群体遗传结构（精选9篇）
群体遗传结构 篇1
剑白香猪原产于贵州省黔东南苗族、侗族自治州, 被誉为“中国香猪之乡”, 由于独特的地理位置和复杂多样的地形地貌, 再加上交通闭塞, 地理隔离以及众多少数民族特有的经济、文化活动等原因, 保留了许多独特的家畜地方品种及类型。1997年5月份, 贵州大学动物科学系从剑河县引进2月龄白香猪进行种质测定, 此后又对其进行纯种选育, 到目前为止已繁育到第10代, 命名为贵州白香猪。研究利用微卫星DNA标记来检测贵州白香猪群体遗传结构, 为该品种早日作为实验动物应用提供可靠的理论数据。
1 材料与方法
1.1 动物
试验猪群来自贵州大学香猪研究所。选育群体 (52头) 、原始种群 (53头) , 共105头, 其中每个家系公母各半。
1.2 引物
采用世界粮农组织 (FAO) 和国际动物遗传学会 (ISAG) 联合推荐的27个微卫星标记, 从中选用17个引物由北京赛百盛公司提供。
1.3 方法
采集耳组织用灭菌剪刀剪碎, 常规酚-氯仿抽提法提取DNA, 紫外分光光度计检测浓度及纯度后进行PCR扩增, 扩增产物用2%的聚丙烯酰胺凝胶 (稳压150 V) 电泳7～8 h, 银染显带, 干胶保存。判断基因型, 带型缺失或模糊的记为0, 进行基因频率的计算。
PCR反应条件:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性45 s, 退火45 s, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环;最后72 ℃延伸7 min。4 ℃保存, 结束程序。
1.4 数据统计及分析
利用PopGen 3.2软件计算贵州白香猪选育群体和原始种群的多态信息含量 (PIC) 和平均杂合度 (H) 等指标。
利用微卫星标记的共显性特征, 根据Falconer DS等提出的公式, 导出近交系数估计公式:
undefined
式中Fx是随机交配群体的近交程度, 可用双亲是同型基因型的概率pm占所有可能基因型概率pi之和的比值来表示。
某个品种在所有微卫星位点的平均近交系数:
undefined
式中Fij为第i个品种在第j个位点的近交系数, n为微卫星位点数。
2 结果与分析
2.1 2个种群在17个微卫星基因座的等位基因数、杂合度及多态信息含量 (见表1)
用PCR技术扩增了27个微卫星标记, 其中17个微卫星位点扩增效果好, 带型清晰, 其等位基因频率、有效等位基因和多态信息含量等统计结果见表1。从表1的结果可以看出, 所检测的2个种群微卫星基因座的平均等位基因数分别为2和4.222 2。共发现等位基因数为76个, 其中36个等位基因为各种群所共有。等位基因最多的为微卫星座位SW632和SW936, 共发现8个等位基因, 最少的只有1个等位基因, 相同的等位基因共有6个座位。13个位点的等位基因均有减少, 4个位点的等位基因没有发生变化。有36个等位基因为2个种群所共有, 占所有等位基因的47.4%, 另外40个等位基因则在各家系间表现出不同程度差别。2个种群17个微卫星基因座的平均杂合度和平均多态信息含量分别为0.418 8, 0.611 8和0.324 9, 0.545 7, 说明通过选种选育后种群与原产地种群差距较大。
2.2 随机交配群体的近交系数分析结果
假定群体均在随机交配的前提条件下, 2个种群在17个微卫星位点上的群体平均近交系数分别为0.560 5和0.388 2。
3 讨论
贵州白香猪在连续10个世代的闭锁繁育、同质选配后, 已形成遗传结构较为稳定的选育群体。从各种群的等位基因组成可以评价其遗传背景。张桂香等[1]采用FAO-ISAG联合推荐的27个微卫星DNA标记对56个中国地方猪品种和3个引进猪种 (杜洛克猪、长白猪、大白猪) 进行遗传多样性分析, 所测得56个中国地方猪种平均等位基因数均高于贵州白香猪2个种群。张青峰等[2]采用9个微卫星DNA标记检测近交系五指山小型猪 (WZSP) 群体遗传结构, 所测得平均等位基因为2.11, 略高于贵州白香猪选育群体的平均等位基因数。以上说明在近交和人工选育过程中丢失了大量的等位基因。说明伴随人工选育过程贵州白香猪各种群产生严重分化与基因分离, 各种群基因型差别趋向明显, 构成独立遗传群体。
多态信息含量是衡量片段多态性的较好指标。樊斌等[3]用27个微卫星座位测得湖北省3个主要地方猪种通城猪、清平猪和阳新猪的平均多态信息含量为0.743 3, 0.683 9, 0.609 4。与其他近交小型猪相比, 牛荣等用21个微卫星座位测得广西巴马小型猪的平均多态信息含量为0.388 1。商海涛等[4]用35个微卫星座位对3品系小型猪进行研究, 所测得贵州小型香猪、广西巴马小型猪和版纳小耳猪近交系的平均多态信息含量分别为0.425 3, 0.352 0, 0.317 1。贵州白香猪的2个种群在17个微卫星座位上的平均多态信息含量分别为0.324 9和0.545 7, 明显低于其他商品猪种, 选育后群体的平均多态信息含量略低于广西巴马小型猪, 接近于五指山小型猪和版纳小耳猪, 属中度或低度多态。表明长期近交和人工选育产生基因分离 (分化成多个家系) 并使部分等位基因丢失、座位多态性降低, 从而使多态信息含量降低。
杂合度又称基因多样度, 反映各亚群体在n个座位上的遗传变异。一般认为它是度量群体遗传变异的一个最适参数。樊斌等用27个微卫星座位测得湖北省3个主要地方猪种通城猪、清平猪和阳新猪的平均杂合度分别为0.748 9, 0.698 7, 0.627 3, 与其他近交小型猪相比, 牛荣等[5]用35个微卫星座位测得版纳小型猪近交系的平均杂合度为0.502 8, 张青峰等采用9个微卫星DNA标记检测近交系五指山小型猪 (WZSP) 群体的平均杂合度为0.384 9, 商海涛等用35个微卫星座位对3品系小型猪进行研究, 所测得贵州小型香猪、广西巴马小型猪和版纳小耳猪近交系的平均杂合度分别为0.402 7, 0.345 4, 0.353 7。贵州白香猪的2个种群在17个微卫星座位上的平均杂合度分别为0.418 8和0.611 8, 其中选育群体与其他商品猪种相比明显较低, 较接近于五指山小型猪、广西巴马小型猪和版纳小耳猪。贵州白香猪的原始种群近交程度本来就比较高, 又由于长期的近交和人工选育产生近交分化, 群体中不断淘汰不利基因, 纯化有利基因, 使群体基因型趋于一致和纯合, 而导致了遗传基因多样性的低水平。
对试验所检测的原始群体与选育群体进行微卫星DNA检测分析, 其等位基因数、平均杂合度、平均多态信息含量和平均近交系数均存在较大的差异, 说明伴随选育过程贵州白香猪原始群体与选育群体产生严重分化与基因分离, 各群体基因型差别更趋明显, 已构成独立的遗传群体。
摘要：为了开发贵州白香猪的利用价值, 试验采用微卫星标记对白香猪选育群体和原始种群的遗传变异进行了检测。结果表明:2个种群的平均等位基因差距较大, 平均杂合度、PIC和平均近交系数均有明显变化, 说明贵州白香猪选育群体已成为一个稳定的遗传群体, 符合封闭群动物的遗传特征。
关键词：贵州白香猪,微卫星,杂合度,多态信息含量 (PIC) ,近交系数
参考文献
[1]张桂香, 王志刚, 孙飞舟, 等.56个中国地方猪种微卫星基因座的遗传多样性[J].遗传学报, 2003, 30 (3) :225-233.
[2]张青峰, 冯书堂, 牟玉莲, 等.微卫星DNA检测近交系五指山小型猪 (WZSP) 群体遗传结构[J].安徽农业大学学报, 2007, 34 (1) :66-69.
[3]樊斌, 李奎, 彭中镇, 等.湖北省三品种猪27个微卫星座位的遗传变异[J].生物多样性, 1999, 7 (2) :91-97.
[4]商海涛, 牛荣, 魏泓, 等.三品系小型猪35个微卫星基因座的遗传学研究[J].遗传, 2001, 23 (1) :17-20.
[5]牛荣, 商海涛, 魏泓, 等.版纳小耳猪近交系5家系35个微卫星座位的遗传分析[J].遗传学报, 2001, 28 (6) :518-526.
群体遗传结构 篇2
对6个牛微卫星座位的遗传变异及多态性分析,以期了解BMY牛和婆罗门牛的`群体遗传结构与育成情况.6个微卫星座位的多态信息含量为在0.524～0.752间,BMY牛、婆罗门牛两个群体的平均期望杂合度和观察杂合度值接近,分别为0.737 6和0.739 6,0 641 2和0.653 7,进入横交固定第二世代的BMY牛期望杂合度值较高,这与我们的育种进展相符.红安格斯的期望杂合度较低(0.460 9)接近日本和牛0.471,暗示红安格斯牛的同质性较高.
作 者：开兴 朱芳贤 吴桂生 聂龙 金显栋 杨国荣 袁希平文际坤 张亚平QU Kai-Xing ZHU Fang-Xian WU Gui-Sheng NIE Long JIN Xian-Dong YANG Guo-Rong YUAN Xi-Ping WEN Ji-Kun ZHANG Ya-Ping 作者单位：开兴,QU Kai-Xing(云南省肉牛和牧草研究中心,昆明,650212;中国科学院昆明动物研究所云南省畜禽分子生物学重点实验室、细胞与分子进化重点实验室,昆明,650223)
朱芳贤,金显栋,杨国荣,袁希平,文际坤,ZHU Fang-Xian,JIN Xian-Dong,YANG Guo-Rong,YUAN Xi-Ping,WEN Ji-Kun(云南省肉牛和牧草研究中心,昆明,650212)
吴桂生,聂龙,张亚平,WU Gui-Sheng,NIE Long,ZHANG Ya-Ping(中国科学院昆明动物研究所云南省畜禽分子生物学重点实验室、细胞与分子进化重点实验室,昆明,650223)
群体遗传结构 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
试验采用典型群随机抽样法, 采集了60份岷县黑裘皮羊 (公羊10头、母羊50头) 的新鲜血样, EDTA抗凝。采样羊只均来自中心产区, 采样个体具有该品种的明显特征。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取
基因组DNA提取参考《分子克隆实验指南》 (第3版) 用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA的方法, 稍加改进。
1.2.2 微卫星标记的选择
采用FAO推荐微卫星引物, 共15对 (见表1) , 可由GenBank查得, 由宝生物工程 (大连) 有限公司合成。
1.2.3 PCR反应条件
PCR反应体系为20 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s, 50～60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共35个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存, 备用。
用10%的非变性PAGE凝胶进行电泳, 然后用银染法进行定影、显色。
1.3 统计分析
使用Excel Microsatellite Toolkit计算等位基因频率、等位基因大小范围。多态信息含量 (PIC) 、杂合度 (He) 和有效等位基因数 (Ne) 用Dispan软件计算。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA的检测
采用常规的酚-氯仿抽提法提取基因组DNA, 用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果见图1。由图1可知, 基因组DNA是1条较为整齐的条带, 亮度较好, 说明提取的DNA纯度较高, 浓度较大, 符合分子生物学试验要求。
2.2 PCR产物的检测
2.2.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测
对选取的15个微卫星座位进行PCR产物扩增, 用2%琼脂糖凝胶电泳检测;结果见图2。从图2中几乎看不出等位基因之间的差别, 这是由于碱基数相差较小, 琼脂糖凝胶电泳无法分辨。特异PCR产物在琼脂糖检测时只会看到1条带, 根据DNA Marker 来判断所扩增产物是否在该微卫星位点的特异性条带区域之内。
2.2.2 PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
根据等位基因扩增片段的大小判断个体的基因型, 分离出1条带的为纯合子, 2条带的为杂合子, 无条带为无效等位基因。15个微卫星座位中73.33%的微卫星座位等位基因数为10～13个。图3和图4为微卫星标记BM6526和BM757在岷县黑裘皮羊中扩增产物的部分聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。通过对电泳结果分析表明, 所选15个微卫星座位的多态性是比较丰富的。
1～11.酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA。
1～6.PCR产物;7.DNA Marker;8.PCR产物。
1～9, 11～21.BM6526位点引物的PCR产物;10.DNA Marker。
1～2, 4～15.BM757位点引物的PCR产物;3.DNA Marker。
2.2.3 微卫星位点等位基因频率
15个微卫星位点的等位基因在岷县黑裘皮羊中的分布及频率见表2。由表2可知:岷县黑裘皮羊在15个微卫星座位上共检测到160个等位基因, 每个座位平均10.67个等位基因, 其中OarFCB128和BM6506位点的等位基因数最多, 为15个, 片段大小分别为101～147, 184～234 bp, 等位基因频率分别为0.048 4～0.161 3、0.032 3～0.177 4;OarAE129位点的等位基因数最少, 为6个, 片段大小分别为145～175 bp, 等位基因频率分别为0.032 3～0.354 8。
2.2.4 微卫星位点的多态信息含量、有效等位基因数及群体杂合度
结果见表3。由表3可知:15个微卫星位点在岷县黑裘皮羊中的平均多态信息含量、平均有效等位基因数及群体平均杂合度分别为0.861 5, 9.248, 0.882 6;OarFCB128位点的多态信息含量、有效等位基因数及群体杂合度最高, 分别为0.910 8, 13.310, 0.924 9;BM8125位点最低, 3个指标分别为0.778 8, 5.379, 0.814 1。说明OarFCB128位点变异最大, BM8125位点变异最小。
3 讨论
岷县黑裘皮羊又称岷县黑紫羔羊, 以生产黑色二毛裘皮著称。首先, 它是资源评价的基础, 因其可以确定品种范围, 判定品种属性;其次, 它可以估计某些基因资源在特定品种或群体中潜在分布的可能性, 以便制订保持或发展品种特性的计划[4] 。对一个品种从外型到基因遗传结构的分析, 有利于对其进行综合评价, 为遗传资源的保护提供可靠的依据[5] 。
研究中所选择的微卫星位点要求尽可能地分布在各个染色体上, 位点的选择还考虑等位基因数的多少, 这样就有可能提供更多的遗传信息。每个位点的等位基因至少在4个以上才能较好地进行遗传分析, 一般选择等位基因数在5～19个为宜, 等位基因数太少, 不能提供足够的信息量, 为以后的分析带来不便。而多态信息含量大于0.7的微卫星为最好的遗传标记, 这是由于此时双亲在该位点通常是杂合的, 在其后代中可以观察到等位基因分离。另外, 扩增产物的片段大小应在100～300 bp之间, 片段太大, 不容易获得扩增产物;太小, 不利于结果的统计分析[6]。研究参考联合国粮农组织 (FAO) 和国际动物遗传学会 (ISAG) 推荐的引物, 选取了其中15个微卫星引物, 试验结果表明15个微卫星位点多态性较好, 可以用于岷县黑裘皮羊的遗传多样性评价。
注:每个微卫星位点的第一行数据为基因的大小, 单位为bp;第二行为基因频率, 单位为%。
等位基因数、有效等位基因数、杂合度和多态信息含量等参数是描述群体内遗传变异的重要指标。等位基因频率是衡量动物群体遗传结构的主要指标之一, 是估计和比较遗传变异的第一步。
多态信息含量是衡量片段多态性的指标。Botstein D等[7]首先提出了用多态信息含量衡量基因变异程度:当PIC>0.5时, 该位点为高度多态性位点;当0.25
基因杂合度又称基因多样度, 反映各群体在多个位点上的遗传变异, 被认为是度量群体遗传变异的一个最适参数。就相同的分子标记而言, 群体平均杂合度的高低反映了群体的遗传一致性程度, 群体杂合度越低, 表明该群体的遗传一致性越高, 而群体的遗传变异越少, 群体遗传多样性越低。研究表明, 岷县黑裘皮羊的平均杂合度为0.882 6, 大于0.5, 说明岷县黑裘皮羊具有较高的群体杂合度, 群体内的遗传变异较大, 群体近交程度弱, 具有丰富的遗传多样性。
参考文献
[1]彭张瑞.岷县黑裘皮羊的品种资源及保护[J].农业科技与信息, 2008 (19) :56-57.
[2]曹红鹤, 王雅春, 陈幼春, 等.五种微卫星DNA标记在肉牛群体中的研究[J].中国农业科学, 1999, 32 (1) :69-73.
[3]BARKER J S F, TAN S G, SELVARAJ O S, et al.Genetic variationwithin and relationships among populations of Asian water buffalo[J].Animal Genetics, 1997, 28:1-13.
[4]常洪.家畜遗传学纲要[M].北京:中国农业出版社, 1995.
[5]GENG S M, SHEN W, QIN G Q, et al.DNA fingerprint polymor-phism of goat populations from China ChaiDaMu Basin, Asian Aus-trala sian[J].Journal of Animal Science, 2002, 8 (1) :127-132.
[6]马雪峰.中国三个地方家兔品种和三个配套系的微卫星DNA遗传多态性研究[D].北京:中国农业科学院, 2006.
群体遗传结构 篇4
为保护人工养殖大黄鱼的种质资源,用15对微卫星标记对来自浙江沿海地区的四个大黄鱼养殖群体共171个个体进行了遗传多样性分析.结果显示,这些标记在四个群体中均表现出丰富的多态性;共检测到206个等位基因;各基因座观测等位基因数7～23个,平均等位基因数13.73,大小在88～318bp之间.四个群体的.平均观测杂和度(Ho)为0.5981～0.6893,期望杂和度(He)为0.7319～0.7944,多态信息含量(PIC)0.7138～0.7836,表明四个养殖群体在所检测位点均具有较好的多态性.对遗传距离的计算结果表明闵粤东群体与反交群体较近,聚类结果中首先聚到一起.本研究首次选择微卫星标记评估人共选育大黄鱼群体的遗传多样性,并采用高精度的377 DNA测序仪进行检测,将对大黄鱼的种质资源保护提供科学依据.
作 者：王文文 常玉梅 梁利群 WANG Wen-wen CHANG Yu-mei LIANG Li-qun 作者单位：王文文,WANG Wen-wen(南开大学生命科学学院,天津,300071)
常玉梅,梁利群,CHANG Yu-mei,LIANG Li-qun(中国水产科学院黑龙江水产研究所,黑龙江,哈尔滨,150070)
群体遗传结构 篇5
关键词：罗布羊,遗传多样性,系统进化,mtDNA D-Loop,微卫星DNA
新疆罗布羊是生存在塔里木盆地中心的罗布泊地区,极适宜荒漠草场、极端干旱气候、耐粗饲、强抗逆的独特地方羊种。罗布羊因世代生活在塔克拉玛干沙漠深处依罗布泊而居的土著民族“罗布人”而得名,2009年被批准列入国家畜禽遗传资源名录。现主要分布在新疆南部尉犁县沿塔里木河下行直到若羌县境内,包括尉犁县的塔里木乡、墩阔坦乡、兴平乡、古勒巴格乡及若羌县的吾塔木乡等地,存栏数2余万只。
罗布羊被毛白色,有少数羊脸颊、嘴巴和耳朵甚至整个脸部为黑色。其头较小,鼻梁拱起,两眼突出,耳大下垂,脂尾。一般公羊有螺旋形大角,个别母羊有小角。成年公羊体重50.36 kg,母羊47.20kg,性成熟年龄12~18月龄,产羔率约120%。表现多胎的性状,肉膻味小、鲜嫩[1]。
罗布羊是在我国西部极端生态环境形成的珍贵地方品种,目前对其遗传资源的评价仅有表型性状的初步研究结果[1,2]。王慧华等利用X染色体上20 334个单核苷酸标记(SNP)对10个中国绵羊群体遗传关系进行了分析,认为罗布羊与多浪羊、哈萨克羊遗传关系较近聚成一类[3],2016年袁泽湖等利用Illumina ovine SNP 50k芯片数据分析了中国11个地方绵羊品种的遗传结构,发现罗布羊与乌珠穆沁羊有间接的遗传关系,与哈萨克系绵羊有较近的遗传关系[1]。但有关新疆罗布羊的群体遗传多样性及形成历史没有相关研究报道。
本研究选择新疆尉犁县罗布羊和新疆南部地方羊种:卡拉库尔羊、多浪羊、策勒黑羊、和田羊及巴音布鲁克羊,利用经典的绵羊微卫星标记和mt DNA D-loop序列研究罗布羊群体遗传多样性及种间系统发育关系,一方面为揭示罗布羊的品种起源与形成及品种的保护利用提供依据,另一方面罗布羊微卫星位点的研究与开发为罗布羊种质特性研究提供基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
采集新疆尉犁县罗布羊种羊场种羊120只(公羊9头,母羊111头)全血样本,用于分析罗布羊群体遗传多样性,及采集阿克苏地区的卡拉库尔羊(Karakul)、喀什麦盖提县的多浪羊(Dolang)、和田策勒县的策勒黑羊(Cele)、和田于阗县的和田羊(Hotan)和库尔勒地区222团的巴音布鲁克羊(Binbuluk)公母各3只全血样本用于克隆测序,分析罗布羊与新疆地方羊种间遗传关系。采样分布见图1。
1.1.2 试剂
全血DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;2×EasytaqPCR Super Mix购自法国Trans Gen公司;p MD19-T载体、DH5α菌株感受态、DNA纯化试剂盒与DNA连接试剂盒购自日本Takara公司;胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉与氨苄青霉素购自德国Sigma公司。
1.1.3 仪器设备
梯度PCR仪TC-5000(TECHNE公司,英国);电泳仪JY-ECPT3000(北京君意东方电泳设备有限公司);凝胶成像系统Gel Doc XR+(伯乐BIO-RAD公司,美国);核酸测定仪3730xl(ABI公司,美国);超净工作台SW-CT-2F(上海博讯实业有限公司);微量移液枪4910(Eppendorf公司,德国);电热恒温水浴锅HH-S(江苏金坛市医疗机械厂);台式高速冷冻离心机Sigma30(Sigma公司,德国);电子分析天平FA2004(上海精密科学仪器公司)。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA制备
每个样本取0.5 m L全血按试剂盒说明提取基因组DNA,提取结果通过琼脂糖凝胶和核酸测定仪检测。
1.2.2 罗布羊遗传多样性分析
选取了位于绵羊6号染色体上的OARHH35、OARJMP8、BMS648、BM143和AE101,26号染色体上的BM6526,25号染色体上的BMS1714,共7个多态性较丰富微卫星位点,其Uni STS ID分别为279513、25407、279531、9461、28213、81341和251381。PCR扩增引物及条件见表1。120只罗布羊基因组DNA 7对微卫星的PCR产物用3730xl基因分析仪毛细管电泳检测基因分型。
1.2.3 mt DNA D-loop克隆与测序
根据Gen Bank羊科动物mt DNA全长序列(登录号:AF010406.1),利用Primers5.0设计罗布羊D-loop全序列引物,扩增片段大小为1 326 bp。引物及扩增条件如下:
上游引物为:5'-TCATCTAGGCATTTTCAGTG-3',下游引物为:5'-CTCACCATCAAC-CCCCAAAGC-3';扩增条件:94℃5 min,(94℃30 s,50℃30 s,72℃60 s)×35,72℃10 min。
卡拉库尔羊(Karakul)、多浪羊(Dolang)、策勒黑羊(Cele)、和田羊(Hotan)和巴音布鲁克羊(Binbuluk)和罗布羊(Lopnur),共150个DNA样本的PCR产物利用DNA纯化回收试剂盒纯化后,连接到p MD19-T Easy载体,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株,PCR鉴定后,阳性克隆菌株送到上海生工测序。
1.3 统计分析
1.3.1 遗传参数的计算
微卫星标记的基因型频率和等位基因频率及等位基因数(N)可根据电泳结果统计得到。利用GE-NEPOP 1.2软件进行统计分析,计算罗布羊群体微卫星位点的平均等位基因数(K)、观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)、多态信息含量(polymorphism information content,PIC)。
1.3.2 系统进化分析
采用MEGA6.06软件分析卡拉库尔羊、多浪羊、策勒黑羊、和田羊、巴音布鲁克羊、罗布羊,另从Gen Bank数据库中获得绵羊的线粒体DNA D-loop区全序列(见表1,藏羊、蒙古羊和哈萨克羊为我国绵羊的三个母系[2]),构建Neighbor-Joining Tree,对罗布羊的系统发育进行分析。
Network 4.1.1.2软件(来自http://www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm网站)用于分析罗布羊单倍型群体网络关系。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA提取
利用全血DNA提取试剂盒提取罗布羊120头和卡拉库尔羊、多浪羊、策勒黑羊、和田羊、巴音布鲁克羊各6头基因组DNA,经凝胶电泳检测结果符合SSR检测要求(图2)。
2.2 7个SSR标记的基因分型
将120只罗布羊基因组DNA 7对微卫星的PCR产物用3730xl基因分析仪毛细管电泳检测基因分型。(图3)。
2.3 mt DNA D-loop克隆与测序
以卡拉库尔羊、多浪羊、策勒黑羊、和田羊、巴音布鲁克羊和罗布羊基因组DNA为模板,用羊D-loop全序列引物,PCR扩增获得1 326 bp的目的片段。(图4)。经克隆测序,获得6个品种羊的D-loop全序列150个。
注:M为DL2000 DNA marker;1~24为基因组PCR产物。Note:M:DL2000 DNA marker;1-24 for products of genome DNA.
注:M为DL2000 DNA marker;1~24为基因组PCR产物。Note:M:DL2000 DNA marker;1-24 for PCR products of mt DNA D-loop.
2.4 罗布羊遗传多样性分析
罗布羊群体遗传多样性丰富,其平均等位基因数(K)、观察杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、多态信息含量(PIC)分别为8.86、0.711、0.791和0.769。7个微卫星位点,除了BM143,其它位点的HO与HE值均很相近。其中位点OARHH35与BM6526的杂合度与PIC值较高(表3)。
在120头罗布羊中发现BM143位点有9个等位基因,其中7个基因位点均呈纯合子状态,其比例达到55.70%。其HO值与HE值相差0.403,HW检测呈显著差异,这一结果说明该位点检测罗布羊遗传多样性存在HW不平衡,不适合作为罗布羊群体遗传特性进行检测位点。
2.5 罗布羊等新疆南部绵羊mt DNA D-loop序列及遗传距离分析
通过克隆测序和PCR结果测序获得罗布羊120头、和田羊等其它5个新疆南部地方羊种D-loop环序列,完整序列长为1 181 bp或1 182 bp。120个罗布羊D-loop环序列比对,发现共有208个核苷酸突变位点,共69个单倍型,利用NETWORK软件分析其群体网络关系,发现群体形成A、B、C 3个进化支系,支系间分布清晰,见图5。利用MEGA6.06软件,分析罗布羊3个分支的代表单倍型,和田羊、卡拉库尔羊、巴音布鲁克羊、策勒黑羊、多浪羊和Gen Bank上公布的塔什库尔干羊、巴什拜羊、叶城羊、蒙古羊、哈萨克羊和藏羊,三个野羊:羱羊、摩佛伦羊、盘羊,亚洲型A型和欧洲型B型共17个群体间的遗传距离。发现17个群体间的遗传距离在0.154~0.003之间。中国绵羊的三大母系:藏羊、哈萨克羊和蒙古羊间的遗传距离在0.003~0.005之间;三大母系与新疆地区和田羊、卡拉库尔羊、策勒黑羊、卡拉库尔羊、塔什库尔干羊、巴什拜羊和叶城羊的遗传关系较近(0.003~0.009)。罗布羊的A支系与三大母系及新疆地方羊种的遗传关系较B、C支系近(0.012~0.016);B支系与欧洲型B型和多浪羊关系较近(0.012~0.015),较盘羊、羱羊和三个支系中B支系与摩佛伦羊(O.musmon)的关系较近;C支系则与其它18个单倍型距离均较远。3个支系间的距离较远,见图6。
2.6 17个绵羊种系统进化分析
MEGA6.06聚类分析利用选择丁Kimura双参数模型,忽略插入、缺失位点,自举检验1 000次,函数为伽马分布,构建了17个绵羊种N-J聚类图(图7)。结果发现,两个野羊种摩佛伦羊(O.musmon)与盘羊(O.vignei)聚为一支,然后与新疆地方羊种、三个母系品种聚在一起。罗布羊的B进化支与欧洲B型和多浪羊汇成一支。罗布羊C进化支先与巴音布鲁克羊聚为一支,然后和A进化支聚成一类,再与新疆其它地方羊种及蒙古羊、藏羊及亚洲型A型聚在一起。从聚类关系,两个野羊种摩佛伦羊(O.musmon)与盘羊(O.vignei)对新疆地方羊品种有贡献。
3 讨论
这是首次对罗布羊遗传多样性研究的试验。绵羊SSR标记的研究一方面可以较准确地评价绵羊群体遗传多样性,另一方面可以开发绵羊生产性状辅助选择的有力工具。从罗布羊7个SSR标记的平均多态信息含量结果,认为尽管罗布羊的生活生存的地域环境相对封闭,其遗传多样性丰富。但低于张烨华等检测的策勒黑羊、多浪羊、巴音布鲁克羊、巴什拜羊、阿勒泰羊的遗传多样性(PIC≥0.8350)[5]。这可能与当地传统放牧管理、自然交配方式、种群长期闭锁繁育有关。由此也可以确定:罗布羊群体遗传结构相对稳定,并且受自然和人工选择压力较小,这有利于罗布羊今后的选种育种工作,事实上罗布羊已被发现有遗传稳定的多胎和抗干旱类群,这是罗布羊多胎系或抗干旱系选育的良好基础。
罗布羊SSR分析发现位点BM143位点存在罗布羊群体HW不平衡现象。BM143是位于绵羊第6号染色体上与多胎基因(Fec B)紧密连锁的一个位点,与湖羊的产羔性状有极显著的相关性[6],该基因位点在罗布羊群体中有9个等位基因,纯合子数占55.73%,但整个群体在该位点上等位基因频率存在显著的HW不平衡。群体HW不平衡有多种因素造成,对于该位点在罗布羊群体的等位基因数初步判断(在滩羊中有6.1210个等位基因),很有可能由于该位点的突变,使突变位点基因频率较小[7,8]。因此该位点不宜作为罗布羊生产性能等标记辅助选择位点。
罗布羊的系统进化分析结果显示,罗布羊的一个B支系较为古老,与新疆多浪羊与欧洲型B型关系较近,受新疆其它地方羊种的影响较小,该结果与王慧华利用N-J树分析中国绵羊群体遗传结构的结果相同[3],而C支系与巴音布鲁克羊的进化关系结果与袁泽湖等对中国地方绵羊遗传关系的分析结果相近[4]。A支系则与新疆塔克拉玛干沙漠南缘的地方羊种间关系相对较近。
从古至今家绵羊一直是新疆居民的主要生活资料之一。而绵羊的进化与当地居民的生活方式、文化及社会历史变迁有着不可分割的关系。因此罗布羊的起源进化与罗布人有着密切的关系。从文献资料分析,罗布人的生活习俗完全不同于维吾尔族,是罗布泊地区古老的土著民族,也是楼兰王国中主要居民之一。拥有自己的语言,主要以捕鱼为生,不食粮食不牧家畜。18世纪中叶后由于罗布泊逐渐干涸,迫使罗布人一部分由阿不旦庄南迁至现在的若羌县米兰地区;另一部分向北迁至尉犁县的喀尔曲克村,逐渐与当地维吾尔民族的生活融合在一起,开始了放牧生活[9,10]。多浪羊是在1919年,麦盖提县宗教人士艾克热汗吐逊从阿富汗引进与当地土种羊杂交形成的一个绵羊地方品种[11,12]。由此推断罗布羊品种形成早于多浪羊,与上述文献资料基本可以相互印证。从罗布羊、多浪羊、欧洲型B与巴音布鲁克羊的聚类进化关系,多浪羊主要分布在喀什地区,巴音布鲁克羊是13世纪时,蒙古民族西征欧洲带到巴音布鲁克地区的欧俄羊种[13,14],从地域上库尔勒地区尉犁县靠近蒙古地区,而喀什地区是古丝绸之路重要的枢纽,由此可以初步推测最早的罗布羊应来自绵羊发源地中东,经蒙古高原到达新疆的较古老地方羊种[15]。相比之下新疆其它地方品种形成时间相对较晚。由于交通与经济往来逐渐频繁,罗布最终与新疆其它羊种相互杂合,形成一个新的进化支系A。
野羊种摩佛伦羊(O.musmon)与新疆地方羊品种间的进化关系与Glazko V I等国内外学者对家绵羊起源研究的结果一致[8,[16,17,18,19]]。
对于罗布羊的起源还需要通过对分布在若羌地区的罗布羊遗传信息进一步分析研究加以证明。
4 结论
群体遗传结构 篇6
AFLP (amplified fragment length polymorphism) 技术[2]作为一种新型的分子标记, 具有信息量大、灵敏度高和多态性丰富等优点。AFLP技术可以在对研究对象基因组序列了解甚少的情况下, 利用少量引物检测到大量的有效位点进行分析[3]。在对虾类中, 目前应用AFLP标记技术已经构建了日本对虾 (Marsupenaeus japonicus) 和斑节对虾 (Penaeus monodon) 的连锁图谱[4,5]、中国对虾 (Fenneropenaeus chinensis) 抗病选育群体的遗传变异分析[3]。此研究利用AFLP标记技术对凡纳滨对虾6个养殖群体的遗传变异水平进行探讨, 旨在从分子水平上分析中国凡纳滨对虾种质资源的现状, 为下一步开展凡纳滨对虾遗传育种研究工作提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2007年4月, 取自美国夏威夷引进的凡纳滨对虾亲虾30尾, 并在广东省雷州半岛选取东方、海星、旭明、乾塘和广益虾苗场的凡纳滨对虾育种群体各30尾, 于95%的乙醇中固定和保存。基因组DNA提取方法参考《分子克隆实验指南》[6]。来自东方、海星和旭明虾苗场的凡纳滨对虾在当地普遍表现出较好的养殖性状, 来自乾塘虾苗场的群体的生产性状代表当地正常水平, 一个生长速度性状严重退化, 即将被淘汰的群体样品来源于广益虾苗场的虾苗。
1.2 AFLP反应
试验方法参照VOS等[2]的方法。选用EcoRⅠ和MseⅠ限制性内切酶, 内切酶和连接酶均购自New England Biolab公司。引物及接头由上海生物工程有限公司合成。选择性扩增使用了8种EcoRⅠ引物和8种MseⅠ引物共64个引物组合, 根据预试验结果, 从中筛选重复性好、多态性较高的6对引物组合进行正式扩增反应。扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行100 W恒功率电泳。染色程序参考《分子克隆实验指南》[6]银染方法。在显色终止、漂洗之后进行拍照、记录、分析。
1.3 数据统计与分析
首先按电泳图谱中扩增条带的有无, 每个DNA片断视为一个分子标记, 在同一位点, 当AFLP谱带存在时赋值为“1”, 不存在时赋值为“0”, 将整个分子标记图谱转化成“0”和“1”的数字矩阵。利用POPGENE 1.31软件[7], 计算以下遗传参数。
Nei (1973) 平均基因多样性指数:
H=1-∑Pi2, Pi2为单个位点上等位基因的频率;
Nei (1972) 群体间遗传相似性系数:
I=∑ (XiYi) /﹛∑ (Xi) 2∑ (Yi) 2﹜1/2
其中Xi、Yi分别为X和Y群体第i个位点的等位基因频率;
群体间Nei (1972) 遗传距离:DA=1-lnI
加上偏差较正后Nei (1978) :
I= (2n-1) ∑ (XiYi) /﹛∑[2n (Xi) 2-1]∑[2n (Yi) 2-1]﹜ 1/2
其中Xi、Yi分别为X和Y群体第i个位点的等位基因频率;
群体内shannon多样性指数:H0=-∑ (XilnXi) /N
其中Xi为位点i在某一群体中出现的频率, ln为自然对数, N为所测座位数;
采用ARLEQUIN 2.000软件[8], 计算以下遗传参数以及进行分子方差分析 (AMOVA) ;
群体遗传分化指数:Fst=σ2P/P (1-P) , P为某等位基因在整个群体中的平均频率;σ2为该等位基因在分群体之间的方差。
用MEGA 3.0软件[9]基于Kimura 2-parameter模型进行群体间、群体内遗传距离以及所有个体间的平均遗传距离的计算, 并进行聚类分析, 各分支结点上的数字均为1 000次重复检验 (bootstrap test) 得到的该结点的支持率。
2 结果
2.1 AFLP扩增结果
采用6对AFLP引物组合对6个凡纳滨对虾育种群体共180尾个体进行比较分析, 共统计了410个DNA条带, 结果见表1。各引物组合之间的扩增效果之间存在一定差异, 扩增片段大小在0.1～1.2 kb之间。6对引物组合共扩增出287条多态性条带, 多态比例69.90%。平均每对引物组合扩增出68.33条带, 其中47.83条带呈现出多态性。
2.2 6个群体的遗传多样性
通过6对AFLP引物扩增图谱分析, 得到凡纳滨对虾6个育种群体的遗传多样性指数见表2。多态位点百分数处于68.39%～71.20%之间, 不同
群体间大小顺序为广益>进口>东方>旭明>乾塘>海星。平均基因多样性指数处于0.2020～0.2495之间, 不同群体间大小顺序为进口>乾塘>东方>海星>旭明>广益, Shannon多样性指数大小排序与平均基因多样性指数相同。
2.3 6个群体间遗传相似性和遗传距离
根据Nei计算所得群体间遗传相似性系数和遗传距离见表3。偏差校正后, 不同群体间的遗传相似性系数为0.8479～0.9622, 遗传距离为0.0385～0.1651。
2.4 6个群体间的遗传分化
配对比较Fst值见表4, 其中每个Fst值对应的P<0.01, 在表中不再单独列出。WRIGHT[10]认为, Fst在0～0.05之间表示群体间遗传分化微弱;0.05～0.15之间表示群体遗传分化中等;0.15～0.25之间表示群体遗传分化较大;当Fst大于0.25时, 表示遗传分化极大。此研究的6群体间Fst值最小为0.07693, 最大0.29164, 表明6群体间遗传分化已逾越遗传分化中等的底线, 而广益群体与进口群体间已有极大的遗传分化。
分子方差分析 (AMOVA) 结果表明, 群体间方差占总方差的17.98%, 而群体内方差占总方差的82.02% (表5) , 说明选育群体的遗传变异大部份来源于群体内个体间的遗传差异。
2.5 聚类分析
用MEGA 3.0软件对6个凡纳滨对虾群体进行聚类分析, 得到UPGMA聚类树 (图1) , 更为直观清晰地表明了6个群体之间的遗传关系。东方群体首先与进口群体聚为一支, 再依次与海星、旭明聚为一大支, 而广益与乾塘群体聚为另一支, 这2支经过一段遗传距离最终聚在一起。
3 讨论
中国的凡纳滨对虾养殖规模与产量已达到了前所未有的水平, 但中国国内对于这一优良养殖虾类的遗传育种研究还亟待深入。对水生经济动物养殖群体与野生群体的研究表明, 如果未经科学合理的选种育种, 养殖群体经过累代的人为干预后, 遗传变异水平会显著降低, 或者养殖群体种质严重混杂出现良莠不齐, 造成群体养殖性状的衰退[11,12]。凡纳滨对虾在中国没有天然的野生群体分布, 各个育种 (苗) 场保种的亲虾是从国外不同地区、不同时间、不同批次引进的不同数量的凡纳滨对虾群体。因此, 中国南方目前养殖的凡纳滨对虾根据虾苗来源可以分为进口苗和本地苗2种。进口苗是引进成熟种虾所繁殖的苗种, 本地苗是进口苗在现有的养殖环境中留种再繁殖的后代。进口苗与本地苗在中国南方现有的养殖环境和养殖模式中, 所表现出的生长性状与抗病能力有着明显的区别。进口苗具有较好的生长性状, 生长速度快, 养成规格均匀, 养殖110 d可达60 ind·kg-1以内, 但抗病能力较差。本地苗中的不同群体则分化严重, 有部分群体生长与抗病能力都比较好, 生长性状表现接近进口苗, 而部分群体生长性状表现较差, 生长速度缓慢, 养成规格大小分化显著。所以, 选择具有一定代表性的凡纳滨对虾群体进行遗传分析, 是下一步种质改良和管理的重要科学技术基础。
采用AFLP技术对凡纳滨对虾遗传多样性进行研究的文献在此研究之前鲜有报道。PATRICIA和PEDRO[13]对一个封闭的凡纳滨对虾育种群体连续5代的遗传多样性采用RAPD方法进行监测, 多态位点在第5～9代中分别为76.56%, 71.88%, 67.19%, 68.75%和54.69%。李锋等[14]对2批次引进的凡纳滨对虾亲本采用RAPD方法进行比较, 发现2批亲本的遗传多样性存在较大差异, 其多态位点数分别为61.54%和50.52%。在AFLP分析中, 多态条带百分比既与研究的样本来源及其数量有关, 也与各个引物的扩增效率有关。岳志芹等[3]对中国对虾选育系4个群体各12个样本共48个样本, 采用7对AFLP引物共扩增出350条带, 多态位点比例为57.7%。此研究在正式扩增之前先做了大量的引物筛选, 从64对引物组合中筛选出6对多态性高、稳定性好的引物组合, 共对180尾凡纳滨对虾个体进行扩增, 不同引物组合的多态带百分数在58.21%～78.79%之间 (表1) , 平均多带条百分数为69.90%, 笔者认为这个结果相当理想, 可以有效地用于6个凡纳滨对虾群体的遗传多样性分析。
PATRICIA和PEDRO[13]对一个封闭的凡纳滨对虾育种群体连续5代的遗传多样性采用随机扩增DNA多态性 (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) 方法进行监测, Nei遗传多样性h分别为0.267, 0.259, 0.242, 0.253和0.216。张海琪等[15]对进口的凡纳滨对虾F1代和浙江本地品系2个群体各20尾样本进行比较分析, 发现采用同工酶方法2群体间遗传相似系数为0.9968, Nei遗传距离为0.0032;同时采用RAPD方法得到2群体间的遗传相似度为0.9815, 遗传距离为0.0185, 在11条引物扩增得到的110条DNA谱带中, 多态位点比例在浙江本地群体和引进群体中分别为50.19%和47.27%。在此研究中, 进口群体的多态位点占70.88%, 本地群体的多态位点在68.39%～71.20%之间;进口群体与本地群体间的遗传相似性系数在0.8813～0.9504之间, 遗传距离在0.0470～0.1263之间, 与PATRICIA和PEDRO[13]、李锋等[14]和张海琪等[15]的研究结果相似。
在此研究的6个凡纳滨对虾群体中, 笔者通过采用多态位点百分数、平均基因多样性、Shannon多样性指数等指标来综合考察各个群体的遗传多样性水平。就多态位点而言, 不同群体间大小顺序为广益>进口>东方>旭明>乾塘>海星, 平均基因多样性指数在不同群体间大小顺序为进口>乾塘>东方>海星>旭明>广益, Shannon多样性指数大小排序与平均基因多样性指数相同, 群体内Fst指数排序为广益>东方>旭明>乾塘>海星>进口。可以看到, 虽然6个凡纳滨对虾群体的遗传多样性水平采用4种指标的排序并不完全严格一致, 但是却表现出相近的变化趋势。比如, 就平均基因多样性和Shannon多样性指数2个指标而言, 进口群体在6个群体中为最大, 就多态位点百分数而言仅次于广益群体, 位居第二, 而其群体内Fst指数则最小, 这些排序说明进口群体在6个群体中具有较高的遗传多样性水平, 本地群体的遗传多样性水平则有所降低。
在鱼类的育种过程中, 选择育种过程造成群体内遗传多样性下降, 管理不善则容易出现近交衰退而造成群体内遗传多样性的迅速降低[16]。目前世界上对凡纳滨对虾进行选育, 并形成选育品系的只有美国夏威夷海洋研究所[17]。中国引入的凡纳滨对虾群体在引种初期一般均表现出优良生长速度, 但随着养殖规模的扩大, 与当地环境的融合, 引入品系在各方面发生变化, 一些特征因缺乏及时有效的选育而渐渐消失。出现这种现象的原因, 笔者认为是由于生产单位通过个体选择的方法筛选留种、留种亲虾的筛选多数来自于某一池塘或某一群体, 连续几代的重复筛选与使用, 这些亲虾或其后代发生近亲交配的几率很高, 从而使养殖种群越来越单一, 一些处于杂合状态下的基因位点变为纯合。王鸿霞等[18]采用微卫星标记对10个亲代个体在繁殖中对子代的遗传贡献率进行检测, 发现其中只有8个个体对子代群体的基因库有贡献, 不同个体之间贡献率存在差别, 最高为54.28%, 最低为8.57%, 另外2个个体对子代基因库没有贡献。因此, 此研究中本地苗群体相对进口苗群体普遍表现出遗传多样性水平较低的现象是可以理解的。
在6个凡纳滨对虾群体的遗传多样性结果中值得注意的另一个问题是, 就基因多样性指数和Shannon多样性指数而言, 乾塘群体相对于东方、海星和旭明群体表现出较高的遗传多样性水平, 广益群体相对于东方、海星和旭明群体表现出较低的遗传多样性水平。笔者认为, 这种现象的出现可能是种质资源学中种质混杂和种质退化的反映。市场上引进种虾的来源、品系和种群背景混乱, 如果没有科学的管理、分析与指导, 各品系或种群不加控制地随意混合交配, 使相对封闭的育种群体的遗传多样性出现增大现象, 即出现种质混杂。混杂和退化是2个不同的概念。由于亲虾来源困难, 在养殖育苗生产过程中, 生产者为了降低成本, 从养殖的凡纳滨对虾中挑取部分作为亲虾培育、进行育苗生产, 从而导致养殖群体的遗传多样性水平下降, 部分优良养殖性状丧失, 表现为生长缓慢、抗病力低, 即出现种质退化。此试验结果说明不同群体的遗传多样性存在明显的差异, 这些基于遗传的差异是不同群体生长性状差异的原因之一。因此可以说, 在育种实践过程中遗传多样性水平的高低变化是一把双刃剑, 需要及时检测与科学管理, 才能保证育种群体在改良养殖性状的同时尽可能地保持较高的遗传多样性水平。
目前, 美国夏威夷海洋研究所从全世界不同地区收集及培育的凡纳滨对虾按生长、抗病力和对环境适应等的差异, 划分并保存有500多个品系。中国大陆引进的凡纳滨对虾来自于美国夏威夷和中国台湾省2个地区, 引进渠道主要在民间进行, 不同的引进者曾先后在不同时间引进不同来源、品系和数量的种虾[17]。引种之后, 各个育种 (苗) 场之间因为利益竞争关系而很少出现相互之间的育种群体交流。在此研究中, 6个凡纳滨对虾群体间Fst值最小为0.07693, 最大0.29164, 表明6群体间遗传分化已逾越遗传分化中等的底线, 而广益群体与进口群体间已有较大的遗传分化。在颉晓勇等[16]对于新吉富罗非鱼的遗传育种研究中, 基础群体F0与选育群体第9代F9之间Fst值为0.07587, 即经过连续9代的选择育种, 第9代选育群体与基础群体间遗传分化已经逾越中等分化的底线 (0.05) 。因此, 此研究中的6个凡纳滨对虾群体在传代的过程中已经各自形成了遗传上相对独立的体系。目前, 中国有些凡纳滨对虾群体已经较好地完成了进口良种的本地化过程, 若以它们作为育种材料, 必将能提高中国凡纳滨对虾的养殖性能, 而且成本比从美国进口凡纳滨对虾要低得多。因此, 在下一步的凡纳滨对虾育种中, 除了继续补充原产地材料外, 最经济的方法是利用中国已有的凡纳滨对虾资源。
姚雪梅等[19]在中国海南省对SPF (无特定病原) 凡纳滨对虾进口苗的子一代 (F1) 和子二代 (F2) 养殖性状进行比较发现, F1代适应力与成活率随着养殖时间逐渐提高, 但养殖90 d时成活率只有17.7%, 而F2代成活率高达67.2%, 证明进口群体虽然具有生长速度快的优势, 但还需要一个本地化的过程才能在中国的养殖环境中表现出优良的生产性状。ARGUE等[20]发现凡纳滨对虾的生长与适应力呈现出负相关, 通过对引进种的选择和驯化出现新的表型性状, 最为明显的是适应力提高与生长速度变慢。特别值得注意的是, 姚雪梅等[21]在中国海南以SPF凡纳滨对虾引进群体建立自交系F1和F2, 与海南经过若干代养殖后选育的凡纳滨对虾群体进行杂交试验, 对比发现凡纳滨对虾杂交代具有生长和存活双重优良性状, 杂交优势显著, 与自交系相比, 杂交使生长速度和存活率2个表型性状都得到了改良。此研究中6个群体之间已形成了遗传上相对独立的体系, 根据聚类分析的结果, 选择亲缘关系较远的群体进行杂交, 也是一条值得考虑的种质利用途径。
摘要：中国多批次引进凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei并结合生产开展了相对独立的育苗工作, 但对引进群体及引进后留种形成的本地群体的遗传变异水平缺乏了解, 不利于种质管理及利用。此研究采用AFLP技术对抽查的6个养殖群体进行分析, 发现进口群体具有相对较高的遗传多样性水平;养殖性能较好的东方、海星和旭明群体遗传多样性水平与进口群体相近;而乾塘群体遗传变异水平最高, 推测可能是与其种质混杂有关;广益群体遗传多样性水平最低, 可能已出现近交衰退。通过对各个群体间的遗传距离进行分析, 为下一步根据亲缘关系的远近开展群体间杂交育种提供技术依据。
群体遗传结构 篇7
1.1试验材料
随机采集成都市蒲江猪场引自阿坝藏族自治州的藏猪耳组织90份、血样18份,赴甘孜藏族自治州德格县随机采取藏猪耳样17份,四川农业大学动物遗传育种研究所提供稻城藏猪肌肉组织18份。
1.2引物的选择与合成
选取美国肉畜研究中心(USDA)公布的分布于家猪18条染色体上的18对微卫星引物(见表1),由北京博迈德生物技术有限公司合成。
注:F代表上游引物;R代表下游引物
1.2试验方法
1.2.1基因组DNA的提取
采用北京百泰克公司的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
1.2.2微卫星PCR扩增反应体系与反应条件
上下游引物(10 pmol/μL)各0.5μL,2×Power Taq PCRMasterMix 12.5μL,模板DNA(50 ng/μL)1.0μL,双蒸水10.5μL,反应总体积为25μL。94℃预变性4 min→(94℃变性30 s→48~59℃退火30 s→72℃延伸30 s)×34→72℃延伸6 min→4℃保存。
1.2.3电泳检测及凝胶成像
用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果后,取PCR产物5μL在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上220 V电泳2 h左右,银染、凝胶成像,用Gel-Pro Analyzer软件读取片段大小。
1.3数据分析方法
将Gel-Pro Analyzer软件读取的片段数据转换至Microsoft Office Excel 2007中,统计分析基因型。用Cervus(Version 3.0)软件的Allele Frequency Analysis程序分析微卫星座位的多态信息含量,观察杂合度等数据。用Population Genetic Analysis(Version 1.32)计算有效等位基因数、F统计量、基因流值和群体间的遗传距离等数据。
2 试验结果
2.1 微卫星等位基因及其分布
结果见表2。微卫星的有效等位基因数是基因纯合度的倒数,表示等位基因在群体中分布的均匀程度,等位基因在群体中分布越均匀,有效等位基因数就越接近观测等位基因数。由表2可见,各微卫星座位上的观测等位基因数与有效等位基因数在三个群体中均存在明显差异,表明各微卫星在群体内和群体间的分布都不均衡。
2.2 群体内的遗传变异
衡量群体内遗传变异的指标多用群体多态信息含量(PIC)和基因杂合度(H)来表示。PIC反映群体蕴藏遗传信息的多少,H反映基因纯合程度。当PIC≥0.5时为高度多态基因座;0.25≤PIC<0.5时为中度多态基因座;PIC<0.25时为低度多态基因座(David et al.,1980)。H越高,群体的变异程度越大,育种中可供选择的余地就越大。
本试验所测三个藏猪群体各微卫星座位的多态信息含量和杂合度结果见表3。从表3可见,阿坝群体中,SW1443、SW911、SW957、SW2459和SW886座位表现为高度多态性,SW2442和S0004座位多态性贫乏,其他11个座位均表现为中度多态性;稻城群体中,IGF1和SW24座位表现为低度多态性,SW1202、SW886和S0026座位表现为中度多态性,其他13个座位均表现为高度多态性;德格群体中,IGF1座位多态性贫乏,SW2442、S0227、SW1202、S0101和SW886座位表现为中度多态性,其余12个座位表现为高度多态性。三个群体18个座位的平均多态信息含量分别为0.4071、0.530 6和0.513 0。多态信息含量低的座位其观测杂合度也低,反之亦然。表明各座位观测杂合度的变化趋势与多态信息含量的变化基本一致,说明本试验结果可信。
2.3 群体间的遗传变异衡量群体近交程度和群体
间遗传分化程度的指标是F统计量,包括亚群体的固定指数(Fis)、总群体的固定指数(Fit)和亚群体间的基因分化率(Fst)。任何携带有遗传物质的个体在群体内和群体间的流动称为基因流(Nm)。本研究三个群体的F统计量和基因流值分析结果见表4。由表4可见,各座位亚群体的固定指数(Fis)均小于总群体的固定指数(Fit),亚群体间的基因分化率(Fst)因微卫星座位不同而各有差异,其中SW24座位最高(0.417 0),SW787座位最低(0.0643);各微卫星座位的平均Fis为0.4617,平均Fit为0.5758,平均基因分化率为0.2154,表明各亚群体的稳定性不如总群体,三群体间存在一定程度的分化。群体基因流也因微卫星座位不同而不同,SW1202座位最大(5.4058),SW24座位最小(0.3495),各座位平均基因流为1.5432,表明三个群体间存在一定的基因交流。
三个群体的奈氏标准遗传距离DS(见表5)均在0.6以上,表明三个群体相互间存在较大的遗传分歧,属各具特点的亚群体,这与F统计量的分析结果一致。
3 讨论
3.1 关于群体内遗传变异
本研究三个群体的观测等位基因数与有效等位基因数差异较大,且有效等位基因数低于张亚妮等研究的合作猪(4.150 4)和迪庆藏猪(3.069 6),说明等位基因在不同群体中的分布不均匀,不同地区的藏猪其有效等位基因数也有差异。多态信息含量和观测杂合度亦低于张亚妮等报道的合作猪、迪庆藏猪,说明四川藏猪群体与外界交流较少,群体内高度近交繁殖。
3.2 关于群体间遗传变异
本研究平均Fst为0.215 4,表明群体间的遗传变异为21.54%,另外78.46%的遗传变异由个体间的差异产生。Wright认为,群体间基因流大于1就能发挥均质化作用,即能有效抑制由遗传漂变引起的遗传分化(Wright,1931)。本研究平均基因流为1.543 2,表明群体基因流足以抵制遗传漂变的作用,可以防止群体分化的发生。
3.3 关于试验结果的可靠性
合理的抽样方式和足够的样本含量是决定样本是否具有代表性及试验结果可靠性的重要依据。常洪认为,当群体规模有限、分布较为单一时,可采用简单随机抽样构成样本(常洪,1998)。本试验群体主要分布在四川甘孜、阿坝地区,规模有限,因此采用简单随机抽样。根据Tajima的DNA序列抽样分布理论,在DNA水平上估计群体遗传变异时,样本数量大于10,抽样方差就不会太大,所选样本就有代表性(Tajima,1983)。本研究三个群体的样本含量均大于15,能反映群体的遗传信息,保证了试验结果的可靠性。
参考文献
[1]常洪.中国家畜遗传资源研究[M].西安:陕西人民出版社,1998:45-49.
[2]David B,Raymond L W,Mark S,et al.Construction of a genetic linkage map in man using restrictionfragment length polymorphisms[J].American Journal ofHuman Genetics,1980,32(3):314-331.
[3]Tajima F.Sampling variance of heterozyogsity and genetic distance[J].Genetic,1983,106:437-460.
[4]Wright S.Evolution in mendelian populations[J].Genetics,1931,16:97-159.
群体遗传结构 篇8
关键词：玉米群体,SSR,遗传多样性,豫综5号
我国玉米育种难以取得突破性进展的重要原因是种质遗传基础狭窄,解决玉米种质基础狭窄问题的唯一途径是种质扩增、改良与创新[1,2,3,4]。研究不同群体遗传组成和多样性及其群体间的遗传关系,对于种质改良创新和合理利用具有十分重要的意义[5,6,7]。
河南农业大学在1990年由16个美国种质来源的自交系组配而成豫综5号群体,经过3轮的半姊妹轮回选择、1轮相互半姊妹轮回选择和1轮混合选择等方法进行改良。目前已有的研究和育种实践证明:该育种群体增产潜力大,具有较高利用价值。河南农业大学、新疆农业科学院、四川农业大学等单位先后从该改良群体中选育出优良自交系,并在生产上得到广泛应用,并组配出了多个通过审定的新品种。
为进一步改良和利用玉米的群体改良提供理论依据,该研究利用SSR标记分析技术初步分析其遗传特点,对玉米群体豫综5号不同轮次群体多态性位点的平均杂合度、遗传距离、位点比例以及基因型频率和种类等群体遗传结构进行研究,比较3种方法改良后不同轮次群体基因频率等遗传多样性变化规律。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验以豫综5号的C1、C2、C3、C4、M5等5轮改良的群体和C0群体作为材料,并选用塘四平头、Reid、旅大红骨和P群的自交系B73、齐319、Lancaster、掖478、黄早4、Mo17、丹340,共6个代表国内主要杂优类群的自交系作为试验对照。
1.2 样品DNA提取
全部材料在田间种植,植株长6～7片叶时,从对照自交系中各取6个单株,从豫综5号群体的不同世代各取100个单株,采摘幼嫩叶于-80℃冰箱保存。自交系按6个单株叶片混合,豫综5号按单株叶片,采用改良CTAB法提取DNA。
1.3 SSR扩增
均匀分布在玉米10条染色体上的100对SSR引物,由MaizeGDB中随机初步选择,由上海生工合成,再通过电泳从中筛选出35对引物用于试验,要求多态性高、带型好(表1)。这些引物基本上在玉米10对染色体上平均分布,每条染色体约3对引物。
PCR扩增反应总体积为15μL,包括0.5 mmoL/L dNTP0.3μL,10×buffer(含MgCl2)1.5μL,10 ng/μL引物1.5μL,ddH2O 8.6μL,1 U Taq酶0.1μL,模板DNA 3.0μL。
采用PTC-200扩增仪进行PCR反应。程序为95℃预变性2 min;95℃变性1 min,65℃退火1 min,72℃延伸1.5min,共8个循环,每个循环降低1℃;95℃变性1 min,57℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,共28个循环;72℃保温10 min;4℃保存。扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳60 min左右,恒功率50 W。
1.4 数据处理
多态位点比例=多态位点数/扩增位点
基因频率fi=等位基因数/2N(N是样本容量)
观察杂合度H0=观察杂合单株数/N
根据Nei&Li提出的公式计算遗传距离GD(N)=1-GS(N);遗传相似指数GS(N)=2a/(2a+b+c),式中a为同一群体内2个单株共有的条带,b和c分别为2个单株各自特有的条带。
按Hardy-Weinberg平衡比例估计期望杂合度He=1-∑(fi2)(fi是两群体i等位基因的频率)。群体内不同基因型数量及基因型频率从电泳版面上根据电泳的带型进行统计。
2 结果与分析
2.1 不同轮次改良群体的基因型数目和频率分析
由表2可知,在豫综5号的6个轮次中35对引物共检测到234种基因型,除了个别改良群体的基因型数目比上一轮有所减少,一般改良后群体的基因型种类基本上是后一轮多于前一轮。全部35对引物总和也是相似的情况,其中C4的基因型数目较上一轮C3和后一轮M5都偏低。这种基因型数目的差异产生的原因可能有以下3种:一是选择前后扩增的等位位点数也产生了变化,因而导致基因型及其数目的变化,如引物p-umc1555、p-phi015、p-phi109275等。二是选择过程中基因的重组产生新的基因型,如引物p-umc1169、p-umc2048和p-umc1062在不同轮次群体中都扩增出3个等位位点,它们的基因型数都有所增加;三是选择使某些基因型丢失,如引物p-phi227562在6个世代都扩增出3个等位位点,它们的基因型数分别为5、6、3、4、5、5。这表明在轮回选择中,从新一轮群体中选出比上一轮更优良的新基因型成为可能,通过中选单株间的充分重组,能使子代群体产生更丰富的基因型变异。
2.2 不同轮次改良群体检测到的多态位点及多态位点比例
由表3可知,对6个不同轮次改良群体DNA样品用35对SSR引物进行扩增,共检测出115个等位基因变异,每对引物检测出的等位基因数为2～6个,平均每个位点3.29个,6个群体扩增的多态位点及多态位点比例不尽相同。在6个群体的多态位点比例达到100%的引物为2/3。通过比较多态位点比例和多态位点数,发现:C2>C3>M5>C1>C4>C0。其结果说明:C0的遗传基础比较宽,经过不同轮回选择方法改良后,C1、C2、C3、C4、M5的遗传变异仍然很丰富,但3种方法在保持群体的遗传多样性方面存在差异。
2.3 群体内遗传距离的比较
由表4可知,基础群体C0的单株与改良群体内单株间遗传距离间平均遗传距离相比几乎无变化,改良群体内遗传距离其标准差、极值都略大于基础群体,表现为略有增加。这可能是由于在轮回选择过程中又渗入了一些新种质,改良群体经过数次重组交换,增加了部分个体间的异质性,使改良群体中大部分个体间的遗传距离变大。
2.4 不同轮次群体的基因杂合度比较
由表5可知,每一个等位位点在不同群体中的基因频率有差异,即每一对引物在不同群体中的杂合度有差异。通过半姊妹轮回选择的改良群体C1、C2、C3各轮次间差异不大,平均基因杂合度分别为0.334、0.316、0.314;通过相互半姊妹轮回选择的改良群体C4的平均基因杂合度较上一轮明显减少,为0.258;混合选择群体M5的平均基因杂合度与C4相比略有增加,为0.266。结果表明:半姊妹轮回选择和混合选择,在保留群体的遗传多样性上,可能优于相互半姊妹轮回选择。豫综5号通过轮回选择后,各轮群体的平均观察杂合度和平均期望杂合度都存在着一定的差异,豫综5号改良群体偏离遗传平衡状态,说明还没有达到HardyWeinberg遗传平衡状态,这可能是由于群体的轮回选择和优良种质的渗透造成的。
2.5 不同轮次改良群体间遗传距离
在根据表现型和配合力标准进行轮回选择,遗传距离的相对远近,说明所获得的不同轮次改良群体由于选择,导致了针对试验所检测到的基因位点发生一定变化,由表6可知:C0与各轮次之间的关系是:C4
3 结论与讨论
从多态性位点比例、位点的平均杂合度,遗传距离以及基因型种类和频率等方面该研究利用SSR标记分析技术,对豫综5号不同轮次群体的遗传结构进行研究,得出如下结论:豫综5号可以作为进一步改良和从中选育优良自交系的基础材料,通过不同方法的轮回选择没有达到Hardy-Weinberg遗传平衡状态,各轮次仍保持有丰富的遗传多样性。
该研究中,通过相互半姊妹轮回选择的改良群体C4的等位基因型种类、基因数目、平均基因杂合度较C1、C2、C3和M5都偏低。通过半姊妹轮回选择的改良群体C1、C2、C3的等位基因型种类、基因数目、群体内单株间平均遗传距离平均基因杂合度差异相对不大。该结果表明:在保持群体的遗传多样性方面。混合选择与半姊妹轮回选择可能优于相互半姊妹轮回选择。
参考文献
[1]黄素华.利用SSR标记分析玉米轮回选择群体的遗传多样性[J].遗传学报,2004,31(1):73-80.
[2]王铁固,库丽霞,陈彦惠,等.利用SSR分析玉米群体的遗传变异[J].华北农学报,2005,20(5):13-16.
[3]铁双贵,张莉,卫敏,等.玉米骨干自交系品质基因SSR标记遗传多样性研究[J].河南农业科学,2005(11):27-29.
[4]李新海,袁力行,李晓辉,等.利用SSR标记划分70份我国玉米自交系的杂种优势群[J].中国农业科学,2003,36(6):622-627.
[5]孟庆雷.豫综5号玉米群体不同轮次改良效果的研究[D].郑州:河南农业大学,2008.
[6]吴连成,侯本军,库丽霞,等.用SSR标记分析豫综5号和金皇后综合种的遗传变异[J].华北农学报,2007(3):30-34.
群体遗传结构 篇9
近年来,随着市场对蒙古鲌的需求量逐渐增加,开展了一些与其养殖相关的研究,如蒙古鲌人工繁殖技术[2]、池塘高效养殖技术[3]、肌肉营养成分分析与评价[4]等,但与其遗传多样性相关的研究较少,仅见蒙古鲌线粒体细胞色素b基因、COI基因和线粒体ND2基因序列分析[5,6],关于蒙古鲌mt DNA d-loop序列研究尚未见报道。鱼类mt DNA d-loop序列由于缺乏编码的压力,控制区进化速度相对较快,其序列的变异不仅有核苷酸之间的替换,还有不同长度核苷酸序列的缺失、插入或不同拷贝数的串联重复,是线粒体DNA序列和长度变异最大的区域。近年来,越来越多的工作集中在通过分析控制区序列变异来研究鱼类种、属甚至亚科的系统发育关系以及种群的起源、地理分化、分布等方面。S.Sukumaran等[7]结合mt DNA d-loop区序列和COI基因序列探讨了印度沙丁鱼遗传结构和物种起源。J.P.Wang等[8]利用mt DNA d-loop区序列探讨了台湾铲颌鱼的种群遗传结构,结果表明该鱼种在台湾的6个主要种群与它们生存的各河流的地理分布一致。Q.Q.Cheng等[9]利用mt DNA d-loop区序列研究长江流域四个湖刀鲚群体的遗传分化情况,结果表明,长江刀鲚4个群体没有产生显著的遗传分化,大多数变异发生在种群内部。M.R.Menezes等[10]利用线粒体DNA dloop区序列对印度沿海岸鲣种群遗传结构进行了研究,系统发育分析结果表明,鲣4个分支存在于印度海域,但没有产生明确的地理分布。傅建军等[11]利用mt DNA d-loop区序列探讨了长江水系、珠江水系和黑龙江水系8个草鱼野生群体系统发育关系,遗传距离与地理距离存在极显著正相关。
研究以蒙古鲌为对象,从形态学和分子遗传学两个方面来研究兴凯湖(XK)、镜泊湖(JB)和乌苏里江抚远段(FY)三个地理群体蒙古鲌的遗传差异,探讨不同地理群体的遗传多样性,旨在为蒙古鲌的种质资源保护、合理开发利用和良种选育等提供基础资料和科学指导。
1 材料与方法
1.1 试验样本
蒙古鲌,于2014年11月份—2015年3月份采集于黑龙江流域镜泊湖、兴凯湖和乌苏里江抚远段。采集的完整蒙古鲌样本各30尾,其体长范围为:兴凯湖群体17.4~25.0 cm,镜泊湖群体19.4~22.0 cm,乌苏里江抚远段群体17.6~24.6 cm。样本冰鲜保存运回实验室,清洗后进行形态学测量。取鱼体右侧背鳍下方50 mg小块肌肉于-20℃保存。
1.2 形态度量
采用传统形态度量学和框架结构度量学结合方法,参照陈宜瑜[12]方法,使用游标卡尺测量蒙古鲌样品。测量时以鱼体左侧为基准,精确到0.1 mm。测量特征包括:全长、体长、体高、体宽、尾柄长、尾柄高、头长、吻长、眼径、眼间距、眼后头长、背鳍基长、臀鳍基长、胸腹距、背吻距、腹吻距、背尾距、背腹距。为消除异速生长及体型差异的影响,将所测头部特征数据除以头长,体部特征除以体长进行校正。整理后共得到19项形态数值,用SPSS 17.0统计软件进行主成分分析[13]。
1.3 基因组总DNA的提取和目的片段的扩增、纯化及测序
取保存的蒙古鲌样本背部肌肉30 mg左右切碎,置于1.5 m L离心管中,常规SDS蛋白酶K消化,使用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提3次,乙醇沉淀获得基因组总DNA。蒙古鲌线粒体d-loop扩增引物为:Mit Dl-F 5'-CACCCYTRRCTCCCAAAGCYA-3',Mit Dl-R 5'-GGTGCGGRKACTTGCATGTRTAA-3'[14]。PCR反应体系(50μL)为:10×Buffer 5μL,10 mmol/L d NTPs 0.5μL,前、后引物各0.5μL,(5 U)Taq酶1μL,模板DNA 200 ng,加超纯水补足50μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30~35个循环;72℃延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,用纯化试剂盒(Ultra Clean 15 DNA Purification Kit-MO BIO Laboratories Inc)纯化后,送交北京华大生物技术有限公司测序,所用测序引物与PCR扩增引物相同。
1.4 数据的统计与分析
取每个个体的DNA测序2次,所有测序结果用Clustal X 1.83[15]软件进行比对,用Bio Edit7.05.3软件进行优化[16]。通过MEGA 4软件人工校对序列,统计碱基组成、转换-颠换比、保守位点、变异位点,计算基于Kimura2-Parameter模型的遗传距离并构建邻接树,用1 000次Bootstrap计算分支支持率[17]。使用Dna SP 5.10软件计算序列的单倍型数、单倍型多样性(h)、核苷酸多样性多样性(π),并进行Tajima’s D检验和Fu’s Fs检验。通过Network软件构建单倍型网络图[18]。通过Arlequin 3.5软件计算遗传分化系数(Fst)和群体间基因流值来评价群体间的遗传差异[19],分子方差(AMOVA)分析检验群体遗传变异情况,通过1 000次重抽样来检验不同遗传结构水平上协方差的显著性。18种单倍型序列提交到Gen Bank,登录号为KU641403~KU641420。
2 结果与分析
2.1 形态分析
对标准化特征变量进行主成分(PC)分析。主成分的负载值、贡献率和累计贡献率见表1。
注:*负载值P>0.500。
PC1、PC2、PC3和PC4 4个主成分之间可以解释87.840%的群体差异。其中PC1、PC2和PC3占总变异的81.655%。对于各主成分影响较大的性状(负载值P>0.500):PC1包括体高、体宽、尾柄高、尾柄长/尾柄高、头长、眼后头长、背吻距、胸腹距、背尾距;PC2包括背鳍鳍长、臀鳍鳍长、腹吻距、背腹距;PC3包括尾柄长、尾柄长/尾柄高、头长、眼径、眼间距;PC4包括体高/体宽。这些特征主要反映鱼的头部与身体的高度或宽度、尾柄的长度和高度、各鳍的位置等(与游泳相关的特性),说明3个群体形态的差异主要是由身体的高度或宽度和各鳍位置的差异造成的。由PC1、PC2和PC3散点图(见图1)可见,尽管3个群体在A、B两个散点图上分布有某些倾向,但大部分区域重叠,很难完全彻底分开。
2.2 线粒体D-loop区序列特征
共得到全部蒙古鲌样本mt DNA d-loop去序列片段长949 bp,其中突变位点为44个(突变率为4.6%),简约信息位点为32个。D-loop基因片段中T、C、A、G的平均含量分别为31.4%、21.1%、34.0%和13.5%。A+T的含量(65.4%)显著大于G+C的含量(34.6%)。同时还可以看出,mt DNA d-loop基因表现出很强的反G偏倚,G的含量明显低于其他3种碱基含量,这些都与脊椎动物线粒体DNA的特点相同[20]。对比其他已报道鱼类mt DNA d-loop区结构[21,22,23],对蒙古鲌控制区的结构进行了分析,识别了扩展终止序列区、中央保守区和保守序列区,并找到了DNA复制终止相关的扩展序列ETAS和中央保守区的保守序列CSB-F、CSB-E、CSB-D以及保守序列区的保守序列CSB-1、CSB-2、CSB-3,见表2。
2.3 遗传多样性与遗传距离
三个群体共检测到18种单倍型(h),镜泊湖的单倍型较其他群体多(见表3)。三个群体蒙古鲌的单倍型多样性(Hd)很高,从0.882(FY)到0.890(XK);而核酸多样性(π)相对较低,从0.475%(JB)到0.771%(XK)。Tajima’s D检验和Fu’s Fs检验均为非显著性(P>0.10)。Tajima’s D检测值为负,表明存在大量的低频等位基因位点;Fu’s Fs检测值仅镜泊湖为负,表明可能在某一时间段种群受到负选择作用,有害变异频率因选择而降低,或一条有利的等位基因频率受正向选择作用在种群中刚固定不久,导致外缘突变相对内部突变的比例大大增加。
基于线粒体DNA D-loop区序列,根据Kimura2-parameter模型计算出蒙古鲌三个群体内遗传距离在0.005 08~0.010 16之间,群体间遗传距离在0.005 66~0.008 25之间(见表4)。结果表明,三个群体内的平均遗传距离与群体间遗传距离处于同一水平,没有体现群体的遗传分化。三个蒙古鲌群体间,遗传分化系数(Fst)为-0.010 64~0.048 53(P>0.05),Fst值均较低,未产生遗传分化。XK与FY群体Fst为负值,说明两个群体间存在较大的基因交流,遗传分化不显著(见表5)。JB与XK群体间Fst为0.048 53,接近但尚未达到遗传分化水平(P>0.05),表明这两个群体间未出现遗传分化。AMOVA分析结果表明,97.46%的变异来自于群体内个体间,2.54%的变异来自于群体间(见表6)。这一结果也说明三个群体间的差异不显著,遗传分化不明显。
注:对角线为蒙古鲌群体内遗传距离,对角线下为群体间遗传距离。
注:对角线下为遗传分化系数(P<0.50),对角线上为基因流。
2.4 系统发育分析
用MEGA 4.0软件,根据Kimura 2-parameter进化参数模型构建单倍型的NJ分子系统树,见图2。通过Network软件构建单倍型网络图,见图3。由图3可见,18种单倍型基本聚类成两大类;9种单倍型(hap2、hap3、hap4、hap5、hap9、hap13、hap16、hap17和hap18)为3个地理种群之间的共享。XK和FY两个群体共有的单倍型最多,JB和XK群体仅有1个共有单倍型hap13。每个群体都有其独有的单倍型,可以作为物种鉴定的依据。hap4和hap5两个单倍型各群体间共享,其中hap4位于网络图的扩展中心,可能是最原始的单倍型。图2的A支与图3的Ⅰ类基本对应,B支与图3的Ⅱ类基本对应。但也存在少数的不一致情况,例如:hap5和hap6在图2中聚类于A支,在图3中却聚类于Ⅱ类;hap16在图2中聚类于B支,在图3中却聚类于Ⅰ类。两个聚类图的结果均显示,单倍型的聚类与地理分群没有相关性。
3 讨论
群体分化是物种分化的初期表现,研究群体分化对于理解物种分化的过程与机制具有重要的作用。本研究结合形态和mt DNA d-loop数据,分析了镜泊湖、兴凯湖和乌苏里江抚远段蒙古鲌三个地理群体的群体分化情况。形态分析结果表明,在主成分分析中,虽然区分群体有一定的分化倾向,群体间的形态差异主要是由身体的高度或宽度和各鳍位置的差异造成的,但无显著差异。由散点图可见,三个群体有较大的重叠,无论PC1、PC2还是PC3轴都无法把它们彻底分为不同的组,说明这三个群体在形态上没有产生分化。
遗传多样性是生物多样性的基础,是物种长期生存和进化的的前提,也是物种进化潜能的保证。核苷酸多样性是一个群体的遗传多样性的重要指标[24]。本试验结果表明,镜泊湖、兴凯湖和乌苏里江抚远段蒙古鲌群体平均单倍型多样性(0.891±0.022)较高,核苷酸多样性较低(0.006 90±0.000 91)。与已报道的翘嘴鲌[25]相比,蒙古鲌的遗传多样性更高。本研究确定了蒙古鲌线粒体各部分结构序列扩展终止序列区(ETAS)、保守序列区(CSB)和中央保守区(CD),与鲤科鱼类mt DNA d-loop区结构表现出高度的相似性[22]。三个群体内遗传距离在0.005 08~0.010 16之间,群体间遗传距离在0.005 66~0.008 25之间。三个群体内的平均遗传距离与群体间遗传距离处于同一水平,没有体现出群体的遗传分化。三个蒙古鲌群体间Fst为-0.010 64~0.048 53,虽然抚远段与镜泊湖之间Fst最大(0.048 53),接近但尚未达到遗传分化标准(P>0.05),表明群体间未出现遗传分化。AMOVA分析表明,97.46%的变异来自于群体内个体间,2.54%的变异来自于群体间,从另一角度说明这三个群体间的差异不显著,遗传多样性主要来自于种群内部。兴凯湖和乌苏里江抚远段的单倍型多样性与核酸多样性相近,并且高于镜泊湖群体,可能是两者同属乌苏里江流域,基因交流频繁导致,而镜泊湖则属于松花江流域。兴凯湖群体的遗传多样性相对最丰富,而镜泊湖群体的遗传多样性相对最低;三个群体系统发育分析结果表明,单倍型NJ树没有单一的地理群体构成一支,没有定向分化的标志,并且单倍体型网络图也呈现出相同的特征。单倍体型的网络图显示主要以hap4作为核心,各个群体联系在一起,但一些节点没有确定,这些节点可以看到没有被发现或消失的单倍体型,这可能是由于群体经历了一个负向选择,低频等位基因导致的结果。两种系统发育分析结果也表明,三个群体在遗传结构上同样没有产生分化。JB群体在进化过程中,单倍型多样性和遗传多样性均低于XK和FY群体,这表明其适应环境的能力已相对减弱。