稳定干涉（共8篇）
稳定干涉 篇1
COPS3是COP9信号复合体的第三个亚基,在高度恶性骨肿瘤样本中检测到高表达［1］,进一步机制研究发现COPS3蛋白在骨肉瘤发生发展中发挥了重要作用［2］。目前研究认为,COP9信号复合体是26S蛋白酶体复合物的一部分,其与E3酶的结合会促进底物发生蛋白酶体依赖的泛素化降解［3，4］,从而影响肿瘤的发生发展; 另一方面COP9信号复合体作为去Neddylation修饰酶,能够影响底物蛋白的表达水平,在生物的发育过程中发挥重要功能［5，6］。
NLRP3炎症小体是细胞内的一类多蛋白复合体,它能够感受外界信号刺激并激活半胱天冬酶-1 ( caspase-1)［7］,活化的caspase-1进一步调控IL-1β、 IL-18等促炎因子加工和分泌［8］,导致机体能够对感染和损伤等外界刺激产生系统或局部反应,因此NLRP3炎症小体在机体对抗病原微生物的天然免疫反应中发挥非常重要的作用［9］。
本实验室前期工作通过酵母双杂交筛选,发现NLRP3与COPS3存在相互作用。为了进一步探讨COPS3蛋白是否在NLRP3炎症小体活化过程中发挥功能,利用shRNA干扰技术构建了COPS3的稳定干涉细胞系,并在此基础上观察了COPS3是否影响NLRP3炎症小体的激活。
1材料
1. 1主要试剂
含嘌呤霉素抗性的PLKO. 1慢病毒载体,人胚胎肾细胞293TN ( 细胞购自中国科学院上海细胞库) , 人急性单核细胞性白血病细胞THP1细胞( 来自美国National Institutes of Health) ,小提质粒提取试剂盒( Promega公司) ,琼脂糖DNA回收试剂盒( Promega公司) ,磷酸钙转染试剂( 迈晨科技有限公司) ,大肠杆菌E. coli DH5α 感受态细胞( 天根生化科技有限公司) ,限制性核酸内切酶( New England Biolabs公司) , RPMI 1640培养基( 迈晨科技有限公司) 。
1. 2主要仪器
恒温培养箱( Thermo公司) ,核酸电泳仪( Amer- sham公司) ,低温高速离心机( Sigma公司) ,凝胶成像分析系统( USA) ,恒温摇床( Fuma公司) 。
2方法
2. 1 shRNA靶序列设计
利用Public TRC Portal网站,从中选取3条适用于PLKO. 1载体的COPS3特异性shRNA干涉序列,序列如表1所示。
2. 2慢病毒质粒的构建及阳性克隆的筛选
将合成DNA单链溶解成100 μmol/L终浓度, 互补单链各取1. 25 μL混合,加入5 μL 0. 5 mol/L Na Cl,补加水至终体积为40 μL,95 ℃ 加热5 min后,体系缓慢降温至室温。取退火后体系2 μL,将其与Age I和EcoR I处理后的p LKO. 1载体混合,用于连接反应。将连接产物各取5 μL分别接种于50 μL DH5α 感受态中,轻轻混匀后冰浴30 min,将含有连接产物的感受态于42 ℃热激90 s; 迅速将EP管取出,冰浴3 min。EP管中加入600 μL无抗LB培养基,置37 ℃ 孵育1 h后,3 000 r / min室温离心3 min,弃上清,留60 ~ 70 μL菌液混匀后均匀涂于氨苄青霉素抗性LB琼脂平板上。平板置于37 ℃培养16 h后,挑取克隆重悬于5 m L含氨苄青霉素抗性的LB培养液中,37 ℃悬摇16 h,提取菌液质粒并通过测序鉴定阳性克隆。
2. 3病毒包装
利用磷酸钙转染法将慢病毒质粒6 μg和包装质粒4. 5 μgps PA × 2,1. 5 μg p CMV-VSVG转染至293TN细胞中,转染6 h后换成DMEM培养基。细胞培养48 h后收集病毒,1 300 r/min离心5 min,取上清到50 m L离心管中,于4 ℃ 冰箱保存。96 h后第二次收集病毒,将两次收集得到的病毒混合后通过0. 45 μm过滤器进行过滤,4 ℃保存备用。
2. 4 THP1细胞的病毒感染
接种THP1细胞5 × 106/10 cm皿,每皿加入6 m L病毒上清,再用RPMI 1640完全培养基补齐至10 m L,同时加入终浓度为8 μg / m L polybrane,感染细胞。
2. 5感染细胞的干涉效果检测
将THP1细胞感染24 h后500 r/min离心,更换成RPMI 1640完全培养基并加入嘌呤霉素1 μg /m L培养2 ~ 3 d,裂解部分细胞,制备Real-Time PCR样品,检测干涉效果。
2. 6 NLRP3炎症小体激活效应检测
将稳定干涉COPS3细胞系培养至12孔板,200 nmol PMA处理24 h后加5 mmol ATP刺激30 min, 收取细胞样品,采用免疫印迹方法检测NLRP3炎症小体的激活效应。
3结果
3. 1 PLKO. 1- COPS3-shRNA克隆构建
COPS3干涉序列引物退火后,利用琼脂糖核酸凝胶电泳分析发现在50 bp处出现一条明显条带( 图1) ,与预期分子量相符,说明退火成功。将退火产物与EcoR I和Age I双酶切后的PLKO. 1载体相连,成功构建了PLKO. 1-COPS3-shRNA克隆。
3. 2阳性克隆验证及测序结果
分别从3条shRNA干涉序列克隆中各选取2个单克隆,提取菌液质粒后用EcoR I和Noc I进行双酶切鉴定,琼脂糖核酸凝胶电泳分析结果如图2所示。6个单克隆的酶切产物均能看到两条明显条带,提示干涉序列成功插入。从3条shRNA干涉序列克隆中各选取1个质粒进行测序分析( Invitrogen公司) ,测序结果如图3所示,插入片段所含的58个碱基序列均与设计合成的靶向COPS3寡核苷酸序列完全一致。
3. 3干涉效果检测
将筛选获得的稳定细胞株裂解,利用Real-Time PCR手段检测COPS3干涉效果( 图4 ) ,结果显示3条shRNA干涉序列均能够显著抑制COPS3的mR- NA水平,其中2#干涉序列的干涉效果最明显。
3. 4稳定敲低COPS3蛋白抑制NLRP3炎症小体的激活
将稳定干涉COPS3细胞系培养于12孔板,200nmol PMA处理24 h后加5 mmol ATP刺激30 min。 Western-Blot实验结果显示,COPS3 2 #和3 #干涉序列能够明显抑制caspase-1的剪切和IL-1β 的分泌( 图5) ,1#干涉序列对炎症小体的抑制效应不明显。
4讨论
由于THP1细胞是悬浮细胞,转染难度高,并且siRNA瞬时干涉方法存在诸多缺点,如基因沉默持续时间短,siRNA自身不能复制、容易被降解等。为了克服以上困难,本实验室采用PLKO. 1慢病毒表达系统建立THP1稳定干涉细胞系,该体系安全性能高,干涉效果持久。COPS3稳定干涉细胞系的成功建立为我们进一步探索其功能提供了有利工具。
COP9复合物是一种去Neddylation酶,在信号转导调控与蛋白质降解过程中发挥重要功能［10］。 Neddylation是一种类泛素化的蛋白质修饰方式,通过将结构上与泛素相似的分子NEDD8( Neural pre- cursor cell-expressed developmentally downregulated 8) 共价结合到底物蛋白质上,实现对底物分子的修饰,从而影响蛋白质的生物学功能［11］。文献报道, 植物中COP9可作用于NLR( NOD-like receptor) 复合体,在植物的抗病菌反应中发挥重要作用［12］。那么COP9是否通过其第三亚基COPS3蛋白在哺乳动物的炎症反应中发挥重要作用有待于进一步深入研究。
COPS3作为COP9信号复合体的第三个亚基, 目前报道在骨肉瘤,肺癌等多种肿瘤中高表达并发挥重要功能,但其详细作用机制尚不十分明确［2，13］。 利用siRNA技术干涉COPS3基因表达,能明显抑制骨肉瘤和肺癌细胞的增殖［13，14］。我们通过酵母双杂交技术筛选到COPS3与NLRP3存在相互作用, 并在稳定干涉COPS3的THP1细胞系中证明敲低COPS3能在一定程度上抑制Caspase-1和IL-1β 剪切,说明COPS3能够正向调控NLRP3炎症小体的激活。那么COPS3是通过什么机制调控NLRP3炎症小体? COPS3对炎症小体的调控是否依赖COP9复合体的去Neddylation酶功能? 以及COPS3对炎症反应的正向调控是否促进肿瘤的发生和转移? 本研究将为我们进一步深入探讨COPS3在炎症反应中的调节功能,以及揭示炎症反应与肿瘤发生的关系提供一定的理论依据。
摘要：COPS3(COP9 signalosome subunit 3)作为COP9信号复合体的第三个亚基,在多种恶性肿瘤中高表达。本实验室通过酵母双杂交系统筛选,发现COPS3与NLRP3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3)存在相互作用。目前关于COPS3与NLRP3炎症小体的相关性未见文献报道。为了研究COPS3对NLRP3炎症小体的影响,利用慢病毒感染系统建立了稳定干涉COPS3的THP1细胞系。首先将COPS3的不同干涉序列片段稳定整合到THP1细胞中,通过嘌呤霉素压力筛选,应用实时定量荧光PCR(real time PCR)手段检测COPS3的干涉效果,最终确定成功建立干涉COPS3的稳定细胞株。在稳定敲低COPS3的细胞株中,发现NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。综上提示,COPS3能够正向调节NLRP3炎症小体的激活。
关键词：COPS3,慢病毒,稳定干涉细胞系,NLRP3炎症小体
稳定干涉 篇2
1、知道两列频率相同的波才能发生干涉现象;知道干涉现象的特点.
2、知道现象是特殊条件下的叠加现象，知道干涉现象是波特有的现象.
3、通过观察波的独立前进，波的叠加和水现象，认识条件及干涉现象的特征.
教学建议
本节重点是对干涉概念的理解和产生稳定干涉条件的应用.学习中要注意两列波的波峰、波峰相遇处是振动最强的地方，波谷、波谷相遇处也是振动最强的地方;而波峰、波谷或波谷、波峰相遇处则是振动最弱的地方.干涉的图样是稳定的，振动加强的地方永远加强，振动减弱的地方永远减弱.
为什么频率不同的两列波相遇，不发生干涉现象?
因为频率不同的两列波相遇，叠加区各点的合振动的振幅，有时是两个振动的振幅之和，有时是两个振动的振幅之差，没有振动总是得到加强或总是减弱的区域，这样的两个波源不能产生稳定的干涉现象，不能形成稳定干涉图样.而是波叠加中的一个特例，即产生稳定的干涉图样.
请教师阅读下表：
|
项目
|
备注
|
|
|
概念
|
频率相同的两列波叠加，使某些区域的振动始终加强，某些区域的振动始终减弱，并且振动的加强区和减弱区相互间隔的现象 |
是波特有的现象 |
|
产生稳定干涉条件
|
(1)两列波的频率相同； (2)振动情况相同. |
|
|
产生的原因
|
波叠加的结果 |
教学设计示例教学重点：波的叠加及发生的条件.教学难点：对稳定的图样的理解.教学方法：实验讨论法教学仪器：水槽演示仪，长条橡胶管，计算机多媒体新课引入：问题1：上节课我们研究了波的衍射现象，什么是波的衍射现象呢?(波绕过障碍物的现象)问题2：发生明显的衍射现象的条件是什么?(障碍物或孔的大小比波长小，或者与波长相差不多)这节课我们研究现象，如果同时投入两个小石子，形成了两列波，当它们相遇在一起时又会怎样?请学生注意观察演示实验.一、观察现象：①在水槽演示仪上有两个振源的条件下，单独使用其中的一个振源，水波按该振源的振动方式向外传播;再单独使用另一个振源，水波按该振源的振动方式向外传播.现象结论：每一个波源都按其自己的方式，在介质中产生振动，并能使介质将这种振动向外传播.②找两个同学拉着一条长绳，让他们同时分别抖动一下绳的端点，则会从两端各产生一个波包向对方传播.当两个波包在中间相遇时，形状发生变化，相遇后又各自传播.(由于这种现象一瞬间完成，学生看不清楚，教师可用计算机多媒体演示)现象结论：波相遇时，发生叠加.以后仍按原来的方式传播，是独立的.1.波的叠加：在前面的现象的观察的基础上，向学生说明什么是波的叠加.教师板书：两列波相遇时，在波的重叠区域，任何一个质点的总位移都等于两列波分别引起的位移的矢量和.
结合图下图解释此结论.
解释时可以这样说：在介质中选一点 为研究对象，在某一时刻，当波源l的振动传播到 点时，若恰好是波峰，则引起 点向上振动;同时，波源2的振动也传播到了 点，若恰好也是波峰，则也会引起 点向上振动;这时， 点的振动就是两个向上的振动的叠加， 点的振动被加强了.(当然，在某一时刻，当波源1的振动传播到 点时，若恰好是波谷，则引起户点向下振动;同时，波源2的振动传播到了 点时，若恰好也是波谷，则也会引起 点向下振动;这时， 点的振动就是两个向下的振动的叠加， 点的振动还是被加强了.)用以上的分析，说明什么是振动加强的区域.
波源l经过半周期后，传播到P点的振动变为波谷，就会使P点的振动向下，但此时波源2传过来的振动不一定是波谷(因为两波源的周期可能不同)，所以，此时P点的振动可能被减弱，也可能是被加强的.(让学生来说明原因)
问题：如果希望P点的振动总能被加强，应有什么条件?如果在介质中有另一质点Q，希望Q点的振动总能被减弱，应有什么条件?
总结：波源1和波源2的周期应相同.
2：
观察现象：③水槽中的水.对水波干涉图样的解释中，特别要强调两列水波的频率是相同的，所以产生了在水面上有些点的振动加强，而另一些点的振动减弱的现象，加强和减弱的点的分布是稳定的.
详细解释教材中给出的插图，如下图所示.在解释和说明中，特别应强调的几点是：①此图是某时刻两列波传播的情况;②两列波的频率(波长)相等;③当两列波的波峰在某点相遇时，这点的振动位移是正的最大值，过半周期后，这点就是波谷和波谷相遇，则这点的振动位移是负的最大值;④振动加强的点的振动总是加强的，振动减弱的点的振动总是减弱的.
让学生思考和讨论，并在分析的基础上，给出干涉的定义：
(教师板书)频率相同的两列波叠加，使某些区域的振动加强，某些区域的振动减弱，并且振动加强和振动减弱的区域互相间隔，这种现象叫，形成的图样叫做图样.
请学生反复观察水槽中的水，分清哪些区域为振动加强的区域，哪些区域为振动减弱的区域.
最后应帮助学生分析清楚：介质中某点的振动加强，是指这个质点以较大的振幅振动;而某点的振动减弱，是指这个质点以较小的振幅振动，这与只有一个波源的振动在介质中传播时，各质点均按此波源的振动方式振动是不同的.
问题：任何两列波进行叠加都可以产生干涉现象吗?(不可以)为什么?(干涉是一种特殊的叠加.任何两列波都可以进行叠加，但只有两列频率相同)
总结：干涉是波特有的现象.
二、应用
请学生思考和讨论在我们生活中是否遇到过现象，举例说明：
例1、水现象.
例2、声现象.
三、课堂小结
今天，我们学习了波特有的现象：.请同学再表达一下：什么叫波干涉?什么条件下可能发生?
课后的任务是认真阅读课本.
探究活动
稳定干涉 篇3
关键词：并联机床,工件,安装位置,计算
0 引言
并联机床是基于空间并联机构Stewart平台原理开发的, 是近年才出现的一种新概念机床, 它是并联机器人机构与机床结合的产物, 是空间机构学、机械制造、数控技术、计算机软硬技术和CAD/CAM技术高度结合的高科技产品。但由于其结构及工作空间非常复杂, 在使用它加工工件时, 极有可能发生机床零件间的自己干涉及机床与工件的干涉。
1 并联机床的特点
随着高速切削的不断发展, 传统串联式机构构造平台的结构刚性与移动台高速化逐渐成为技术发展的瓶颈, 而并联式平台便成为最佳的候选对象, 而相对于串联式机床来说, 并联式工作平台具有如下特点和优点:
1.1 结构简单、价格低机床机械零部件数目较串联构造平台大
幅减少, 主要由滚珠丝杠、虎克铰、球铰、伺服电机等通用组件组成, 这些通用组件可由专门厂家生产, 因而本机床的制造和库存成本比相同功能的传统机床低得多, 容易组装和搬运。
1.2 结构刚度高由于采用了封闭性的结构 (clos e d-loop
s tructure) 使其具有高刚性和高速化的优点, 其结构负荷流线短, 而负荷分解的拉、压力由六只连杆同时承受, 以材料力学的观点来说, 在外力一定时, 悬臂量的应力与变形都最大, 两端插入 (build-in) 次之, 再来是两端简支撑 (simply-supported) , 其次是受压的二力结构, 应力与变形都最小的是受张力的二力结构, 故其拥有高刚性。其刚度重量比高于传统的数控机床。
1.3 加工速度高, 惯性低如果结构所承受的力会改变方向, (介
于张力与压力之间) , 两力构件将会是最节省材料的结构, 而它的移动件重量减至最低且同时由六个致动器驱动, 因此机器很容易高速化, 且拥有低惯性。
1.4 加工精度高由于其为多轴并联机构组成, 六个可伸缩杆杆
长都单独对刀具的位置和姿态起作用, 因而不存在传统机床 (即串联机床) 的几何误差累积和放大的现象, 甚至还有平均化效果 (averaging e ffe ct) ;其拥有热对称性结构设计, 因此热变形较小;故它具有高精度的优点。
1.5 多功能灵活性强由于该机床机构简单控制方便, 较容易根
据加工对象而将其设计成专用机床, 同时也可以将之开发成通用机床, 用以实现铣削、镗削、磨削等加工, 还可以配备必要的测量工具把它组成测量机, 以实现机床的多功能。这将会带来很大的应用和市场前景, 在国防和民用方面都有着十分广阔的应用前景。
1.6 使用寿命长由于受力结构合理, 运动部件磨损小, 且没有
导轨, 不存在铁屑或冷却液进入导轨内部而导致其划伤、磨损或锈蚀现象。
2 干涉检查与干涉回避
如果所用并联机床的工作台上没有周边器械或周边器械放置的比较远, 不会影响工件的安装位置或加工过程中也不会出现机床与周边器械干涉现象时, 则可省略机床及工件与周边器械的干涉检查。
2.1 自己干涉
2.1.1 检查点的组成在加工过程中, 所有刀具位置可以应用文
献中所述方法检查是否会发生自己干涉。如果发生干涉, 则用调整工件的安装位置来回避干涉。工件的安装位置改变后, 加工过程中的刀具位置自然也就改变了。因此, 还须再次进行检查, 直到不发生自己干涉为止。
2.1.2 检查干涉的方法刀具位置和姿势分别在直进空间圆和回
转空间圆内时, 一定不会发生自己干涉。所以, 自己干涉的检查方法为: (1) 读取所有检查点, 求出每一个检查点所对应的直进空间圆和回转空间圆。 (2) 刀具位置和姿势分别在对应的直进空间圆和回转空间圆内时, 判定为在该检查点不会发生自己干涉;在所有的检查点都不发生干涉时, 则判定为在该安装位置不会发生自己干涉。 (3) 如果在某检查点的位置或姿势超出了直进空间圆或回转空间圆, 则用文献中所述的检查干涉的方法进行复检。由于空间圆比一般的检查干涉的计算量要小的多, 所以, 这样的检查方法可以缩短每次检查的计算时间。
2.1.3 回避干涉的方法由于在同一水平面内, 刀具位置在z轴
上时最不容易出现自己干涉。所以, 如果在某个检查点出现了自己干涉, 则将该检查点与z轴的连线作为回避方向。然后, 将工件的安装位置沿回避方向移动10mm。如果连续两次回避方向的夹角大于150°, 可以认为回避方向已经翻转, 在该水平面内不存在能够安装的位置, 所以, 只能将工件的安装位置向上提高。
2.2 机床与工件的干涉
2.2.1 检查点的组成机床与工件之间可能发生干涉的零部件
有刀具、夹头、主轴头、主轴夹板、夹板铰链和连杆。工件可以认为是由加工表面和非加工表面构成。其中, 加工表面由加工点、与机床可能会发生干涉的非加工表面由非加工点构成, 在此, 将加工点和非加工点统称为查询点。
2.2.2 检查干涉的方法在检查是否出现第1类干涉时, 首先将
刀具、夹头、主轴头和主轴夹板 (简称为刀具系统) 以及第1类干涉的检查点向xz平面投影, 然后, 检查落入刀具系统投影内的检查点是否与刀具系统发生干涉。由于第1类干涉与工件的安装位置无关, 所以, 在计算工件的安装位置之前, 只需进行1次这样的检查计算由于工件安装位置的不同, 必将导致夹板铰链和连杆的位置与姿势的变化。所以, 工件的安装位置每次调整后, 都必须检查是否会发生第2类干涉。因此, 如何减少第2类干涉的检查点是缩短检查时间的关键。本文中, 判断第2类干涉检查点的条件是满足d0且h0, 这对于较小的工件或者较平坦的工件, 可以大幅度地削减检查点数。
2.2.3 回避干涉的方法当出现干涉时, 其回避方法与出现自己干涉时的回避方法相同。
2.3 机床与周边器械的干涉
2.3.1 检查干涉的方法可能与周边器械发生干涉的机床零件
有刀具、夹头、主轴头、夹板铰链、连杆和主轴夹板, 它们的形状为圆柱体和有界平面构成的多面体, 而周边器械的外形为多面体。所以, 周边器械与机床零件之间可以沿用“有界平面与圆柱体”及“有界平面与有界平面”的干涉检查方法。即在所有的检查点上, 计算构成周边器械的有界平面与机床零件的圆柱体或有界平面之间是否有交点。如有交点, 说明发生干涉;如无交点, 则说明不发生干涉。
2.3.2 回避干涉的方法如果机床与周边器械发生干涉, 则将周
稳定干涉 篇4
1 材料与方法
1.1 主要试剂、载体及细胞
Trizol,Invitrogen公司生产;RNase抑制物(Inhibitor),原平皓生物公司生产;rTaq酶、反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒、pMD18-T载体,TaKaRa公司生产;BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、T4 DNA连接酶,Promega公司生产;脂质体Lipofect、小提小量试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司生产;pRNAT-U6.1/Neo,南京金斯瑞生物科技公司生产;pcDNA3.1(+)载体、293GP细胞,东北林业大学生命科学学院研究室自存。
1.2 小鼠MSTN基因真核表达载体的构建
1.2.1 骨骼肌总RNA的提取
采用颈椎脱臼法将性成熟的昆明小鼠(ICR小鼠)处死后,采集骨骼肌组织50 mg,用Trizol法提取总RNA,并置于-80 ℃冰箱中保存,备用。
1.2.2 引物的设计及合成
根据GenBank中小鼠MSTN基因序列(登录号为BC105674.1),设计1对在上、下游5′端分别加入BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的特异性引物MSTN-1和MSTN-2(引物序列分别为5′-GGATCCCCTGTTCATGCTGATTGC-3′和5′-GAATTCGAAGACCTTCCATGACTTG-3′)。将引物送宝生物工程(大连)有限公司合成,将合成的引物与pMD-18T载体连接。
1.2.3 RT-PCR 取上述骨骼肌RNA
2 μL,50 μmol/L Oligo15 1 μL,DEPC灭菌水3 μL,于70 ℃保温10 min后冰浴2 min,再加入5×M-MLV Buffer 2 μL,dNTP 0.5 μL,RNase Inhibitor 0.25 μL,Reverse Transcriptase M-MLV 0.5 μL,DEPC灭菌水0.75 μL于42 ℃保存1 h,70 ℃保存15 min,经冰浴冷却后获得cDNA。
1.2.4 小鼠MSTN基因的扩增与测序
MSTN基因的扩增:以MSTN-1、MSTN-2为引物对MSTN 基因进行PCR 扩增。PCR反应体系(25 μL):cDNA 产物1 μL, 215 mmol/L dNTP 4 μL, 10 ×rTaq Buffer 2.5 μL, MSTN-1和MSTN-2引物各1 μL,rTaq 酶0.3 μL,加DEPC灭菌水至25 μL。PCR 反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,共35个循环;72 ℃再延伸10 min。
pMD18-T-MSTN重组质粒的构建:将上述的PCR产物经电泳后回收MSTN基因片段,然后与两端含有连接酶的线性pMD18-T载体在16 ℃条件下连接30 min(PCR 产物1.0 μL,pMD18-T载体 1.0 μL,ddH2O 3.0 μL)。取连接产物5 μL转化50 μL大肠杆菌感受态细胞DH5α,蓝白斑筛选。挑取白色克隆于含有氨苄西林(Amp)的LB培养液中摇菌,采用小提小量试剂盒提取质粒。
重组质粒进行PCR鉴定(以STN-UP和MSTN-DOWN为引物进行扩增及电泳)和酶切鉴定(用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切及电泳)。将PCR鉴定和酶切鉴定正确的pMD18-T-MSTN质粒送Invitrogen公司测序。
1.2.5 小鼠MSTN基因真核表达载体的构建
利用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pcDNA3.1(+)载体获得载体片段,经BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切pMD18-T-MSTN载体获得MSTN基因片段,再利用T4 DNA 连接酶将载体片段和MSTN基因片段连接并转化后获得重组质粒。经PCR鉴定和酶切鉴定后,获得小鼠MSTN基因真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN。
1.3 小鼠MSTN基因shRNA载体的构建
1.3.1 小鼠MSTN基因shRNA设计与合成
根据GenBank上小鼠MSTN基因mRNA 序列,在线设计shRNA序列。共设计109条符合Tuschl法则的shRNA序列,再经过人工筛选3条shRNA序列(S1 MSTN基因的第310～328位碱基为5′-GGTATACTGGAATCCGATC-3′;S2 MSTN基因的第427～445位碱基为5′-GATGACGATTATCACGCTA-3′;S3 MSTN基因第659～677位碱基为5′-GCTCCTAACATCAGCAAAG-3′),并将其利用shRNA表达载体设计3条shRNA序列。将设计的shRNA序列送南京金斯瑞生物公司合成后连接到pUC57载体上,分别命名为pUC57-M1、pUC57-M2、pUC57-M3。
1.3.2 小鼠MSTN基因shRNA的构建
利用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的pRNAT-U6.1/Neo质粒进行双酶切后获得酶切产物pRNAT-BH;利用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ分别对pUC57-M1、pUC57-M2、pUC57-M3进行双酶切获得M1、M2、M3。将pRNAT-BH分别与M1、M2、M3片段进行连接获得重组质粒pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3,将其转染大肠杆菌感受态细胞DH5α后提取重组质粒并进行测序。
1.4 小鼠MSTN基因shRNA的干涉效率
1.4.1 小鼠MSTN基因干涉载体的转染
采用常规方法,利用培养液(10%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素、1%谷氨酰胺和1%非必需氨基酸的DMEM液)进行传代培养,并制备细胞悬浮液。将上述细胞悬浮液,用6孔培养板(每孔含2 mL培养液)对冷冻保存的293GP细胞进行传代培养。细胞转染前12 h用不含抗生素的培养液(2 mL)进行续培养,当细胞密度达到40%～50%时,用2 μg pcDNA 3.1(+)-MSTN、2 μg pcDNA 3.1(+)-MSTN和2 μg pRNAT-M1、2 μg pcDNA 3.1(+)-MSTN和2 μg pRNAT-M2、2 μg pcDNA 3.1(+)-MSTN和2 μg pRNAT-M3的4种载体液与用250 μL无血清培养液稀释10 μL Lipofect试剂溶液混合后,分别加入含有细胞的培养孔中并于室温下保持20 min,再置于37 ℃、100%湿度、5%CO2培养箱中培养12 h。然后用含有抗生素的合成培养液进行续培养,每隔24 h在倒置荧光显微镜下观察细胞形态及细胞发出荧光情况。
1.4.2 小鼠MSTN基因干涉载体的干涉效率检测
细胞总RNA的提取及反转录:采用脂质体法将上述293GP细胞转染36 h后,采用Trizol法提取293GP细胞总RNA;利用反转录试剂盒对总RNA进行反转录,获得cDNA。
RT-PCR引物设计:根据GenBank中的GAPDH(登录号为NM-008084.2)和MSTN(登录号为NM-010834.2)基因序列,应用Oligo 6.0软件和Primer premier 6.0软件分别设计作为参照的GAPDH基因引物(G1 5′-ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3′,G2 5′-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT-3′)和MSTN基因引物(M3 5′-GAGAATGGCCATGATCTTGCTGTA-3′,M4 5′-CGCAGTCAAGCCCAAAGTCTC-3′),将设计的引物送宝生物工程(大连)有限公司测序。
干涉效率的检测:根据SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明,将上述获得模板cDNA和引物配置成4个PCR反应混合物,并进行RT-PCR。采用RT-PCR仪对RT-PCR结果进行融解曲线分析,并以GAPDH为内参照,计算转染pcDNA 3.1(+)-MSTN、pcDNA 3.1(+)-MSTNpRNAT-M1、pcDNA 3.1(+)-MSTN和pRNAT-M2、pcDNA 3.1(+)-MSTN和pRNAT-M3载体后的MSTN基因的相对表达量。
2 结果与分析
2.1 小鼠MSTN基因的克隆及序列分析
利用MSTN-1和MSTN-2引物对小鼠MSTN基因进行RT-PCR扩增并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后,在约1 150 bp处可观察到特异性扩增带(见图1)。阳性重组质粒pMD18-T-MSTN通过EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后,经琼脂糖凝胶电泳,可观察到约2 700 bp和1 150 bp的2条带(见图2)。对阳性重组质粒pMD18-T-MSTN的PCR鉴定结果,在约1 200 bp处出现特异性条带(见图3)。
1.DL-4 500 Marker;2.PCR产物。
1.DL-4 500 Marker;2.重组质粒双酶切产物。
1.DL-4 500 Marker;2.重组质粒PCR产物。
对pMD18-T-MSTN进行测序,所克隆的MSTN基因序列大小为1 145 bp,与GenBank上BC105674(小鼠MSTN基因的参照序列)有99.83%的同源性;仅在第497位点存在1个T与C的转换。
2.2 小鼠MSTN基因真核表达载体的构建
对pcDNA 3.1(+)-MSTN的PCR鉴定结果,可见长度约为1 200 bp的条带(见图4)。对pcDNA 3.1(+)-MSTN双酶切鉴定结果,可见长度约为1 200 bp和5 400 bp的2条带(见图5)。
1.重组质粒PCR鉴定;2. DL-4 500 Marker。
1. DL-4 500 Marker;2.重组质粒双酶切鉴定。
2.3 shRNA的转染
用pcDNA 3.1(+)-MSTN、 pcDNA 3.1(+)-MSTN和 pRNAT-M1、 pcDNA 3.1(+)-MSTN和 pRNAT-M2、 pcDNA 3.1(+)-MSTN和 pRNAT-M3对传代培养的293GP细胞(见图6)进行转染。在转染后的第36小时,转染4种载体约80%的细胞,可见表达绿色荧光蛋白的绿色(见174页彩图7)。
2.4 小鼠MSTN基因在293GP细胞中的扩增
采用RT-PCR方法,以GAPDH基因作为内参对照,用MSTN基因引物扩增转染pcDNA 3.1(+)-MSTN、 pcDNA 3.1(+)-MSTN和 pRNAT-M1、 pcDNA 3.1(+)-MSTN和 pRNAT-M2、 pcDNA 3.1(+)-MSTN和 pRNAT-M3的293GP细胞的cDNA,通过对PCR产物的融解曲线检测GAPDH、MSTN基因扩增情况及融解曲线和标准扩增曲线。试验结果表明:GAPDH和MSTN基因均被特异性扩增,且2个基因的融解曲线均呈“S”型,而荧光定量动力学曲线平滑,可用于目的基因的相对定量分析。
2.5 shRNA对MSTN基因的干涉效率(结果见图8)
由图8可知:当转染pcDNA 3.1(+)-MSTN的293GP细胞的MSTN基因表达量为1.000时,转染pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3的表达量分别降低至(0.232±0.010),(0.763±0.010),(0.298±0.010)。
3 讨论
根据P.Alexander等[6]的报道,用复制缺陷型病毒携带干扰朊病毒蛋白的mRNA序列的shRNA构建的载体转染小鼠胚胎细胞后,出生的小鼠对朊病毒的抵抗能力显著提高。另有报道,构建小鼠BMP4条件性RNAi载体BMP4CRNAi,经FVB小鼠受精后原核注射获得了抑制BMP4表达的后代[7]。研究表明,采用RNAi转基因的方法能够在表达量上调节目标基因表达,或者修饰出不同表型的基因敲除小鼠。
J.G.Doench等[8]研究了在Hela细胞中对CXCR4基因表达具有抑制作用的shRNA。结果表明,shRNA与CXCR4基因互补程度对翻译抑制具有显著的加乘作用。因此,根据C.E.Meacham 等[9]将3种沉默效能针对不同的抑癌基因p53的RNAi导入Eμ-Myc转基因小鼠的胚胎细胞中,这些小鼠出生后根据p53被敲除的水平呈现不同的疾病谱。表明不同的RNA干涉序列对相应基因具有不同的调控效率。为了筛选小鼠MSTN基因的干涉序列,研究采用RT-PCR等分子生物学方法克隆获得了与GenBank中的序列同源性为99.91%的小鼠MSTN基因序列(见图1～3),并构建了真核表达载体连接pcDNA 3.1(+)-MSTN(见图4,5)。与此同时,根据GenBank上的小鼠MSTN基因mRNA 序列,设计shRNA pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3。利用pcDNA 3.1(+)-MSTN和所设计的3种干涉载体转染293GP细胞(见图6,7)并检测细胞中MSTN基因表达量,其结果表明转染pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3后MSTN基因相对表达量明显降低(见图8),pRNAT-M1干涉效率最高。
自J.W.Gordon等[10]首次采用原核显微注射法获得转基因小鼠以来,该方法得到不断完善,已成为获取转基因动物的主要手段。R.D.Palmiter等[11]获得带有白蛋白启动子的人生长激素基因的转基因鼠。此外,K.M.Gaensler等[12]获得转150 kb的人β珠蛋白基因簇的转基因鼠。如果筛选适合的启动子,就能构建组织特异性表达的融合基因,且通过显微注射法获得转基因后代。如果利用小鼠MSTN基因的RNA干涉序列与小鼠肌肉特异型启动子构建真核表达载体,采用原核注射或通过体细胞转染后再经体细胞核移植的方法就有可能获得MSTN基因被干涉的转基因小鼠,且可利用该方法进一步开展家畜的相关研究。
摘要：为了筛选小鼠肌肉生长抑制素(MSTN)基因的干涉序列,根据GenBank中小鼠的MSTN基因序列,采用RT-PCR方法克隆获得MSTN基因序列,构建其真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN;根据MSTN基因序列设计合成3种MSTN基因干涉序列(M1、M2、M3),并构建相应的RNA干涉载体pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3。将构建的真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN单独或分别与3种干涉载体共转染293GP细胞,检测干涉载体对MSTN基因的干涉效率。结果表明:试验成功克隆得到与GenBank中的序列同源性为99.91%的小鼠MSTN基因序列,并构建了真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN;与转染pcDNA 3.1(+)-MSTN后的293GP细胞中MSTN基因的相对表达量(1.000)相比,转染pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3后MSTN基因相对表达量明显下降,pRNAT-M1的干涉效率最高。说明研究成功获得对MSTN基因表达具有明显干涉作用的干涉序列。
关键词：小鼠,肌肉生长抑制素(MSTN)基因,RNA干涉
参考文献
[1]MCPHERRON A C,LAWLER A M,LEE S J.Regulation of skele-tal muscle mass in mice by a new TGF-βsuperfamily member[J].Nature,1997,387(6628):83-90.
[2]RIOS R,FEMANDEZ-NOCELOS S,CAMEIRO I,et al.Differen-tial response to exogenous and endogenous myostatin in myoblastssuggests myostatin acts as an autocrine factor in vivo[J].Endocri-nology,2004,1:326-330.
[3]BELLINGE R H S,LIBERLES D A,LABERLES D A,et al.Myo-statin and its implications on animal breeding:a review[J].AnimGenet,2005,36(1):1-6.
[4]SCHUELKE M,WAGNER K R,STOLZ L E,et al.Myostatin mu-tation associated with gross muscle hypertrophy in a child[J].N En-gl J Med,2004,350(26):2682-2688.
[5]TUSCHL T,ELBASHIR S M,HARBORTH J,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mam-malian cells[J].Nature,2001,411(6836):428-429.
[6]ALEXANDER P,SABINA E,SABA A K,et al.Lentivector-me-diated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs surviv-al of scrapie-infected mice[J].J Clin Invest,2006,116(12):3204-3210.
[7] LI F B, DU X L, YU Y, et al. Generation of bone morphogenetic protein 4 conditional RNA interference mice[J]. Hereditas, 2008,30(3):341-346.
[8]DOENCH J G,PETERSEN C P,SHARP P A.siRNAs can func-tion as miRNAs[J].Genes Dev,2003,17(4):438-442.
[9] MEACHAM C E, HO E E, DUBROVSKY E, et al. In vivo RNAi screening identifies regulators of actin dynamics as key determinants of lymphoma progression[J].Nat Genet, 2009, 41(10):1133-1137.
[10] GORDON J W, SCANGOST G A, PLOTKIN D J, et al. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1980, 77(12), 7380-7384.
[11] PALMITER R D, NORSTEDT G, GELINAS R E, et al. Metallo-thionein-human GH fusion genes stimulate growth of mice[J]. Science, 1983, 222:809-814.
用陪伴代替干涉 篇5
铃木教学法,主要重点在于开发孩子们的潜能,使资质普通的孩子,也能多才多艺,同时,让孩子在才能教育的培养过程中,成为一位品学兼优、行为优雅的好学生。这样的教学法,除了可在教室实行之外,更需要良好的家庭环境,让孩子们的感官能够发挥得淋漓尽致。
在铃木镇一教学的过程中,他发现有不少家长们,用主观的意识和强硬的态度,来干涉孩子们的学习。可是,真正的教育不是干涉,而是用心陪伴———让爸妈的爱在他们心海中,激起源源不绝的爱的浪花,发酵成生生不息的灵感。
在我教学的生涯中,有一位妈妈,让我深刻地体会到“陪伴”的重要性。这位妈妈因为孩子写不出作文而担心不已,帮他找补习班及家教来补强,可是未见效果。眼看大考逼近,妈妈急急忙忙地与我联络。在交谈的过程当中,我终于得知孩子写不出作文的原因———以前在学校时,被罚写太多次了,所以就拒绝再提笔写作了!
心病要靠心药医,解铃还需要系铃人。亲子之间为了写作,使彼此关系常常就像拔河一样,呈现拉锯战。妈妈好说歹说要他去补习,但学习效果不彰;小孩坚持要用他自己的方式来学习。在这样互相拉扯的过程中,亲子之间的情感也一点一滴地在耗损着……
这位妈妈问我该怎么办?我则回答说:“看您怎么看待自己的小孩?如果您愿意尊重他,而且不把他当作您所拥有的,就放手让他学会为自己的决定负责。但您还是可以在他的身边默默地陪伴他。”这位妈妈听完后,答应我会先细细思量,再告诉我她的答案。
过了几天,这位妈妈似乎有所顿悟,于是打电话跟我说:“我觉得自从我不再干涉他怎么写作文之后,他好像变得比较快乐,也比较愿意提起笔来写作文了!”
浅析“不干涉内政原则” 篇6
不干涉内政原则是是国际关系和国际法上的一项基本法律原则, 也是指导当今国际关系的一项重要准则, 主要就是对促进国际和平与安全以及维护国际社会正常秩序起着重要作用。本文对其不干涉内政的起源及发展进行简述、“内政”及“干涉”的进本内涵进行简述, 主要对该原则在适用上的一些例外因素进行分析, 从中了解各国学者对该原则的认识分歧, 从而导致该原则在适用上的一些问题和障碍。
一、不干涉内政原则的产生和发展
所谓的“不干涉内政原则”, 是指每个国家都有平等的主权, 每个民族都有决定自己命运的权利, 任何国家或任何国际组织都无权以任何方式去干涉其他国家在本质上属于国内管辖的事物。
不干涉内政原则最早由法国提出。法国资产阶级革命胜利以后, 法国政府为反对欧洲封建势力对其内部事务的干涉, 在1783年法国宪法中规定了不干涉内政原则。
资产阶级当时提出这个原则的目的, 是保证自己得以建立其新的剥削制度而不受周围一些君主专制国家的侵犯。随着资本主义的发展, 特别是到了帝国主义时代, 这一原则遭到了粗暴的破坏。1823年, 美国总统门罗则发表国情咨文, 宣布美国奉行“不干涉政策”, 实际上美国是把美洲圈入气独家控制的势力范围, 阻止了欧洲国家干涉美洲各国的事务。
第一次世界大战以后, 《国际联盟盟约》首次以条约形式肯定了不干涉内政原则, 该《盟约》第15条第8款对其进行了规定, 大意为一旦某项争议经争端一方声明, 并为国际联盟行政院承认, 属于该争端方的国内管辖事项, 国际联盟就不得介入。1954年签订的《联合国宪章》将“不干涉内政原则”列为了七项基本法律原则之一, 与《国际联盟盟约》的规定相比, 特点是明确强调了联合国不得干涉“本质上属于任何国家国内管辖的事件”, 取消了“国内管辖事件”须经国际组织某机构承认的规定, 但同时也明确了任何国家均不得以“内政”为由来对抗联合国安理会为维护集体安全而作出采取执行行动的决定。
1954年, 中国、印度、缅甸三国共同倡导的和平共处五项原则将之称为“不干涉内政原则”。这种提法突出了各国实施不干涉内政原则中的对等义务和责任, 使得该项原则的表达更合理。这是对于该原则的理解和现实指导意义的大突破, 也是中、印、缅三国对现代国际法发展作出的举世称颂的贡献。
1965年联合国通过的《关于各国内政不容干涉及其独立于主权之保护宣言》对不干涉内政原则的涵义进行了初步的概括, 对“内政”的范围及“干涉行为”的表现也初步的进行了描述。
1970年联合国大会通过了《国际法原则宣言》, 该宣言对不干涉内政原则进行了详细的解释, 把该原则的具体内容归纳成五个方面, 相对于1965年的宣言, 进一步丰富了不干涉内政原则的内涵, 并对其运用提供了比较明确的标准。
二、“内政”和“干涉”的界定
“内政”和“干涉”的界定问题的存在会影响不干涉内政原则在适用上的界限不清, 所以笔者认为有必要对这两个问题进行下分析。
(一) “内政”的涵义
什么是“内政”, 就如“不干涉内政原则”一样, 学者们有很多不同的见解。
有学者认为, 国家主权范围内的事务就是国家在宪法中所规定的事项以及与国家行使主权相联系的一切对内对外活动;有学者认为, 从国际法角度看, 内政或国内管辖事项是指应由国家自主处理的一切事项;也有学者认为, 按照有关国际法文件的规定, 凡在本质上属于国内管辖的事件, 均属内政。众说纷纭, 这些界定或太绝对得将宪法规定的事项解释为一国的内政, 或不知道什么是“应由国家自主处理事项”, 或者是根本没有一项国际文件从内涵上给“内政”下过明确、恰当的定义。
笔者认为, 从合理的角度出发, 所谓的“内政”应该是指未经国际法确定为某国的国际义务, 而可由该国自由行使的任何事项。这个涵义具体而言:
其一, 关于“内政”, 我们不能简单将其理解为发生在一国境内的任何事件, 因为在一国境内发生但侵害到了他国的权益的事件就可能属于“非内政”。同样的“属于国内管辖事件”的说法也是不能划清两者之间的界限。
其二, “内政”与“非内政”的划分要看有关国家在相关事务上是否已经承担了“国际义务”。比如, 某国已参加了《禁止酷刑公约》, 其司法部门仍然在国内对嫌疑犯或被告采用刑讯逼供, 这无疑是违背了所承担的国际义务, 这就属于“非内政”。
其三, 国际义务是否存在的依据则是国际法, 而非各国的国内法。
其四, “内政”不是由一国的政府确定, 或是有某一国际机构确定, 而应该是由这个国家是否受到国际义务的约束。简言之, “内政”与“非内政”的界限:一国是否受某项国际义务约束。
(二) “干涉”的涵义
什么是“干涉”, 在我国的学者中几乎学者对其作出明确的解释, 这也说明了实际判断中存在某些难以确定的因素。曾经英国学者对“干涉”作过界定和解释, 他认为国际法给予了干涉严格的定义, “干涉是指一个国家对另一个国家事务的强制或专断的干预, 旨在一个国家对另一个国家强加某种行为和后果”。
从这位英国学者的界定中进一步引申, 笔者认为, 所谓“干涉”是指一国或几国为实现自己的意图, 使用政治、经济、甚至军事的手段, 以直接或间接的、公开或隐蔽的方式干预另一国的内外事务, 使被干预国按照干预国的意图行使, 以改变被干预国所执行的某种方针、政策或存在的情势。国际法上的“干涉”特点归纳起来主要有以下几点:
第一, 干涉者使用非法手段介入了别国的内政事项。“非法手段”即国际法所不允许使用的方式和方法。比如, 有个很明确的例子, 干涉者威胁和使用武力, 这在国际法上肯定是被禁止的。因为如果干涉包含武力的使用, 它就违反了《联合国宪章》第2条, 该条款规定:禁止使用威胁或武力或与联合国原则不符的任何方式侵害任何国家的领土完整或政治独立。从该条款的措辞可以很明显地看出, 除了使用威胁或武力外, 国际法上显然还包括其它干涉方式可以达到侵害国家的领土完整或者政治独立的目的。
第二, 干涉者必定是使用了强迫手段来干预别国的内政。奥本海认为:“要构成干涉, 干预必须是强力的或专断的, 或者是胁迫的, 在实际上剥夺了被干涉国家对有关事项的控制权。”这里特别指出因为干涉是强制的, 所以提出建议、斡旋或调停等不是干涉。
在国际实践中, 典型的干涉方式主要有三种:武装干涉、经济干涉、外交干涉。除此之外, 诸如向他国派遣特工或通过在他国收买代理人以策动他国内乱, 支持或资助他国反政府组织或恐怖组织以颠覆他国政权等, 均属于干涉内政的行为范畴。
三、不干涉内政原则的适用之例外因素
什么是不干涉内政原则, “内政”和“干涉”的界定给这个定义奠定了基础。但在国际上, 通常存在喜欢干涉别国内政的情况, 特别是西方国家。而且为使干涉内政行为合法化, 西方学者提出了各式各样所谓的“干涉的法律依据”。例如:依据权利的干涉, 保侨干涉, 应邀干涉, 人道主义干涉等等。我国学者一般都反对这种所谓的干涉理论和干涉依据, 并认为这不过是给帝国主义的侵略行径套上合法的外衣, 是为其干涉别国内政的非法行为所找的一种借口。
笔者认为, 干涉并不分“合法”和“非法”, 而应均属于非法, 但从某些方面看, 我们又不能把所有的“介入行为”或“干预行为”都纳入“干涉内政”的范畴。例如:在请求下的援助行为、人道主义干预、外交保护措施等等。
“在请求下的援助行为”是指一国经另一国合法政府请求, 并在其同意的范围内所给予的援助行为。不过这个行为的合法适用需要有两个前提:其一, 请求并同意的内容必须是合法的。其二, 这种请求必须来自请求国的合法政府。例如反政府的邀请必然是非法的, 则属于干涉内政的行为。在请求下的援助行为的最大特点就是没有强迫因素, 而是应他国请求、经他国同意作出的援助行为, 所以, 在本质上就不属于“干涉”的范畴, 应排除在干涉之外。
“人道主义干预”是指在一国严重侵犯基本人权的情形下, 他国或国际社会对该侵害国所施加的一定的强制措施。它的实施关键在于被采取措施的国家违背了其所承担的国际义务, 侵害了受国际法保护的基本人权。当然其中由谁来判断, 怎么来判断是否违背了国际义务也是值得推敲的问题。
“外交保护措施”是指一国通过外交途径对本国公民在海外合法权益所进行的保护。当然这不能简单地称作“保侨干涉”, 两者之间存在着很大的区别。外交保护的本质是针对东道国违背国际义务的行为, 是国际法上的责任问题, 而不属于保护侨民而干涉他国内政。
四、结论
综上所述, “不干涉内政原则”的基本涵义是要求国家在国际关系上不得以任何方式介入别国的内部事务, 不得将自己的立场、意志或者社会制度强加于别国。弄清该原则的适用范围, 首先要将“内政”、“干涉”两个基本概念界定清楚。西方学者为其不法行为所寻找的借口根本不能在法律上站稳脚跟。但从另一角度看, 也不是所有的“介入行为”和“干预行为”都是非法干涉内政的行为, 存在着某些例外因素。正确及合理地运用不干涉内政原则, 才能维护国际社会秩序的长治久安。
参考文献
[1]梁西.国际法[M].武汉:武汉大学出版社, 2000.
[2]端木正.国际法[M].北京:北京大学出版社, 2000.
[3]刘海山.国际法[M].北京:法律出版社, 1992.
[4]曹建明, 周红钧, 王虎华.国际公法学[M].北京:法律出版社, 1998.
[5]詹宁斯, 瓦茨修订.奥本海国际法[M].北京:中国大百科全书出版社, 1998.
干涉合成孔径雷达成像技术 篇7
1 干涉合成孔径雷达测高基本原理
SAR有很强的高分辨率,但是基于二维平面,具体来说,它基于长的合成孔径阵列得到较高的横向分辨率,利用信号的宽频带得到距离向的高分辨率。然而实际地形上是三维空间,可以通过航向的法平面表示测高原理,如图1所示,在不同的两个位置分别设置一个接收天线,天线1的斜距是r1,天线2测得斜距为r2=r1+Δr。对两个天线所测得的斜距分别画圆弧q1和q2,那么目标便位于圆弧的交点上。因此只要天线的位置和斜距已知,就可以从几何关系确定P点的高度。InSAR便是基于此原理完成高度测量的[1]。
2 干涉合成孔径雷达测高过程
如前所述,InSAR测量高度的几何原理并不复杂,而实际则不然,这主要是由于无法从复图像直接获得相位的真值。所以高程测量的核心问题就是如何得到干涉相位的真值。干涉法测高的基本过程可以包括6个步骤:(1)两接收分别成像。(2)图像配准。(3)降噪滤波。(4)生成干涉相位及去平地相位。(5)二维相位解缠。(6)恢复平地相位。文中主要讨论InSAR成像处理中两大的关键步骤,即去平地相位以及相位解缠[2]。
3 去平地相位
去平地相位之前首先要生成干涉相位。通常是将一幅复图像f1(x,r)取复共轭,与另一幅图像的f2(x,r)相乘。然后将相乘后的相位取出,得到原始的干涉相位,如式(1)所示
φo(x,r)=arg[f1(x,r)*f2(x,r)] (1)
然而干涉相位的真实值不仅是目标高度的函数,还是目标水平地面距离的函数,即对水平地面,干涉相位随水平地面距离而改变,在干涉相位图中表现为近密远疏的干涉条纹。图2给出高度3 000 m,波长0.03 m,基线倾角30°,基线长度为20 m的水平地面的干涉条纹三维图像。由于条纹的密集度远大于目标高度引起的干涉条纹,所以在相位解缠之前,要将地面对应的干涉相位去掉,即去平地相位,这有利于后续的相位解缠[3]。
4 二维相位解缠绕
相位解缠是InSAR处理中的一个重要组成部分。从SAR复图像中得到的干涉相位与地形有关[4]。由于三角函数的原因,实际只能得到相位主值。计算目标高度,则要在干涉相位值加上2π整数倍,这称为相位解缠。
4.1 相位解缠绕的原理
对于一维相位解缠,解缠前相邻点的相位差绝对值<π,需要把线上的采样点按照顺序分别求出相邻点的解缠绕值。
假设φ(m)为缠绕相位,ϕ(m)解缠绕相位,此时m=1,2,3,…,M。路径积分解缠法可以表示为
ϕ(1)=φ(1),ϕ(m+1)=φ(m)+Δ(m) (2)
其中
这样就能逐一推导,获得真实相位。
对于二维解缠绕,如果选择不同的积分路径,得到的结果很可能也不同,主要是相位中残点的干扰。在上面的二维序列中残点出现在它的中心。对于包围一个残点的路径积分不会为零。对于包围多个残点的环路积分,如果正负残点个数不等,环路积分也不等于零。所以残点便是造成二维相位解缠结果不惟一的直接原因。为解决不唯一性,提出了基于局部的方法和基于基于整体的方法。文中只讨论分支截断法和最小二乘方这两种基本算法。
4.2 分支截断法
分支截断方法就是将残点的影响控制在一定的范围里。其原理是,闭合回路中有残点并且正负残点的个数相同时,环路积分是0。对于闭合回路中无残点时,环路解缠绕的相位差是0。需要把残点连接成分支,并使正负残点数相等,使用路径积分进行相位解缠并且积分路径不能穿过分支,这便使得环路积分为零,保持了相位解缠绕的惟一性,如图3所示。
4.3 最小二乘法
最小二乘法首先设相位解缠绕结果是ϕ(m,n),ϕ(m,n)的横向和纵向的一阶差分犹豫解缠绕的误差导致与缠绕相位φ(m,n)求出的一阶差分不相等。若使二者近似相等,把一阶差分的均方误差作为目标函数,并使其最小化,便得到最近似的ϕ(m,n)。
设缠绕相位为φ(m,n),解缠相位为ϕ(m,n)。其行向一阶差分和纵向一阶差分分别为Δx(m,n)和Δy(m,n)
然后求解使式(5)最小的ϕ(m,n)
将式(5)对相位矩阵φ中的ϕ(m,n)求偏导数,使得偏导数为0,即最优值。所以解为
ϕ(m+1,n)+ϕ(m-1,n)+ϕ(m,n+1)+ϕ(m,n-1)-4ϕ(m,n)=Δx(m,n)-Δx(m-1,n)+Δy(m,n)-Δy(m,n-1) (6)
式(6)给出了最小二乘意义下解缠绕相位与缠绕相位差分二者的关系,改写为
[ϕ(m+1,n)-2ϕ(m,n)+ϕ(m-1,n)]+[ϕ(m,n+1)-2ϕ(m,n)+ϕ(m,n-1)]=ρ(m,n) (7)
其中
ρ(m,n)=[Δx(m,n)-Δx(m-1,n)]+[Δy(m,n)-Δy(m,n-1)] (8)
为保证延拓边界的光滑性,处理边界问题,要先对函数图像进行二维镜像反射,再进行周期延拓,这可以利用快速傅里叶变换求解。快速傅里叶变换求解Possion方程可以使运算速度加快。
二维镜像反射如图4所示,在二维平面内,将φ(m,n)以m=M-1为轴做镜像反射,再以n=N-1为轴作镜像反射,得到
然后再将
再对式(7)用傅里叶变换求解,得
其中,Φ(k,l)表示ϕ(m,n)的二维镜像反射
4.4 实验结果
下面利用高斯山模型进行InSAR成像,解缠方式分别采用分支截断法和最小二乘法。图5表示高斯山区平地相位后的图像。
平地相位去除后,相位图只表现相位缠绕,可见有些相位不是真实相位。图6和图7分别用分支截断法和最小二乘法对其进行相位解缠。
从解缠结果来看,分支截断法较好地保持了原始相位,取得了较好的结果,其信息损失主要集中在枝切线上,如图7所示。而最小二乘法恢复出的相位误差要比分支截断法严重,主要原因是由于解缠绕处理时把正常点与残点同时加入计算,产生了不良影响,如图8所示。但由于其利用了快速傅里叶变换算法,因此计算效率高。
5 结束语
文中对干涉合成孔径雷达测量高程的原理及过程进行了简单的介绍,通过对一些常用算法的编程实现,比较了基于整体的最小二乘相位解缠算法和基于局部的分支截断相位解缠算法,可以看出,分支截断相位解缠算法解缠效果较好,基本保持了原始相位的精度。最小二乘法恢复出的相位误差要比分支截断法严重,但由于其利用了快速傅里叶算法,因此计算效率高。
摘要：介绍了合成孔径雷达的成像原理,简述了InSAR的测高步骤,重点论述了去平地效应和两种相位解缠算法,最后分别利用分支截断法和最小二乘法两种解缠算法,进行了高斯山模型的解缠绕仿真,并对结果进行了简要的分析。分析结果表明,分支截断解缠绕算法解缠效果较好,基本保持了原始相位的精度。而小二乘法恢复出的相位误差比分支截断严重,但计算率高。
关键词：干涉合成孔径雷达,去平地相位,相位解缠
参考文献
[1]保峥,邢孟道,王彤.雷达成像技术[M].北京:电子工业出版社,2005.
[2]穆冬.干涉合成孔径雷达成像技术研究[D].南京:南京航空航天大学,2001.
[3]刘永坦.雷达成像技术[M].哈尔滨:哈尔滨工业大学出版社,1999.
同步相移干涉表面精密测量 篇8
表面加工质量的保证, 通常由精密制造设备和合适的制造工艺来实现, 其前提是制造系统必须具有良好的稳定性和可靠性。然而, 高精密加工时, 表面加工质量极易受到制造系统及其单元在静力学、动力学和热力学方面运行状态的影响[1,2]。为保证表面质量, 现有的高精密表面加工 (如表面精密磨削、金刚石单点加工等) 不得不采取经常性的加工表面离线检测, 以便于可能需要的工艺调整或补偿。如此质量控制方式将因为加工表面离线检测和重新置位的过程, 工艺连续性、加工环境和状态的一致性受到破坏而降低工艺调整和补偿的可靠性, 同时也降低效率。表面在线测量能保持工艺连续性, 保持测量前后加工环境和状态的一致性, 从而保证由表面检测所获得的工艺调整和质量控制的依据可靠, 实现更为可靠的质量保证, 并提高加工效率, 因而受到高度重视。然而, 一般精密表面测量方法 (如激光波面干涉测量方法) 由于对外界环境极度敏感, 易受到在线环境下振动干扰的限制, 难以用于在线测量。因此, 表面在线精密测量是高精密制造领域的一个难题。
微电子、微机电系统 (MEMS) 、光电子信息技术和航空航天技术等的快速发展, 对表面质量要求正稳步提高[3], 表面在线精密测量及质量控制问题因而变得更为突出, 需开发适用于在线条件下表面精密测量和有效质量控制的方法[3,4]。
为此, 本文基于激光波面干涉表面测量原理[5,6,7], 提出以偏振相移[5]为基础的同步相移技术, 研究在线在机表面精密测量的解决方案——同步相移干涉精密表面在线测量系统。该系统在传统泰兰-格林激光波面干涉仪[7]基础上, 利用偏振干涉[8], 采用偏振的同步相移技术, 有效地抑制在线环境对波面干涉测量精度和可靠性的影响, 从而实现精密加工平面和球面的表面形状在线测量。
1 测量原理
1.1系统原理
提出的同步相移激光干涉表面精密在线测量系统原理如图1所示。图中, L1为准直透镜;L2、L3为扩束透镜;BS为消偏振分光棱镜;P1、P2、P3为检偏器;M1、M2为反射镜;Q1、Q2、Q3为1/4波片。He-Ne激光器发出的光经空间滤波器、偏振片和准直镜L1后, 成为准直平面波进入偏振分光棱镜, 偏振方向垂直纸面的分量经分光面反射, 经过1/4波片Q1到达参考表面, 并被反射回来穿过分光棱镜成为参考光波, 该光波由于两次通过Q1使偏振方向变为平行于纸面, 从而穿过偏振分光棱镜分光面进入干涉光路;偏振方向平行于纸面的偏振分量穿过分光面, 经过1/4波片Q2后入射到被测表面, 反射回来的光波为带有被测表面偏离信息的准平面波。该准平面波再经过Q2, 偏振方向变为垂直纸面并由偏振分光棱镜分光面反射进入干涉光路。这两束偏振方向正交的光波在干涉光路中共路经过1/4波片Q3后变成旋转方向相反的圆偏振光, 它们一同经过L2和L3组成的扩束镜扩束或收束至合适于后面CCD的孔径后, 进入同步相移干涉单元。在同步相移单元, 多步相移同时发生并被同步采集送入计算机进行分析和干涉相位恢复[9,10], 得到从被测表面返回的波面波前形状, 从而得到被测表面面形。用于球面测量时, 则在偏振分光棱镜后置放一适当聚焦镜, 产生标准球面波入射到被测表面, 返回的波带有被测表面偏离信息, 随后进入测量系统, 得到测量结果。
1.2同步相移原理
相移干涉技术是激光波面干涉实现表面高分辨率高精度测量的重要技术, 其测量不确定度达到λ/100[5,6,9,10] (λ为激光波长) 。
常见的相移干涉技术大多采用参考镜的步进驱动来实现相移, 是分时相移, 以获得多步相移干涉图, 进而基于相移算法进行干涉相位的分析和恢复。分时相移中, 诸如振动等时域变化的环境因素影响将在相移过程中引入额外的相移, 成为相移误差, 从而引入干涉相位的恢复误差, 进而造成测量误差。
为此, 本系统基于偏振干涉原理[5], 提出同步相移技术, 建立同步相移单元, 同时获得产生不同相移的多幅相移干涉特征, 以避免环境振动等时域因素引入相移误差进而引起测量结果误差。
采用的同步相移原理如图2所示。进入的旋转方向相反的两共路相干光波被消偏振分光棱镜BS1、BS2和BS3分为光强相等的三组相干光束 (其中光路中使用的消偏振分光棱镜可以将入射光分为能量相等的两束出射光, 而且对偏振态不影响) , 分别通过检偏器P1、P2、P3后发生三路偏振干涉[8], 偏振干涉相位对应被测表面形状误差及检偏器的检偏角度。
以穿过BS1的一组相干光波为例。在图1中, 假设由参考表面和被测表面反射回来的出射到1/4波片Q3、偏振态分别沿平行于纸面的x向和垂直于纸面的y向正交的两光波电场分量表示为琼斯向量:
式中, E1、E2分别为两光波的电场分量幅值;wck (x, y) 、wbc (x, y) 分别为两光波的波前相位。
1/4波片的琼斯矩阵为
检偏器的琼斯矩阵为
Jp=[cos θ sin θ] (3)
式中, θ为检偏器的检偏角。
这两相干光波穿过Q3、BS2、BS1和检偏器P1后, 幅度减少为原来的1/4, 出射的光波总的电场分量可表示为
那么, 在CCD上接受到的干涉光强分布为
可以看出, 两束相干光的相位差不仅与被测相位有关, 而且还与检偏器的检偏角成线性关系。因此, 三路偏振干涉相位分别受到2倍于P1、P2、P3检偏角度的相位调制。于是, 通过设置检偏器P1、P2、P3合适的检偏角, 使得三路相干光波偏振干涉分别产生相位值为0、2π/3、4π/3的相移, 三步相移干涉特征得以同时获得。
三步相移干涉特征由同步控制采集卡控制的同步CCD1、CCD2、CCD3同时获取, 实现同步相移干涉测量。
1.3抗振特性分析
采用偏振相移的方法获得的三步相移干涉特征分布为
Ii (x, y) =Ia+Ibsin[Δw (x, y) +αi]} i=0, 1, 2 (6)
式中, αi为第i步相移量;wbc (x, y) 、wck (x, y) 为对应被测表面和参考表面的相干波面相位分布;Δw (x, y) 为被测表面和参考表面对应点的相位差。
采用同步偏振相移, 获取α0=0、α1=2π/3、α2=4π/3三步相移干涉特征I0、I1、I2:
由于环境振动干扰, 被测表面在测量过程中存在振动, 每时刻除偏振相移产生的相移外, 还会由于振动引入相位变化, 从而产生一定的相移误差。设被测表面存在振动, V (t) =Vmsin ω t (Vm为最大振幅, ω为振动频率) , 图3为振动引起相移误差示意图。
若采用一般的分时相移, 设相移在时间上间隔为td, 开始相移时间ts是随机的, 每步相移采样时振动引起的相移误差φi等于该时刻振动量Vmsin (ω t) , 即
以三步相移为例, 三步获得的相移分别为
由于时间ts的随机性, 采样间隔td的不一致, 每步的相移误差φi都是不确定的, 可导致大的测量误差。
而采用同步相移技术, α′0=Vmsin ω ts, α′1=2π/3+Vmsin ω ts, α′2=4π/3+Vmsin ω ts。同步采集获得干涉特征为
即由于相移时间上的同步, 使振动引入的相移误差都是Vmsin ω ts。采用相移算法得到干涉相位为[10]
得到表面被测点高度为
由于每个被测点高度都包含相同的误差项λ (Vmsin ω ts) / (4π) , 即由于振动引入的相移误差只是将被测表面的每个点提升了同样的高度, 而对最后被测表面面形误差测量结果没有影响, 故同步相移技术消除了振动引入的测量误差。
2 实验装置与实验结果
为了验证理论分析结果, 模拟了在现场振动情况下的同步相移测量和普通分时相移测量实验, 实验装置如图4所示。其中, 图4a所示为模拟被测样品振动的装置。样品固定于压电陶瓷的一端, 压电陶瓷的另一端固定。压电陶瓷电压输入端接入PZT驱动器, 由PZT驱动器产生一定频率、幅值和波形的电压信号, 驱动压电陶瓷产生动态位移, 带动被测样品做振动, 以模拟现场振动。图4b为同步相移测量系统装置图, 其光源采用5mW He-Ne激光源, CCD为敏通公司的MTV-1881EX黑白CCD, 能实现同步控制, 同步采集卡为西安微视公司生产。
将一个边长为20.0mm的被测Wafer样品固定于压电陶瓷上, 压电陶瓷电压输入端由PZT驱动器输入频率为50Hz、电压值30～110V变化的锯齿波信号, 驱动压电陶瓷产生频率为50Hz、峰值为4.1μm、呈锯齿波变化的动态位移, 带动样品振动。在振动的情况下, 由测量系统分别进行同步和分时相移测量, 同步相移按上述同步相移原理实现, 分时相移由另一PZT在被测表面振动的同时步进驱动参考表面实现。得到的相移干涉图见图5。
将图5中的相移干涉图分别取截面灰度显示, 如图6所示, 图中, 3条曲线之间的错位量对应实际相对相移量。可以看出, 图6a中错位量不均等, 实际相移量远离名义相移量;而在图6b中, 错位量均等, 实际相移量近似等于名义相移量。因此, 在确定的名义相移量情况下, 由于分时采样时刻相对被测表面振动引起相移周期的随机性, 三幅相移干涉图间的实际相移量存在不确定的误差;而同步相移中, 三幅相移干涉图在被测表面振动周期中的同一时刻获取, 实际相移量只与偏振相移产生的准确性有关, 不受振动影响。
将分时和同步采集的干涉图分别送入计算机进行处理, 完成相位信息提取, 计算表面形貌, 得到表面形貌结果分别如图7a和图7b所示。
结果显示, 在振动干扰情况下, 相对于分时相移, 同步相移测量方法较好抑制了振动影响, 取得了理想的测量结果, 而分时相移则由于振动引起相移混乱, 得到不可信的测量结果。
3 结论
针对精密表面加工中的在线在机质量监测问题, 基于波面干涉表面形貌精密测量原理, 结合提出的以偏振相移为基础的同步相移技术, 研究了具有抗振特性的精密表面激光波面干涉测量方案。介绍了偏振干涉同步相移表面测量原理, 分析了其抗振特性, 建构了测量系统实验装置, 并完成了测试实验。分析和测试结果验证了研究的同步相移激光波面干涉测量系统用于在线表面精密测量的适应性。
参考文献
[1]Chen Mingjun, Zhao Qingliang, Dong Shen, et al.The Critical Cconditions of Brittle-ductile Transi-tion and the Factors Influencing the Surface Qualityof Brittle Materials in Ultra-precision Grinding[J].Journal of Materials Processing Technology, 2005, 168 (1) :75-82.
[2]Jager V E, Hinzmann G, Just A.The Influence ofThermal Expansion of the Cutting Tool during Ul-traprecision Diamond Turning of Electroless Nickelon the Accuracy of the Workpiece and a SimpleMethod of Correction[C]//Europe Society for Pre-cision Engineering.1st International Conference andGeneral Meeting of the European Society for Preci-sion Engineering and Nanotechnology.Bremen:EU-SPEN, 1999:143-146.
[3]Richter U, Hentsch W, Liepack H, et al.In SituMeasurements of Optical Film Parameters andPlasma Monitoring during Reactive Sputtering forAdvanced In-line Process Control[J].Thin SolidFilms, 2009, 516:4541-4545.
[4]Rosati G, Boschetti G, Biondi A.et al.On-line Di-mensional Measurement of Small Components onthe Eyeglasses Assembly Line[J].Optics and La-sers in Engineering, 2009, 47:320-328.
[5]苏大图.光学测试技术[M].北京.北京理工大学出版社, 1996.
[6]吴震.光干涉测量技术[M].北京.中国计量出版社, 1993.
[7]Malacara D.Optical Shop Testing[M].2ed.NewYork:John Wily&Sons, Inc, 1992.
[8]Shamier J.Optical Systems and Processes[M].Washington D C:SPIE Optical Engineering Press, 1999.
[9]Meng X F, Cai L Z, Wang Y R.Wavefront Recon-struction by Two-step Generalized Phase-shift-ing Interferometry[J].Optics Communications, 2008, 281:5701-5705.
扫一扫微信支付