA越来越受到关注[8]。
本研究选择前期鸭高通量测序工作中检测到的miRNA-17a*,研究其相对表达量,并分析感染H5N1亚型禽流感病毒后的SPF鸭与对照组SPF鸭相同组织间的相对表达差异。结果表明,在对照组SPF鸭的肺脏中miRNA-17a*的相对表达量较高,推测miRNA-17a*可能对禽类的呼吸系统具有一定的调节作用。感染H5N1亚型禽流感病毒后,miRNA-17a*在气管中的相对表达量与非感染SPF鸭气管的相对表达量相比升高,表明感染H5N1亚型禽流感病毒后miRNA-17a*及其对应的靶基因主要对禽类的呼吸系统产生影响,这与其在SPF鸭不同组织中的表达结果相一致,因此预测miRNA-17a*可能在水禽的呼吸系统中具有重要的调节作用,其调控的靶基因可能在水禽中起到抑制病毒复制的作用。但是这还需要进一步预测miRNA-17a*的靶基因,分析靶基因与miRNA-17a*的作用机理。
参考文献
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