玉米须总皂苷

玉米须总皂苷（精选7篇）

玉米须总皂苷 篇1

摘要：以玉米须为试验材料, 对玉米须总皂苷的水浴提取工艺进行了研究, 并对总皂苷提取物的抑菌活性进行了探讨。在单因素试验的基础上, 通过L16 (45) 正交试验, 确定总皂苷最佳提取条件:乙醇浓度75%、提取温度65℃、提取时间120min、液料比40∶1mL/g和提取2次, 在此条件下, 总皂苷含量达2.667g/100g。在试验范围内, 玉米须总皂苷提取物对供试菌均有不同程度的抑制作用, 并随着提取物浓度的升高, 抑菌作用逐渐增强;当提取物为30mg/mL时, 对变形杆菌的抑制作用最强;其次为沙门氏菌和枯草杆菌;对金黄色葡萄球菌的抑制效果最差。

关键词：玉米须,总皂苷,水浴提取,抑菌活性

玉米须是禾本科玉蜀属植物玉米的花柱和柱头。它含有多种活性成分, 如树胶状物、苦味糖苷、挥发油、多糖、β-谷甾醇、黄酮类、皂苷类与生物碱类化合物等。具有显著的消肿利尿、清热解毒、平肝、利胆、降血糖、止血抑菌、降压、增强免疫和抗癌等功效。

我国玉米种植面积约为2 350万hm2, 玉米产量居世界第2位, 估算玉米须的产量为750万t以上。玉米须来源丰富、价格低廉, 但只有少部分入药, 绝大部分都白白浪费掉了, 但玉米须药理价值与食疗特征兼备。鉴于此, 全面开发利用玉米须资源, 具有广阔的研究与开发前景。

皂苷是广泛存在于植物界的生理活性广泛的一种特殊的苷类。皂苷普遍具有祛痰止咳、祛风湿、降胆固醇、抗炎抑菌、免疫调节、兴奋或抑制中枢神经、抗肿瘤及抗真菌作用。尽管方敏等人确定了比色法测定玉米须皂苷的方法;李坦等人优化了玉米须蚕茧总皂苷的提取工艺;但对玉米须总皂苷的提取方法上研究的相对较少, 尚无成形工艺。研究表明:玉米须乙醇提取物对细菌具有一定的抑制作用。本文对玉米须总皂苷的水浴提取进行了研究, 并对总皂苷提取物的抑菌活性进行了探讨, 旨在为进一步综合开发利用玉米须资源提供一定的理论指导。

1 试验材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米须 (2010年产) , 购自新乡胖东来医药超市;大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、产气杆菌和枯草杆菌等均由河南科技学院食品学院微生物学试验室提供;人参皂苷Rg1对照品, 购自上海同田生物技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯;牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g和蒸馏水1 000mL, pH值7.0～7.2。

1.2 主要仪器与设备

FW-400A倾斜万能高速粉碎机, 北京中兴伟业仪器有限公司;SHA-C水浴恒温振荡器, 金坛市杰瑞尔电器有限公司;WFJ7200可见分光光度计, 上海尤尼柯仪器有限公司;RE52-98旋转蒸发器, 上海亚荣生化仪器厂;SW-CJ-IB型超净工作台, 苏州净化设备有限公司;高压灭菌锅LB-50L, 江阴滨江医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 测总皂苷含量标准曲线绘制

采用陈勋等人的方法, 并稍作修改。称取干燥至恒重的人参皂甙Rg1对照品22.5mg, 用60%乙醇溶解并定容至50mL, 作为对照品溶液。分别准确移取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mL于具塞试管中, 用60%乙醇补充至0.5mL后, 依次加入0.2mL新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液和0.8mL高氯酸, 60℃水浴15min, 流水冷却, 加5mL冰醋酸, 静置20min后, 在548nm处测吸光度, 60%乙醇随行空白。以皂苷含量为纵坐标, 吸光度为横坐标, 绘制皂苷含量测定标准曲线。

1.3.2 玉米须总皂苷的提取方法

玉米须经干燥、粉碎 (过40目筛) 、石油醚脱脂后, 密封置4℃冰箱, 备用。准确称取上述样品2g, 用一定体积的乙醇溶液水浴提取后, 过滤得上清;滤渣继续用相同体积、相同浓度乙醇溶液提取1次, 过滤后, 合并滤液, 减压浓缩后, 用50mL去离子水溶解, 依次用3倍体积乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取3次, 正丁醇层减压浓缩后, 得玉米须总皂苷提取物;将其配制成一定浓度的样液后, 按照标准曲线1.3.1的方法测定玉米须中总皂苷含量。

1.3.3 玉米须总皂苷提取物的抑菌作用

(1) 不同浓度玉米须总皂苷提取物的制备。取脱脂后玉米须粉, 加入75%乙醇, 液料比为80∶1g/mL, 65℃水浴120min, 按1.3.2中的方法得玉米须总皂苷提取物, 制成10、20和30mg/mL的溶液备用。

(2) 抑菌效果试验。

细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基。将供试的大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、产气杆菌和枯草杆菌分别接种到装有培养基的试管内, 于37℃培养24h。取活化好的菌种斜面, 用无菌生理盐水配制成 (1～10) ×106CFU/mL的菌悬液, 备用。以十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.4 数据处理

采用软件SPSS11.5进行统计分析, 结果以平均数±标准误 (x±S) 表示, 差异显著性分析采用LSD检验法。

2 结果与分析

2.1 玉米须总皂苷提取单因素

2.1.1 乙醇浓度对总皂苷含量的影响

准确称取脱脂玉米须粉2g, 加入60mL不同浓度的乙醇, 在65℃水浴提取60min后, 测定总皂苷含量, 考察乙醇浓度对提总皂苷取效果的影响。由图1可知:在乙醇低浓度范围内, 随乙醇浓度增加, 玉米须总皂苷含量增加;当乙醇浓度为85%时, 玉米须总皂苷含量达最高值;乙醇浓度继续升高后, 玉米须总皂苷含量呈下降趋势。因此, 乙醇最佳浓度为85%。

2.1.2 提取温度对总皂苷含量的影响

准确称取脱脂玉米须粉2g, 加入75%乙醇溶液60mL, 分别在不同温度下水浴提取60min后, 测定总皂苷含量, 考察提取温度对提取效果的影响。由图2可知:随提取温度升高, 玉米须总皂苷含量先上升再下降。当温度在45～75℃时, 随提取温度增加, 玉米须总皂苷含量增加显著;当提取温度为75℃时, 玉米须总皂苷含量为最高值;温度大于75℃时, 随提取温度增加, 玉米须总皂苷含量下降。因此, 提取温度选择75℃为宜。

2.1.3 提取时间对总皂苷含量的影响

准确称取脱脂玉米须粉2g, 加入75%乙醇溶液60mL, 在65℃水浴中提取不同时间, 测定总皂苷含量, 考察提取时间对提取效果的影响。由图3可知:提取时间在50～90min时, 玉米须总皂苷含量增加幅度较大;当提取时间超过90min后, 随着提取时间延长, 玉米须总皂苷含量略有下降;因此, 最优提取时间为90min。

2.1.4 液料比对总皂苷含量的影响

准确称取脱脂玉米须粉2g, 加入不同液料比的75%乙醇溶液, 在65℃水浴提取60min后, 测定总皂苷含量, 考察液料比对总皂苷含量的影响。由图4可知:液料比从20∶1增加至30∶1时, 玉米须总皂苷含量增加较为显著;液料比大于30∶1时, 玉米须总皂苷含量增加不明显。从提取效果、减少溶剂用量以及降低浓缩负荷等方面考虑, 宜选择液料比为40∶1mL/g。

2.2 正交试验

在单因素试验基础上, 进行了正交试验。由表1可知:极差R直观反映出各因素对玉米须总皂苷含量影响的顺序:乙醇浓度>提取温度>提取时间>液料比, 即乙醇浓度对玉米须总皂苷提取的影响最大, 液料比影响最小。由表2可知:乙醇浓度和提取温度对玉米须总皂苷含量的影响显著 (P<0.05) , 其他因素影响不显著。正交试验结果显示, 玉米须总皂苷最优提取条件为A2B2C3D2, 即乙醇浓度为75%、提取温度为65℃、提取时间为120min、液料比为40∶1和提取为2次。

2.3 验证试验

按正交试验确定的水浴最优提取条件, 在提取温度65℃, 乙醇浓度75%, 液料比40∶1情况下, 提取时间120min, 测得玉米须总皂苷含量为2.667g/100g, 比正交试验结果中的较优组合 (A2B4C3D2) 含量高, 表明此正交试验得出的最优组合是符合实际的。

2.4 玉米须总皂苷的抑菌作用

玉米须总皂苷提取物对供试菌株均有不同程度的抑制作用;提取物浓度增高, 抑菌效果增强 (见表3) 。其中, 30mg/mL的提取物对变形杆菌的抑制程度最强, 抑菌圈直径可达29.5mm, 其次为沙门氏菌与枯草杆菌, 对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最差, 低浓度下无抑制。可见, 玉米须总皂苷提取物对食品常见病原菌具有一定的抑制效果, 作为绿色天然防腐剂开发前景广阔。

注:“—”表无抑制作用;同列间相比, 有相同字母者差异不显著 (P>0.05) , 无相同字母者差异显著 (P<0.05) 。

3 结论

在单因素基础上, 进行了正交试验, 确定玉米须总皂苷水浴提取的最佳条件:乙醇浓度75%、提取温度65℃、时间120min和液料比40:1, 总皂苷含量为2.667g100g (以人参皂苷Rg1计) 。各提取因素对玉米系总皂苷含量影响的顺序为:乙醇浓度>提取温度>提取时间>液料比。各种提取因素中, 乙醇浓度和提取温度对玉米须总皂苷的提取效果影响显著 (P<0.05) 。

玉米须总皂苷提取物对变形杆菌的抑制作用最强, 对沙门氏菌和枯草杆菌等也有较好的抑菌效果。玉米须总皂苷作为天然食品防腐剂应用前景广阔, 值得进一步研究开发。

玉米须总皂苷 篇2

玉米须(stigma maydis)是禾本科植物玉蜀黍的花柱和柱头,是一种传统的中草药,在《全国中草药汇编》《中药大辞典》等当代中医药典籍中都有记载,其性味甘、平,有降压、利尿、泄热、平肝、利胆等功效。现代药理研究证实玉米须有显著的利尿、降血糖、抑菌、抗肿瘤、治疗胆汁淤积性肝病等作用[1,2,3,4,5,6],玉米须含有多种化学成分,如挥发油、皂苷、黄酮、多糖、有机酸、维生素K3、维生素E及少量的生物碱[2,6]。玉米须提取物中总黄酮、多糖的含量测定已有文献报道[7,8,9],总皂苷的含量测定尚未见文献报道。玉米须提取物治疗糖尿病取得了较好的效果[10,11,12,13],玉米须总皂苷是其降糖的主要活性部位之一[5,14,15,16],测定玉米须提取物中总皂苷的含量,有助于玉米须提取物的量化研究,也有助于深入探讨玉米须总皂苷降糖的机制。文献对中药成分中总皂苷的含量测定报道较多[17],大孔吸附树脂-比色法是近10多年来发展起来的一种新方法,其去除干扰成分效果好,样品损失少,操作简便,本文建立了一种大孔吸附树脂-比色法测定玉米须提取液中总皂苷含量的方法。

1 材料和方法

1.1 仪器

AL204电子分析天平(METTLER TOLEDO上海天平仪器厂),WH-90A微型混合器(上海亚荣生化仪器厂),FW80高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司),Beckman Allegra TM64R离心机,Millipore纯水仪,CQ-250型超声仪(上海超声波仪器厂),78HW-2恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司),GM-0.15II隔膜真空泵(天津市腾达过滤器件厂),SHB-IIIA循环水式多用真空泵(河南省太康科教仪器厂),UV-160紫外分光光度仪(日本岛津),CS-9301薄层色谱扫描仪(日本岛津),RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试剂

玉米须(中国杭州胡庆余堂医药集团公司供应,山东产),乙醇(杭州化学试剂有限公司,AR),甲醇(杭州化学试剂有限公司,AR),香草醛(上海双喜香料助剂厂,AR),高氯酸(上海金鹿化工有限公司,AR),醋酸、氢氧化钠(杭州化学试剂有限公司,AR),D101大孔吸附树脂(天津海光化工有限公司),微孔滤膜(直径50 mm,0.45μm,上海亚东核级树脂有限公司),人参皂苷Rb1(中国药品生物制品检定所,批号110704-200318),水为18.2ΜΩ超纯水,其他试剂均为分析纯。

1.3 样品处理

取玉米须,除杂后,80℃干燥至恒重,粉碎备用。

1.4 玉米须提取液的制备

采用水回流提取方法,取已处理的玉米须10g,用超纯水100 m L浸泡1 h,装入索氏提取柱中,烧瓶中再加入50 m L超纯水。沸水浴1 h,稍冷,加超纯水100 m L,提取30 min。收集提取液,高速离心,滤膜过滤,收集滤液,即得玉米须提取液。

1.5 大孔吸附树脂柱的制作

取D101大孔吸附树脂5 g,用95%乙醇浸泡过夜后,湿法装柱(1.0 cm×28.0 cm),随即用95%乙醇进行洗脱至流出物与水混合(1︰1)不发生浑浊,然后用蒸馏水洗至无醇味。

1.6 玉米须总皂苷的纯化与富集

将玉米须提取液以流速为2 m L/min通过大孔吸附树脂柱,待溶液全部进柱后,分步用2个柱体积蒸馏水、1.5个柱体积0.1%Na OH溶液、1个柱体积的15%乙醇进行洗脱,以除去糖类、黄酮类等水溶性杂质,弃去洗脱液。再以70%乙醇洗脱至无玉米须皂苷洗出[18](薄层色谱法检查:硅胶H-CMC-Na板,正丁醇-乙酸乙酯-水(4︰1︰5)上层,5%磷钼酸乙醇液,110℃显色)。收集洗脱液,将洗脱液旋转蒸发浓缩,回收乙醇,得清膏10 m L。

1.7 对照品溶液及供试品溶液的配制

1.7.1 对照品溶液

准确称取干燥至恒重的标准品Rb161 60 mg于10 m L容量瓶中,用甲醇定容,得质量浓度为6.160 mg/m L标准贮备液,装入棕色瓶中保存备用。吸取5 m L标准贮备液,用甲醇稀释定容至50 m L,得浓度为0.616 mg/m L的标准溶液备用。

1.7.2 供试品溶液

取5 m L容量瓶,精密称定,取已制备的清膏适量置容量瓶中,精密称定,得清膏重,加5m L甲醇,超声振荡15min(温度为25℃);3 500r/min离心20 min,取上清液。用甲醇定容至5 m L。放冷,过0.45μm滤膜,待用。

1.8 测定波长的选择

精密吸取对照品溶液及供试品溶液各0.5 m L,按“1.9”项下操作,分别在400～800 nm进行扫描,结果显示,对照品及样品均在530 nm处有最大吸收峰,故确定测定波长为530 nm。见图1。

1.9 标准曲线的制备

精密吸取对照品溶液0.40、0.60、0.80、1.00和1.20 m L置玻塞刻度试管中,挥去溶剂,加新配制的5%香草醛-冰乙酸0.5 m L,高氯酸0.8 m L,于60℃水浴中加热15 min,立即放入冰浴中冷却,加冰乙酸稀释到5 m L,摇匀,得质量浓度分别为0.05、0.07、0.10、0.12和0.15 mg/m L的系列溶液,室温放置10min,在530 nm处测定吸收度,同时以试剂为空白。以浓度为纵坐标,吸收值为横坐标,得回归方程:Y=0.1291,X=0.0018,(r=0.9918),线性范围:0.05～0.15 mg/m L。见图2。

2 结果

2.1 样品的测定

配制供试品溶液9份,精密吸取25μL,挥去溶剂,加新配制的5%香草醛-冰乙酸0.5 m L,高氯酸0.8 m L,于60℃水浴中加热15 min,立即放入冰浴中冷却,加冰乙酸稀释到5 m L,摇匀,室温放置10min,在530 nm处测定吸收度,结果见表1。

2.2 精密度试验

取“1.9”项下浓度为0.05、0.10和0.15 mg/m L的溶液各1份,分别重复测定6次,记录A值进行统计分析,RSD分别为3.92%、3.05%和4.24%,表明本方法具有良好的重现性,分析测试条件合理。

2.3 加样回收率试验

取3份已知皂苷含量的清膏适量,分别置于已精密称定容量瓶中,精密称定总重量,得清膏重;精密称取人参皂苷Rb1标准品0.02 g,加入到上述容量瓶中,按“2.1”项进行操作,测定回收率。结果见表2。

3 讨论

玉米须作为玉米的副产物,资源十分丰富,但对它的开发利用非常有限,大部分被白白浪费掉,随着近年来对玉米须的研究加深,表明其在医药、食品方面均有很好的应用前景。总皂苷是玉米须提取物降糖的主要活性部位,可提高小鼠糖尿病模型的糖耐量,对小鼠糖尿病模型胰岛细胞及肾脏均有保护作用[5,10,14]。文献对玉米须总皂苷研究均采用重量法,其中干扰成分未经有效去除,含量也未经准确测定,将对试验结果造成一定的偏差。样品测定结果显示,玉米须提取液中总皂苷的含量存在较大差异,提示测定玉米须总皂苷含量,对深入探讨其药理作用,确定给药剂量等有重要意义。本法样品处理简单,准确度高,精密度好,分离效能高,适合玉米须中总皂苷含量的测定。

摘要：目的 建立玉米须中总皂苷含量的定量测定方法。方法 以中国药品生物制品检定所出品的人参皂苷Rb1标准品为对照进行比色法测定,样品加新配制的5%香草醛-冰乙酸0.5mL,高氯酸0.8mL,于60℃水浴中加热15min,显色,530nm测定A值。结果 玉米须中总皂苷吸收度A与浓度C呈良好的线性关系,回归方程为Y=0.1291,X=0.0018,相关系数r=0.9918。平均加样回收率为98.38%,RSD为1.57%。结论 该方法样品处理简单,准确度高,精密度好,分离效能高,适合玉米须中总皂苷含量的测定。

69例三七总皂苷不良反应分析 篇3

关键词：三七总皂苷制剂,不良反应,回顾性分析

1 资料与方法

1.1 一般资料

在江苏省人民医院2003年1月—2008年3月上报的不良反应分析报告中检索由于使用三七总皂苷所引起的不良反应, 共69例。

1.2 方法

对患者性别、年龄、既往过敏史、家族不良反应事件、不良反应出现的时间、预后情况、对原患疾病的影响、关联性等方面进行统计和分析。

2 结果

2.1 发生不良反应的性别与年龄

在所收集的69例三七总皂苷制剂所致的不良反应中, 男14例, 女55例, 具体的性别与年龄分布情况见表1。

(n)

2.2 家族药品不良反应事件

在69例不良反应事件中, 有家族药品不良反应事件的为5例 (7.25%) ;无不良反应为37例 (53.62%) ;不详 (不代表没有) 为27例 (39.13%) 。

2.3 过敏史

69例不良反应事件中, 8例有过敏史 (包括对青霉素和一些食物过敏) , 占总数的11.59%;31例无过敏史, 占总数的44.93%;30例过敏史不详 (不代表一定没有) , 占总数的43.48%。

2.4 不良反应症状出现时间

在69例病例中, 首次用药即出现不良反应的为1例, 占1.45%, 非首次用药即出现不良反应的为64例, 占98.44%;非首次用药即出现不良反应的病例中严重不良反应为2例, 占2.89%;一般不良反应有62例, 占89.86%;另有4例无记载。在不良反应出现的时间中, 1~5天即出现不良反应的为22例, 占31.88%;6~10天出现不良反应的为7例, 占10.14%;10天以上出现不良反应的为5例, 占7.25%;另有35例不良反应出现天数不详。

2.5 不良反应对原患疾病的影响

在69例病例中, 对原患疾病无明显影响的为67例, 占97.10%;使患者病程延长的为1例, 占1.45%;使患者病情加重的为1例, 占1.45%。

2.6 不良反应关联性评价

在69例不良反应中, 关联性为可能的有37例, 占53.62%;关联性为很可能的有21例, 占30.43%;关联性为肯定的有8例, 占11.59%, 另有3例无记载。

3 讨论

3.1 不良反应与性别、年龄的关系

由表1可知, 在这69例不良反应事件中, 女性所占比例明显高于男性, 说明使用三七总皂苷制剂时, 女性比男性发生不良反应的概率高, 这与刺五加注射液[1]、参麦注射液[2]等中药注射剂不良反应的文献报道中描述的男女比例不同, 这可能与以下因素有关:生理和心理特征, 特别是女性特殊的生理周期, 以及女性的激素水平和耐受性。因此女性患者用药时, 更加需要密切观察药物的治疗效果和不良反应, 一旦发生异常, 需要及时查明原因并采取措施, 如对药物剂量进行调整或对所用药物进行更换, 以免发生不良反应。

从年龄分布的角度分析, 在60岁以上的老年人中, 不良反应的发生率比较高。这要从含三七总皂苷制剂的主要适应证和老年人自身生理特点两方面分析:首先, 60岁以上老年患者使用该药频率比较大, 因为该年龄段老年人易患各种心脑血管疾病, 经常使用三七制剂做对症治疗, 所以该年龄段老年人使用较多, 出现不良反应概率较高;其次, 老年患者对药物的敏感性和耐受性与青壮年不同, 他们对剂量的个体差异比较大, 药效阈值相应变窄, 因为老年患者大多体质较差, 且存在不同程度的脏器功能减退, 因而易使药物蓄积引起不良反应。故老年患者在用该药时应重点观察他们的反应, 尽量避免或者减少不良反应的发生。

3.2 不良反应与过敏史及家族不良反应的关系

在69例不良反应事件中, 不能排除家族不良反应事件及过敏史者所占比例相对较大, 故医师用药前应详细询问病史, 对不能排除家族不良反应事件和过敏史的病人需考虑做过敏试验或尽量避免使用。

3.3 用药与症状出现时间的关系

不良反应症状出现时间长短不一, 最少的仅为1天, 多的长达十几天, 但大部分出现在1~5天内。所以用药前5天的临床反应需加以重视, 需要连续观察, 但是这并不代表能忽视5天后的不良反应观察。

3.4 不良反应对原患疾病的影响分析

据统计数据分析, 不良反应对原患疾病的影响不大, 只有1例使病程延长, 1例使病情加重, 且没有致人死亡的病例。故只要注意预防, 细心观察患者的临床表现, 发现不良反应立即停药并进行处理, 基本上不会对患者造成很大伤害。

3.5 不良反应的关联性评价分析

69例不良反应事件的关联性评价中, “可能”和“很可能”两个结果占了近九成, “肯定”仅为一成。但“肯定”是指“再次用药不良反应再次出现”, 在临床上, 只要怀疑发生了不良反应, 医生多数会选用其他同类药物而不会再次选用该药, 故“很可能”和“可能”的结果较多。

对于三七总皂苷类制剂的不良反应应给予足够的重视, 特别是临床医生应该注意用法用量和剂型对病人造成的不同影响, 并尽量单一化给药, 根据病人的具体情况, 设计个体化给药方案。对用药的过程密切观察, 在发现不良反应后立即停药并采取措施, 防止严重的不良反应发生。

参考文献

[1]曾聪彦, 彭伟文, 吴惠妃.刺五加注射液不良反应78例文献分析[J].中国中医药信息杂志, 2004, 11 (2) :1721.

白鹤藤总皂苷提取条件蹬优化 篇4

1 试验部分

1.1 仪器

722紫外-可见分光光度计;KQ 5200 DB型数控超声波清洗器;HHsyzl-Ni6-C电热恒温水浴锅;DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱。

1.2 原料与试剂

白鹤藤 (市售) ;香草醛、甲醇、高氯酸、正丁醇、乙醇、冰醋酸、石油醚 (均为分析纯) 。

1.3 方法[5]

1.3.1 试剂的配制

1.3.1.1 水饱和正丁醇溶液[6]

在150 mL的分液漏斗中加入21 mL水和100 mL正丁醇, 振摇3 min后, 静置分层, 除去下层, 上层则为水饱和正丁醇溶液。

1.3.1.2 显色剂[7]

取香草醛0.1 g, 加冰醋酸2 mL, 再加入8 mL高氯酸, 溶解摇匀, 配成5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合溶液 (1∶4) 。

1.3.1.3 样液

称取白鹤藤粗粉5 g, 置250 mL三口烧瓶中, 加入一定量提取剂, 在一定温度的水浴中回流提取一定时间, 经减压抽滤后离心分离, 将上层清液转入圆底烧瓶减压浓缩, 转入分液漏斗中用石油醚萃取, 弃去醚层, 将提取液蒸发至干, 用25 mL蒸馏水溶解, 转入250 mL分液漏斗, 用正丁醇萃取, 萃取液蒸干, 用甲醇溶解, 转入100 mL容量瓶中定容备用。

1.3.2 分析方法

精确吸取0.4 mL定容后的提取液, 置于10 mL具塞试管中, 置水浴中挥干溶剂, 立即取出, 冷水冷却, 精确加入新配制的5%香草醛-冰醋酸和高氯酸 (1∶4) 混合溶液1 mL, 加塞摇匀, 置于60 ℃水浴中加热15 min, 取出, 流水冷却至室温后再加入冰醋酸5 mL, 摇匀, 于445 nm处测定吸光值, 随行试剂作空白对照。

1.4 提取条件的优化

1.4.1 提取剂的选择

分别以100 mL蒸馏水、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、70%乙醇、65%乙醇、50%乙醇作为提取剂, 在79 ℃水浴中超声波回流提取30 min。结果见图1。结果表明, 不同提取剂提取对白鹤藤总皂苷吸光值影响显著, 75%乙醇作为提取剂时其吸光值最高, 从而确定提取出的白鹤藤总皂苷含量最高。 (本实验所用超声波功率均为100 MHz) 。

1.4.2 料液比的选择

分别以10、16、20、30、40倍量的75%乙醇作提取剂, 在69 ℃下超声波回流提取30 min, 结果见表1。采用料液比1∶20时, 提取率最高, 故采用料液比1∶20提取。

1.4.3 提取时间的选择

用75%乙醇100 mL作为提取剂, 分别在69 ℃水浴中超声波回流提取20、35、45、55、70、85 min, 结果见图2。由图2可知, 超声波回流提取45 min时白鹤藤总皂苷提取率最高。

1.4.4 提取温度的选择

用75%乙醇100 mL作为提取剂, 分别在40、55、60、65、75、79 ℃水浴中超声波回流提取30 min, 结果见表2。由表2可知, 75 ℃下白鹤藤总皂苷提取率最高。

2 讨论

通过单因素试验研究白鹤藤总皂苷的提取条件, 用香草醛-冰醋酸-高氯酸试剂显色, 利用紫外-可见分光光度计在445 nm处测定白鹤藤总皂苷的吸光度, 以吸光度为指标优化白鹤藤总皂苷的超声提取条件。分别考察了提取剂、料液比、提取时间、提取温度对吸光度的影响, 各项指标均符合要求, 选择了最优的提取工艺。本实验方法经济简便无污染, 具有实际应用意义。

参考文献

[1]覃道光.民族医药与方剂学[M].南宁:广西科学技术出版社, 2006.133-134.

[2]谢秀琼.现代中药制剂新技术[M].北京:化学工业出版社, 2004.30-32.

[3]黄锁义, 黎海妮, 唐玉莲, 等.超声波提取芒果叶总黄酮[J].中国现代应用药学杂志, 2006, 23 (6) :455-456.

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[6]任凤莲, 邱昌桂, 连琰.百合总皂甙的提取工艺[J].中南大学学报 (自然科学版) , 2005, 36 (1) :69.

匙羹藤总皂苷抗氧化活性研究 篇5

1 材料与方法

1.1 试剂和主要仪器

FJ-200 高速分散匀质机 (上海标本模型厂) ;3k15 台式高速冷冻离心机 (SIGM公司) ;数显式三用电热恒温水温箱;电子天平;722 型分光光度计;超氧化物歧化酶 (SOD) 测试盒、过氧化氢酶 (CAT) 测试盒、蛋白定量测试盒 (上述测试盒均为南京建成生物工程研究所制) 、硫代巴比妥酸;冰醋酸;L—半胱氨酸;2-硫代巴比妥酸 (TBA) ;1, 1, 3, 3-四乙氧基丙烷 (TEP) ;SD大鼠, 体重180-220g (雌性各半) , 由广西医科大学实验动物中心提供 (动物生产许可证SCSK桂2014-0003) ;试验用水为自制双蒸水。

1.2 方法

1.2.1 肝匀浆的制备

(1) 匀浆介质的制备:将Tris1.21g及EDTA-2Na37.23mg加双蒸水500ml, 再用200mmol/LHCL进行滴定至p H7.4, 然后加入3.42g蔗糖, 8g Na CL, 用双蒸水稀释到1000 ml, 放入盐水瓶中, 以9 磅压力进行消毒30min, 4℃冰箱中备用。

(2) 取SD (体重180g~220g) 大鼠, 禁食一天, 颈椎脱臼处死, 取肝脏, 立即用冰冷的生理盐水漂洗, 除去血液, 滤纸吸干, 称重, 剪刀剪碎, 用预冷的匀浆介质稀释成20%肝匀浆, 高速分散匀质机匀浆, 之后置高速冷凝离心机中3000r/min离心15min, 取上清液, 用含糖PBS稀释配制成10%肝匀浆。用考马斯亮蓝法测定其蛋白含量[4]。

1.2.2 匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏LPO的影响

在1.0m L的4g/L肝反应液中依次加入0.05m L硫酸亚铁、0.02m L L-半胱氨酸、不同浓度的匙羹藤总皂苷样品, 混匀, 37℃水浴15min, 再加入2.0m L醋酸终止反应, 最后加入2.0m LTBA, 混匀, 沸水中加热15min, 流水冷却, 在532nm处测吸光度值。

1.2.3 匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏SOD的影响

采用试剂盒黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。

混匀, 室温静置10min, 1cm光径, 双蒸水调零, 550nm处测吸光度值。

组织匀浆中SOD活力计算公式:

SOD活力 (U/mgprot) = (对照OD值-测定OD值) ∕对照OD值 ÷ 50% × 稀释倍数 ÷ 待测样本蛋白浓度 (mgprot/ml)

1.2.4 匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏CAT的影响

采用试剂盒钼酸铵显色法测定CAT的活力。

混匀, 0.5cm光径, 405nm处, 双蒸水调零, 测吸光度值。

组织匀浆中CAT活力计算公式:

CAT活力 (U/mgprot) = (对照OD值-测定OD值) ×271× (1/60×取样量) ÷待测样本蛋白浓度 (mgprot/ml)

1.2.5 数据处理

采用统计学软件SPSS13.0 进行分析, 结果以均数±标准差 (±s) 表示。组间分析采用One-Way ANOVA和SNK-q两两比较得到相应P值。以P<0.05 或P<0.01 差异显著, 有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 不同剂量匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏LPO影响

结果由表3 可见, 除雌性大鼠样品组7 和雄性大鼠样品组5 与对照组比较无显著性差异外, 其余各组肝脏LPO值均低于对照组 (P<0.05) 。说明匙羹藤总皂苷在1.0mg/ml ~6.0mg/ml浓度范围可以抑制大鼠肝脏脂质过氧化。

2.2 不同剂量匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏SOD的影响

结果见表4, 匙羹藤总皂苷加入量在1.00~6.50mg之间, 与对照组比较SOD活性明显提高, 说明匙羹藤总皂苷可以提高大鼠肝脏线粒体SOD的活性。

2.3 不同剂量匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏CAT的影响

结果见表5, 匙羹藤总皂苷加入量在之间, 与对照组比较CAT活性明显提高, 说明匙羹藤总皂苷可以提高大鼠肝脏线粒体CAT的活性。

2.4 讨论

研究大鼠肝脏LPO、SOD、CAT已经有一套较成熟的实验方法, 通过加入匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏线粒体作用模型的影响, 用细胞匀浆硫代巴比妥酸 (Thiobarituric acid, TBA) 比色, 测定大鼠肝脏线粒体LPO的含量, 说明匙羹藤总皂苷在1.00~6.00mg范围内具有抑制LPO及其代谢废物的作用;采用试剂盒黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力, 测定体系中加入匙羹藤总皂苷 (1.00~6.50mg/ml) , 可提高大鼠肝脏线粒体SOD的活性, 采用试剂盒钼酸铵显色法测定CAT的活力, 测定体系中加入匙羹藤总皂苷 (1.00~6.50mg/ml) , 提高了大鼠肝脏线粒体CAT的活性, 说明匙羹藤总皂苷能提高机体内抗氧化酶的活性, 以达到间接清除自由基之目的。通过匙羹藤对大鼠肝脏细胞抗氧化能力指标LPO、SOD、CAT的影响的研究, 预测其对人体抗氧化作用的功效, 为其做为功能性食品添加剂的开发利用提供科学依据及开发前景。

摘要：目的:研究匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (CAT) 、和脂质过氧化物 (LPO) 作用的影响。方法:通过硫代巴比妥酸 (TBA) 分光光度法测定大鼠肝脏脂质过氧化 (LPO) 的二级分解产物丙二醛 (MDA) 的含量, 以考察匙羹藤总皂苷对实验大鼠肝脏LPO的作用影响, 采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力, 钼酸铵显色法测定CAT的活力, 考察匙羹藤总皂苷对实验大鼠肝脏SOD和CAT的作用大小。结果:与对照组比较匙羹藤总皂苷在1.0mg/ml6.0mg/ml浓度范围可抑制大鼠肝脏LPO作用;在1.0mg/ml6.5mg/ml浓度范围内可提高大鼠肝脏SOD和CAT的活性。结论:匙羹藤总皂苷可以提高大鼠肝脏SOD和CAT的活性, 降低MDA的产生。

关键词：超氧化物歧化酶 (SOD) ,过氧化氢酶 (CAT) ,脂质过氧化物 (LPO) ,匙羹藤

参考文献

[1]李茜.广西几种特色壮药的药理毒性及活性成分的研究进展[J].中医药学刊, 2005, 23 (12) :2232-2233.

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[3]扈玉华, 路建荣, 朱习会.匙羹藤提取物体外抑菌活性的观察[J].中国中医药信息杂志, 2008, 15 (10) :40-41.

UPLC法测定三七总皂苷含量 篇6

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(美国安捷伦1290),检测器为二极管阵列检测器;色谱柱(Ultimate XB-C18柱,2.1 mm×50.0 mm,1.8μm,月旭材料科技上海有限公司);超声波清洗机(江苏昆山超声仪器有限公司);电子分析天平(日本岛津)。

三七总皂苷对照提取物(中国食品药品检定研究院,批号:110870-201002)5种皂苷类物质含量标定为:三七皂苷R1(6.9%),人参皂苷Rg1(28%),人参皂苷Re(3.8%),人参皂苷Rb1(29.7%),人参皂苷Rd(7.3%);甲醇(色谱纯,月旭科技);水为重蒸馏水。

1.2 色谱条件

色谱柱(Ultimate XB-C18柱,2.1 mm×50.0 mm,1.8μm);检测波长为203 nm;柱温25℃;流速0.6 m L/min;进样量2μL;以水为流动相A,以乙腈为流动相B,按表1中的规定进行梯度洗脱。

1.3 溶液制备

1.3.1 对照提取物溶液的制备。取三七总皂苷对照提取物适量,精密称定,加70%甲醇溶解并稀释成每1 m L含2.5 mg的溶液,即得。

1.3.2 供试品溶液的制备。取样品25 mg,精密称定,置10m L量瓶中,加70%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。

1.4 色谱分析

取供试品溶液和对照提取物溶液各2μL,按照色谱条件进行测试。

1.5 线性关系考察

分别称取三七总皂苷对照品适量,用70%甲醇溶解并稀释制成每1 m L含0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、7.50、20.00 mg的溶液,按照色谱条件,分别精密吸取各浓度对照品溶液2μL,自动进样器进样,测定峰面积,以各色谱峰峰面积(Y)对其浓度(X)进行线性回归。

1.6 精密度考察

吸取对照品溶液2μL,按照色谱条件,自动进样器连续进样6次,进行精密度考察[10]。

1.7 稳定性考察

参照色谱条件,取制备的供试品溶液,在室温条件下放置,分别在0、1、2、4、8、12、24、36 h进样测定,记录每针样品中5种皂苷类成分的峰面积。

1.8 重复性考察

取样品6份,按照上述方法制备供试品溶液,再根据色谱条件进样测试5种皂苷类成分的含量。

1.9 加标回收率考察

取三七总皂苷样品6份,每份12.5 mg,精密称定,置10m L量瓶中,分为3组,同时加入对照品,第1组分别加800μL,第2组分别加1 000μL,第3组分别加1 200μL,70%甲醇溶解并稀释至刻度,同供试品溶液的制备方法处理,按照色谱条件进样测定,分别计算回收率。

1.1 0 样品测定

取3个不同批次的三七总皂苷提取物,采用本方法与药典的方法进行测定,比较含量结果。

2 结果与分析

2.1 色谱分析结果

色谱分析图谱如图1。结果表明,此条件下三七总皂苷成分与其他成分分离度良好。

2.2 线性关系考察结果

以各色谱峰峰面积(Y)对其浓度(X)进行线性回归结果见表2。结果表明,三七总皂苷的5种皂苷类成分在本试验范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系。

注:1-三七皂苷R1;2-人参皂苷Rg1;3-人参皂苷Re;4-人参皂苷Rb1;5-人参皂苷Rd

2.3 精密度考察结果

三七总皂苷的5种皂苷成分峰面积的RSD(n=6)分别为1.02%、0.39%、0.98%、0.35%、0.79%,表明精密度良好。

2.4 稳定性考察结果

根据每针样品中5种皂苷类成分的峰面积,其RSD(n=8)分别为0.93%、0.82%、0.77%、0.68%、0.91%。结果表明,供试品溶液中三七总皂苷成分在36 h内较为稳定。

2.5 重复性考察结果

5种皂苷类成分含量的RSD值(n=6)分别为0.38%、0.35%、0.61%、0.54%、0.42%,表明该方法重复性良好。

2.6 加标回收率考察结果

5种皂苷类成分的平均回收率分别为98.18%、99.43%、97.26%、98.54%、99.02%,RSD(n=6)分别为1.03%、0.64%、0.98%、1.37%、0.78%。

2.7 样品测定

3 个不同批次的三七总皂苷提取物采用2种方法测定的含量比较结果见表3。

3 结论与讨论

关于检测波长,《中国药典》2015版规定检测波长为203 nm,通过文献及实际操作过程发现,203 nm波长时各色谱峰分离较好,响应值也较高,故仍然采用203 nm波长测定;在柱温的选择上,柱温是影响色谱峰分离度的一个重要因素,笔者在试验过程中,主要考察25、27、29、31℃等常规柱温范围,发现该色谱条件下都能满足规定的分离度要求,故规定该方法的柱温为25℃。色谱柱的选择上,主要考察了规格基本相同的Waters ACQUITY UPLC BEH ShieldR P 18柱、安捷伦zorbax rrhd eclipse XDB-C18柱、月旭Ultimate XB-C18柱和Ultimate Polar-RP柱,发现这几种柱子都可应用于该方法测定。本方法与药典方法所测结果基本一致,且分析时间大为缩短,峰形好,洗脱溶剂消耗小,方法准确,重现性好。

摘要：〔目的〕建立超高效液相色谱法测定三七总皂苷提取物中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的含量。〔方法〕采用Ultimate XB-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.8μm);以水(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱(0~4min,19%B;4~8 min,19%~35%B;8~10 min,35%~95%B;10~11 min,95%B):检测波长为203 nm,柱温25℃,流速0.6 m L/min,进样量2μL。结果:三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd分别在0.006 9~0.552 0、0.028 0~2.240 0、0.003 8~0.304 0、0.297 0~2.376 0、0.007 3~0.584 0mg/m L范围内呈良好的线性关系。平均回收率分别为98.18%、99.43%、97.26%、98.54%、99.02%。RSD分别为1.03%、0.64%、0.98%、1.37%、0.78%。〔结论 〕该方法分析时间短,洗脱溶剂消耗小,方法准确,重现性好,可用于三七总皂苷提取物的质量控制。

关键词：UPLC法,三七总皂苷,提取物,含量

参考文献

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鹅不食草总皂苷提取工艺研究 篇7

1 仪器与试药

UV-1700型分光光度计(日本岛津);BP211D电子天平(德国赛多司);微波反应器;超声清洗机;烘箱;水浴锅;真空泵(以上器材均为上海亚荣生化仪器厂生产)。

鹅不食草(采于吉林长白县);齐墩果酸对照品(含量测定用,

2 方法与结果

2.1 鹅不食草总皂苷的提取

2.1.1 微波提取法

称取鹅不食草粉末150g,置2000m L圆底烧瓶中,加石油醚1 0 0 0 m L浸泡2次,每次2 h,过滤,残渣挥尽石油醚后加9 5%乙醇1000m L,置微波提取器中提取1h,滤过,残渣加入95%乙醇1000mL继续提取1h,滤过,合并2次提取液,减压回收乙醇,残渣加蒸馏水500mL溶解,溶液用水饱和正丁醇萃取3次,每次500mL,弃去水层,合并正丁醇层,将正丁醇溶液60℃减压蒸干即得鹅不食草总皂苷干品。

2.1.2 回流提取法

称取鹅不食草粉末150g,置2000m L圆底烧瓶中,加石油醚1000mL浸泡2次,每次2h,过滤,残渣挥尽石油醚后加95%乙醇1000mL,在60℃水浴中回流提取2次,合并2次提取液,减压回收95%乙醇,残渣加蒸馏水500mL溶解,溶液用水饱和正丁醇萃取3次,每次500mL,弃去水层,合并正丁醇层,将正丁醇溶液60℃减压干燥即得鹅不食草总皂苷干品。

2.1.3 超声提取法

称取鹅不食草粉末150g,置2000m L圆底烧瓶中,加石油醚1000mL浸泡2次,每次2h,过滤,残渣挥尽石油醚后加95%乙醇1000mL,超声提取1h,滤过,残渣加入95%乙醇1000mL继续超声提取1h,滤过,合并2次提取液,减压回收乙醇,残渣加蒸馏水500mL溶解,溶液用水饱和正丁醇萃取3次,每次500mL,弃去水层,合并正丁醇层,将正丁醇溶液60℃减压蒸干即得鹅不食草总皂苷干品。

2.2 鹅不食草总皂苷含量的测定[3]

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品2.3mg,置10mL的容量瓶中,加95%乙醇溶解并定容至刻度,备用。

2.2.2 样品溶液的制备

称取上述3种提取方法所得鹅不食草总皂苷干品各50mg,置100mL容量瓶中,加95%乙醇溶解并定容至刻度,备用。

2.2.3 测定波长的选择

吸取对照品溶液0.5mL于10mL具塞试管中,沸水浴中挥干,依次加入新配制的10%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL,摇匀,于70℃水浴中加热15min取出,冰水浴中冷却后加入冰醋酸5mL,混匀,以相应试剂为空白,在400~700nm波长范围内测定其吸收波长。同法测定鹅不食草总皂苷吸收波长。二者最大吸收均为550nm,故选择测定波长为550nm。

2.2.4 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL,置10mL具塞试管中,照2.2.3项下自“沸水浴中挥干”起,于550nm测定吸光度,以齐墩果酸溶液浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为:A=61.352C-0.0016,r=0.9998(n=5)。结果表明齐墩果酸在3.833~19.167µg/m L范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.5 样品含量测定

取样品溶液,在550nm处测定吸光度,将吸光度带入标准曲线,线性回归法计算鹅不食草总皂苷含量。测定结果见表1。

2.3 正交实验优化回流提取法提取条件

2.3.1 正交试验设计

称取鹅不食草粉末500g,加石油醚3000mL浸泡2次,每次2h,过滤,残渣采用乙醇回流提取法提取总皂苷,为了寻求醇提的最佳工艺条件,我们采用4因素3水平依正交实验表L9(34)进行正交实验。考察因素为:提取溶剂、提取次数、提取时间以及溶剂用量等四因素。因素水平表见表2,实验结果和方差分析结果分别见表3和表4。

由表3实验结果分析可知,影响鹅不食草总皂苷回流提取的主次因素为C>B>A>D,提取时间与提取次数为主要影响因素,溶剂用量影响力最低,最佳提取工艺条件为A2B1 C2D3,即:80%乙醇提取2次,每次1.5h,溶剂用量为14倍量。

2.3.2 验证试验

称取鹅不食草药材3份,每份500g,石油醚脱脂后按照正交试验结果进行提取,提取物用水饱和正丁醇萃取,3份药材萃取物中总皂苷平均含量达到69.7%,折合到原药材中平均含量为2.59%。

注﹡:所测总皂苷含量为折合到500g原药材中的含量

注:F0.1(2,2)=9.00,F0.05(2,2)=19.00

3 讨论

本文采用超声、回流、微波等3种方法提取鹅不食草总皂苷,通过含量测定结果显示回流提取法优于其他两种提取方法,且该方法简便易行,对设备要求低。

在确定回流提取法后,又采用正交实验法对鹅不食草总皂苷的乙醇回流提取工艺进行了优选,文献记载[3],鹅不食草总皂苷大多以齐墩果烷型形式存在,故我们选择了以齐墩果酸为标准物测定总皂苷。并以总皂苷含量为指标对醇提工艺进行了优化,结果表明其有效部位的最佳提取工艺为:80%乙醇提取2次,每次1.5h,溶剂量为14倍量。按此结果提取鹅不食草总皂苷的提取效果最好。同时通过验证试验证明本正交试验工艺重现性好,实用性强。

本实验对鹅不食草总皂苷定量的研究,为其质量标准的建立提供方法学的参考,以控制药材质量,保证临床疗效,为进一步开发鹅不食草资源奠定基础。

摘要：目的 研究鹅不食草总皂苷的提取工艺并测定其含量。方法 对比微波、超声、回流等3种鹅不食草总皂苷提取方法,并采用正交实验优化所确定提取方法的最佳提取工艺条件,同时用分光光度法测定总皂苷含量。结果 回流提取法为鹅不食草总皂苷最佳提取方法,正交实验确定总皂苷最优提取条件:80%乙醇提取2次,每次1.5h,溶剂用量为14倍量。分光光度法测定总皂苷含量达到69.7%。结论 回流提取法提取鹅不食草总皂苷的方法可行,分光光度法测定总皂苷含量简便、灵敏。

关键词：鹅不食草,总皂苷,提取方法,正交实验,含量测定

参考文献

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