脓毒症大鼠（精选6篇）
脓毒症大鼠 篇1
据统计, 脓毒血症病患的住院率以及死亡率一直居高不下, 重症患者的死亡率更是高达28%~47% 。在脓毒血症的研究中, 常需要制备脓毒血症模型, CLP模型是目前研究脓毒血症中最重要也是应用最为广泛的一类模型, 主要原因是此类模型能够很好的表现出脓毒血症病患的病理生理学的临床症状, 其次, 该模型的制备也比较简单, 更容易被推广开来, 因此, 被科学人员推崇为研究脓毒血症的“金标准”。最常见同时也最有效的就是啮齿类动物的盲肠结扎穿刺 (CLP) 模型。在CLP模型建立中, 有效的死亡率是制备CLP模型的关键, 而影响CLP模型的死亡率又有很多原因, 其中包括了穿刺针头的粗细, 穿孔的个数, 以及盲肠结扎的长度, 当然还包括了一些人为的误差等等。因此, 本文探讨控制脓毒症模型的有效死亡率, 显示出不同程度的CLP模型, 以制备出科研人员所需要患病程度的动物模型。
1 材料与方法
1.1 动物分组
采用雄性SD大鼠84 只, SPF级, 体重在300~325 g左右, 实验大鼠分为手术组72 只, 和假手术组12 只。手术组分为100%长度结扎组和50%长度结扎组各36 只。其中各长度组又分为3 个手术亚组, 分别为1 穿孔组、2 穿孔组、3 穿孔组, 每个亚组实验大鼠为12 只。假手术组为100%长度结扎组6 只和50%长度结扎组6 只。手术操作均由同一人完成, 以保证实验的一致性。
1.2.盲肠结扎穿孔模型制作
1.2.1 术前准备
称量实验动物体重, 确定麻醉计量、计算好每只实验动物的手术时间, 所有物品进行无菌操作。
1.2.2 手术操作
(1) 抽取5%的水合氯醛, 用生理盐水1:1 稀释, 按照100mg/kg体重标准进行大鼠腹腔内注射麻醉。
(2) 大鼠麻醉后, 以合适的力度用管镊子夹大鼠的脚趾, 应没有明显的收缩反应。
(3) 将麻醉后的大鼠仰面平放在泡沫板上, 用电动剃毛器将腹部以下的毛剔除, 并用酒精进行消毒处理。
(4) 毛发剔除后, 进行备皮, 备皮面积控制在4×4cm左右, 备皮区域用络合碘进行消毒, 消毒完后, 再在备皮部分铺上一次性无菌手巾。
(5) 找到大鼠的腹部中线, 找到后再用一次性手术刀沿着腹部中线做平行纵向切口, 划开切口, 并扩大切口至2cm左右, 再用钝头镊夹住腹膜肌肉, 用剪刀小心将腹膜肌肉剪开。
(6) 小心打开大鼠腹膜, 将盲肠轻轻地从腹腔内夹出来, 并将其他的肠管小心放回腹腔中。小心的将盲肠里存储的粪便轻轻推入至盲肠的顶端, 使盲肠内保持一定量的粪便。
(7) 长度的定量:用泰丝线来测量盲肠末端顶点到回盲瓣处的长度以标测盲肠的全长, 为100%结扎长度, 再将用于标测盲肠总长的丝线后对折一次再减去一半, 以此长度来确定盲肠50%的结扎长度。
(8) 穿孔个数亚组:用21 号针头分别采取单次、双次, 以及三次贯通穿刺盲肠的方法于肠系膜端穿透至对侧, 穿刺过程中小心避免损伤血管。
(9) 拔出穿刺针后, 轻轻挤压盲肠, 若有粪便挤出, 则说明穿孔成功。。
(10) 用生理盐水讲轻轻将挤出的粪便洗净, 以免盲肠粪便污染腹部切口, 影响实验结果, 再重新定位好盲肠的位子, 将处理好的盲肠放入腹腔内。
(11) 切口的缝合:使用外科手术缝线以单纯连续缝合法来缝合大鼠的肌肉层和表皮, 缝合完毕后再用络合碘进行消毒, 以清洁手术创口。
(12) 生理复苏:这是很关键的一步, 手术后, 将预热的37℃的生理盐水对实验动物进行皮下注射。
(13) 把术后的大鼠仰放在笼具内, 保持22℃的恒温, 12h光照和黑暗的周期, 并给予充分的水和食物。监测时间手术后第一天每隔1h监测一次。第二天每隔3h一次。第3 天至第7 天每隔6h观察一次。记录完整的死亡时间和存活时间。
2 实验结果
2.1 手术后大鼠的生理情况
实验大鼠一般在2~3h内就麻醉苏醒, 苏醒的时间因个体差异不同, 苏醒后大鼠恢复正常的活动, 能够自由的饮水和进食。术后12h, 较少表现出明显的细菌感染临床现象。而12h之后, 手术组开始出现竖毛, 乏力少动, 眼眶出现粘液, 颤抖。而假手术组的表现为活跃灵敏, 身体状态表现正常, 能够正常进食饮水。
2.2 死亡率以及生存时间
分别对每个小组的死亡率进行观察, 假手术组实验大鼠全部存活。手术组大鼠约于CLP手术后12h候开始出现死亡情况, 各实验组大鼠的死亡时间主要集中在手术后的12~36h之间。随盲肠结扎长度和穿刺孔数量的增加, 生存时间缩短。而其中100%长度结扎的手术组, 1 穿孔组的生存率为75%, 平均生存时间为72.67±5.68h, 而2 穿孔组的生存率为33.3%, 平均生存时间为41.00±8.87h, 3穿孔组的生存率为0%, 平均生存时间为15.92±0.468h。在50%长度的结扎组中, 1 穿孔组的生存率为83.3%, 平均生存时间为77.00±4.53h, 2 穿孔组的生存率为50%, 平均生存时间为53.58±8.80h, 3穿孔组的生存率为0%, 平均生存时间为18.67±0.53h。结果见表1 和图1。
CLP模型的生存情况还可从图1 生存曲线得知, 无论是100%结扎长度还是50%的结扎长度, 1孔穿刺组的生存情况最优, 其次2 孔穿刺组的生存情况次之, 3 孔穿刺组的生存情况最差。
3 讨论
结果显示盲肠结扎的长度和穿孔的个数在影响死亡率中起到关键的作用。与K.D. Singleton等人的报道一致, 可能该模型造成腹腔内炎症的主要原因是由流入腹腔内部的粪便所导致, 而流入腹腔内部的粪便的量, 是由穿刺针头的大小和穿孔个数所决定的。而盲肠结扎的长度越大, 就算穿孔数和针头的粗细一致, 但从盲肠中流入腹腔内的粪便也就越多, 感染便愈发严重, 因此死亡率也就越高。
参考文献
[1]Rittirsch D, Huber-Lang MS, Flierl MA, et al.Immunodesign of exper-imental sepsis by cecal ligation and puncture[J].Nat Protoc, 2009, (4) :31-36.
[2]Remick DG.Pathophysiology of sepsis[J].Am J Pathol.2007, 170 (5) :1435-1444.
[3]Janeway CA Jr, Medzhitov R.Introduction:the role of innate immunity in the adaptive immune response[J].Semin Immunol, 1998, 10 (5) :349-350.
[4]Cohen J.The immunopathogenesis of sepsis[J].Nature, 2002, 420 (6917) :885-891.
脓毒症大鼠 篇2
1 材料与方法
1.1材料
清洁级雄性SD大鼠78只,体重(270±20)g,购自中南大学湘雅医院实验动物中心。大鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ(c TnⅠ)、肿瘤坏死因子(TNF-α)及白细胞介素1β(IL-1β)定量ELISA试剂盒(R&D,美国)和大鼠·OH-、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购自长沙赛晶生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与模型制备
将78只SD大鼠随机分为正常组(Norm组)、假手术组(Sham组)、脓毒症组(CLP组)、小剂量依达拉奉治疗组(ED1组)及大剂量依达拉奉治疗组(ED2组)。盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)制备脓毒症模型[6]:10%水合氯醛3 ml/kg行腹腔内麻醉,固定、消毒、铺巾,腹前正中切口2~3 cm,游离肠系膜和盲肠,以3.0丝线环形结扎盲肠根部,9号针头在结扎线下5 mm处贯穿盲肠2次,挤压肠管使粪便自穿刺点溢出,还纳肠管后逐层缝合关腹。ED1组及ED 2组在CLP造模后立即尾静脉分别注射依达拉奉3 mg/kg、6 mg/kg。Sham组除不结扎和穿刺盲肠外,其余操作同CLP组。术毕各组皮下注射生理盐水30 ml/kg以补充体液丢失。
1.2.2 标本留取与指标检测
血清c Tn I:术后3 h、6 h、12 h水合氯醛腹腔麻醉后,开腹自腹主动脉抽血,3 000 r/min离心15 min,上清液置入-20℃冰箱保存。按试剂盒说明书酶联免疫吸附法测定。心肌氧化应激指标:(1)自腹主动脉抽血后立即开胸取心肌组织,冰生理盐水洗净血液后滤纸吸干,放入Ependoff管置入-70℃冰箱保存;(2)在冰水浴中制备心肌匀浆,4 000 r/min离心15 min,上清液按试剂盒说明书测定·OH-、MDA和SOD。心肌炎症因子:上步所得心肌匀浆,按试剂盒说明酶联免疫吸附法检测TNF-α及IL-1β。心肌病理学观察及病理积分:(1)取一块右心室壁组织,10%中性福尔马林固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色,光镜下观察心肌病理形态变化;(2)Kishimoto法计算心肌病变积分:每张切片取5个高倍视野,计算每个视野中炎症细胞浸润及坏死区域面积与整个视野的面积之比,无病变计0分,<25%计1分,25%~50%计2分,50%~75%计3分,>75%计4分。对心肌病理学变化的评估遵循双盲法原则。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;非正态分布的计量资料以M(QL-QU)表示,2组间比较用Mann-Whitney U检验;计数资料以构成比/率表示,两组间比较用χ2检验;Pearson相关分析检验相关性,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清中c Tn I的变化
血清中c Tn I的变化见表1:Norm组与Sham组差异无统计学意义(P>0.05);CLP组各时间点均明显高于Norm组及Sham组(P<0.01);ED 1组及ED2组较CLP组明显降低(P<0.01);ED 2组较ED 1组明显降低(P<0.01)。
2.2 心肌中·OH-、MDA和SOD的变化
心肌中·OH-、MDA和SOD的变化见表2:Norm组与Sham组心肌中·OH-、MDA和SOD水平差异无统计学意义(P>0.05);与Norm组及Sham组比较,CLP组心肌·OH-及MDA水平3 h即明显升高,6 h达到高峰,之后有所降低,SOD水平明显降低(P<0.01);ED 1组及ED 2组心肌·OH-及MDA水平较CLP组明显降低,SOD水平明显升高(P<0.01),但与Norm组及Sham组比较,ED 1组及ED 2组心肌·OH-及MDA水平明显升高,SOD水平明显降低(P<0.01);ED 2组与ED 1比较,心肌·OH-及MDA水平明显降低,SOD水平明显升高(P<0.01)。
2.3 心肌中TNF-α和IL-1β的变化
心肌中TNF-α和IL-1β的变化见表3:Norm组与Sham组比较差异无统计学意义(P>0.05);与Norm组及Sham组比较,CLP组6 h明显升高,12 h有所下降(P<0.01);ED1组及ED2组较CLP组明显降低(P<0.01),但较Norm组及Sham组明显升高(P<0.01);ED2组较ED1组明显降低(P<0.01)。
2.4 心肌病理形态学改变
2.4.1 心肌病理形态学改变
Norm组及Sham组无明显病理改变(见图1);LPS组间质充血水肿,炎症细胞浸润,心肌纤维断裂(见图2);ED1组及ED2组上述病理改变明显减轻(见图3、4)。
注:1)与Norm组及Sham组比较,P<0.01;2)与CLP组比较,P<0.01;3)与ED1组比较,P<0.01
注:1)与Norm组及Sham组比较,P<0.01;2)与CLP组比较,P<0.01;3)与ED1组比较,P<0.01
注:1)与Norm组及Sham组比较,P<0.01;2)与CLP组比较,P<0.01;3)与ED1组比较,P<0.01
2.4.2 心肌组织病理积分
CLP组较Sham组明显升高(P<0.01);ED 1组及ED 2组与CLP组比较下降(P<0.01);ED 2组较ED 1组明显下降(P<0.01)(见表4)。
2.5 血清c Tn I与心肌氧化应激指标及炎症因子的相关性分析
血清c Tn I与心肌氧化应激指标及炎症因子的相关性分析见表5:c Tn I与·OH-及MDA呈正相关,与SOD呈负相关;c Tn I与TNF-α及IL-1β呈正相关。
注:1)与Norm组及Sham组比较,P<0.01;2)与CLP组比较,P<0.01;3)与ED1组比较,P<0.01
3 讨论
研究发现,脓毒症早期即可发生心肌器质性损伤,常伴有心律失常、低血压和心力衰竭,可进一步加重其他器官损害[7],防治心肌损伤对改善脓毒症预后有重要的临床意义。
本研究采用CLP法复制大鼠脓毒症模型,RIT-TIRSCH等[6]认为此法建立的脓毒症动物模型更符合实际的病理生理过程。c Tn I是心肌损伤敏感而特异的指标,广泛用于心肌损伤的检测[8]。研究发现脓毒症状态下存在氧化应激[9]。氧化应激指活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生过多和/或代谢障碍造成其大量堆积,引起细胞组织的氧化损伤[10]。·OH-是化学性质最活泼的ROS,也是ROS中诱导生物损伤最重要的成分,破坏性极强。然而自由基活性高,性质不稳定,半衰期短,临床对其直接测定相当困难,通过检测某些氧化产物含量及抗氧化酶活性可有效评价氧化应激状态。生物膜中的多不饱和脂肪酸最易受到ROS攻击而发生脂质过氧化反应,其代谢产物MDA的含量和性质相对稳定,检测方法简便,一直以来被众多国内外学者认为是反应机体氧化应激损伤的重要指标。SOD能催化·O2-发生歧化反应,从而缓解内毒素诱导的白细胞呼吸爆发,减少ROS的生成,其活性高低可反应机体清除氧自由基的能力。TNF-α及IL-1β是脓毒症早期导致心肌损伤的主要致炎因子,两者作用机制相似且相互协同,同时去除血清中的这两种成分,可显著逆转心肌功能障碍[11]。本研究发现,CLP组较对照组c Tn I、·OH-、MDA、TNF-α及IL-1β水平明显升高,SOD水平明显降低(P<0.01),且c Tn I与·OH-、MDA、TNF-α及IL-1β正相关,而与SOD负相关(P<0.01),表明氧化应激及炎症因子参与了脓毒症心肌损伤。
脓毒症大鼠 篇3
1材料与方法
1. 1实验动物清洁级健康雌性Wistar大鼠100只, 体质量200 ~ 250g ( 购于河北医科大学实验动物中心) 。实验分组: 将100只大鼠随机分为5组, 每组20只。Ⅰ 组: 健康对照组; Ⅱ 组: 脓毒症3d组; Ⅲ组: 参麦+ 大黄制剂治疗3d组; Ⅳ: 脓毒症7d组; Ⅴ组: 参麦+ 大黄制剂治疗7d组。
1. 2动物模型的制备采用盲肠结扎穿孔的方法制造脓毒症大鼠模型, 沿腹部正中线作1cm切口, 找到盲肠, 在盲肠根部应用4号缝合线结扎盲肠, 此过程中应避免结扎回肠及盲肠系膜血管, 18号静脉穿刺针贯穿盲肠, 挤出少量肠内容物, 同时留置一条宽2mm的橡皮条以防止针孔闭合。盲肠还纳至腹腔, 逐层缝合腹壁切口, 术毕在腹腔注射生理盐水3ml/100g抗休克, 待麻醉清醒后可自由活动、进食及饮水。造模成功标志: 大鼠出现精神倦怠、寒颤、腹胀、躁动、竖毛等表现, 剖腹可见腹腔有血性或脓性分泌物, 空肠肠管胀气, 盲肠肿胀发黑、发生粘连等, 可视为制模成功。本文同时采用肛温、白细胞计数的变化作为动物SIRS的诊断标准。
1. 3给药方法正常对照组自由饮水及进食。脓毒症组大鼠采用CLP造模后腹腔内注射10ml/kg的生理盐水。参麦+ 大黄制剂治疗组, 待造模成功后腹腔内注射10ml/kg的参麦注射液, 同时给予2ml/kg中药大黄制剂 ( 大黄1. 5g、黄芪2. 0g、甘草1. 5g、茯苓1. 5g、川芎1. 0g、菊花1. 5g、丹参1. 0g) 水煎至20 ~ 30ml, 每次2ml / kg保留灌肠, 早晚各1次, 保留时间30min。
1. 4标本收集对照组大鼠麻醉成功后即留取血液标本2 ~ 3ml; 脓毒症组于造模成功后3d及7d留取血液标本2 ~ 3ml; 参麦+ 大黄制剂治疗组于造模成功后3d及7d留取血液标本2 ~ 3ml。标本离心机3000r / min, 10min取上清, 并放于- 20℃ 冰箱保存。应用全自动生化分析仪测定血清肌酐, 应用ELISA法 ( 血清胱抑素-C测定试剂盒购于美国SIGMA公司) 测定血清中胱抑素-C的含量。
1. 5统计学方法应用SPSS 18. 0统计软件进行数据处理。 计量资料以± s表示, 多组间两两比较采用q检验, P < 0. 05为差异有统计学意义。
2结果
与Ⅰ组比较, Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅴ组肌酐及胱抑素-C水平明显升高 ( P < 0. 05) ; 与Ⅱ组比较, Ⅲ组肌酐及胱抑素-C水平有所下降 ( P < 0. 05) ; 与Ⅲ组比较, Ⅳ组肌酐及胱抑素-C水平明显升高 ( P < 0. 05) ; 与Ⅳ组比较, Ⅴ组肌酐及胱抑素-C水平明显下降 ( P < 0. 05) 。见表1。
注: 与Ⅰ组比较, *P < 0. 05; 与 Ⅱ 组比较, #P < 0. 05; 与 Ⅲ 组比较, △P < 0. 05; 与Ⅳ组比较, ▲P < 0. 05
3讨论
血清胱抑素-C ( Cystatin-C) 是半胱氨酸酶抑制剂家族中的成员, 为分子量1. 33 k Da的蛋白质, 能在有核细胞内以稳定的速度转录与表达, 不受年龄、性别、炎性反应等因素的影响[2], 由于分子量大于肌酐, 且携带正电荷, 所以更易反映肾小球滤过功能。胱抑素-C通过肾小球滤过, 在近曲肾小管被重吸收, 肾脏是清除循环中胱抑素-C的惟一器官, 所以血清浓度主要由肾小球滤过率决定。有研究显示胱抑素-C的上升可比肌酐早1 ~ 2d[3], 在诊断AKI时敏感性和特异性均较好[4,5]。
严重感染诱发的SIRS是导致多器官功能障碍的主要原因, AKI为最严重的并发症之一, 致死率较高[6]。失控性的炎性反应在AKI的发生过程中起重要作用, 越来越多的证据表明TNF在肾损伤的发病机制中起主要作用, 可促进炎性反应、 促进细胞凋亡、细胞外基质聚集, 同时减少肾小球血流和破坏肾小球的通透性屏障[7]。Anane等[8]认为TNF-α、IL-6等炎性递质大量释放可致炎性反应细胞大量激活, 从而形成炎性反应因子的“瀑布样”反应。有研究证实TNF-α 在炎性反应细胞因子“瀑布样”反应过程中起重要作用, 糖皮质激素可在一定程度上阻断级联炎性反应[9,10,11], 但糖皮质激素的不良反应较多, 不容忽视, 临床上需有糖皮质激素类似作用而无糖皮质激素作用的药物。
参麦是由人参、麦冬提取的注射液, 具有益气固脱、养阴生津、生脉, 治疗冠心病、病毒性心肌炎、慢性阻塞性肺疾病、休克、肺心病等疾病可激活肾上腺皮质系统, 增加休克时各种病理物质的清除作用, 改善心、肝、脑、肾等重要脏器的血液供应, 同时可改善微循环[12]。参麦注射液的有效成分是麦冬皂苷和人参皂苷。目前研究表明人参皂苷具有糖皮质激素相似的作用, 可通过上调IκB ( NF-κB的抑制蛋白) 的表达和抑制NF-κB信号通路的活化, 降低促炎性反应细胞因子的产生和释放, 从而对肾脏功能起保护作用。国外有研究发现人参皂苷对顺铂所致急性肾衰竭有保护作用, 对大部肾切除小鼠的肾脏具有保护作用。有研究表明参麦注射液能减轻肾组织损伤, 对肾功能恢复具有促进作用, 也有研究表明人参皂甙能增加小鼠肾血流量, 可刺激肾小球、远曲小管, 乃至整个肾脏生成内源性NO, 从而对肾脏起保护作用。
有研究表明大黄制剂可直接抑制基因表达, 具有减少炎性递质、预防内毒素血症的目的。中药大黄制剂预防内毒素血症的机制可能为直接抑制细菌生长和代谢, 减少内毒素的产生; 通过攻下作用使大量细菌和内毒素随肠内容物排出体外, 减少内毒素的吸收; 通过改善微循环、增强网状内皮细胞功能, 抑制内毒素的吸收并使其失活。我院自行配制的由大黄、黄芪、甘草、茯苓、川芎、菊花、丹参等组成中药配方进行结肠透析, 有健脾、补气、益肾、通腑降浊、活血化瘀、清热解毒的功效, 起到攻补兼施、标本兼治、扶正泻浊、活血化瘀的作用, 从而减少内毒素吸收、减轻炎性反应, 起到保护肾功能的作用。
本结果显示, 应用参麦注射液联合中药大黄制剂后可在一定程度上降低脓毒症大鼠肌酐及胱抑素-C水平, 因此, 可通过进行进一步的临床试验, 从而观察参麦注射液联合中药大黄制剂是否对脓毒症患者肾脏功能起保护作用, 预防急性肾损伤的发生。
摘要：目的 观察参麦注射液联合中药大黄制剂预防脓毒症大鼠急性肾损伤的效果。方法 应用盲肠结扎穿孔 (CLP) 的方法制作脓毒症大鼠模型, 清洁级健康雌性Wistar大鼠100只, 随机分为5组, 每组20只。Ⅰ组:健康对照组;Ⅱ组:脓毒症3d组;Ⅲ组:参麦+大黄制剂治疗3d组;Ⅳ:脓毒症7d组;Ⅴ组:参麦+大黄制剂治疗7d组。健康对照组自由饮水及进食。脓毒症组大鼠造模成功后腹腔内注射10ml/kg生理盐水。参麦+大黄制剂治疗组造模成功后参麦注射液10ml/kg腹腔内注射+2ml/kg中药大黄制剂保留灌肠。测定各组血清肌酐及胱抑素-C水平。结果与Ⅰ组比较, Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅴ组肌酐及胱抑素-C水平明显升高 (P<0.05) ;与Ⅱ组比较, Ⅲ组肌酐及胱抑素-C水平有所下降 (P<0.05) ;与Ⅲ组比较, Ⅳ组肌酐及胱抑素-C水平明显升高 (P<0.05) ;与Ⅳ组比较, Ⅴ组肌酐及胱抑素-C水平明显下降 (P<0.05) 。结论 参麦注射液联合中药大黄制剂对预防脓毒症大鼠急性肾损伤可起一定的作用。
脓毒症大鼠 篇4
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级雄性Wistar大鼠39只,体重200～250 g,购自中国科学院上海实验动物中心。
1.2 实验药品
乌司他丁(Ulinastatin,UTI)50 000 U/支,广东天普生化医药股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 动物模型的制备与分组
39只Wistar大鼠,分为3组:假手术(sham)组9只,ALI组15只,乌司他丁(UTI)组15只。本实验参照文献[4]的方法,以大鼠盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症模型。以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定,腹正中切开1.5 cm长的切口,在盲肠根部结扎,用18号针在游离端穿通2次,轻挤出少量肠内容物,留置2 cm皮瓣防止针孔闭合,送回盲肠于腹腔,缝合切口,术毕皮下注射生理盐水30 mL/kg抗休克。UTI组于造模前30 min腹腔注射UTI(20 000 U/kg),ALI组于造模前30 min腹腔注射生理盐水2 mL。在假手术后6、12、24 h这3个时间点sham组分别处死大鼠3只,ALI组和UTI组分别处死大鼠5只。
1.3.2 标本的制备
分别于各时间点取抗凝腹主动脉血0.5 mL,行动脉血气分析,测定大鼠动脉血氧分压(PaO2),取每只大鼠左肺上叶测定肺组织湿/干重比值(W/D),取右下肺组织置于-80℃保存,用于测定肺组织中的HSP70 mRNA含量。另取左肺下叶置于10%中性甲醛溶液中固定,制成病理切片,采用苏木精-伊红(HE)染色。
1.3.3 实时荧光定量PCR
(realtime-PCR)检测肺组织HSP70 mRNA含量取肺组织50 mg,按Trizol法常规提取细胞总RNA并反转录合成cDNA,进行实时PCR扩增(Stratagene M×3 000实时荧光定量PCR仪)。HSP70引物序列:上游5′-GCA CCA GCA GCC ATC AAG AGT-3′,下游5′-GTG TGC AAG CCG ATC ATC AGC-3′,扩增产物为180 bp。HSP70实时PCR条件:95℃3 min,95℃30 s,60℃30 s,72℃45 s,共32个循环。所有待检标本每组设3个平行孔,各重复3次。标准化HSP70基因的表达量为各标本HSP70基因CT值与相应内参基因β-actin CT值的差值。
1.4 统计学方法
应用SPSS 11.0软件包分析,计量资料数据以均数±标准差表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动脉血气分析变化
ALI组大鼠动脉血氧分压(PaO2)随CLP术后时间的延长而降低,与sham组比较,显著降低(P<0.05),UTI组PaO2各时间点较ALI组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
注:与sham组比较,*P<0.05;与ALI组比较,#P<0.05
2.2 肺组织湿/干重比值(W/D)比值变化
ALI组大鼠W/D比值随CLP术后时间的延长而上升,较sham组显著升高(P<0.01),UTI组治疗后W/D比值明显低于ALI组同时间点,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
注:与sham组比较,*P<0.05;与ALI组比较,#P<0.05
2.3 肺组织的病理形态学变化
sham组大鼠肺组织结构完整,肺泡腔清晰,肺间质无水肿、无炎症,且各时间点无明显差异。ALI组大鼠造模后6 h可见肺泡内水肿渗出,伴有出血及炎症细胞浸润,随时间的延长病变程度加重,至造模后24 h可见肺泡隔增宽,肺泡内严重的充血、出血及肺间质见大量炎性细胞浸润。UTI组大鼠肺组织病理变化较ALI组轻,造模后6 h可见部分肺泡内少量水肿渗出伴有少量出血,至造模后24 h可见大鼠肺泡隔略有增宽,部分肺泡内见渗出、水肿、出血,肺间质见少量炎症细胞浸润,见图1。
2.4 肺组织HSP70 mRNA的表达
ALI组大鼠肺组织HSP70 m RNA的表达水平随着CLP术后时间的延长显著升高(P<0.05),至CLP术后12 h达到高峰。UTI组大鼠各时间点肺组织HSP70 m RNA的表达水平又显著高于ALI组(P<0.05)。见表3。
注:与sham组比较,*P<0.05;与ALI组比较,#P<0.05
3 讨论
脓毒症常见的并发症为ALI,其病理特征是肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤,中性粒细胞在肺内聚集,表现为广泛的肺水肿和微小肺不张,临床上表现低氧血症[5]。本实验采用较经典的盲肠结扎穿孔(CLP)制作大鼠脓毒症性ALI模型。实验研究发现,ALI组大鼠动脉血氧分压(PaO2)随着时间的延长而下降明显,W/D比值随着时间的延长而增高。同时光镜下观察发现,ALI组大鼠造模后6 h可见肺泡内水肿渗出,伴有出血及炎症细胞浸润,随时间的延长病变程度加重,至造模后24 h可见肺泡隔增宽,肺泡内严重的充血、出血及肺间质见大量炎症细胞浸润。
HSP是一具有多个成员的蛋白质家族,根据分子量的大小可以分为多个亚家族,其主要功能与蛋白质代谢有关。在各种应激反应中防止蛋白质变性、聚集,对细胞具有保护作用。其中HSP70与肺脏生物学关系较为密切,是HSP中最保守的一族,在细胞应激后生成最为显著,提高机体组织对各种应激损伤的耐受性。HSP70主要是作为分子伴侣,参与蛋白质的折叠、组装和转运,清除细胞内变性的蛋白质,稳定细胞结构[6]。有研究发现,脓毒症大鼠进行呼吸机正压通气导致机械张力可诱导肺组织HSP70的表达增加,改善肺损伤[7]。将载有HSP70的腺病毒基因注入动物体内可缓解ARDS的进展[8]。HSP70可能通过多种机制防止肺损伤的发生和发展:(1)抗炎症,使炎症介质的产生减少,抗炎细胞因子的表达增加;(2)抗氧化,可抑制氧阴离子的生成,直接或间接地促进释放自身的抗氧化酶,提高抗氧化酶类的活性;(3)调节细胞内蛋白的修复与合成,减轻应激或损伤刺激引起的细胞膜蛋白的变性,保护细胞蛋白质r RNA及DNA的合成途径免受损伤;(4)抗细胞凋亡,上调细胞内Bcl-2的表达[9,10]。本实验结果显示,ALI组大鼠各时间点肺组织HSP70 mRNA表达水平较sham组显著升高,至CLP术后12 h达到高峰,后开始下降。
UTI是一种广谱的蛋白水解酶抑制剂,对多种蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制作用,具有抑制过度的炎症反应、改善休克时组织循环与器官灌注、对溶酶体酶具有稳定作用。UTI在过度炎症反应、缺血和缺氧等造成的心、肺、肝、肾等组织细胞损害中具有保护作用。有研究表明,UTI可作用于ALI的早期环节,在转录水平通过P38MARK信号通路抑制TNF-α,改善促炎性介质/抗炎性介质失衡状态,减轻LPS诱导的ALI[11]。另外,UTI可以抑制肺泡内皮细胞表面蛋白质的分解,减小肺毛细血管的通透性[12]。临床上运用UTI治疗ALI/ARDS综合征患者,可以改善患者通气功能,减轻肺水肿,显著缓解患者的缺氧状态,减少多脏器功能衰竭的发生[13]。本实验结果显示,应用UTI治疗后,UTI组大鼠各时间点PaO2较ALI组上升,增高的W/D比值下降,HSP70 mRNA表达显著增加,同时肺组织病理形态学表现均有明显改善。提示UTI可能通过上调HSP70的表达,改善脓毒症大鼠肺组织的损伤。
脓毒症大鼠 篇5
1 材料与方法
1.1 实验分组和给药方法
体重200~220 g Wistar雄性大鼠54 只 (购于兰州大学动物实验中心) , 称重后随机分为3 组:假手术A组 (实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水, 麻醉后行开腹手术, 不做模型诱导, n=6) ;脓毒症模型B组 (实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水, 麻醉后CLP建立腹腔感染模型, n=24) ;NS398 干预C组 (CLP建立腹腔感染模型, 实验开始前2 h腹腔内注射NS39810 mg/kg, n=24) 。 将B、C两组根据取材时间不同又分为4 组, 每组6 只。 除干预措施不同外, 其余喂养相同, 分别于造模后3、6、12、24 h, 假手术组在术后6 h抽取大鼠门静脉血标本, 用于检测肝功能, 包括谷丙转氨酶 (ALT) 、谷草转氨酶 (AST) ;取肝组织观察病理学改变、免疫组织化学染色和RT-PCR。
1.2 动物模型的建立
盲肠结扎穿孔 (cecal ligation and puncture, CLP) 腹腔感染模型建立参照Flammand等[7]的方法。 实验前动物禁食12 h, 自由饮水, 腹腔内注射1%氯胺酮10 mL/kg, 麻醉成功后, 无菌操作, 腹正中2 cm切口进腹, 于盲肠出口处用4 号线结扎, 18G套管针将盲肠贯通穿孔一次, 穿孔为两个, 挤出少量肠内容物, 还纳肠管于腹腔, 间断缝合腹壁。 术后各组动物均自由进食饮水。
1.3 主要药物和试剂
NS398 购于Sigma公司, NF-κB p65 免疫组化试剂盒、SABC试剂盒购于武汉博士德公司, Trizol柱式RNA抽提试剂盒、AMV cDNA第一链合成试剂盒为上海生工公司产品, 2×HotStart Taq PCR Mastermix试剂盒为北京天为时代公司产品。
1.4 检测指标和方法
1.4.1 逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 观察COX-2mRNA水平变化 ①取-80℃冰箱保存肝组织50 μg, 用Trizol柱式总RNA抽提试剂盒提取总RNA, 并检测纯度和完整性。 ②RT-PCR (二步法, 按照说明书操作) : 引物序列 (5′→3′) :COX-2 上游引物CTG TATCCC GCC CTG CTG GT; 下游引物GAG GCA CTTGCG TTG ATG GT[8];产物287 bp。 β-actin (内参照) 上游引物GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA; 下游引物CTA GGA GCC AGG GCA GTA ATC;产物839 bp (均由上海生工公司合成) 。反应条件:94℃预变性3 min, 然后按94℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 1 min进行28 个循环, 最后72℃延伸10 min。 PCR产物6 μL, 在1.8%琼脂糖胶上电泳, EB染色, 凝胶成像仪照相记录。分析结果以COX-2 与相应 β-actin条带灰度 (IOD) 之比值Q表示 (Q=IODCOX-2/IODβ-actin) , 用Quantity One 4.0 图像分析软件分析IOD。
1.4.2肝细胞NF-κB表达的测定采用Elisa法 (免疫组织化学法) 肝组织标本经10%福尔马林固定, 石蜡包埋, 4μm切片, 分别做HE和NF-κB免疫组化标记, 采用SABC法, 按试剂盒说明书进行。经DAB显色后, 苏木精复染, 中性树胶封固。用已知的阳性片作为阳性对照, 每组均用PBS代替一抗作阴性对照。所有切片均在同一条件下的显微镜下观察, 结果以胞质或胞核中发现棕黄色颗粒或褐色颗粒为阳性细胞, 阴性对照则无棕黄色反应产物。取光学显微镜下每平方毫米视野 (20×或40×) 中的阳性细胞数, 随机选择5个视野, 其中每平方毫米内的平均阳性细胞数作为计数标准。采用以下评分标准[9]。染色强度分为4级:0级:阴性, 1级:弱阳性染色, 2级:中度阳性, 3级:强阳性染色。每张切片按所见阳性细胞范围分为5级:0级:阴性, 1级:1%≤阳性细胞≤25%, 2级:25%<阳性细胞≤50%, 3级:50%<阳性细胞≤75%, 4级:75%<阳性细胞≤100%, 每张切片的染色积分以两者之和表示。
1.4.3肝功能检测用日立7020全自动生化分析仪检测肝功能指标ALT、AST。
1.4.4 超微结构观察TEM-1230 透射电镜观察肝脏超微结构改变。
1.5 统计学方法
所得实验数据均由SPSS 13.0 软件分析, 实验数据满足方差齐性时, 采用均数±标准差 (±s) 描述, 多组比较采用单因素方差分析 (one-way ANOVA) 方法, 组间两两比较采用Bonfferoni法。 以P < 0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RT-PCR观察COX-2 在不同组、不同时间变化结果
由图像软件分析相应条带后可知: 肝组织中COX-2 mRNA在假手术组呈低表达 (1040.82±2.77) ;CLP造模后3 h表达明显增强 (2064.04±6.78) , 到6 h达到高峰 (3992.45±16.75) , 12、24 h仍呈高表达[ (2916.80±6.79) , (2237.80±7.42) ]。 NS398 干预后各时点COX-2 mRNA表达较脓毒症组显著降低, 但是仍然高于假手术组。 见图1。
M:Marker;1:假手术组;2:脓毒症3 h;3:脓毒症6 h;4:脓毒症12 h;5:脓毒症24 h;6:NS398 3 h;7:NS398 6 h;8:NS398 12 h;9:NS398 24 h;10:β-actin
2.2 大体及病理检查结果
2.2.1 假手术组肉眼观察, 肝脏无明显改变。 肝脏红润, 无血性腹水及坏死灶。
2.2.2 脓毒症组各时间点大鼠剖检均可见不同程度的血性腹水, 肠管扩张, 并可见散布于盲肠、大网膜、肠系膜等处出血、坏死灶和皂化斑。 肝脏大小无明显改变, 颜色呈暗红色, 表面可见散在的点状淤血。电镜下3 h组可见肝细胞核基本正常, Diss间隙增宽, 溶酶体增多, 线粒体扩张 (图2) 。 6 h组可见肝细胞核固缩、畸形, 内质网减少, 线粒体嵴断裂、髓鞘样改变, 并有肥大细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润 (图3) 。12 h组和24 h组可见细胞变形, 血窦扩张, 肝细胞核固缩、染色质呈块状、核膜不清, 线粒体、内质网明显减少, 内质网扩张、脱颗粒, 胆小管闭塞、绒毛消失 (图4、5) 。
2.2.3 NS398 干预组除3 h组外, 其余各组可见少量血性腹水, 肠管轻度扩张, 盲肠处可见出血坏死, 无灶化斑。肝脏色泽稍暗, 未见出血点。电镜下3 h组与脓毒症3h组变化基本相同 (图6) 。 6 h组Diss间隙增宽, 核染色质边集, 内质网减少, 线粒体扩张, 未见细胞浸润 (图7) 。 12 h和24 h组可见溶酶体增多, 内质网和线粒体仅见个别扩张, 个别核膜不完整、染色质边集 (图8、9) 。
2.3 实验大鼠在同一时间段ALT、AST变化
结果显示, CLP造模后脓毒症组ALT、AST含量显著增高, 到24 h含量最高, 各时段与假手术组比较差异有统计学意义 (P < 0.05) 。 而NS398 干预组ALT、AST含量也增高, 在3、12、24 h, 与假手术组差异无统计学意义 (P > 0.05) ;相同时段比较, ALT、AST与脓毒症组差异有统计学意义 (P < 0.05) 。 这与COX-2 mRNA变化基本相同。 见表1。
2.4 在同一时间段大鼠NF-κB变化
肝细胞中NF-κB在假手术组呈低表达;CLP造模后3 h表达增强, 到12 h达到高峰, 24 h仍呈高表达。 NS-398 干预后相同时点NF-κB表达较脓毒症组显著降低, 但是仍然高于假手术组 (P < 0.05) 。 这与COX -2 mRNA变化基本一致, Pearson相关分析, COX-2 mRNA与NF-κB呈正相关 (r = 0.685, P =0.042) 。 见表2。
注:与假手术组比较, *P < 0.05;与脓毒症组比较, △P < 0.05;ALT:谷丙转氨酶;AST:谷草转氨酶
注:与假手术组比较, *P < 0.05;与脓毒症组比较, △P < 0.05;ALT:谷丙转氨酶;AST:谷草转氨酶
3 讨论
脓毒症时机体各个重要器官都有可能受到炎症波及, 而肝脏是炎性反应最为剧烈和最容易受到损伤的器官之一, 内毒素 (LPS) 通过直接或间接作用造成肝损伤, 其中细胞因子、氧自由基等发挥重要作用[10]。肝损伤的就是各种致病因素作用于肝组织, 肝细胞在一定程度上出现变性、坏死和功能性变化。 作为重要炎症介质, 前列腺素在肝损伤中的细胞因子网络中发挥重要作用。 COX是合成各种前列腺素 (prostaglandins, PGs) 的关键限速酶, 在肝损伤时, 激素、 细胞因子、 内毒素和促癌剂等诱导COX-2 的表达, 氧化应激与脂质过氧化的代谢产物也可诱导COX-2 表达参与肝损伤[11]。 但是COX-2 在肝损伤后高表达, 究竟是对肝组织的保护性因素还是损伤性因素, 其作用机制如何, 目前尚不完全清楚, 而且一直存在争议。 一些实验研究认为, 抑制COX-2 表达, 不仅可以降低血中炎症细胞和其他有害因子水平, 减轻脓毒症症状, 从而抵御内毒素介导的感染和死亡, 降低病情严重程度。 其中的机制可能与COX-2 抑制剂能阻碍NF-κB的激活有关。
NF-κB由p50 和p65 两个亚基组成, 只有p65在蛋白的C末端含有转录激活区域能直接作用于转录区域而激活转录过程, 因此, 可通过测定NF-κB亚单位p65 反映NF-κB的活性[12]。 近年来研究发现COX-2 的基因中含有2 个NF-κB位点序列:5-GGGACT TTC C2-3′, 分别位于-445/-427 和-223/-214处, 该位点序列发生定向突变后, 几乎完全封闭TNF-α对COX-2 启动子连接的报告基因活性的诱导作用[13]。 而且有研究表明COX-2 抑制剂发挥抗炎和抗增殖作用主要与抑制转录因子NF-κB或AP-1 相关[14]。 二者的相互关系如何, 相互之间的作用机制如何, 所以在前人研究的基础上, 笔者假设通过反馈调节机制, 可以抑制COX-2 mRNA来减弱NF-κB的表达。
本研究采用经典的CLP, 制造与临床感染相似的脓毒症动物模型。结果表明脓毒症之后肝组织炎性反应剧烈, 肝脏功能迅速变化, 转氨酶快速升高, 而且病理变化显著, 肝细胞出现变性坏死, 这提示已造成一定程度的肝损伤。本研究中笔者观察发现, 在没有明显脓毒症的假手术组NF-κB表达较低 (0.60±0.54) , 而在脓毒症B组, 3 h后NF-κB表达显著增高, 12 h时达到高峰 (12.20±0.32) , 24 h仍然高表达。 与此同时, 脓毒症后早期肝组织COX-2 mRNA表达即增高, 24 h时仍呈高表达, 这个变化与NF-κB变化相一致。 这说明NF-κB参与脓毒症肝损伤过程, 而NF-κB的活化促进了COX-2 mRNA的表达, 而且COX-2 mRNA的表达增高可能是造成机体损伤的一种有害机制。当使用COX-2 特异性抑制剂NS-398 干预后, COX-2mRNA表达明显降低, 肝功能及肝细胞病理损伤明显好转, 同时段NF-κB较脓毒症组降低 (P < 0.05) 。Pearson相关分析, COX-2 mRNA与NF-κB呈正相关 (r=0.685, P=0.042) 。 Strong等[15]的研究结果也表明:NS398 通过抑制PGE2 和COX-2 mRNA表达, 从而明显降低致炎症细胞因子产物水平, 提高宿主存活率。这些变化使我们有理由相信, 选择性COX-2 抑制剂在抑制COX-2 mRNA表达的同时, 通过负反馈调节机制, 减弱NF-κB的表达, 从而改善肝损伤, 有效保护肝细胞。
通过实验研究表明, COX-2 在脓毒症后引起的肝损伤中占有重要地位, NS-398 通过负反馈调节机制, 特异性抑制COX-2 来抑制肝细胞中NF-κB的表达, 从而减轻肝细胞损伤。
摘要：目的 探讨环氧合酶2 (COX-2) 和核因子-κB (NF-κB) 在脓毒症大鼠的肝组织炎性反应中的表达及其相互关系。方法 随机选择54只200220 g成年Wistar大鼠分为3组, 假手术A组 (实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水, 麻醉后行开腹手术, 不做模型诱导, n=6) ;脓毒症模型B组[实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水, 麻醉后盲肠结扎穿孔 (cecal ligation and puncture, CLP) 建立腹腔感染模型, n=24];NS398干预C组 (CLP建立腹腔感染模型, 实验开始前2 h腹腔内注射NS398 10 mg/kg, n=24) 。以CLP法建立动物模型, 逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 法检测COX-2 mRNA在肝脏组织的表达, 免疫组织化学法 (Elisa) 测定NF-κB在肝细胞中表达, 并检测肝脏功能, 如谷丙转氨酶 (ALT) 、谷草转氨酶 (AST) 和肝脏大体标本及病理变化。结果 ①COX-2 mRNA在A组呈低表达 (1040.82±2.77) , 各时点C组较B组明显降低。②肝细胞中NF-κB在A组表达较低[3 h: (0.60±0.54) , 6 h: (0.60±0.54) , 12 h: (0.60±0.54) , 24 h: (0.60±0.54) ], 脓毒症后其表达明显增高[3 h: (2.60±0.55) , 6 h: (7.20±1.09) , 12 h: (12.20±0.32) , 24 h: (6.40±0.73) ];在同一时点比较, B组低于C组[3 h: (1.60±1.89) , 6 h: (6.60±0.79) , 12 h: (9.20±2.68) , 24 h: (4.80±1.60) ] (P<0.05) 。③Pearson相关分析, COX-2 mRNA与NF-κB呈直线正相关 (r=0.685, P=0.042) 。④脓毒症后肝脏转氨酶明显增高[ALT:3 h: (174.00±18.73) U/L, 6 h: (204.67±23.59) U/L, 12 h: (311.00±44.53) U/L, 24 h: (506.67±24.79) U/L;AST:3 h: (619.67±145.81) U/L, 6 h: (594.00±34.59) U/L, 12 h: (1027.66±136.21) U/L, 24 h: (1518.33±139.38) U/L], NS-398干预后降低[ALT:3 h: (105.33±18.01) U/L, 6 h: (157.00±32.36) U/L, 12 h: (101.00±16.52) U/L, 24 h: (93.33±10.41) U/L;AST:3 h: (217.00±26.21) U/L, 6 h: (461.33±22.01) U/L, 12 h: (322.00±72.33) U/L, 24 h: (268.00±98.57) U/L], C组与B组差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示经干预肝脏病理损伤减轻。结论 COX-2在脓毒症后引起的肝损伤中占有重要地位, NS-398通过特异性抑制COX-2来抑制肝细胞中NF-κB的表达, 从而减轻肝细胞损伤。
脓毒症大鼠 篇6
1 Materials and methods
1.1 Experimental animal and grouping
96 adult health Sprague-Dawley(SD)rats(weighing 280 to 340 g,equal females and males)were obtained from the Animal Center of Anhui Medical University.All of the rats were randomly divided into three groups including group A(sham operation group,n=32),group B(normal saline group,n=32)and group C(SM group,n=32)after dyeing and numbering.Every group were divided into four groups including 12,24,36 and 48-hour time point groups again,each group had eight rats.The rats were placed into different cages to raise.
1.2 Animal model preparation
All the rats were experimentally fed for a week,overnight fasting(water ad libitum)before experiment.After anesthesia achieved by intraperitoneal injection of chloraldurat at a dose of 0.03 mL/kg,the rats were fixed on board to lie on the back,degerming and spreading surgical drape.A midline incision was made in the abdominal wall of group A rats and then sutured,while the cecum of groups B and C was ligated below the ileocecal valve with silk suture.The ligated cecum was then punctured through and through with a9 gauge needle.Following puncture,the cecum was gently squeezed to ensure that the wounds were patent.The abdomen was closed by suturing both peritoneal and skin layers.At 1/2,12,24 and 36-hour time points after surgery,rats in groups A and B were injected with normal saline at a dose of 5 m L/kg,while group C rats were injected with SM injection(Hebei Shenwei Medicine Limited Company,batch number:06032421)with hypodermic injection.After induction of sepsis,the animals were killed at 12,24,36 and 48-hour time points after CLP and blood was drawn from the abdominal aorta after anesthesia induced by chloraldurat.Blood samples were placed into 5 mL collection tubes to measure IL-6 and IL-8.All the rats died of shock.
1.3 Index measuring
Blood samples were centrifuged at 4000 rpm for10 minutes at 4℃.Serum was collected and immediately frozen at 80℃until it was used for radio immunoassay analysis.Serum cytokines(IL-6 and IL-8)were assayed by commercial assay kits(from Beijing North Biotechnology Research Institute,batch number:200702).
1.4 Statistical analysis
Data were generally presented as means±standard error of the mean and were analyzed using SPSS11.5,statistics handlings with t-test.
2 Results
2.1 Serum levels of IL-6
Compared with group A,groups B and C′s serum levels of IL-6 significantly increased following CLP.At 36 hour time point,group C′s serum level of IL-6reached maximum[(0.90±0.10)μg/L]and began to decrease after that.Group B′s serum level of IL-6kept on increasing after CLP,reached peak value[(1.62±0.43)μg/L]at 48 hours time point.At every time point,group B′s serum levels of IL-6 were significantly higher than those of group A and C(P<0.01).
Note:1)Compared with group A,P<0.012)Compared with group B,P<0.01
2.2 Serum levels of IL-8
Serum IL-8 level of group B significantly increased after CLP,and reached peak value at 36hours time point[(2.14±0.13)μg/L].Group C′s serum IL-8 Level reached maximum[(0.74±0.06)μg/L]at24 hours time point and began to decrease after that,serum IL-8 level at 48 hours time point was similar to that of 12 hours time point.At every time point,group B′s serum levels of IL-8 were significantly higher than those of group A and C(P<0.01).
Note:1)Compared with group A,P<0.012)Compared with group B,P<0.01
3 Discussion
Sepsis is a systemic inflammatory response syndrome(SIRS)induced by infection,excessive production of proinflammatory cytokines such as tumor necrosis factor(TNF)-α,interleukin(IL)-1β,IL-6and IL-8 play an important role in SIRS.TNF-αand IL-1βare especially known to serve as triggering cytokines for the cytokine cascades[1].Both IL-6 and IL-8 belong to interleukin family,many cell types,including T/B leukomonocytes,macrophages,fibroblast,and vascular endothelial cells,can produce them in response to stimulation with TNF-a activating reticuloendothelial cell system,and they compose of essential components of second order inflammatory reaction network[2].IL-6,a cytokine with both pro-and antiinflammatory properties,is released early in response to endotoxin challenge and stimulates the production of most acute-phase proteins[3].IL-6 has a longer half-life than other cytokines(such as TNF-α,IL-1β)and is elevated in patients with sepsis.High IL-6 concentrations are associated with increased mortality[4].Riedemann reported that using an anti-IL-6 antibody and the cecal ligation and puncture model of sepsis,it has been demonstrated that optimal survival occurs when sufficient antibody is given to blunt but not completely eliminate IL-6[5].IL-8 plays an important role in the pathophysiological process of infection organism,which can intensively attract and activate neutrophilic leukocytes,promote granular leukocytes sticking to vascular endothelial cells,increase granular leukocytes′penetrating power to endothelial cell layer and permeability of vessel endothelium,induce neutrophilic leukocytes entering tissue space and inflammatory area,all those are involved in microcirculation disturbance and organ dysfunction[6].IL-8 concentration has a good relationship with the degree of neutrophilic leukocytes′activation and host reaction to infection,monoclonal antibody of IL-8 can cut down blood oxyradical concentration and elevate survival rate of septic shock animal[7].
SM injection,a pure Chinese drugs pharmaceutics,is composed of ginseng and ophiopogonis tuber.It can increase activities of superoxide dismutase(SOD),Na+,K+-ATP and Ca2+-ATP enzyme,clean up free radicals,mitigate lipid peroxidation,improve energy metabolism and minicirculation,repair and protect ultra-structure of aging cells,accommodate autonomic nerve,immune and blood sugar,counteract arrhythmia,shock and oncoma,and can keep gastric mucosa from harms induced by alcohol and antifani[8,9].LI reported that SM injection has immunoregulation function on sepsis rats.It can increase organism immune function,depress infection diffusion and prevent the development of MODS,mainly through accommodating hypothalamic-pituitary-adrenal axis and containmenting excessive synthesis and release of TNF-α[10].Our study showed that SM injection can significantly decrease serum levels of IL-6 and IL-8,which mechanism may be related with decreasing synthesis of TNF-α.Sepsis prognosis often has relation with blood IL-6 and IL-8 levels,so SM injection may have positive protection for sepsis therapy and improve the prognosis and survival of sepsis rats.
参考文献
[1] SHIGETO O, HIROYUKI H, HIDETOSHI S, et al. Sequential mea- surement of IL-6 blood levels in patients with Systemic inflammato- ry response syndrome (SIRS)/sepsis[J]. Cytokine, 2005, 29(4): 169- 175.
[2] CROZIER TA, M-LLER JE, OUITTKAT D, et al. Effect of anesthe- sia on the cytokine responses to abdominal surgery[J]. Br J Anaesth, 1994, 72(3): 280-285.
[3] SAMIR Q, LATIFI, MARY A, et al. Persistent elevation of serum interleukin-6 in intraabdominal sepsis identifies those with pro- longed length of stay[J]. J Pediatr Surg, 2004, 39(10): 1548-1552.
[4] JAROSLAV M, PETRA S, MICHAL F, et al. Interleukin-6 gene variants and the risk of sepsis development in children [J]. HumanImmunology, 2007, 68(9): 756-760.
[5] RIEDEMANN NC, NEFF RF, GUO KD, et al. Protective effects of IL-6 blockade in sepsis are linked to reduced C5a receptor expres- sion[J]. J. Immunol., 2003, 170(1): 503-507.
[6] GERALD S, EDWIN B, JAN SE, et al. Comparison of whole blood interleukin-8 and plasma interleukin-8 as a predictor for sepsis in postoperative patients[J]. Clinica Chimica Acta, 2007, 378(1-2): 117-121.
[7] CARVALHO GL, WAKABAYASHI G, SHIMAZU M, et a1. Anti- interleukin-8 monoclonal antibody reduces free radical production and improves hemodynamics and survival rate in endotoxic shock in rabbits[J]. Surgery, 1997, 122(1): 60-68.
[8] HE D, PENG X, ZHEN ZJ, et al. Preventive effect and mechanism of Shenmai injection on liver cirrhosis induced by chemical damage in rats[J]. China Journal of Modern Medicine, 2005, 15(19): 2929- 2932. Chinese
[9] DENG Y, HUANG P, ZHANG CY, et al. Experimental study of Shenmai on cyclosporine A-induced acute nephrotoxicity in rats[J]. China Journal of Modern Medicine, 2005, 15(8): 1185-1186. Chi- nese