CD34+造血干细胞

CD34+造血干细胞（共4篇）

CD34+造血干细胞 篇1

摘要：目的 研究不同剂量电离辐射对人造血干细胞CD34+的损害及其机制。方法 采集健康人脐带血, 分离培养得到CD34+造血干细胞, 分为对照组和辐射组。分别用1、2、5 Gy的X线对辐射组细胞进行照射后继续培养24 h后进行对比, 检测细胞增殖活性, 测定各组内ROS水平并定量测定各组细胞内caspase-3和Nrf-2水平。结果 用1、2、5 Gy的电离辐射对CD34+造血干细胞进行照射后, 细胞活性降低, ROS释放量增高, 细胞内caspase-3、Nrf-2蛋白相对表达量升高, 且这种作用与电离辐射剂量相关。结论 电离辐射可诱导CD34+造血干细胞损伤, 损伤作用很可能与细胞凋亡和氧化应激作用相关。

关键词：造血干细胞,电离辐射,活性氧,Nrf-2

放疗是对肿瘤疾病进行治疗的重要方法之一, 但射线在杀死肿瘤细胞的同时也损伤了正常细胞。造血干细胞 (HPCs) 很容易受到辐射损伤。研究表明电离辐射可以诱导HPCs产生大量的活性氧 (ROS) , 引起HPCs氧化应激, 从而引起细胞内基因发生突变, 影响细胞正常的增殖和分化, 甚至发生癌变[1,2,3]。Nrf-2是一种细胞因子, 它与氧化应激反应密切相关, 可以保护正常的细胞不受其破坏[4]。ROS和caspase-3参与了细胞凋亡的过程[5,6]。本研究分析治疗剂量下不同剂量电离辐射对造血干细胞CD34+的损害及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均由美国Gibco公司提供;CD34+细胞选择试剂盒、MTT试剂盒、AV/PI双染试剂盒、ROS检测试剂盒等均购于上海碧云天生物科技有限公司;caspase-3和Nrf-2的一抗和二抗购于武汉博士德生物科技有限公司。

1.2 HPCs的分离培养

脐带血由陕西省人民医院检验科采集。供者身体健康, 无遗传病史及传染病史。供者知情同意。从脐带血中分离培养CD34+细胞 (每次采集脐血100 m L) 。采用磁珠细胞分选免疫磁性吸附柱分离装置, 用CD34+细胞选择试剂盒按其说明进行CD34+细胞的分离与纯化, 培养21 d。

1.3 辐射组HPCs的处理

将培养的HPCs-CD34+细胞分为辐射组和对照组, 对辐射组进行X射线照射, 剂量分别为1、2、5 Gy。电离辐射后24 h和对照组一起送实验室检测, 对照组未经照射。

1.4 实验室检测

细胞活性检测采用MTT法。先将1 mg/m L的MTT加入各组细胞内, 37℃下培养3 h后, 倒掉培养液, 加入二甲基亚砜, 置于酶标仪 (美国Bio-Tek公司) , 并在550 nm波长下测定各组细胞的吸光度, 结果以百分比表示。

ROS水平测定用流式细胞仪检测, 电离辐射作用6 h和24 h后, 每个样本收集大约5×105细胞, 然后向各试验孔内添加50μm的H2DCFDA, 37℃条件下避光染色30 min, 之后收集各孔内细胞, 用PBS液清洗后重悬, 用流式细胞仪 (美国BD公司) 进行检测, 调整激发波长至490 nm, 发射波长为527 nm, 最后用Cell Quest软件分析荧光相对强度。

1.5 统计学方法

所有数据均重复测量三次。计量资料采用±s表示, 多组间均数比较采用单因素方差分析, 任意两组之间均数比较采用t检验。使用统计学软件SPSS20.0进行统计学处理, 以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞存活率及ROS释放量的比较

辐射组及对照组HPCs的细胞存活率检测结果如表1所示, 辐射导致存活细胞百分比逐渐下降, 这种下降和辐射剂量相关, 对照组与辐射组中的各组比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。对各组细胞内ROS释放量进行了测定, 当HPC经电离辐射诱导24 h后, 细胞内ROS释放量增多, 1 Gy组和2 Gy组与对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 而5 G组的ROS释量与对照组并无明显差异 (P>0.05) 。

注:与对照组比较, *P<0.05。

2.2 两组caspase-3、Nrf-2蛋白相对表达量测定结果比较

辐射组中各组的caspase-3、Nrf-2蛋白相对表达量较对照组均有增加且差异均有统计学意义 (P<0.05, 表2) 。

注:与对照组比较, *P<0.05。

3 讨论

血液系统损害是电离辐射损害的重要表现之一, 尤其造血干细胞对电离辐射特别敏感。有报道称治疗剂量的电离辐射会诱导造血干细胞发生不同程度的损伤[7]。造血干细胞具有自我更新及多向分化的潜能, 在一定条件下可分化为多种血液细胞, 对人体的重要性不言而喻。从前对于造血系统辐射损伤的研究多是大剂量照射后的损伤研究, 对治疗剂量的辐射损伤研究较少[8]。本次研究采用1、2、5 Gy三种辐射剂量, 这是在肿瘤疾病的放疗中常常采用的剂量[9]。

活化氧 (ROS) 是由分子氧转化来的, 在抗炎抗菌等方面发挥作用。正常情况下机体细胞内的ROS水平稳定在一定范围内, 当电离辐射照射造血干细胞后会引起细胞内ROS活性的上升, 推测原因可能是因为受到电离辐射后大量细胞死亡, 为了避免发生凋亡, 未死亡的细胞就会增殖, 而在增殖的过程中细胞就会产生ROS, 从而导致线粒体功能障碍, 最终导致细胞损伤。有实验证明成熟的造血干细胞CD34+在增殖过程中产生的ROS水平高, 而未成熟的造血干细胞CD34+在增殖过程中产生的ROS水平低, 二者有明显差异[10]。但是在本次研究中我们发现在5 Gy剂量电离辐射下, 造血干细胞CD34+的ROS水平与对照组基本持平, 可能是在高剂量的电离辐射下, 细胞内的某种抗氧化机制被激活导致的[11]。

Caspase-3在细胞凋亡过程中的作用十分重要, 在凋亡信号传导的多种途径中发挥作用。正常情况下caspase-3以酶原 (32KD) 的形式存在于胞浆中, 当细胞凋亡时caspase-3被激活, 活化的caspase-3可以使胞浆胞核底物发生裂解, 从而导致细胞凋亡。本次研究通过对caspase-3定量测定, 证实了治疗剂量的电离辐射能够诱导造血干细胞产生较多的caspase-3, 当caspase-3的活性增强时细胞就会逐渐走向凋亡[12]。

核因子相关因子2 (Nrf-2) 是一种转录因子, 参与线粒体呼吸链的核编码组分的协调调节, 参与细胞周期控制、蛋白质合成和细胞代谢的调节。Nrf-2参与了细胞的氧化应激反应, 细胞内的抗氧化基因可以被Nrf-2激活并表达, 起到对抗细胞氧化的作用[13]。本次研究证实, 治疗剂量的电离辐射也会导致造血干细胞CD34+的损伤。

CD34+造血干细胞 篇2

法, 用于临床移植的造血干细胞 (HSC) 来源有外周血、骨髓和脐血。大量临床研究表明, 外周血造血干细胞移植 (PBSCT具有供者不麻醉, 患者易接受;可获得较多造血干细胞数, 造血以及免疫重建快, 因此发生感染、出血的机会减低, 同时, 需要输血减少也会减少GVHD的发生和严重程度。移植后造血功能的重建主要取决于输入HSC的数量和质量[1], 输入的移植物中必须含有足够数量的造血干细胞才能保证移植受者获得快速持久的造血重建。因此, 临床上快速而准确地检测移植物中造血干细胞水平, 能够确保移植成功, 在造血干细胞移植中有重要意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2006年4月-2012年8月, 32例患者 (男18例, 女14例, 中位年龄32岁) 在我院进行外周血造血干细胞移植。25例自体、7例异基因 (5名父系供者, 2名同胞供者, 男5例, 女2例, 中位年龄28岁) 接受rh G-CSF 5μg.kg-1, 皮下注射, 第5天上午给予rh G-CSF 2小时后用全自动血细胞分离机以MNC程序进行PBSC采集。32例患者均进行MNC计数、CD34+细胞计数。最低限MNC>4×108/Kg, CD34+细胞细胞数>4×106/Kg, 比较两种计数指标对造血重建的影响。

1.2 MNC检测

将EDTA抗凝的造血干细胞移植物应用全自动血细胞分析仪 (美国贝克曼公司生产LH-755) 进行干细胞计数 (WBC×109/L) , 同时做移植物涂片两张, 用贝索公司生产的瑞氏-姬姆萨染液染色, 在显微镜下分类计数MNC, HSC直径8um, 胞体圆形, 胞浆量极少。两次计数200个有核细胞, 取均值。计算公式:MNC计数 (108/kg) =WBC×MNC%×移植物容积/受者体重。

1.3 CD34+细胞检测

采用BDFACSCalibur型流式细胞仪 (美国BD公司) 检测, PE一抗CD34+细胞单抗为法国Immunotech公司产品, 按常规测定计算CD34+细胞计数 (106/kg) 。

2 结果

2.1 输入MNC和CD34+细胞数

(1) 32例受者输入MNC的中位数为6.75 (2.92-18.76) ×108/Kg, 输入CD34+细胞的中位数5.03 (2.35-15.14) ×106/Kg; (2) 32例受者造血重建均达到了100%。

2.2 MNC组和CD34+细胞组造血重建时间 (见附表)

附表MNC组和CD34+细胞组造血重建时间的比较

项目MNC组CD34+细胞组ANC>0.5×109/L时间+9d (+9-+14) +9d (+9-+21) PLT>20×109/L时间+11 d (+9-+42) +11 d (+9-+38) 植活率100%100%

*中位数 (范围, d) *ANC=中性粒细胞计数*PLT=血小板计数。*ANC>0.5×109/L和PLT>20×109/L为造血功能重建的标准。

3 结论

CD34+表面抗原是造血干细胞重要标记之一, 检测方法是流式细胞术 (FCM) [2]。但部分单位不具备购买流式细胞仪的条件, 不能检测, 另外, FCM检测CD34+细胞的方法缺乏统一标准, 在不同实验室的结果会有很大差异。实践证明, 动员后供者外周血MNC与CD34+细胞计数呈显著正相关, MNC与CD34+细胞同步增加, MNC可用来估计外周血CD34+细胞的水平[3]。MNC计数不用流式细胞仪, 仅用显微镜及全自动细胞分析仪两种仪器即可, 具有设备要求低、结果准确、稳定、操作省时等优点[4]。本组一例女性急性髓性白血病患者, 检测CD34+细胞数未达到快速造血重建的数量, 而MNC计数已达到造血重建的数量, 根据经验我们未增加采集次数, 该受者移植后造血功能重建顺利。该现象提示, 单独应用MNC计数能可靠预示造血重建。因此, 用MNC计数取代CD34+细胞计数来作为造血干细胞移植中造血干细胞含量的指标是完全可行的。

摘要：目的 探讨造血干细胞移植中单个核细胞 (MNC) 计数与CD34+细胞细胞计数之间的比较。方法 2006年4月-2012年8月, 32例患者 (男18例, 女14例, 中位年龄32岁) 在我院进行外周血造血干细胞移植。25例自体、7例异基因 (5名父系供者, 2名同胞供者, 男5例, 女2例, 中位年龄28岁) 接受统一的动员方案, 用全自动血细胞分离机以MNC程序进行外周血造血干细胞 (PBSC) 采集。32例患者均进行MNC计数及CD34+细胞计数, 进行相关分析, 比较两种计数指标对造血重建的影响。结果 ①32例受者输入MNC的中位数为6.75 (2.92-18.76) ×108/Kg, 输入CD34+细胞的中位数5.03 (2.35-15.14) ×106/Kg;②32例受者造血重建均达到了100%。。结论 MNC作为造血干细胞含量的计数依据, 其植活率和植活速度与CD34+细胞作为依据的病例相似, 结果表明:MNC计数完全可代替CD34+细胞计数, 可作为造血干细胞移植中造血干细胞含量的指标。

关键词：造血干细胞移植,单个核细胞,CD34+细胞

参考文献

[1]Bensinger WI, Longin K, Appelbaum FR, et al.Peripheral bloodstem cells (PBSCs) collected after recombination human granulocytecolony-stimulating factor (rhG-CSF) :an analysis of factorscorrelating with the tempo of engraftment after transplantation.Br JHematol, 1994, 87:825-831.

[2]张之难, 杨天楹, 郝玉书.血液病学 (下册) [M].北京:人民卫生出版社, 2003:2011-2059.

[3]温丙昭, 李玲, 丁凌录, 等.供者单采外周血中幼稚粒细胞检测的研究[J].白血病, 2000, 9 (3) :136-138.

CD34+造血干细胞 篇3

关键词：化疗后骨髓抑制/中医药疗法,@龟鹿二仙胶/治疗应用,小鼠

近年来临床应用发现,滋阴益气补阳法不仅能明显减轻肿瘤患者化疗后免疫功能低下,还有缓解血红蛋白、血小板减少的作用,能有效减轻肿瘤患者化疗后骨髓抑制。为进一步探讨其对骨髓造血功能的影响,对荷瘤小鼠应用该法组方的龟鹿二仙胶治疗后骨髓CD34+细胞凋亡及其凋亡相关基因Cyt-C、bcl-2mRNA的表达进行了实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～8周龄昆明种小鼠,体重(20±2)g,接种正常传代的肝癌细胞H22后备用,浙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2 实验药物

滋阴益气补阳方药龟鹿二仙胶:由鹿角胶6g、龟板9g、人参9g、枸杞子15g等组成,煎汁,过滤,浓缩至100%浓度,使每毫升含生药1克,分装,置4℃冰箱备用,批号:20050926,上述工作委托浙江省中医院制剂室专业人员制剂。环磷酰胺(CTX):0.2g/瓶,江苏恒瑞医药股份有限公司产品,批号:05021121。

1.3 实验设备与试剂 EPICS XL流式细胞仪:

BD公司。Dynal磁珠聚集器:BD公司。FFG02HSD PCR仪:Techne。DYY-6B型稳压稳流电泳仪:北京市六一仪器厂。ultrospec3300pro微量核酸测量仪:Amershan。凝胶成像分析系统:he Bio-RadGel Doc TM EQ170-8060。全自动酶标仪:PYNATECH。78HW-1恒温磁力搅拌器:杭州仪表厂。AnnexinV-FITC(膜联蛋白-V-FITC):联科生物技术有限公司。Dynal M2450 CD34免疫磁珠阳性选择系统:Dynal产品。DNA marker:北京赛泰克生物科技有限公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成提供。

1.4 方法

1.4.1 实验分组及造模给药

荷瘤小鼠72只,随机分成6组,每组12只。高剂量组:腹腔注射CTX10mg/kg,灌胃中药19g/kg;中剂量组:腹腔注射CTX 10mg/kg,灌胃中药9.5g/kg;低剂量组:腹腔注射CTX10mg/kg,灌胃中药4.75g/kg;单纯CTX组:腹腔注射CTX10mg/kg,灌胃生理盐水0.3ml;单纯中药组:腹腔注射生理盐水0.2ml;灌胃中药19g/kg;生理盐水组:腹腔注射生理盐水0.2ml,灌胃生理盐水0.3ml。均连续给药9天。

1.4.2 指标测定

第10天颈椎脱臼法处死小鼠,截取后腿胫骨,制备骨髓单细胞悬液。流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞凋亡;RT-PCR法检测Cyt-C、bcl-2mRNA的表达。

1.4.3 统计学方法

数据处理采用SPSS10.0软件包,计量资料用undefined表示;多组间资料比较采用方差分析,多个样本均数间的两两比较:采用one way ANOVA分析。

2 结果

2.1 龟鹿二仙胶对骨髓CD34+细胞凋亡的影响 见表1。

与盐水组及单纯中药组比较△P<0.05,△△P<0.01;与CTX组比较*P<0.05,**P<0.01

2.2 龟鹿二仙胶对骨髓CD34+细胞Cyt-CmRNA、bcl-2mRNA表达的影响 见表2。

与盐水组及单纯中药组比较△P<0.05,△△P<0.01;与CTX组比较*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

中医药对化疗的增效减毒作用越来越受到重视,在化疗同时使用中医药,尽可能利用中医药增加化疗药物杀灭肿瘤细胞的疗效,减轻化疗毒副反应以保证化疗的正常进行是引人注目的研究热点之一。

临床发现,化疗后肿瘤患者往往存在多脏器功能受损,表现为肺脾气虚、肝肾不足、阴阳两亏等现象,故运用滋阴、益气、补阳类中药更符合中医辨证治疗原则[2,3]。龟鹿二仙胶,最早见于明代王三才《医便》一书,为滋阴益气补阳代表方,治“诸虚百损,五劳七伤”。该方由鹿角胶、龟板、人参、枸杞子组成。四药合用,性味平和,入五脏而以肝、肾为主,善通奇经之任、督,生精、益气、养血,阴阳并补。现代研究发现[4,5]龟鹿二仙胶有明显的补血、补肾、壮阳、抗辐射、抗衰老作用;苏晓妹等报道[6]用龟鹿二仙胶改为汤剂(龟鹿二仙汤)治疗各种恶性肿瘤放化疗后白细胞减少症,取得了较好的疗效。提示龟鹿二仙胶有较好的促进骨髓生成作用。

骨髓造血活动与造血干细胞存在密切相关性,髓性造血干细胞具有分化为红细胞系、粒细胞巨噬细胞系、巨核细胞系造血祖细胞的能力。CD34抗原选择性地表达于造血干/祖细胞膜上,是一种特征性标志[7]。最早期的造血祖细胞CD34表达最高,随着细胞的分化、成熟,CD34抗原逐渐减少直至消失。本实验骨髓CD34+细胞早期凋亡结果显示,单纯CTX组(化疗组)FITC+/PI-细胞比例较生理盐水组明显升高(P<0.05),而高、中、低3个剂量组及单纯中药组FITC+/PI-细胞比例较单纯CTX组明显降低,差异有显著性。提示化疗药物CTX诱导CD34+细胞骨髓造血干/祖细胞凋亡,滋阴益气补阳中药对化疗诱导的细胞凋亡有抑制作用,能有效地促进骨髓造血。

机体内存在多条细胞凋亡的信号转导途径,由线粒体细胞色素C途径和死亡受体途径所介导的细胞凋亡是目前研究较多的途径。许多研究结果均表明,线粒体在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用[8,9],是最重要的途径之一,其通过Cyt-C途径诱导细胞凋亡。本实验Cyt-CmRNA表达检测结果显示,加用中药的中、低剂量组Cyt-CmRNA在骨髓CD34+细胞的表达低于单纯CTX组,而高剂量组Cyt-CmRNA表达与单纯CTX组相仿。表明适当剂量的滋阴益气补阳中药对Cyt-CmRNA表达有抑制作用,但大剂量的滋阴益气补阳药对Cyt-CmRNA表达反而无明显抑制作用。两者间相关分析也显示:药物剂量与Cyt-CmRNA表达量之间无直线相关关系。推测滋阴益气补阳中药抑制骨髓CD34+细胞凋亡并非以线粒体细胞色素C途径为主,还存在其他主要调控基因,共同构成一个复杂的调控网络相互作用,共同调节细胞凋亡。

抗凋亡基因bcl-2是Bcl-2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子。被认为是哺乳动物细胞死亡的减毒剂,具有调控细胞色素C释放的功能[10]。bcl-2基因的过量表达对于造血干细胞如同生长因子一样,可促进骨髓造血细胞增殖和修复[11]。本实验bcl-2mRNA表达量检测结果显示,单纯CTX组bcl-2mRNA表达量较生理盐水组(阴性对照)减少;而使用滋阴益气补阳中药的高、中、低三个剂量组及单纯中药组bcl-2mRNA表达量明显升高,差异有显著性(P<0.01)。并且,中药配合化疗高、中、低三个剂量组骨髓CD34+细胞bcl-2mRNA表达量与药物剂量之间存在明显相关性,即滋阴益气补阳中药剂量越大,bcl-2mRNA表达量越高。提示滋阴益气补阳中药能上调骨髓CD34+细胞bcl-2mRNA的表达。此结果与细胞凋亡检测结果相一致,说明滋阴益气补阳中药抑制凋亡的机理可能与上调bcl-2mRNA的表达有关。

总之,本实验结果证实滋阴益气补阳中药(龟鹿二仙胶)能有效抑制化疗小鼠CD34+造血干/祖细胞凋亡,促进骨髓造血。此结果为滋阴益气补阳法临床运用于防治化疗后骨髓抑制提供了有力的实验室依据。

参考文献

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[2]蒋沈君,刘云霞.参芪扶正注射液改善化疗副反应的疗效观察.中国中医药科技,2007,5(14):209.

[3]田卫卫,李晶,黄映红,等.补虚化疗方对化疗小鼠红细胞免疫功能及血液流变学的影响.中国中医药科技,2003,10(2):88.

[4]郑本瑞,罗自文.龟鹿二仙胶的药理学研究.中成药,2000,22(12):860.

[5]潘琦,潘杨,何东初.龟鹿二仙胶治疗虚损衰老临床研究.中国中医药信息杂志,2001,8(8):23.

[6]苏晓妹,秦志丰.龟鹿二仙汤治疗肿瘤放化疗后白细胞减少78例.浙江中医杂志,2003,38(1):12.

[7]Karuse DS,Fackler MJ,Civin CI,et al.CD34+:structure,biology and clinical utility.Blood,1996,87:1.

[8]Fan TJ,Xia L,Han YR.Mitochondrion and apoptosis.Acta BiochemBio-phys Sin,2001,33(1):7.

[9]Lin QS.Mitochondria and apoptosis.Acta BiochemBiophys Sin,1999,31(2):116.

[10]Monaghan P,Robertson D,Amos TA,et al.Ultrastructure localization of Bcl-2protein.J HistochemCytochem,1992,40:1849.

CD34+造血干细胞 篇4

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

3个月龄雄性新西兰大白兔, 体重2.5~3.5 kg, 由第四军医大学动物实验中心提供。将兔随机分为3组, 其中10只为实验组, 接受共培养细胞膜片复合HA移植治疗;10只为BM-MSC对照组, 接受单纯BM-MSC细胞膜片复合HA移植;5只为空白对照组, 不接受任何治疗。

1.1.2 实验试剂及仪器

α-MEM培养基, 青、链霉素 (Gibco, 美国) ;胎牛血清 (FBS, GE Healthcare, 美国) ;Percoll分离液, 抗坏血酸, 地塞米松, 戊巴比妥钠, 羟基磷灰石 (Sigma, 美国) ;谷氨酰胺 (Invitrogen, 美国) ;兔CD34抗体 (Bioss Inc., 美国) ;人重组粒细胞刺激因子 (齐鲁制药, 山东) 。流式细胞仪 (Beckman-Coulter, 美国) , 二氧化碳恒温孵箱 (Thermal, 美国) , 体视显微镜 (Leica MZ9.5, 法国) , 倒置相差显微镜及照相系统 (Olympas, 日本) 。

1.2 方法

1.2.1 兔PB-CD34+细胞的分离

采血前给予兔皮下注射人重组粒细胞刺激因子10μg/kg, 1次/d, 于第5天采血。采用心脏取血的方法, 每只兔取血约80ml。将取得的静脉血与等体积的PBS充分混匀, 采用Percoll分离液分离得到单个核细胞。依据说明书加入抗体标记细胞, 将细胞悬液置于4℃冰箱中孵育30min, 利用流式细胞仪分选PB-CD34+细胞。将分选好的细胞调整密度为1×106/ml, 接种于25 cm2的一次性培养瓶中, 放置二氧化碳孵箱 (5%CO2) 中孵育, 备用。

1.2.2 兔BM-MSC的分离

抽取兔股骨骨髓血, 采用密度梯度离心法分离骨髓血中的MSC[2]。调整细胞密度接种于25 cm2的一次性培养瓶中, 放置二氧化碳孵箱 (5%CO2) 中孵育。24 h后换液, 去除悬浮、未贴壁的细胞, 之后每3 d更换培养液。待细胞生长至80%~90%融合时, 以0.25%胰蛋白酶消化, 按1∶2比例传代培养。

1.2.3 共培养体系的建立

取对数生长期P3 r BM-MSC接种于6孔培养板内, 每孔细胞数量为1×105, 过夜培养贴壁。培养基为含10%胎牛血清的低糖α-MEM培养液, 加入谷氨酰胺2 mmol/L, 青霉素钠和链霉素各100 U/ml。将PB-CD34+细胞加入培养板内, 每孔数量为5×105, 每孔细胞数目之比为PB-CD34+细胞∶BM-MSCs=5∶1。之后1周内培养液不更换, 第2周时培养液每3 d更换1次。共培养14 d后, 弃去未贴壁的细胞。

1.2.4 共培养细胞与单纯BM-MSC成膜诱导

取共培养满14 d的细胞 (于9 cm培养皿中, 2种细胞添加比例同前) 以成膜诱导液 (含10%FBS的α-MEM, 加入地塞米松10 mmol/L、抗坏血酸50μg/ml、谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素钠和链霉素各100 U/ml) 继续培养14 d, 每3 d换液1次。相同方法培养单纯BM-MSC。

1.2.5 细胞膜片复合羟基磷灰石移植物的制备

以眼科镊配合细胞刮刀轻轻地收获细胞膜片。将预先在基础培养液中湿润过夜的羟基磷灰石粉末100 mg轻撒于膜片中央, 小心地将其包裹于细胞膜片中, 再将其放入基础培养液, 置于二氧化碳孵箱中孵育4 h, 使其膜缩收紧团块。分别制备共培养细胞及单纯BM-MSC细胞膜片复合物备用。

1.2.6 兔颅骨极限缺损模型的建立和修复

实验动物均接受1%戊巴比妥钠1 ml/kg静脉注射麻醉。麻醉显效后头部剪毛备皮, 用碘酒、酒精交替消毒皮肤。于颅顶部设计舌形切口, 手术刀切开皮肤、皮下组织, 暴露颅骨, 将骨膜翻起, 以手机钻头比照直径15 mm圆形塑料圆片制备全层缺损, 此过程中持续以生理盐水降温, 并注意保护颅骨下的硬脑膜组织。之后共培养实验组及BM-MSC对照组移植事先制备好的移植物, 去除骨膜组织后小心缝合伤口。空白对照组直接缝合伤口。

1.2.7 观察指标

术后, 所有动物继续饲养8周。术后4、6、8周行CT扫描并三维重建。8周后以过量麻醉剂 (1%戊巴比妥钠2 ml/kg) 处死动物, 收集颅骨标本进行检测。

1.2.7. 1 大体观察

活体触诊动物颅骨修复情况。肉眼观察取出标本缺损区修复情况。

1.2.7. 2 影像学观察

所有实验动物术后4、6、8周给予头颅常规CT扫描, 并行三维重建, 比较各组动物颅骨缺损修复情况。

1.2.7. 3 组织学观察

将标本以4%多聚甲醛固定2d后, 17%EDTA (p H 7.0) 脱钙2周, 流水冲洗2 h, 石蜡包埋, 切片, 常规HE染色。

1.2.7. 4 新生骨定量分析

选择通过标本中心、切面完整、染色清晰的切片, 以图像分析软件 (Image-Pro Plus, Media Cybernetics, 美国) 定量检测染色切片, 计算缺损修复率, 公式为新生骨面积/缺损区面积, 结果以x珋±s标准差表示。

1.2.8 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件分析数据, 2组数据之间比较采用双侧t检验, P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 共培养体系的建立及细胞膜片形成

成功分离出兔PB-CD34+细胞及BM-MSC。共培养14 d后, 倒置显微镜下观察共培养细胞呈复层贴壁生长状态, 细胞形态为成纤维样, 细胞之间的形态无明显差异。2种细胞成膜诱导培养7 d左右开始形成薄膜样物质, 并逐日增厚, 14 d后, 于培养皿底部可见一层白色薄膜即为细胞膜片。以细胞刮刀小心自薄膜边缘沿培养皿底部刮下膜片, 此过程中可以发现膜片具有一定弹性及机械性能。倒置显微镜下观察见膜片内细胞呈梭形, 密集、重叠生长 (图1) 。2种细胞膜片从形态学上无明显差别。

A:剥离的细胞膜片;B:培养14 d后膜片中的细胞

2.2 实验动物情况及大体观察

所有动物均对手术、麻醉耐受良好, 无并发症及术后感染。术后8周, 触诊实验组及BM-MSC对照组动物颅顶部缺损处可触及硬组织生成, 质地无明显区别。空白对照组动物颅顶部可触及明显缺损。肉眼观察标本发现, 实验组及BM-MSC对照组动物颅顶缺损区均有骨性组织生成, 空白对照组动物颅顶部仅见纤维性组织生长。

2.3 常规CT扫描并重建结果

所有实验动物术后4、6、8周给予头颅常规CT扫描并行三维重建。可以观察到:空白对照组仅缺损边缘有少量新骨生长;BM-MSC对照组生成的新骨量明显大于空白对照组, 但所生成新骨大部分位于缺损边缘, 而缺损中央部分并不明显;共培养细胞组缺损边缘及中央均有明显的新骨生成, 且术后8周影像显示, 缺损已基本修复 (图2) 。

2.4 组织学观察及定量分析

所取得的标本均行HE染色检查 (图3) , 结果显示:共培养细胞组的成骨效果明显高于2对照组。以图像分析软件定量检测HE染色切片, 各组新生骨修复率为:空白对照组6.3%±1.2%;BM-MSC对照组为14.7%±2.1%;共培养细胞组为29.5%±5.6%, 共培养细胞组与BM-MSC对照组及共培养细胞组与空白对照组之间的差别均有统计学意义 (P<0.05, 图4) 。

3 讨论

细胞共培养是上个世纪80年代发展起来的新技术, 它是将2种或2种以上的细胞混合置于同一环境中进行培养, 以最大限度地模拟体内环境、维持培养体系性状以及观察细胞之间的相互作用。共培养体系建立的目的在于, 利用一种辅助细胞的存在, 诱导另一种目的细胞的分化、增殖及细胞活性的维持等。由于共培养技术能够更好地模拟细胞在体内的生长环境, 因此取得了比单一细胞培养更好的实验效果。国内外的许多研究已经证实, 共培养的不同细胞之间通过“对话”, 能够起到诱导分化、维持和促进细胞活性等作用。Bhandari等[3]将大鼠肝细胞与成纤维细胞共培养发现, 相比单独培养的肝细胞, 18 d后只有共培养体系的肝细胞仍能保存细胞活性与功能。Sorrell等[4]将人皮肤纤维样细胞与血管内皮细胞共培养后发现, 前者通过释放成纤维细胞生长因子和VEGF-A维持了血管内皮细胞的完整性。

在本实验中, 我们采用了直接接触共培养的方法, 以PB-CD34+细胞为辅助细胞, 以BM-MSC为目的细胞。BM-MSC是目前骨组织工程中的应用最广泛的种子细胞, 其促进成骨的能力已得到众多实验的证实[5,6]。以往CD34+细胞均自骨髓血中获得, 但是近年来, 外周血CD34+细胞越来越受到研究者青睐。主要原因是外周血收集方便, 若应用于临床, 还可以使患者省去麻醉及骨髓穿刺之苦。虽然外周血CD34+细胞数量相对较少, 但应用粒细胞集落刺激因子等细胞因子和/或化疗药物刺激之后, 通常能将足够数量的细胞动员至外周血中。根据相关文献的报道, PB-CD34+细胞具有很强的诱导促进血管发生的作用[7,8], 同时其本身也可以分化为MSC而贴壁生长[9,10]。本文的结果证明, 经过PB-CD34+细胞的诱导, BM-MSC的成骨效应可以进一步增强。

细胞膜片技术最初是为了解决组织工程中种子细胞的流失而产生的, 它的原理是通过各种细胞因子、药物等的诱导, 使被培养的细胞分泌大量的细胞外基质而形成的薄膜状细胞聚合体。这一技术由Okano等[11]于1993年首次报道。由于细胞膜片技术保留了一些重要的细胞表面蛋白, 如细胞与细胞间离子通道、连接蛋白、生长因子受体等[12], 使其拥有很多优点, 包括良好的生物相容性;适宜的机械强度和可操作性;细胞接种成功率高、基质丰富;可量化控制, 能够根据实验的需要调整膜片大小和厚度;可以直接用于组织构建, 也可以联合有效的支架材料一起应用。我们采用将细胞膜片包裹培养液预培养的羟基磷灰石粉末修复颅骨缺损, 既能提高移植细胞的利用率, 又能有效地利用羟基磷灰石的骨诱导活性, 在实验中也取得了良好的修复效果。

另外, 我们的研究还存在一些缺点和不足。首先, 没有使用细胞示踪技术, 进一步证明移植的外源性细胞在成骨中发挥了重要作用。其次, 应用流式细胞仪分选外周血CD34+细胞的成本较高, 限制了其临床应用。

综上所述, 我们通过应用共培养细胞修复兔颅骨极限缺损模型, 验证了共培养细胞可以作为一种优秀的种子细胞应用于骨组织工程。通过运用细胞膜片技术复合HA支架材料, 我们有效地修复了兔颅骨极限缺损, 为临床治疗颅骨缺损提供了一种新的思路和方法。

参考文献

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