大黄素和大黄酚（精选5篇）
大黄素和大黄酚 篇1
摘要：目的建立测定三黄片中大黄素和大黄酚总含量的不确定度评定方法。方法采用《中国药典》2005年版一部三黄片中的HPLC法测定大黄素和大黄酚总含量, 分析影响其不确定度的因素来源, 对各个不确定度因素进行评定, 并计算合成不确定度, 最终给出测量结果的扩展不确定度和置信水平。结果合成不确定度为1.7×10-2;扩展不确定度为3.4×10-2。结论本方法可用于HPLC法测定药物含量的不确定度的分析, 使测定结果更加可靠。
关键词：不确定度评定分析,高效液相色谱法,三黄片,大黄素,大黄酚
测量不确定度是与测量结果相关联的参数, 它表征了可以合理地赋予被测对象的数值的分散程度。由于测量不确定度是对测量结果的定量表征, 中国合格评定认可委员会在对实验室进行认可时, 都要求开展测量不确定度的评定。本文根据国家质量技术监督局发布的计量技术规范《测量不确定度评定与表示》 (JJF1059-1999) [1]中有关规定, 对《中国药典》年版一部收载的三黄片中的HPLC法测定大黄素、大黄酚总含量的测量不确定度进行分析, 考察了其不确定度的主要来源, 为实验过程的控制和检测报告的评估提供科学的依据。
1 实验方法
1.1 仪器与试药
Agilent 1200系列高效液相色谱仪;Mertler XS205型电子天平 (0~80g/0~220g, d=0.01mg/0.1mg) ;25mL量瓶、10 mL量瓶、10 mL移液管、25 mL移液管均为A等级;大黄素、大黄酚对照品 (由中国药品生物制品检定所提供, 批号分别为110756-200110、110796-200514, 纯度为100%) ;三黄片:为评价性抽验品种 (批号20080301, 河南明康制药有限公司生产) ;甲醇为色谱纯;其他试剂均为分析纯。
1.2 色谱条件[2]
色谱柱:迪马C18 (4.6 mm×250mm, 5μm) ;流动相:甲醇-0.1%磷酸 (85∶15) ;柱温:40℃, 流速:1.0mL/min;检测波长254nm。进样量10μL, 理论板数按大黄素峰计算不低于2000, 大黄素、大黄酚的分离度>6.7。
1.3 方法[2]
1.3.1 对照品溶液的制备
取经五氧化二磷干燥15h的大黄素、大黄酚对照品各约10mg, 精密称定, 置100mL量瓶中, 加无水乙醇-乙酸乙酯 (2∶1) 混合溶液分别溶解并稀释至刻度, 摇匀。精密吸取大黄素对照品溶液10mL和精密吸取大黄酚对照品溶液25mL置同一100mL量瓶中, 加无水乙醇-乙酸乙酯 (2∶1) 混合溶液稀释至刻度, 摇匀。用微孔滤膜 (0.45μm) 过滤, 作为对照品溶液 (每1mL含大黄素10μg、大黄酚2510μg) 。
1.3.2 供试品溶液的制备
取本品20片, 除去包衣, 精密称定, 研细 (过三号筛) , 精密称取适量 (约相当于1片的重量) , 置锥形瓶中, 精密加入乙醇25mL, 密塞, 称定重量, 置水浴上加热回流1h, 放冷, 用乙醇补足减失的重量, 滤过, 精密量取续滤液10mL, 置烧瓶中, 水浴蒸干, 加30%乙醇-盐酸 (10∶1) 混合溶液15mL, 置水浴中加热回流1h, 立即冷却, 用三氯甲烷强力振摇4次, 每次15mL, 合并三氯甲烷液, 置水浴上蒸干, 残渣用无水乙醇-乙酸乙酯 (2∶1) 混合溶液溶解, 移置25mL量瓶中, 并稀释至刻度, 摇匀, 用微孔滤膜 (0.45μm) 过滤, 取续滤液, 作为供试品溶液。
1.3.3 测定法
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL, 注入液相色谱仪, 测定, 按外标法计算大黄素和大黄酚的总含量。本品每片含大黄以大黄素和大黄酚总含量计算, 不得少于1.55mg。
2 分析与结果
2.1 建立数学模型
根据《中国药典》格式[3], 含量计算公式如下:
式中, X为大黄素、大黄酚的总含量 (mg片-1) ;As大黄素、As大黄酚分别为供试品溶液中大黄素、大黄酚的色谱峰峰面积;M为供试品平均片重 (g) ;Ws为供试品取样量 (g) ;Vs为供试品溶液最后定容体积 (mL) ;为HPLC法校正因子 (mg/mL) :
式中, m为对照品称样量 (mg) ;Ai为对照品溶液中待测成分的色谱峰峰面积;VR1、VR2、VR3、、分别为大黄素、大黄酚对照品初次定容体积、稀释时移液管取样体积、最后定容体积 (mL) 。
2.2 不确定度各分量的量化
2.2.1 HPLC法校正因子的标准不确定度的评定
的不确定度来源于对照品溶液浓度和色谱峰测量的不确定度等。
2.2.1.1 大黄素对照品溶液浓度的不确定度U (C) 来源于大黄素对照品质量的不确定度和稀释定容体积的不确定度。而对照品质量的不确定度是由称样量和对照品纯度的不确定度组成:
2.2.1.1.1 大黄素对照品质量的不确定度
(1) 大黄素对照品称样量分别为10.55、10.60mg。因每次取样称量都是由相对独立的两次称量所得, 且使用同一台天平, 根据检定证书可知天平精度为0.00001g, 按矩形分布, 取包含因子, 大黄素对照品称样的相对不确定度, 故。 (2) 大黄素对照品由中国药品生物制品检定所提供, 纯度为100%, 由于没有不确定度的其他说明, 故假设为均匀分布, 其区间的半宽度a=0.0001, 按均匀分布计算得。
综合 (1) (2) , 故大黄素对照品质量的相对不确定度。
2.2.1.1.2 稀释定容体积的不确定度
由于本法中环境温度为20℃, 故实验室温度变化而引起的偏差可忽略。根据常用玻璃量器计量检定规程[4]可知:A级100mL量瓶的允许误差为±0.10mL, A级10mL移液管的允许误差为±0.020mL, 由于配制2份溶液, 按三角分布计算稀释定容体积的相对不确定度, 故:
由上可得, 大黄素对照品溶液浓度的不确定度:
2.2.1.2 大黄素对照品色谱峰峰面积的不确定度U (AR)
大黄素对照品色谱峰峰面积是用双标双样平行法进行测定的, 对照品称样量分别为10.55、10.60mg, 记录峰面积分别为393.62836、390.50327、392.27982、392.27856, 采用极差法计算, 取n=2时的极差系数C=1.13, 得到:
由上可得, 大黄素对照品色谱峰峰面积的不确定度
从而计算出大黄素对照品的大黄素=2.6902×10-5 (mg/mL) 。
2.2.1.3 大黄酚对照品溶液浓度的不确定度U (C) 同样来源于对照品质量的不确定度和稀释定容体积的不确定度。而对照品质量的不确定度同样是由称样量和对照品纯度的不确定度组成:
2.2.1.3.1 大黄酚对照品质量的不确定度
(1) 大黄酚对照品称样量分别为10.32、10.38mg。同理可得:大黄酚对照品称样的相对不确定度, 故。 (2) 大黄酚对照品由中国药品生物制品检定所提供, 纯度为100%, 由于没有不确定度的其他说明, 故假设为均匀分布, 其区间的半宽度a=0.0001, 按均匀分布换算得。
综合 (1) (2) , 故大黄酚对照品质量的相对不确定度。
2.2.1.3.2 定容体积的不确定度
同理, 由于本法中环境温度为20℃, 故实验室温度变化而引起的偏差可忽略。根据常用玻璃量器计量检定规程[4]可知:A级100mL量瓶的允许误差为±0.10mL, A级25m L移液管的允许误差为±0.030mL, 由于配制2份溶液, 按三角分布计算定容体积的相对不确定度, 故:
由上可得, 大黄酚对照品溶液浓度的不确定度:
2.2.1.4 大黄酚对照品色谱峰峰面积的不确定度U (AR)
同理, 大黄酚对照品色谱峰峰面积是用双标双样平行法进行测定的。大黄酚对照品称样量分别为10.32、10.38mg, 记录峰面积分别为1349.73206、1338.39990、1344.34082、1343.80872, 采用极差法计算, 取n=2时的极差系数C=1.13, 得到:
由上可得, 大黄酚对照品色谱峰峰面积的不确定度:
从而计算出大黄酚对照品的。
2.2.2 供试品溶液含量测定的不确定度评定
供试品溶液含量测定的不确定度来源于供试品溶液浓度和色谱峰测定的不确定度等。
2.2.2.1 供试品溶液浓度的不确定度U (CS) 来源于供试品的称样量和稀释定容引起的不确定度。
2.2.2.1.2 定容体积的不确定度
同理, 由于本法中环境温度为20℃, 故实验室温度变化而引起的偏差可忽略。根据常用玻璃量器计量检定规程[4]可知:A级25mL移液管的允许误差为±0.030mL, A级10mL移液管的允许误差为±0.020mL, A级25mL量瓶的允许误差为±0.03mL, 由于配制2份溶液, 按三角分布计算稀释定容体积的相对不确定度:
由上可得, 供试品溶液浓度的相对不确定度:
2.2.2.2 供试品溶液色谱峰峰面积的不确定度U (As)
2.2.2.2.1 供试品溶液中大黄素成分峰面积的不确定度
供试品称样量分别为0.3027、0.3048g, 每份供试品溶液2次测量的大黄素峰面积分别为381.19193、381.83142、381.12433、381.49844。, 供试品溶液中大黄素成分峰面积测定的标准不确定度按贝赛尔公式计算得:
, 同理可得S2=0.18705, 则相对不确定度:U (As1) =S1/As1=8.381×10-4, U (As2) =S2/As2=4.905×10-4;
2.2.2.2.2 供试品溶液中大黄酚成分峰面积的不确定度
测定中同时获得的每份供试品溶液2次测量的大黄酚峰面积分别为1029.78015、1031.32288、1030.24731、1031.16760。, 供试品溶液大黄酚成分峰面积测定的标准不确定度按贝赛尔公式计算得:
, 同理可得S2=0.46014, 则相对不确定度:U (As1) =S1/A1=7.485×10-4, U (As2) =S2/A2=4.464×10-4;
2.3 供试品溶液中大黄素和大黄酚的总含量
计算出供试品溶液中大黄素和大黄酚的总含量为1.8634mg/片。
2.4 合成相对不确定度
2.4 扩展不确定度
测定结果符合正态分布, 在置信概率为95%时, 选择包含因子K=2, 则扩展不确定度:
2.5 测量不确定度报告
含量测定的结果可表示为 (1.86±0.03) mg/片。
3 讨论
在测量结果的完整表述中, 测量不确定度是不能缺少的。分析结果的可靠性和准确性直接关系到药品的质量, 不确定度采用了统计学的方法给出了结果数据的分散性和置信水平。不确定度越小, 测量结果的可信程度越高, 使用的价值也越大。本文含量测定方法是采用双标双样平行法测定的, 在该法中, 由于配制供试品溶液和对照品溶液所处的环境温湿度的系统影响可因二者同时操作而消除了环境条件对测定的影响, 故评定出的含量测定扩展不确定度为0.03, 表明了供试品测定结果分散程度的水平, 使测定结果更加可靠。
参考文献
[1]国家质量技术监督局.《测量不确定度评定与表示》JJF1059-1999[S].北京:中国计量出版社, 1999.
[2]国家药典委员会编.中国药典一部[S].北京:化学工业出版社, 2005:328.
[3]国家药典委员会编.中国药典一部[S].北京:化学工业出版社, 2005:附录33.
[4]国家质量技术监督局.JJG196-2006常用玻璃量器检定规程[S].北京.中国计量出版社, 2006.
大黄素和大黄酚 篇2
1 仪器与试药
Waters2695高效液相色谱仪, 包括Waters2487紫外检测器, Empower色谱工作站;大黄素对照品 (中国药品生物制品检定所, 批号110756-200110, 含量测定用) , 大黄酚对照品 (中国药品生物制品检定所, 批号110796-200514, 含量测定用) ;甲醇为色谱纯, 水为超纯水, 其他试剂均为分析纯。驳骨灵酒由广西北流八仙制药厂提供;批号:070305等10批。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
参照《中国药典》大黄药材含量测定方法中的测定条件, 采用Inertsil C18 (250×4.6mm, 5μm) 色谱柱:甲醇-0.1%磷酸溶液 (85:15) 为流动相;流速:1.0ml/min;检测波长为 254nm。
2.2 对照品溶液配制
精密称取大黄素对照品6.57mg, 置200ml量瓶中;大黄酚对照品5.10mg, 置250ml量瓶中, 分别加甲醇使溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即得对照品溶液 (大黄素32.85μg/ml, 大黄酚20.40μg/ml) 。
2.3 供试品溶液的制备
精密量取供试品10ml, 置50ml圆底烧瓶中, 水浴上蒸去乙醇至约3ml, 加水7ml, 加盐酸2ml, 超声处理5min, 再加氯仿15ml, 加热回流1h, 冷却, 移置分液漏斗中, 用少量氯仿洗涤容器, 并入分液漏斗中, 分取氯仿层, 酸液用氯仿提取2次, 每次约10ml, 合并氯仿液, 氯仿液移至100ml锥形瓶中, 挥去氯仿, 残渣精密加甲醇10ml, 称定重量, 置水浴中微热溶解残渣, 放冷后, 再称定重量, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得。
2.4 阴性样品溶液的制备
取不含大黄的阴性供样品, 再按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。
2.5 系统适用性试验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各20μl, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 结果大黄素和大黄酚峰与其他各色谱峰相互之间分离度均大于1.5, 理论板数大黄素峰计算不低于3000, 阴性样品色谱在大黄素和大黄酚对照品峰相应位置上无干扰, 见图1。
2.6 线性关系考察
精密称取大黄素对照品13.64mg, 置200ml量瓶中, 加甲醇使溶解并稀释至刻度, 精密量取1.25、2.5、5.0、7.5、10ml, 分别置10ml量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 作为大黄素对照液。精密称取大黄酚对照品8.06mg, 置200ml量瓶中, 加甲醇使溶解并稀释至刻度, 精密量取1.25、2.5、5.0、7.5、10ml, 分别置10ml量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 作为大黄酚对照液。分别精密吸取上述对照品溶液各20μl, 注入液相色谱仪, 测定。以进样量为横坐标, 峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线, 计算回归方程分别为:Y=61384X-1324 r=0.9997, Y=82713X-3451 r=0.9999, 结果表明大黄素在进样量0.1705～1.364μg, 大黄酚在进样量0.1008～0.8064μg范围内线性关系良好。
2.7 精密度试验
精密取同一对照品溶液20μl, 重复进样6次, 测定大黄素的峰面积。结果RSD为0.1% (n=6) 。表明精密度良好。
2.8 稳定性试验
分别精密取同一供试品溶液 (070305批) 20μl, 于0、2、4、6、12、24 h进样, 测定面积, 结果大黄素RSD为0.73% (n=6) , 大黄酚RSD为0.69% (n=6) 结果表明供试液在24h内稳定。
2.9 重复性试验
取同一批号样品 (070305批) 6份, 按“2.3”项下方法制备供试品, 依法测定大黄素含量:34.52μg/ml, RSD =0.36% (n=6) , 大黄酚含量:16.71μg/ml, RSD =0.22% (n=6) , 结果表明方法的重复性好。
2.10 加样回收率试验
精密量取同一批号样品 (大黄素含量34.52μg/ml, 大黄酚含量:16.71μg/ml, ) 各5ml共取6份, 精密称定, 分别精密加入对照品溶液 (大黄素0.0343mg/ml、大黄酚0.01702mg/ml) 5ml, 按“2.3”项下方法制备供试品, 进样20μl测定, 计算回收率, 结果见表1、表2。
2.11 样品含量测定
取样品按“2.3”项下方法制备供试品, 进样20μl测定, 按外标法计算含量, 结果见表3。
注:A:大黄素对照品;B:大黄酚对照品;C:供试品;D:阴性样品
3 讨论
用HPLC法测定含大黄素、大黄酚的中药制剂文献中多见有报道[1,2,3], 方法简便宜, 结果准确, 可有效控制药品质量。参照《中国药典》大黄药材含量测定方法, 对驳骨灵酒中大黄素、大黄酚的含量测定进行研究, 在此色谱条件下, 大黄素、大黄酚主峰无干扰, 理论板数按大黄素峰计均在3000以上, 主峰前、后分离度均>1.5, 完全达到药典含量检测的规定和要求。本法操作简便, 测定结果表明准确, 精密度和稳定性良好, 能有效地控制驳骨灵酒的质量。
参考文献
[1]王亚林, 索银科, 刘学东.HPLC法测定清热消炎片中大黄素和大黄酚的含量[J].西北药学杂志, 2004, 19 (5) :207-208.
[2]张玉臣, 刘学东, 王永平, 等.HPLC测定大黄通便颗粒中大黄素和大黄酚的含量[J].中成药, 2005, 27 (4) :478-479.
大黄素和大黄酚 篇3
1仪器与试药
Agilent 1200型高效液相色谱仪:1260型高压泵;1260 DAD检测器。梅特勒AE240电子分析天平 (梅特勒公司生产) , KQ100 超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) 。大黄素、大黄酚对照品批号分别为: 110756-200110、110796-200615, 均购自中国药品生物制品检定所;新健胃片:20120305, 20120306, 20120307批由承德颈复康药业集团生产;甲醇为进口色谱纯 (美国) ;水为重蒸水;其它试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱 Agilent C18柱 (4. 6mm × 250 mm, 5μm) ;柱温 25℃;流动相甲醇-0. 1%磷酸 (75∶ 25) ;流速1. 0 ml/min;检测波长254nm;进样量10 μL;理论板数按大黄素峰计算, 应不低于4500。
2.2 对照品溶液的制备
取大黄素、大黄酚对照品适量, 精密称定, 加甲醇制成每1 ml含大黄素10 μg、大黄酚20 μg 的混合对照品溶液, 摇匀, 即得。
2.3 供试品溶液的制备
取本品20片, 研细, 称取2.0 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇 50 ml, 称定重量, 加热回流 1.0 h, 放冷, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀, 滤过。精密量取续滤液 25 ml, 挥去溶剂, 加8 %盐酸液15 ml, 超声处理2 min, 再加三氯甲烷15 ml, 加热回流1 h, 放冷, 置分液漏斗中, 用少量三氯甲烷洗涤容器, 并入分液漏斗中, 分取三氯甲烷层, 酸液再用三氯甲烷提取4次, 每次15 ml, 合并三氯甲烷液, 70 ℃[4]水浴蒸干, 残渣加甲醇使溶解, 转移至10 ml 量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 滤过, 即得。
2.4 阴性对照溶液制备
按处方比例除去大黄, 制成阴性对照样品, 按“2.3”制备阴性对照品溶液。
2.5 干扰试验
精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各 10 μL, 在上述色谱条件下分别进样, 记录色谱图。结果, 供试品溶液在相应位置上有大黄素、大黄酚色谱峰, 分离完全, 而阴性对照溶液在相应位置上无干扰峰, 见图1。
2.6 线性关系考察
分别称取大黄素、大黄酚对照品适量, 精密称定, 加甲醇制成含大黄素、大黄酚为40、80 μg/ml的对照品贮备溶液, 再分别精密吸取贮备液1、2、3、4、5 ml置10 ml量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 按测定方法测定, 以样品的浓度为横坐标 (X) 、测得的峰面积值为纵坐标 (Y) , 进行线性回归, 得大黄素回归方程为Y1=26.54X+0.04 (r2=0.9999) ;大黄酚回归方程为Y2=24.07X-4.8 (r2=0.9998) , 结果表明大黄素在0.0414～0.207 μg范围内线性关系良好, 大黄酚在0.080～0.400ug范围内线性关系良好。
2.7 精密度试验
取供试品溶液按上述色谱条件重复进样6次, 结果大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为0.21%, 0.17%, 表明精密度良好。
2.8 重复性试验
取同一批样品 (批号:120305) 5份, 按上述方法和色谱条件制成供试品溶液并测定, 计算大黄素和大黄酚的含量, 其RSD值分别为0.87%、0.68%, 表明重复性良好。
2.9 稳定性试验
取精密度试验供试品溶液, 分别在0, 2, 4, 6, 8 h进样测定, 结果大黄素、大黄酚峰面积的RSD为0.35%, 0.28%, 表明供试品溶液在8 h内稳定。
2.10 回收率试验
取同一批次已知含量的样品 (批号:120305) 约1.0 g, 精密称定, 共取9份, 分别精密加入大黄素、大黄酚对照品适量, 按上述方法制成供试品溶液并测定, 分别计算回收率。结果见表1, 表2。
2.11 样品测定
取3批样品 (批号:120308, 120309, 120310) , 按照“2.3”制备供试品溶液, 依上述色谱条件测定, 结果见表3。
3讨论
3.1 指标成分的确定
根据相关的文献报道, 大黄中5种蒽醌类成分的检测色谱条件均为C18色谱柱, 波长在254nm下检测, 本试验中发现, 大黄素, 大黄酸不能有效地分离, 特别是芦荟大黄素, 考虑到大黄主要成分为大黄素, 大黄酚, 因此选择了两种成分作为质控指标。
3.2 提取方法的优化
试验过程中对大黄素, 大黄酚的提取方法[5], 提取温度, 萃取次数进行了优选, 结果回流法提取的各成分含量高, 超声法偏低, 与相关的文献报道[6,7]的有所不同, 可能与处方中含有的碱性成分有关;提取温度在75℃时提取的大黄素, 大黄酚含量最高;提取液萃取4次后, 有效成分在液相色谱中均未检出。
参考文献
[1]国家药品标准 (试行) 颁布件 (批件号:WS-10080 (ZD-0080) -2002) .
[2]国家药典委员.中华人民共和国药典, 一部.北京:中国医药科技出版社, 2010:282-283.
[3]国家药典委员.中华人民共和国药典, 一部.北京:中国医药科技出版社, 2010:22-23.
[4]刘丹, 毋福海, 曾承辉.毛细管电泳法测定一清颗粒中七种成分的含量.中国医药工业杂志, 2009, 40 (11) :840-843.
[5]王小凤, 樊淑彦, 何晓文.山庄降脂片中橙黄决明素、大黄素和大黄酚的HPLC测定.中国医药工业杂志, 2009, 40 (10) :770-772.
[6]张红霞, 金艺, 许海燕, 等.HPLC法测定胃力片中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量.沈阳药科大学学报, 2007, 24 (7) :417-419.
大黄素和大黄酚 篇4
关键词：肾康胶囊,HPLC法,大黄酚,大黄素
肾康胶囊是酒泉市中医院协定处方, 由大黄、黄芩、半夏、柴胡、太子参等中药材组成, 具有和解脏腑、益气降浊之功效。对慢性肾功能不全、慢性肾炎、症见头晕乏力、恶心、呕恶、血肌苷及尿素氮升高等症有较好的临床疗效。本实验对肾康胶囊中大黄素、大黄酚进行含量测定和方法验证, 为肾康胶囊的质量标准制定提供参考。
1 仪器与试药
LC-20A高效液相色谱仪 (UV检测器) ;AE240电子天平;KH-250DB型超声波清洗器。
大黄素 (110756-200110) 、大黄酚 (110796-200716) 均购自中国食品药品检定研究院, 肾康胶囊样品及阴性对照均由酒泉市中医院制剂室提供。甲醇为色谱纯 (山东禹王实业有限公司化工分公司) , 纯化水由大得利制药有限公司提供, 其它试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Thermo C18柱 (4.6mm×250mm, 5μm) ;流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液 (80∶20) ;流速:1.0mL/min;检测波长:254nm;柱温:30℃;理论塔板数按大黄酚峰计不低于3 000。
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液制备
精密称取大黄素和大黄酚对照品适量, 加甲醇制成含大黄素、大黄酚分别为10μg/mL、8μg/mL的溶液即可。
2.2.2 供试品溶液制备
取本品内容物适量 (约相当于5g) , 加甲醇50mL, 加热回流提取40min, 滤过, 取滤液50mL, 挥去甲醇, 残渣加10%的盐酸溶液10mL, 超声提取, 加氯仿10mL, 回流提取1h, 分取氯仿层, 酸液用8mL氯仿提取2次, 合并氯仿液, 残渣加甲醇溶解并稀释至25mL即可。
2.2.3 阴性对照溶液制备
取阴性样品, 按供试品溶液制备方法操作, 即可。
2.3 方法学考察
2.3.1 系统适应性试验
按“2.1”项下色谱条件, 分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液10μL进行测定。供试品溶液色谱在与对照品溶液主峰的保留时间处有色谱峰, 阴性对照在大黄酚、大黄素保留时间处无干扰, 大黄素、大黄酚与其他组分达到完全分离效果。见图1。
A对照品;B供试品;C阴性对照
2.3.2 线性关系
分别精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液各2、4、8、16、32、64μL, 按“2.1”色谱条件进样测定, 记录色谱图及峰面积。以峰面积 (Y) 为纵坐标, 进样量 (X) 为横坐标, 分别计算大黄酚与大黄素的回归方程。结果表明:进样量大黄酚在0.02~0.64μg之间, 大黄素在0.016~0.512μg之间时, 进样量与峰面积之间线性关系呈良好, r分别为0.9996、0.9994。
2.3.3 精密度试验
精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液, 在“2.1”色谱条件下连续进样5次, 记录峰面积, 计算大黄素与大黄酚含量, 结果5次进样RSD分别为0.97%和1.36%。表明该方法精密度良好。
2.3.4 稳定性试验
精密量取供试品溶液10μL, 按“2.1”色谱条件, 在0、3、6、9、12h时间进行测定, 记录色谱图及峰面积, 大黄素测定的RSD为2.48%;大黄酚RSD为2.87%。结果表明, 大黄素与大黄酚在12h内比较稳定。
2.3.5 重复性试验
取同一批号样品5份, 按“2.2.2”项下方法制备, 按“2.1”色谱条件测定, 结果本批样品的平均含量为:大黄素0.2228mg/g, RSD为1.12%;大黄酚0.1367mg/g, RSD为1.56%, 表明该方法重复性良好。
2.3.6 加样回收率试验
取本品共6份 (含大黄酚、大黄素分别为0.1367mg/g、0.2228mg/g) , 精密称定, 分别精密加入定量的大黄酚和大黄素对照品, 按“2.2.2”项下方法制备, 进样10μL, 计算平均回收率, 结果见表1。
试验结果表明:本处方样品中大黄素的加样回收率为96.77%, RSD为1.62%;大黄酚的加样回收率为97.18%, RSD为1.13%。
2.3.7 样品含量测定
称取3批样品各3份, 按“2.2.2”项下方法制备, 照“2.1”色谱条件测定, 并根据测得峰面积计算出每批样品的含量, 结果见表2。
3 讨论
本处方中大黄为主药, 选用HPLC对大黄中大黄酚、大黄素进行定量分析。在样品的提取过程中, 曾分别用回流提取法和超声提取法, 结果大黄酚、大黄素不能达到完全分离的效果, 且杂质峰较多, 采用本法进行提取, HPLC结果表明样品提取完全, 杂质峰较少, 效果较为理想。本试验的HPLC图谱表明阴性对照液无干扰, 重现性好, 专属性强, 可以在同一色谱条件下测定大黄酚、大黄素两种成分的含量, 为该制剂中酸枣仁质量控制提供参考。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社, 2010:22.
[2]王洁, 张嫱, 张一鸣, 等.超声提取合HPLC测定三黄片中大黄素和大黄酚的含量[J].辽宁中医药大学学报, 2010, 12 (11) :62-64.
[3]赵晨.HPLC法测定四黄泻火片中大黄素及大黄酚的含量[J].中国药师, 2010, 13 ( (10) :101-103.
大黄素和大黄酚 篇5
1 仪器与试药
1.1 仪器
SHMADZVLC-10Avp, LC-10ATvp型泵, SCL-10Avp型控制器, SPD-10AVP型检测器, CLASS-VP色谱工作站, 岛津UA-1700型紫外-可见分光光度计。Sartovius BP121S (d=0.1mg) , BP211D (d=0.01mg) 电子分析天平。HU3120B超声波清洗器 (120W, 40KHZ;天津市东科仪器设备有限公司) 。
1.2 试剂与试药
大黄酚对照品 (批号:110796-200310, 中国药品生物制品检定所提供, 供含量测定用) ;甲醇为色谱纯, 磷酸为分析纯, 水为高纯水。
1.3 样品
壮西-10样品及大黄原料药材由呼伦贝尔市中蒙医院提供。
2 方法验证
2.1 色谱条件
色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶, 本实验采用Diamonsil (钻石) C18柱 (250mm×4.6mm;5μm) 。Phenomenex C18柱 (250mm×4.6mm;4μm) , 流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液 (85:15) , 检测波长为254nm, 流速为1.0mL·min-1, 采用25℃柱温, 理论板数按大黄酚峰计不得低于2 000。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取大黄酚对照品适量, 加甲醇制成每1mL含9μg的溶液, 即得。
2.3 供试品溶液及阴性对照溶液的制备
取本品研细, 取约1.0g, 精密称定, 置锥形瓶中, 精密加入甲醇25mL, 称定重量, 加热回流1h, 放冷, 再称定重量, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀、滤过。精密量取续滤液10mL, 置锥形瓶中, 挥去甲醇, 加8%盐酸溶液10mL, 超声处理 (功率120W, 频率40KHZ) 5min使溶解, 加三氯甲烷10mL, 加热回流1h, 冷却, 移置分液漏斗中, 用少量三氯甲烷洗涤容器, 并入分液漏斗中, 分取三氯甲烷液, 酸液用三氯甲烷提取4次 (15mL、15mL、10mL、10mL) , 合并三氯甲烷液, 置水浴上低温蒸干, 残渣加甲醇使溶解, 转移至25mL量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得。
另取按处方量并以相同工艺制备的阴性对照 (缺大黄) 适量, 依上法操作即得阴性对照液。
2.4 阴性对照试验
在上述色谱条件下, 分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各20μL, 注入液相色谱仪, 测得结果为:阴性对照色谱中在与大黄酚对照品以及供试品色谱中相对应的保留时间处无色谱峰出现, 表明其它组分对大黄酚的测定无干扰。见图1、图2、图3、图4。
2.5 线性关系考察
精密称取大黄酚对照品2.61mg, 置150mL量瓶中, 加甲醇使溶解, 并稀释至刻度, 摇匀作为对照品溶液 (相当于含大黄酚0.0174mg/mL) 精密吸取1、3、5、7、9、10mL分别置10mL量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 各取20μL进样, 按上述色谱进样量进行回归分析, 结果大黄酚在0.0348~0.3480mg/m L范围内呈良好的线性关系。回归方程为:Y=6702747X-26257, r=0.9999。
2.6 稳定性试验
取同一份供试品溶液, 分别于配制后0h、2 h、4h、8h、10h、12h进样测定, 结果大黄酚峰面积积分值基本稳定, RSD为1.1%, 结果表明在12h内供试品溶液基本稳定。
2.7 精密度试验
精密吸取同一份供试品溶液, 连续进样5次, 测定大黄酚峰面积积分值, RSD为1.0%。
2.8 重复性试验
取同一批号 (批号20060301) 供试品6份, 各约1.0g, 精密称定, 分别按含量测定项下方法操作, 测得每份供试品含量, 结果平均含量为0.6940mg/g, RSD为1.45%。表明效果较好。
2.9 加样回收试验
取供试品 (批号20060301, 含量0.6940mg/g) 9份, 各约0.50g, 精密称定, 分别在其中3份中各精密加入浓度为0.0348mg/m L的大黄酚对照品甲醇溶液5mL, 再分别精密加入甲醇20mL;另3份各精密加入浓度为0.0348mg/m L的大黄酚对照品甲醇溶液10mL, 再分别精密加入甲醇15mL;其余3份各精密加入0.0348mg/mL的大黄酚对照品甲醇溶液15mL, 再分别精密加入甲醇10mL, 分别按“含量测定”项下方法操作, 测定每份含量计算回收率, 结果见表1。
2.1 0 供试品含量测定
分别精密吸取2.2对照品溶液和2.3供试品溶液各20μL, 在2.1色谱条件下进行测定。供试品含量测定结果见表2。
3 讨论
检测波长的选择:取大黄酚对照品溶液, 于岛津UA-1700型紫外可见分光光度仪上, 自200~500nm做光谱扫描, 结果大黄酚在223nm处有最大吸收, 为排除杂质干扰, 确定检测波长为254nm。
提取方法的选择及提取效率的考察:参照《中国药典》2005年版一部“大黄”含量测定项下的方法, 样品中加甲醇加热回流提取蒽醌类化合物, 挥去甲醇后, 加盐酸酸化水解, 使蒽醌化合物全部游离, 加三氯甲烷加热回流提取, 分取三氯甲烷层, 再用三氯甲烷萃取以除去极性较大的杂质, 为了使蒽醌化合物全部游离并使游离态蒽醌提取完全, 实验中考察了加8%HCl 10mL和20mL水解, 用三氯甲烷萃取3次、4次对提取效率的影响结果表明:加8%HCl 10mL与加20mL无明显区别, 用三氯甲烷萃取4次供试品中大黄酚含量基本不再增加, 故将提取次数立为4次, 加8%HCl 10mL进行提取。
摘要：目的:建立蒙成药壮西-10丸中大黄酚的含量测定方法。方法:采用高效液相色谱法测定壮西-10丸中大黄酚的含量。结果:大黄酚的线性范围为0.0348～0.348mg/mL (r=0.9999) , 平均加样回收率97.08%, RSD为1.45% (n=5) 。结论:该方法灵敏、准确、重复性好、专属性强, 适合壮西-10丸的质量控制。
关键词：蒙成药,壮西-10味丸,HPLC,大黄酚,含量测定
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典 (一部) [S].北京:化学工业出版社, 2005.