多基因系统发育分析（通用6篇）
多基因系统发育分析 篇1
线粒体细胞色素b (Cytochrome b, Cytb) 基因是构成线粒体氧化磷酸化系统复合体Ⅲ的蛋白质之一, 也是其中唯一由线粒体基因组编码的蛋白质[1], 具有结构简单、无重组、母系遗传、进化速度快等特点, 广泛应用于系统进化和分类研究[2]。本研究测定了四川板角山羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、贵州麻羊及湖南马头山羊5个品种, 共计69只山羊的Cytb基因全序列, 对其进行变异分析, 以探究贵州及其周边地区山羊品种的进化关系。
1 材料与方法
1.1 样品的采集及DNA的提取
5个山羊品种的全血组织样品来源见表1。用冰瓶运回实验室, -40℃冰箱保存备用。采用Chen等的方法提取细胞中总DNA。
1.2 测序引物的设计及PCR扩增
mt DNA Cytb扩增及测序所用的引物, 利用OLIG06软件导入已发表的羊mt DNA全序列 (Gen Bank序列登录号为AF533441) 进行设计。所设计的PCR引物为:正链引物为:5-AATAGGCGAAGGTTTTGAA-3;反链引物为:5–GCTTTGGGTGCTGATAGTG-3。测序引物设计了3对, 分别为:GCS1:5-TCTCACATGGA ATCTAACC-3, 5-GCCTATGAATGCTGTGG-3;GCS2:5-GTTTTACCATGAGGACAA-3, 5-AATTT ATGCTTCGTTGTTTAG-3;GCS3:5-CGCCATGCTA CTAATTCTTGTTCT-3, 5-GCTATGGCTTCTTCCTTGAGTCT-3。
反应体积为50μL。其中模板为100~150 ng, 10×buffer (Mg2+Free) 5μL、Mg Cl2 (25 Mm) 3μL, Dntp Mixture (各2.5 Um) 、引物各2μL, Ta KaRa Taq (5 U/μL) 0.5μL。PCR扩增体系为:94℃预变性5 min, 35个循环 (94℃60 s, 55℃60 s, 72℃60 s) 、72℃延伸10 min, 于4℃保存。
1.3 PCR产物的回收及测序
PCR产物采用北京博迈德生物有限公司的回收管回收。回收后的PCR产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。
1.4 统计分析方法
(1) 利用DNAStar软件包的Seq Man校对测序结果, 用CLUSTALX软件进行同源性序列比对。本实验所测定的4个山羊品种55条mt DNA Cytb全序列经编辑后, 其中16条系列已登载到Gen Bank数据库中, 其接收号为:EU350118-EU350133。 (2) 用MEGA3.1确定多态位点、核苷酸总变异位点以及点突变位点的统计;计算碱基组成、转换/颠换比率 (Ts/Tv) [3], 核苷酸差异和序列差异, 同义突变/同义突变比率 (Ka/Ks) 。用分子进化遗传分析软件DNAsp确定核苷酸多样度和单倍型多样度。并用MEGA3.1软件的邻接法构建不同脊椎动物之间的进化树。
2 结果
2.1 Cytb序列变异特点
69只山羊mt DNA Cytb基因序列长均为1 140 bp, 且以起始密码子ATG开始, 中间没有插入/缺失, 以终止密码子AGA结束。由69个山羊mt DNA Cytb基因序列个体统计的变异位点和单倍型类型见图1、表2。
由图1可见, 5个品种共69个山羊个体Cytb基因序列中, 总共发现17个变异位点, 分别位于38、174、309、361、426、537、576、594、643、663、695、721、722、852、1 068和1 086, 约占核苷酸总长的1.49%。17个多态位点中转换16次 (14次C/T转换、2次A/G转换) , 1次T/G颠换, 转换数明显大于颠换数。其中2个碱基的单一多态位点有4个, 位点位置为174、309、594、643;没有3个碱基的单一多态位点。17个变异中有11个变异为同义变异, 有6个变异为非同义变异。观察到14种单倍型, 各单倍型编号及共享单倍型见表2, 其中有10个为品种独享, 4个为各品种间个体共享。
2.2 5个山羊品种遗传多样性分析
5个山羊品种的群体遗传多样性参数见表3。由表3可以看出, 5个山羊品种 (基因) 多样性从贵州白山羊的0.889到贵州黑山羊的0.442, 核苷酸多样度从0.001 45~0.002 53, 显示5个山羊遗传多样性属于中等[4]。
2.3 5个山羊品种单倍型间的系统发育分析
为了探讨各品种间的系统发育, 计算了各品种间的净遗传距离 (net genetic distance, d A) 和平均核苷酸差异dxy[5]。根据d A、dxy矩阵用邻接法 (NeighbourJoining, NJ) 构建了5个山羊品种间的关系树 (见图2) 。5个山羊品种可分为2大类群, 即:湖南马头山羊、贵州麻羊、贵州白山羊和贵州黑山羊4个品种为一类;四川板桥山羊1个品种为另一类。
其中贵州黑山羊和贵州白山羊的亲缘关系最近, 与贵州麻羊的亲缘关系次之, 与湖南马头山羊较远, 与四川板角白山羊的亲缘关系最远。
3 讨论
3.1 5个山羊品种的遗传多样性
本试验对5个山羊品种的69个个体进行mt DNA Cytb全序列测定, 结果共发现17个变异位点, 共定义了14种单倍型。各品种中单倍型多样性为0.442~0.889;核苷酸多样度为0.001 57~0.002 28。这表明5个山羊品种的遗传多样性处于中等水平。
Luikart等[6]对世界上88个山羊品种的406个个体的mt DNA高变区481 bp的序列分析结果表明:家养山羊控制区序列表现出很高的遗传多样性。李祥龙[7]利用18种限制性内切酶对我国部分家山羊的mt DNA进行了RFLP分析, 核苷酸多样度仅为0.001 49, 结果认为中国家山羊的遗传多样性比较贫乏。本试验得出的“湘黔川5个山羊的mt DNA遗传多样性为中等水平”的结论介于2种观点之间。造成这种结果差异的原因除了试验方法不同外, 可能还有中国本地山羊杂交利用等方面的原因有关, 以及样本的差异、酶的数量、电泳分型中的不确定因素等影响RFLP的结果。
3.2 5个山羊品种间的亲缘关系
刘若余[8]利用mt DNA D-Loop研究中国山羊品种系统发育的结果认为, 中国山羊品种可分为2大类群, 即:板角山羊、陕南白山羊、雷州山羊、贵州白山羊、成都麻羊5个品种为一类;马头山羊、西藏山羊, 黔北麻羊, 贵州黑山羊等8个品种为另一类。本研究结果认为, 湘黔川5个山羊品种可分为2大类群, 即:贵州黑山羊、贵州麻羊、贵州白羊和湖南马头山羊4个品种为一类;四川板角山羊1个品种为另一类, 其中贵州黑山羊和贵州白山羊的亲缘关系最近, 与贵州麻羊的亲缘关系次之, 与湖南马头山羊较远, 与四川板角白山羊的亲缘关系最远, 这与刘若余[8]利用mt DNA D-Loop研究中国山羊品种系统发育的结果一致。
4 结论
通过对5个山羊品种69个样本线粒体DNA Cytb全序列分析, 得到如下结论。
4.1 变异位点分别位于38、174、309、361、426、537、576、594、643、663、695、721、722、852、1 068和1 086。17个多态位点中转换16次 (14次C/T转换、2次A/G转换) , 1次T/G颠换。17个变异中有59个变异为同义变异, 有6个变异为非同义变异。观察到14种单倍型, 其中有10个为品种独享, 4个为各品种间个体共享。
4.2 实验所得5个山羊品种 (基因) 多样性从贵州白山羊的0.889到贵州黑山羊的0.442, 核苷酸多样度从0.001 45~0.002 53, 显示5个山羊遗传多样性属于中等。
4.3 5个山羊品种可分为2大类群, 即:贵州黑山羊、贵州麻羊、贵州白山羊和湖南马头山羊4个品种为一类;四川板桥山羊1个品种为另一类。
参考文献
[1]Hatefi Y.The mitochondrial electron transport and oxidative Phosphorylation system[J].Annu.Rev.Biochemist, 1985, 54:1 015~1 069.
[2]Smith M F and Patton J L.Variation in mitochondrial cyto chrome b sequence in natural pop ulations of south American akodontine rodents[J]Mo1 Biol Evo1, 1991, 8 (1) :85~103.
[3]Kumar S, Tamure K, In d B, Jakobsen I B, Nei M.MEGA2:Molecular Evolutionary Genetics AnalysisSoftware.Arizona State Universit Tempe, Arizona, USA, 2001.
[4]桂建芳.脊椎动物线粒体DNA的进化遗传学[J].动物学杂志, 1990, 25 (1) :50~55.
[5]Nei M.Molec ular Evolutionary Genetics.1987, New York:Columbia University Press.
[6]Luikart G, Gielly L, Excoffier L, Vigne J D, Bouuvet J, Tabert P.M ultiple matemal origins and weak phylogeographic structure in domestic goats.Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:5 382~5 384.
[7]李祥龙, 张亚平, 陈圣偶, 等.山羊品种间线粒体DNA限制性片段长度多态性研究[J].动物学研究, 1997, 18 (4) :421~428.
[8]刘若余, 中国山羊、黄牛线粒体DNA遗传多样性与起源进化[D].杨凌:西北农林科技大学, 2005.
多基因系统发育分析 篇2
从系统和个体发育审视癌基因等癌学概念
由于尚未建立起整体理论体系,癌之谜依然没有破解.为此,从系统和个体发育角度审视了“癌基因”等主要癌学概念,认为:1)在30多年前首先发现和定性的“(原)癌基因”,后来逐渐发现它们在正常细胞中都具有广谱的生长调节功能,而与癌变并无必然关系.在癌变细胞中相关因子基因表现出的单核甘酸多态性或过度表达,均具有偶然性质.“人类正常细胞普遍存在癌基因”的概念是一种误解;2)由于母体对愈伤干细胞增殖的.失控才产生了原位癌,两者之间存在着相互依存关系并非只是拮抗.不宜将母体视为原位癌的“宿主”.更重要的是,在“控制癌细胞转移”上,两者还有着“共同本能”.赞同癌症不是单纯的基因病而是可控的综合慢性病的理念;3)从进化上看,癌细胞运行糖酵解途径并不单纯是产能方式的转换,而是癌代谢返祖趋势的反映.返祖性导致多样化的癌症具有趋同的代谢型,有利于建立共同的癌代谢机理模式,和开发简单且对各类癌症普适的抗癌药物.
作 者：肖敬平XIAO Jing-ping 作者单位：华南农业大学,生命科学学院,中国广东,广州,510642刊 名：生命科学研究 ISTIC英文刊名：LIFE SCIENCE RESEARCH年，卷(期)：12(1)分类号：Q786 R73关键词：癌 癌基因 单核苷酸多态性 癌代谢
多基因系统发育分析 篇3
关键词 GDF-8基因 ；mRNA表达 ；荧光实时定量PCR ；山羊
中图分类号 S827
Abstract In order to explore the mRNA expression differences and developmental changes of GDF-8 gene in liver， heart， kidney， fat， and skeletal muscle of goat in different growth stages， in this paper， using SYBR Green real-time fluorescent quantitative PCR technology for 2 months， 3 months and 4 months age of Hainan native goat for testing， The results showed that， the GDF-8 gene mRNA expression level in heart was the highest in months 3， and then in liver. The expression level of the five tissues in months 2 and months 4 was very low， especially， the heart tissue in months 2 and months 4 almost have no expression. The expression pattern of liver and fat in the three stage was： months 4>months 2>months 3， the expression differences among the three stages was very significantly（P<0.05）. The expression pattern of heart， kidney and skeletal muscle in the three stages was： months 3> months 4>months 2， the expression differences of kidney among the three stages was very significantly（P<0.05）， the expression differences of heart and skeletal muscle was not significant between months 2 and months 4.
Key words GDF-8 ；mRNA expression ；SYBR green real-time PCR ；goat
动物的生长发育是受基因表达调控的复杂过程，取决于相关基因在不同发育阶段、不同肌肉组织细胞中的特异性差异表达。肉质性状是畜禽动物的重要经济性状， 而GDF-8基因是与动物的肉质性状密切相关的候选基因，对肌肉的生长起负调控作用，又被命名为肌肉生长抑制素基因。近年来的研究结果表明，GDF-8基因除了对肌肉生长具有负调控作用外，对其他的生理功能具有一定的调理作用，如对动物的脂肪沉积、肌蛋白的合成与分解、骨骼肌的生長发育等都具有一定的调控。Kambadur等[1]发现该基因的突变导致处于同一条件下饲养的双肌牛和普通牛，两者的肉质差异非常大，前者肉质要比后者好1.3倍。whittemore等[2]将GDF-8抗体注射到成年鼠体内发现该成年鼠的骨骼肌出现骤增的情况。GDF-8基因作为一种肌肉生长负调控因子，在畜牧生产中具有一定的实践意义，研究GDF-8基因的表达或影响其表达产物活性等，对畜禽肌肉生长的调控、肌肉品质改善等具有重要意义，可大大提高畜禽的瘦肉产量，提高经济效益。海南黑山羊是中国热带地区优良的地方山羊品种，长期经热带地区自然生态环境的影响，形成独特的品种特性和生态特性，在海南各市县均有分布。其肉用性能好、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、是中国热区规模化健康养殖的宝贵品种资源。笔者以同等条件下饲养的海南黑山羊为研究对象，探索GDF-8基因在山羊肝脏、心脏、肾脏、脂肪和骨骼肌中的表达规律，不仅为GDF-8基因在山羊不同组织中的表达规律提供科学的遗传学资料，同时，对海南黑山羊的良种保留与繁育以及肉品质的改善提供一定的借鉴依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
选取中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所实验羊场的海南黑山羊为研究对象，选择在相同营养水平，相同饲养环境下喂养的2月龄、3月龄和4月龄的公羊各3只屠宰，屠宰后取肝脏、心脏、肾、脂肪和骨骼肌，用锡纸包好投入液氮中待用。
1.1.2 主要试剂与仪器
RNA提取试剂盒（Maxwell 16 Total RNA Purification Kit）购自普洛麦格公司，反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒均购自大连宝生物有限公司，移液枪、枪头、琼脂糖和Marker2000等购自海口光威生物有限公司。核酸提取仪Maxwell 16（Promega公司），eppendorf实时荧光定量PCR仪（海口光威生物有限公司），B-iometra PCR仪（德国德国 Biometra公司），凝胶成像系统（法国Vilber）。
多基因系统发育分析 篇4
泾阳链霉菌5406, 是由尹莘耘教授等1953年自陕西泾阳老苜蓿根际分离, 在全国作为抗生菌肥料使用, 能促进有机物分解, 使养分更有效, 同时能释放抗菌物质, 从而能有效地防止多种作物病虫害, 并能产生刺激植物生长的激素[1]。1979年, 陶天申对此菌株进行了形态、培养特征和生理生化特性的研究, 定名为泾 阳链霉菌 (Streptomycesjingyangensisn.sp.Taoetal., 1978) [2]。由于该菌株生产上的优良特性, 国内对该菌的作用机制和应用研究一直没有间断。链霉菌5406能产生两种以上的抗生素[3], 对多种微生物有拮抗作用[4,5]。1975年, 辽宁省林业土壤研究所从菌株中提取到3种不同成分的刺激物质———苯乙酸、琥珀酸和一种很微量就具有生物活性的物质, 发现具有明显的细胞分裂系的生物活性, 刺激细胞横向伸长, 刺激细胞分裂打破休眠[6]。1989年张靖溥等[7]从链霉菌ACCC40021的突变株及其融 合子中提 取出玉米 素和Zip。2012年, 张雯等[8]对该菌代谢产物的生物活性进行研究, 发现发酵液抑制小麦发芽, 促进小麦生长, 菌株发酵液和菌丝体均有一定的固氮、解磷、解钾作用。该菌株于1979年发表于国内的微生物学报, 没有在国际上有效发表, 此后一直没有对该菌株进行分子生物学系统进化分析鉴定。
1材料和方法
1.1主要材料、试剂和仪器
链霉菌ACCC40021由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供;黄赭色链霉菌 (S.silaceus) 模式菌DSM41861T购自德国DSMZ;培养基:高氏一号培养 (培养基编号:0012) ;PCR仪2720型 (美国ABI公司) 。
1.2DNA提取
将在高氏一号试管斜面活化好的单菌落, 接种于100mLTSB培养基, 28℃振荡培养2d;离心收集菌体, 用无菌水冲洗2次, 取0.15g新鲜菌体于研钵 (-20℃预冷) 中, 液氮反复研磨至细粉状, 迅速平均分装至2个1.5mL离心管中;加TE缓冲液550μL, 加65℃预热的20% SDS溶液30μL, 漩涡振荡5s, 加20mg·mL-1蛋白酶K20μL, 轻轻混匀, 37℃保温1h;加等体积Tris饱和酚/氯仿/异戊醇 (25∶24∶1) 抽提, 轻微颠倒 混匀, 10000v·min-1离心10 min;小心吸取 上清至新 离心管中, 加等体积氯仿/异戊醇 (24∶1) 抽提, 10000r·min-1离心5min, 吸取上清液与等体积异丙醇 (4℃预冷) 混匀, 然后10000r·min-1离心3min, 弃上清;沉淀用1mL70%乙醇 (4℃预冷) 洗涤1min, 自然风干, 加入40μLTE溶解, -20℃保存备用。
1.3PCR反应体系
参照链霉菌模式菌天蓝色链霉菌和阿维链霉菌的保守序列设计gyrB, recA, rpoB和trpB的扩增引物[9], 见表1。
PCR反应体系 (50μL) :ddH2O39.5μL, DNA0.5μL, 10×GCBuffer5μL, 引物F2μL, 引物R2μL, dNTPMix0.5μL, TaqDNApolymerase0.5μL。
1.4系统进化分析
将上述PCR产物送交是上海英骏生物技术公司测序, 将获得的16SrRNA, gyrB, recA, rpoB和trpB序列与选取模式菌序列信息用Clustalx软件分析计算, MEGA5.0绘制系统进化树。
2结果与分析
2.15个基因的PCR扩增条件
经过反复实验验证, 确定了链霉菌ACCC40021中16SrRNA, gyrB, recA, rpoB和trpB最佳PCR扩增条件, 见表2。实验表明, 不同的退 火温度对PCR反应有很大的影响, 16SrRNA、recA和rpoB的最佳退火温度为60℃, gyrB的最佳退火温度为65℃, trpB的最佳退火温度为63℃。
2.216SrRNA, gyrB, recA, rpoB和trpBPCR扩增
链霉菌ACCC40021的16S rRNA, gyrB, recA, rpoB和trpB 5个基因在 合适的PCR条件下, 均被成功扩增, 五个基因片段长度分别 大约是1500、1000、1000、900、700bp。
2.3系统进化分析
将16SrRNA序列提交 至Eztaxon, 获得与其序列相似度最高的模式菌的16SrRNA序列, 计算进化距离, 根据进化距离, 使用MEGA5.0构建系统发育NJ树。链霉菌ACCC40021的16SrRNA序列与S.silaceusNRRLB-24166T (EU812170) 序列相似性为99.8%, 进化距离最近, 在NJ树中处于同一进化分枝上, 系统进化树谱结果见图1~5。
PCR扩增S.silaceus模式菌DSMZ41861T的gyrB、recA、rpoB和trpB基因。在NCBI数据库中选取与链霉菌ACCC40021的gyrB、recA、rpoB和trpB基因序列相似性最高的菌株。根据序列信息分别构建gyrB, recA, rpoB和trpB的系统进化树。
根据链霉菌ACCC40021的16SrRNA序列相似性分析其系统发育地位。然后扩增链霉菌ACCC40021中已经普遍应用于细菌鉴定的4个持家基因gyrB, recA, rpoB和trpB, 根据这4个基因的序列信息对链霉菌ACCC40021的系统发育地位进一步验证。根据菌株16SrRNA的序列比 对分析结果, 链霉菌ACCC40021与S.silaceusNRRLB24166T (EU812170) 的序列相似性最高, 进化距离最近。gyrB, recA, rpoB的分析结果显示S.silaceusDSM41861T进化距离最近。通过分析trpB的序列信息, 结果显示链霉菌ACCC40021与S.kanamyceticusAS4.1441 (EF055140.1) 和S.silaceusDSM41861T在同一进化分枝 上, 链霉菌ACCC40021与S. kanamyceticusAS4.1441 (EF055140.1) 的进化距离最近。综合所得数据分析, 将ACCC40021定为黄赭色链霉菌 (Streptomycessilaceus) 。
3讨论
16SrRNA能否作为 细菌种系 发生的黄 金标准, 一直存在争议[10]。16SrRNA在种以上的水平具有很强的分辨力, 在物种水平的分辨力通常很低, 一些研究 已经报道 了代表不 同物种的 细菌16SrRNA的序列完全相同或几乎完全相同[11~14]。有的生物基因组间的相似性是70%, 而16SrRNA的序列相似性却可以达到97%以上[15], 而且很多细菌的基因组16SrRNA有多个拷贝[16], 在一些链霉菌中16SrRNA基因的多 个拷贝间 还存在序 列差异[17]。因此, 依据16SrRNA序列不足以将关系很近的种区分开, 尤其是链霉菌的进化枝[9,18]。一些持家基因如atpD, gyrB, recA, rpoB, trpB等已经被验证可 用于细菌 和链霉菌 的鉴定, 并且比16SrRNA具有更高的分辨率, gyrB等一些基因都可以单独用于链霉菌的进化分析[19,20], 一些基因 在S.coelicolorA3 (2) 的基因组中都只有一个拷贝, 分别在初级代谢中执行不同的功能, 并且具备进化保守性, 在链霉菌的系统发育分析中分辨率更高, 更可靠, 可以对链霉菌在物种水平进行鉴定。黄赭色链霉菌是Labeda等[21]2009年发表的新种, 模式菌株保藏编号NRRLB-24166 (T) =DSM41861 (T) =LDDC6638-99 (T) 。
摘要：链霉菌ACCC40021是尹莘耘1953年分离筛选, 用于农业生产的抗生菌肥。该菌株1979年经鉴定为泾阳链霉菌 (Streptomyces jingyangensis) , 但该菌株名称一直没有在国际上得到有效发表。为了在分子水平上明确该菌株的分类地位, 对ACCC40021的菌株进行了16SrRNA和gyrB, recA, rpoB和trpB等基因的进化分析, 将ACCC40021鉴定为黄赭色链霉菌 (Streptomyces silaceus) 。
多基因系统发育分析 篇5
1 资料与方法
1.1 研究对象
先天性软骨发育不全家系见图1, 先症者 (Ⅱ1) , 男性8岁, 身高0.82 m。患者2 (Ⅱ2) , 男性4岁, 身高0.68 m。依据先天性软骨发育不全的诊断标准:面容粗陋, 不成比例性身材短小, 躯干高度正常, 下肢特别短, 脊柱前凸, 髋关节受累, 呈摇摆步态;头大、囱宽、前额圆凸、鼻凹, 手指粗短。X线检查:头颅大, 颅骨钙化完全, 颅底短小, 肋骨短小, 管状骨粗短, 股骨近端呈卵圆形, 从胸椎到腰椎弓根的距离逐渐变窄。先证者的父母表型均正常, 自述双方家系从未出现过类似的患者, 于泸州医学院附属医院内分泌科求诊, 签署知情同意书后, 患者及其父母静脉各采血2 m L供研究。
1.2 方法
1.2.1 基因组DN A的提取
抽提所有受检个体外周血中有核细胞DNA、患者父亲精液DNA及胎儿羊水DNA, 采用天根生化科技有限公司试剂盒提取DNA, 操作按说明书进行。
1.2.2 PCR扩增
PCR扩增FGFR3基因第10外显子突变热点区域, 扩增引物序列为FGFR10F1:5'-GGCGTTACTGACTGCGAGAC-3', FGFR10R1:5'-TT GAGCGGGAAGCGGGAGA-3', 扩增片段长度为341bp。PCR扩增产物送测序。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离, 溴乙啶染色, Gel Doc1000凝胶成像分析系统观察并保存电泳结果。引物的合成和PCR扩增产物测序均由上海Invitrogen公司完成。
1.2.3 G1138A突变位点的酶切鉴定
引物FGFR10F2:5'-AGGAGCTGGTGGAGGCTGA-3', FGF R10R2:5'-GGAGATCTTGTGCACGGTGG-3', PCR产物经限制性核酸内切酶Bfm I酶切, 3%琼脂糖电泳分离酶切片段, 如存在G1138A杂合突变, PCR产物酶切后将出现164、111及53 bp 3个片段, 如系G1138A纯合突变, 将出现111bp与53bp 2个片段, 如无G1138A突变, 则仅见164 bp片段。
扩增条件及参数:PCR反应体系为50μL, 其中d NTP 10 pmol/L, Mg Cl21.5 mmol/L, 0.5μg基因组DNA, 引物10 pmol, Takara Taq酶2 u。在PTC-200型热循环仪 (MJ Research) 上进行PCR扩增反应, 扩增参数:冷启动, 94℃预变性3 min, 94℃变性30 s, 60℃复性30 s, 72℃延伸30 s, 35个循环, 最后72℃延伸5 min。
2 结果
2.1 PCR产物直接测序检测FGFR3基因突变
患者Ⅱ1和患者Ⅱ2在对应于c DNA序列1138位出现A/G双峰, 先证者父母与胎儿在该碱基位置仅为A单峰, 提示两患者均发生G1138A杂合突变。患者父亲精液基因组DNA测序在该位置也仅为A单峰。家系所有成员在对应于c DNA序列1180位均为A单峰, 未发现A1180T突变。见图2。
2.2 PCR-RFLP检测FGFR3基因突变
两患者PCR产物酶切后出现164、111及53 bp3个片段, 家系患者父母与胎儿标本酶切后仅见164bp片段, 提示家系中两个患者均为FGFR3基因第10外显子G1138A杂合突变, 而其他个体包括胎儿无G1138A突变。胎儿娩出后脐血基因分析结果与产前检查一致, 且随后1年中生长发育正常。见图3。
A:患者G1138A杂合突变, 箭头示G/A双峰, B:父母该位点为野生型, 箭头示G单峰
1、2、3、4、5泳道依次为Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ2和Ⅱ3个体的酶切结果
3 讨论
3.1 骨骼系统畸形是ACH主要的临床表现
软骨母细胞生长和成熟发育障碍, 将导致软骨内成骨受阻。根据KANAKA-GANTENBEIN等的统计, 至发育成熟, 平均身高男性为 (131±5.6) cm, (124±5.9) cm[2]。1994年SHIANG等[3]发现ACH主要是由于FGFR3基因跨膜区c DNA 1138位核苷酸发生点突变, 其中98%为G1138A, 1%为G1138C。该位点的2种突变均导致G380R的改变, 将激活FGFR3基因的功能, 使其下游转录活化蛋白 (signal transducer and activator of transcription, STAT) 活性增强, 细胞周期抑制蛋白表达上调, 最终导致软骨形成被抑制, 产生ACH的一系列表型。FGFR3基因其他位置的突变目前已发现49种, 国内张晔[4]和倪继红[5]的研究结果支持中国人群中FGFR3基因也存在有类似频率的G380R突变热点。近年来, 中国人群中G380R突变热点之外的突变位点也相继有报道, 如A1180T突变[6]、A649T突变[7]和G1620T突变[8]等。
3.2 该家系的遗传机制
ACH为常染色体显性遗传, 作者所研究的家系父母表型正常。虽然80%以上的ACH为散发型, 即由新生基因突变所致, 但生育2例或2例以上患病同胞无法用基因突变解释。当初该家系第1个患者确诊后, 医生认为该家系为新生基因突变所致, 第2胎患病的几率非常小, 故父母未引起足够的重视, 第2胎未做产前诊断导致第2个患者出生, 第3胎才在医生的建议下进行了产前基因诊断。FRYNS等[9]认为该现象是由于生殖细胞嵌合所致, 即双亲之一生殖细胞存在正常和突变两种类型, 但体细胞皆正常, 因此表型正常。HENDERSON等[10]在一个双亲正常出生2例患儿家系中发现母亲外周血细胞存在细胞嵌合, 但由于比例较低尚未引起表型的改变。作者所研究的家系父母外周血细胞基因组没有发现突变, 表明不存在体细胞嵌合, 患者父亲精液标本基因组DNA中也未见突变, 父亲生殖细胞不存在嵌合。因此推测该家系的遗传方式可能为母亲生殖细胞嵌合, 但由于取材的问题该推测难以获得证实。对于显性遗传病, 双亲正常生育多名患儿是极为罕见的现象, 本文报告的家系有较高价值, 临床医师或遗传咨询工作者应该引起足够的重视, 在某些散发型软骨发育不全家系中, 患者的致病基因可能源至双亲之一生殖系部分细胞存在的突变, 其表型正常是因为外周血基因组DNA不携带该突变, 但患者的同胞发病风险远远大于群体发病率, 要想生育正常的小孩, 应该进行产前基因诊断。
参考文献
[1]HORTON WA, HALL JG, HECHT JT.Achondroplasia[J].Lancet, 2007, 370:162-172.
[2]KANAKA-GANTENBEIN C.Present status of the use of growth hormone in short children with bone diseases (diseases of the skeleton) [J].J Pediatr Endocrinol Metab, 2001, 14:17-26.
[3]SHIANG R, THOMPSON LM, ZHU YZ, et al.Mutations in the transmembrane domain of FGFR3 cause the most common genetic form of dwarfism, achondroplasia[J].Cell, 1994, 78:335-342.
[4]ZHANG Y, YU W, SHEN M, et al.Differentiation of achondroplasia and other similar genetic dwarfism by FGFR3 gene analysis[J].Chinese Journal of Medical Genetics, 2000, 17 (4) :252-255.
[5]NI JH, LU G, WANG W, et al.Detection of fibroblast growth factor receptor 3 gene mutation at nucleotide 1 138 site in congenita achondroplasia patients[J].Chinese Journal of Medical Genetics.2002, 19 (3) :205-208.
[6]ZHU B, DONG QM, HUANG XH, et al.Mutation analysis of fibroblast growth factor receptor 3 gene in an achondroplasia family[J].Chinese Journal of Medical Genetics, 2003, 20 (5) :373-375.
[7]ZHANG SR, ZHOU XQ, REN X, et al.Ser 217 Cys mutation in the IgⅡdomain of FGFR3 in a Chinese family with autosomal dominant achondroplasia[J].Chinese Medical Journal (Engl) , 2007, 120:1017-1019.
[8]ZHANG Q, JIANG HO, QUAN QL, et al.Mutation analysis of FGFR3 gene in a family featuring hereditary dwarfism[J].Chinese Journal of Medical Genetics, 2011, 28 (6) :705-707.
[9]FRYNS JP, KLECZKOWSKA A, VERRESEN H, et al.Germinal mosaicism in achondroplasia:a family with 3 affected siblings of normal parents[J].Clin Genet, 1983, 24:156-158.
多基因系统发育分析 篇6
贻贝属常见的有5个种,分别为Mytilus edulis、紫贻贝(M.gallprovincialis)、盖勒贻贝(M.trossul-us)、加州贻贝(M.californianus)和厚壳贻贝(M.coruscus)。M.edulis主要分布于西欧和北美洲东部,紫贻贝主要分布于地中海、西欧、加利福尼亚及东亚,而盖勒贻贝则分布于波罗的海、西伯利亚、加拿大东部及北美西部。几乎在这些种类分布重叠的区域均发现了杂交现象,引起了很多关于贻贝分类地位的讨论[2]。
有关厚壳贻贝的研究相对较少,SCARLATTO[3]首次报道了来自于亚洲太平洋沿海的厚壳贻贝。遗传学方面仅见SHEN等[4]采用线粒体DNA COI基因序列对厚壳贻贝2个养殖群体与2个野生群体遗传多样性的研究报道。加州贻贝主要分布于北美西部沿海及南美等地区,其主要在潮间带生活,个体相对比较大。中国沿海主要有紫贻贝和厚壳贻贝分布。黄渤海盛产紫贻贝,大连的紫贻贝产量居中国之首,人工南移后,东海和南海也有一定产量。厚壳贻贝分布于黄渤海和东海。迄今对贻贝属不同物种之间的进化关系尚不明确。
线粒体DNA(mtDNA)是一种共价闭环双链DNA分子,由于其具有遵循严格的母系遗传、几乎没有重组、结构简单、进化速度快以及在不同的区域进化速度存在差异等优点,逐渐成为种群遗传学和分子系统发育研究的重要标记[5]。细胞色素氧化酶I亚基(cytochrome oxidase subunit I,COI)是线粒体氧化呼吸链的重要成员,由于COI基因变异较大[6],其序列已被广泛应用于贝类的种质鉴定[7]、种群遗传结构分析[8]和分子系统发育分析[9]等研究。线粒体16S rRNA基因是非编码蛋白质基因,由于未受密码子编码的选择压力影响,其大部分区域发生的变异为中性突变[10],加之16S rRNA基因进化速度适中,因此常被应用于不同阶元物种的系统进化和分类研究[11]。该研究运用线粒体COI与16S rRNA基因部分序列对不同贻贝物种进化关系进行了探讨,以期为进一步的遗传分析、种质鉴定和系统进化研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所用的2个野生紫贻贝样品于2008年10月采自青岛花石楼东侧中潮区,另3个于2009年2月采自大连金州;2个厚壳贻贝于2009年4月采自浙江温州平阳南麂列岛海域,另3个于2009年7月采自福建福鼎。取样品闭壳肌组织置于95%乙醇溶液中固定,保存备用。贻贝属其他种类及外群[翡翠贻贝(Perna viridis)和条纹隔贻贝(Septifer virgatus)]的序列信息来自GenBank(表1)。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA提取
取约100 mg贻贝闭壳肌组织,采用标准的酚-氯仿方法[12]提取基因组DNA,将乙醇沉淀后的基因组DNA加入100 μL TE溶液溶解,置于4 ℃下保存备用。
1.2.2 目的片段的PCR扩增、纯化
使用无脊椎动物通用COI引物COI-F(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG)和COI-R(5’-TAAACTTCAG-GGTGACCAAAAAATCA-3’)[13]扩增了贻贝类线粒体COI基因片段。用于扩增16S rRNA基因片段的引物序列为16S rRNA-RA:5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’;16S rRNA-RB:5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’[14]。PCR反应体系总体积为50 μL,每个反应体系内含10×PCR缓冲液[200 mmol·L-1 Tris-HCl,pH 8.4;200 mmol·L-1 KCl;100 mmol·L-1 (NH4)2SO4;15 mmol·L-1 MgCl2] 5 μL,dNTP 200 μmol·L-1,上、下游引物各0.2 μmol·L-1,Taq酶1.25 U(大连宝生物公司出品),DNA模板20 ng,加Milli-Q H2O至50 μL。应用Eppendorf热循环仪进行PCR反应,COI基因反应条件为94 ℃变性40 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共35个循环。反应前94 ℃预变性4 min,反应后72 ℃延伸7 min。16S rRNA的扩增条件为95 ℃变性45 s,50 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,共35个循环。反应前95 ℃预变性3 min,反应后72 ℃延伸10 min。
为排除DNA污染,以上反应均设有阴性对照。取2 μL PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增效果加以检测(U=5 V·cm-1)。应用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海华舜)对PCR扩增产物进行回收纯化。
1.2.3 目的片段序列测定
应用ABI公司3700型全自动DNA序列分析仪进行双向测序以确保结果的准确性,测序反应采用的引物与PCR反应一致。
1.3 数据分析
应用DNAStar软件(DNASTAR,Inc)中的SeqMan软件对正反序列进行组装,得到COI和16S rRNA基因片段的一致序列。用EditSeq对所得到的序列进行编辑和分析,使用无脊椎动物线粒体遗传密码从第1个碱基开始把扩增的COI基因片段翻译成氨基酸序列;用MegAlign对序列进行比对,并计算序列差异百分比。用MEGA 2.0[15]统计变异位点数和转换(Ts)颠换(Tv)位点数,计算Ts/Tv以及简约信息位点(parsim-informative site)数。
利用PAUP*4.0b10[16]计算COI序列碱基组成及对序列碱基组成的异质性进行卡方检验(chi-square test,χ2)。用PAUP*4.0b10和Modeltest 3.7[17]得到COI和16S rRNA基因片段核苷酸最佳替换模型。使用PAUP*4.0b10和MrBayes 3.0[18]软件,应用距离法(NJ)、最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和贝叶斯演绎法(Bayesian Inference,BI)分别重建了系统发育树。前3种方法在PAUP*4.0b10中进行,邻接法分析采用 K2P距离建树;在重建贝叶斯发育树时,同时建立4条马尔科夫链,其中3条热链和1条冷链;共预算10×104～20×104代,对每100代进行1次抽样。然后根据对数似然值老化曲线,忽略动态抽样(这里取前2 500次),对剩余的树在PAUP*4.0b10里计算合意树和各分支的后验概率。同时对2个片段进行贝叶斯联合模型分析,采用分划同质性检验(partition homogeneity test)[19]评价序列片段联合分析的可靠性。对COI片段的1、2和3密码子及16S rRNA基因片段分别运用MrModeltest 2.0[20]软件获得最适合该研究序列矩阵的核苷酸替代模型及相关参数,选择最佳的分区策略,联合各个片段构建系统发育树。该研究采用了4种不同的分区策略(表2),所有的分区策略均用大写字母P表示,数字下标表示分区的数目。
2 结果
2.1 DNA序列组成及变异
5种贻贝COI基因片段同源序列为432 bp。在432 bp比对位点中有121个变异位点,107个简约信息位点;A、T、C和G的含量分别为26.4%、35.0%、16.8%和21.7%,A+T含量61.4%,具有明显的AT偏倚。转换/颠换的平均值2.79,转换主要为TC转换,但在颠换中,TA颠换与CG颠换基本一致。异质性检验表明密码子3个位点的组成均是同质的:第1位点χ2=75.218,df=63,P=0.139;第2位点χ2=50.226,df=63,P=0.878;第3位点χ2=42.428,df=63,P=0.978。COI的同质性表明该研究所用的数据不会对系统树的构建产生负面影响。
5种贻贝16S rRNA基因总长为460 bp。在460 bp长度片段中有68个变异位点,包含了56个简约信息位点;A、T、C和G的含量分别为29.6%、30.6%、15.8%和24.0%,A+T含量60.2%,具有明显的AT含量偏倚。转换/颠换的平均值2.53,TC和AG转换基本一致,但在颠换中,主要发生的是TA颠换,而CG颠换很少发生。
2.2 遗传分化
贻贝属种间的COI和16S rRNA基因的遗传距离见表3。基于COI和16S rRNA基因片段得到物种间遗传距离分别为0.014～0.219和0.006～0.078。紫贻贝与M.edulis之间的遗传距离最小,基于COI与16S rRNA片段分别为0.014和0.006,而M.edulis与厚壳贻贝之间的遗传距离最大,达到0.219(COI)和0.078(16S rRNA)。加州贻贝与厚壳贻贝遗传距离为0.127(COI)和0.023(16S rRNA),小于与其他贻贝间的遗传距离。
该研究结果显示,在COI蛋白质编码基因片段中,检测到的大部分突变都是同义突变(synonymous substitution),其中最普遍的核苷酸替代模式是发生在密码子第3位点上的转换,其次是密码子第3位点上的颠换和密码子第1位点上的无义转换。氨基酸水平上,在COI基因长度为143个氨基酸序列上,仅在M.edulis序列上检测到1处氨基酸替代(amino acid substitution)。
根据核苷酸替代速率公式R=K/2T,K为每个位点的核苷酸替代数,T为2基因的分歧时间,在分歧时间一定的条件下,核苷酸替代速率与K成正比。2个线粒体基因组片段的核苷酸替代数COI>16S rRNA,如紫贻贝与厚壳贻贝间COI(0.203)>16S rRNA(0.070)。贻贝类COI基因片段的替代速率快于16S rRNA(表3)。
以上新世中期(大约350万年前)白令海峡首次开放作为盖勒贻贝与北大西洋M.edulis群体分化的分子钟标准[21],基于COI及16S rRNA基因片段计算推测,则M.edulis大约在498万～827万年前最先与厚壳贻贝分化,然后与加州贻贝约在427万～753万年前分化,最后与紫贻贝在31.8万～63.6万年前分化。分化事件主要发生在晚中新世(Late Miocene)、早上新世(Early Pliocene)及晚更新世(Late Pleistocene)。
2.3 系统发育分析
2.3.1 COI与16S rRNA基因片段分析
基于COI和16S rRNA基因序列,应用NJ、MP、ML和BI分别重建了系统发育树(图1和图2),得到的系统发育树拓扑结构基本一致,节点的支持率很高。5种贻贝属种类分为2个单系群(A和B),单系群A包括贻贝属的M.edulis、紫贻贝和盖勒贻贝;单系群B包括厚壳贻贝和加州贻贝。其中加州贻贝与厚壳贻贝首先聚为1支,M.edulis与紫贻贝聚为1支再与盖勒贻贝聚类。M.edulis与紫贻贝的亲缘关系最近。
2.3.2 COI与16S rRNA序列联合模型分析
对COI和16S rRNA 2个基因片段进行贝叶斯联合模型分析,以得出正确的进化信息,构建更为合理、正确的系统发育树。用PAUP软件对COI和16S rRNA 2个基因片段采用分划同质性检验(partition homogeneity test)[19],评价联合分析的可靠性,结果P值为0.07,说明可将2个基因片段进行联合分析。联合数据共包含901个碱基,不同分区的最适模型见表4。由于每个贝叶斯联合模型分析所得到的系统树拓扑结构几乎完全一致,该研究以P3生成的贝叶斯树(图3)来讨论贻贝属系统进化关系。其结果与运用2个基因片段独立分析的结果基本一致,并且具有较高的后验概率。即加州贻贝与厚壳贻贝先构成1支,再与M.edulis、紫贻贝和盖勒贻贝构成的分支聚类。
3 讨论
一般认为,在线粒体基因组中,12S rRNA和16S rRNA基因进化速率比较低[22]且相对保守,而COI基因变异性较大,在不少无脊椎动物中检测到了较大的遗传变异[23]。从该试验的结果可以看出,在长度为460 bp的16S rRNA片段中,5种贻贝共检测到68个碱基变异,而在长度为432 bp的COI基因片段中,共检测到了121个碱基的变异。由此可见,在5个贻贝种类中COI基因的进化速率比16S rRNA基因快。贻贝类线粒体COI和16S rRNA基因在不同贻贝种间多态性明显差异,证实了COI和16S rRNA基因序列均普遍适用于贻贝类种以上阶元的系统发育分析。该研究结果显示贻贝2基因片段的A+T含量基本一致,分别为61.4%和60.2%,都明显高于G+C含量,这一结果与其他学者在头足类、甲壳类和双壳贝类等的16S rRNA、12S rRNA和COI基因研究结果一致[24,25,26],较高的AT含量应为无脊椎动物线粒体DNA中的普遍现象[27]。
该研究讨论了贻贝属种间的系统进化关系。贻贝属的广泛分布及生存环境对其贝壳外形的影响使该属的分类非常混乱[28]。在贻贝分类研究方面,国外做了大量的报道[29,30,31,32],特别是M.edulis、紫贻贝和盖勒贻贝的形态极其相似而难以区分。随着分子生物学的迅速发展,分子标记被广泛应用于贻贝类的分类研究。KOEHN等[33]通过5个同工酶基因位点对北美东部地区的贻贝进行了研究,认为M.edulis、紫贻贝和盖勒贻贝是不同的物种。McDONALD等[28]开展了贻贝的同工酶分析和形态特征研究,多元统计分析结果表明这3种贻贝构成了1个大的类群,但每种贻贝在遗传和形态表型上都各自独立。
该研究分析结果与McDONALD等[28]对3种贻贝进行的形态学和生物学研究结果一致。这3种贻贝在NJ树、MP树、ML树及BI树中形成1个单系群。3种贻贝进化关系分析表明M.edulis和紫贻贝最相似,而两者与盖勒贻贝距离稍远,盖勒贻贝形成了1个单系,且节点支持率较高(>80)(图1～图3)。M.edulis和紫贻贝间的遗传距离0.014(COI)和0.006(16S rRNA)小于紫贻贝种内个体间遗传距离0.021(COI)和0.007(16S rRNA),而且在聚类树中先聚为1个分支(图1～图3)。盖勒贻贝与M.edulis的净遗传距离为15.4%(COI),这与RIGINOS等[34]得出的紫贻贝与盖勒贻贝间遗传差异17.1%(4.89%/MY)相近。宋文涛等[35]基于线粒体基因组全序列、蛋白编码基因和rRNA基因构建的16种双壳贝类系统树中,M.edulis先与紫贻贝聚类再与盖勒贻贝聚在一起,这与该研究结果一致。HILBISH等[36]开展了贻贝类反热带分布起源研究,3种贻贝的聚类结果与该研究结果基本一致,盖勒贻贝单独1支,但M.edulis与紫贻贝个体有交叉。GERARD等[37]应用16S rRNA与COI序列对南北半球贻贝分化进行研究,也得到了类似的研究结果。
然而,该研究结果与沈玉帮等[38]运用16S rRNA及WENNE和SKIBINSKI[39]运用线粒体DNA限制性内切酶方法对这3种贻贝的进化关系的研究结果存在差异,2项研究均显示M.edulis与盖勒贻贝亲缘关系最近,遗传距离最小。与沈玉帮等[38]研究结果的差异可能是由于其用于分析的16S rRNA基因片段长度仅为282 bp,而该研究中用于分析的该基因片段长度为469 bp,且结合COI片段并进一步对2个基因片段进行贝叶斯联合模型分析,在一定程度上能更为全面、准确地反映其遗传信息。与WENNE和SKIBINSKI[39]研究结果的差异可能是由于在其研究中未将mtDNA 2种基因型(F型与M型)[40]加以区分,M.edulis与盖勒贻贝均有高频率的个体异质性导致两者相近。
VARVIO等[41]运用酶电泳法结合地质古生物(geological-palaeontological)认为紫贻贝是在更新世起源于地中海,从M.edulis的祖先进化而来,且2个种在形态上存在差异,从细胞遗传上亦可区分,推测盖勒贻贝可能是起源于北部的更为普遍古老种类的残余体(relict)。
分子钟假说认为,某一特定的大分子在所有的世系(lineage)中,核苷酸替代速率在时间上是稳定的。基于无脊椎动物的研究数据,以350万年前白令海峡开放作为分子钟标准[21],则M.edulis大约在498万～827万年前最先与厚壳贻贝分化,然后与加州贻贝在427万～753万年前分化,该结果与ORT和POGSON[42]关于M.edulis类与加州贻贝分化年代的结果相近(7.64～7.61 MYA),最后与紫贻贝在31.8万～63.6万年前分化。分化事件主要发生在晚中新世(Late Miocene)、早上新世(Early Pliocene)及晚更新世(Late Pleistocene)。
在线粒体中,COI和16S rRNA基因进化速率相对比较慢,为了更准确地确定贻贝属的系统发育关系,还需结合地理学、生态学及古生物学等方面的资料进行综合分析,其属内系统分化尚有待进一步研究。