缺氧复氧（精选4篇）
缺氧复氧 篇1
取出生在24h内的Wistar大鼠, 无菌条件下分离海马组织, 制成细胞悬液, 转入培养瓶中培养。7～8d传代一次。将实验组分两组 (缺氧组、缺氧-复氧组) , 用CoCl2预处理, 制备模拟缺氧模型。缺氧4h后去除CoCl2形成复氧, 测定两组NSCs的增殖情况。探讨低氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor1α, HIF-1α) 与神经干细胞缺氧、复氧损伤的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物
Wistar大鼠、新生24h内的Wistar乳鼠。
1.2 主要实验仪器
二氧化碳培养箱、XSZ-D型倒置生物显微镜、梯度PCR仪、紫外分光光度仪、台式高速低温离心机、凝胶成像分析系统、单垂直板电泳槽、半干式转移电泳仪、紫外可见分光光度计。
1.3 主要化学试剂
DMEM/F12干粉培养基、无血清培养添加剂B27、D-Hank’s平衡盐溶液、Nestin、氯化钴、DEPC、BIOZOL、DNA Marker DL2、两步法RT-PCR试剂盒、EDTA等。
1.4 实验方法
1.4.1 神经干细胞的分离、培养、传代
神经干细胞培养7～9d后, 离心、收集、分离神经球, 以每毫升5×105个神经干细胞的密度分瓶、传代, 2～3d换半量培养液继续培养。
1.4.2 神经干细胞的鉴定
取部分神经干细胞, 接种于预先涂布多聚赖氨酸盖玻片的六孔培养板中, 加入含EGF及b-FGF的DMEM/F12的条件培养基, 24h后再行Nestin免疫组化染色鉴定。
1.4.3 氯化钴模拟缺氧、及缺氧-复氧模型的制备
将实验组分两组 (缺氧组4h、8h、12h、16h;缺氧-复氧组4h、8h、12h、16h) , 用CoCl2处理神经干细胞造成模拟缺氧模型。
1.4.4 细胞总RNA 的提取
经过裂解细胞、液相分离、沉淀RNA、RNA洗盐、重新溶解RNA、测纯度和定量, 去除混杂的DNA。1.5%琼脂糖凝胶电泳, 在紫外分析仪下观察电泳结果, 观察RNA条带的亮度和完整性。
1.4.5 引物的设计及合成
根据实验需要设计HIF-1α的上游引物为 5’-ATGTGGACAGCGATATGGTCA-3’ 下游引物为5’-AGGTTAAGGCTCCTTGGATGA-3’GAPDH的上游引物为5’-CCACAGTCCATGCCATCACT-3’下游引物为5’-GCCTGCTTCACCACCTTC-3’。扩增长度各为499bp及268bp。
1.4.6 逆转录反应
在PCR仪上进行变性、退火反应。离心使RNA引物沉积于试管底部, 配制反转录反应液后, 在PCR仪上进行反转录反应。
1.4.7 PCR 产物的鉴定、半定量的分析
反转录反应结束后, 取5μL反应液进行电泳实验, 确认PCR 反应产物。将扩增的HIF-1α、GAPDH产物一起行电泳、显色, 同时与DNAMarkers对照, 确定电泳条带。用凝胶成像分析系统摄像并分析电泳条带的平均灰度值, 计算基因表达量。
1.5 统计学处理
应用SPSS13.0统计, 计量资料以均数±标准差表示。
2 结果
2.1 神经干细胞的培养及鉴定
显微镜观察原代单神经干细胞在12h内聚集;到第3天聚集成球形;到第4天可见大量悬浮的神经细胞球, 细胞球呈半透明状, 表面较光滑, 单个细胞呈圆形, 细胞饱满, 细胞与细胞边界清晰, 细胞内部可见粒状结构。将细胞集落离心、吹打分散, 并以1×106个/mL的密度放置在培养皿中, 将培养皿置放到培养箱中培养, 6～7d传代一次, 传代后的神经干细胞球数量明显增多, 细胞内颗粒样物质更为致密, 杂质更少, Nestin表达明显增加。
2.2 缺氧NSCs 形态观察
实验分为缺氧组、复氧组分别培养4h、8h、12h、16h。缺氧4h及8h神经干细胞形态无明显变化。缺氧12h后, 神经干细胞肿胀明显, 折光性差, 并可见细胞碎屑。缺氧16h后, 神经干细胞死亡明显增多。复氧4h、8h、12h随着时间的增加, 神经干细胞肿胀明显, 死亡增多。复氧16h神经干细胞形态与复氧12h组无明显差别。
2.3 缺氧对神经干细胞增殖的影响
缺氧4h时神经干细胞神经球数目较常氧组有少量增加。缺氧8h时神经干细胞神经球数明显增加, 神经球致密, 是常氧组神经数的2倍。缺氧8h后随着时间的增加神经球减少。复氧8h内随着时间的延长, 神经球数减少。12h、16h神经球数无明显差别, 数目稳定。
2.4 缺氧及复氧对HIF-1αmRNA表达的影响
在缺氧及复氧组中, HIF-1αmRNA在分子量为499bp处出现不同程度的DNA条带。在缺氧8h时HIF-1αmRNA表达增多, 8h后随着时间的增加HIF-1αmRNA的表达逐渐减少。复氧组中HIF-1αmRNA随着时间的增加表达反而较少。 (见表1) 。
*P<0.01 VS对照组;#P>0.05 VS 对照组。
3 讨论
神经干细胞是具有自我更新和多分化潜能的细胞。氧是生命存在的必要条件, 经研究表明氧浓度的变化可影响细胞的功能状态。缺氧常可引起神经细胞的损伤[1], 缺氧后再复氧更进一步加重细胞的损伤。氯化钴缺氧模型的机制是钴可替代亚铁螯合于血红蛋白中, 从而损伤细胞对氧的感受[2]。经查询国内外大量资料表明10%的氧浓度能促进神经干细胞增殖更为明显。超过10%氧浓度的重度低氧抑制细胞增殖, 并随时间的增加加重细胞的损伤, 导致细胞的坏死。HIF-1α是细胞低氧反应中最重要的调控因子之一, 在低氧的条件下HIF-1α对NSCs的增殖与凋亡有什么样的作用, 国内外研究的不多。缺氧可以引起细胞损伤, 复氧可以使细胞损伤加重, 复氧加重细胞损伤的机制仍不十分清楚。HIF-lα和HIF-1β共同组成HIF-1, 其中HIF-lα亚单位对氧浓度调节细胞功能有专一性, 决定了HIF-1的主要活性。它受细胞氧浓度的变化调节细胞功能的机制是复杂的, 涉及到遗传物质的表达;生物蛋白的稳定性;细胞核的定位;以及缺氧、复氧后转录功能的增强;HIF-1β是芳香烃受体转位因子ARNT, 能与多种蛋白形成二聚体, 结合成DN[3～5]。HIF-1可调控基因的表达, 参与糖酵解途径基因表达, 调控血红素氧合酶、葡萄糖转运蛋白、腺苷酸激酶、和酪氨酸羟化酶等基因的表达[6]。研究HIF-1αmRNA的表达以及对细胞损伤有什么联系, 有利于弄清神经细胞在缺氧以及缺氧后再复氧中HIF-1因子所能发挥的作用。本实验表明, 使用氯化钴缺氧模型, 缺氧4h后洗涤去除CoCl2形成复氧。实验结果显示缺氧组神经球数目在4h时有少量增加, 8h神经球数目比常氧组增多2倍, 8h后神经球数目减少并有细胞坏死。说明低氧在一定时间内能促进NSCs数目的增加。复氧后随着时间的增加神经球数略有减少, 12h后神经球数目恒定。PCR检测神经干细胞的HIF-1αmRNA表达水平, 显示在缺氧及复氧组中, HIF-1αmRNA在分子量为499bp处出现不同程度的DNA条带。在缺氧8h时HIF-1αmRNA表达增多, 8h后随着时间的增加HIF-1αmRNA的表达逐渐减少。复氧组中HIF-1αmRNA随着时间的增加表达反而较少。实验结果显示: (1) 中等程度的低氧条件更有利于NSCs的增殖; (2) 低氧在一定时间内可增加神经干细胞内HIF-lα的表达, 实验结果显示8h HIF-lα的表达达到高峰; (3) HIF-1参与了低氧引起的神经干细胞的增殖。
参考文献
[1]Semanza GL.HIF-1 and tumor progression:pathophysiology andtherapeutics[J].Trends Mol Med, 2002, 8:562-567
[2]Pampin J B, Garcia Rivero SA, Otero Cepeda XL, et al.Immuno-Histochemic alex pression of HIF-1Ainrespons eto early my ocar-Dialischemia[J].J Forensic Sci, 2006, 51 (1) :120-124
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[7]Resar JR, Roguin A, Voner J, et al.Hypoxia-induciblefactor-1Apoly morphis mand coronary collater alsin patients withis-chemicheart disease[J].Chest, 2005, 128 (2) :787-791
缺氧复氧 篇2
1 材料
1.1 实验动物
1周龄试验用大白兔。
1.2 药品及试剂
前列地尔注射液、胶原酶、胰蛋白酶、SOD、NO试验剂盒、RPMⅠ164培养液、兔抗人FactorⅧ抗体等。
2 实验方法
2.1 兔内皮细胞培养
无菌环境中, 取急死试验用兔主动脉, 将其主动脉外膜去除, 并用PBS清洗3次之后加入0.1%Ⅱ型胶原酶;并于37℃条件下, 消化40 min;离心10min之后弃除上清液;加入RPMⅠ164培养液混匀沉淀细胞。置于37℃条件、5%CO2培养箱中培养, 待用。
2.2 建立缺氧复氧模型
配制模拟缺氧和复氧溶液。将缺氧溶液替换正常培养液3 h, 以达缺氧目的;再将复氧溶液替换缺氧溶液2 h, 达到复氧效果[2]。
2.3 分组实验
正常组:正常细胞培养;模型组:缺氧复氧操作损伤模型;低浓度组:0.05μg/ml+缺氧复氧损伤;中浓度组:0.20μg/ml+缺氧复氧损伤;高浓度组:0.40μg/ml+缺氧复氧损伤;同时, 将前列地尔加入缺氧复氧液中, 并逐渐调整至以上终浓度。
2.4 统计学方法
本文采用SPSS16.0对文中所有相关数据进行统计分析, 计数资料采用χ2检验, P<0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果
与正常组比较, 模型组NO含量、SOD活性、v WF表达均有所下降, MDA含量增加, 且差异具有统计学意义 (P<0.05) ;而低、中、高浓度PGE1组与模型组比较, 其NO含量、SOD活性、v WF表达均有所增加或增强, MDA含量降低, 且差异具有统计学意义 (P<0.05) 。
4 讨论
内皮细胞及其合成物质具有对抗和促进血栓形成的双重功能。则可以通过对内皮细胞分泌物活性物质来进一步判断内皮细胞的抗栓功能。国内外诸多文献均指明:引发内皮细胞结构损伤以及功能障碍主要是由于氧化操作引起的脂质过氧化化产物MDA, 并由MDA的变化进一步判断内皮细胞损伤的大概原因。与此同时, 作为机体重要的抗氧化酶SOD的活性变化也同样可以对机体内部抗氧化损伤能力的加以具体反映[3]。
本文通过比较正常组和模型组SOD和MDA水平发现, 模型组SOD活动降低明显, 而MDA水平升高明显, 从而证明缺氧复氧曾对细胞造成了较为严重的氧化损伤。本文又通过将三组不同PGE1浓度组与模型组比较, 其中, SOD活性均升高明显;而MDA水平均低于模型组。因此, 该对比实验也说明了PGE1可有效提高内皮细胞清除氧自由基的能力, 从而使缓角、降低内皮细胞脂质过氧化损伤程度, 起到了积极的保护作用。同时, 内皮细胞分泌的重要抗栓因子——NO, 也是反映内皮细胞功能的指标之一。而在文中的实验结果中, 则可以看出, 与正常组比较, 模型组NO含量下降明显;而低、中、高浓度PGE1组与模型组比较, 其NO含量均有所增加, 且差异明显。从而也证明了PGE1可通过积极活化NO, 使其浓度升高, 可有效对抗血栓形成。v WF作为外源性凝血系统的启动因子, 具有促进血小板聚焦和黏附作用, 也是内皮细胞抗栓功能的重要标志物。本文模型组与正常组比较, v WF表达均有所下降;而低、中、高浓度PGE1组与模型组比较, v WF表达均有所增加;这也明说了v WF具有保护内皮细胞抗栓功能的作用。
因此, PGE1对机体缺氧复氧损伤之后的血管内皮细胞抗栓功能具有积极的保护作用。
参考文献
[1]王少纲.前列地尔脂微球载体治疗急性脑梗死临床疗效观察.中国实用神经疾病杂志, 2010, 13 (20) :21-22.
[2]关欣, 李应东.细胞缺氧复氧模型建立方法的研究进展.医学综述, 2008, 14 (18) :2737-2739.
缺氧复氧 篇3
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
FACS Calibur型流式细胞仪(美国Becton-DickinSon公司)。清洁级SD24h新生乳鼠。RPMI1640液体培养基和胎牛血清,购于Hyclone公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(购于美国BD公司);二甲基亚砜(DMSO购于美国GIBCO公司)溶液10μL/mL储备液;西洋参茎叶总皂苷(解放军总医院病理生理室王琛博士惠赠)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
无菌操作取出大鼠心脏,立即在无菌D-Hanks液中洗去残血,分离出附着组织,剪成约1 mm3大小碎块,经反复D-Hanks液洗涤、0.15%胰蛋白酶消化,差速贴壁法,制备成心肌细胞悬液,最后用15%胎牛血清的DMEM培养液稀释成细胞密度为3×105/mL,接种于25 mL培养瓶中,放入37℃、5%CO2孵育箱内进行原代培养。
1.2.2 心肌细胞缺氧/复氧模型
按Li等[6]将心肌细胞置于缺氧仓内,通入95%N2-5%CO2混合气,缺氧4h小时后放回CO2孵箱37℃,常规培养12h后检测。
1.2.3 心肌细胞分组及诱导凋亡
将培养细胞心肌细胞分为正常组、缺氧/复氧损伤组、缺氧/复氧加西洋参茎叶总皂甘诱导的乳鼠心肌细胞组(西洋参茎叶总皂甘剂量:40 mg/L,80mg/L,160mg/L)用培养液将细胞稀释为106/mL,混匀后放入37℃,5%CO2的孵箱继续培养24h后分别检测。
1.2.4 流式细胞检测
采用FACS Calibur型分析流式细胞仪,用CELL Quest获取和分析数据。488nm激发光源,先将对照管上样,通过调整参数FAS和SSC,在散色光点图(FSC/SSC)中清楚显示出一个清晰、集中的细胞群体。在获取细胞前,根据FAS/SSC的特点,设定阈值,避免碎片和噪声干扰,确定电压及放大器数值后,再以门中细胞进行设门(gate),使门中细胞占95%以上,收集10000个门内细胞。以门中细胞进行后续荧光信号检测,将对照组细胞的荧光强度设定为非特异性本底荧光,并在此基础上确定阳性荧光表达率。调定流式细胞仪,FL1荧光通道检测Annexin V的荧光强度,FL2荧光通道检测PI的荧光强度。分别将设定阴性对照管使荧光散点图中细胞集中在左下(LL)象限,保持FL1、FL2电压不变。上样调整仪器荧光补偿值,进行校正后,即可分析样本,每个样本均获取10000个细胞,数据以List Mode的形式储存,采用CellQest功能软件进行分析。
2 实验结果
2.1 流式细胞仪检测不同剂量西洋参茎叶总皂甘诱导内质网应激心肌细胞凋亡
将培养乳鼠细胞上流式细胞仪检测。从Annexine V-FITC/PI荧光双参数点图观察到(见图1)对照组细胞主要分布在左下象限,为非凋亡细胞活细胞,右下象限为少量凋亡细胞。损伤组右下象限出现大量凋亡细胞及死亡细胞。增加随着西洋参茎叶总皂甘剂量增加,死亡细胞显著减少,凋亡细胞相对减少(见图1)。
2.2 西洋参茎叶总皂甘诱导内质网应激心肌细胞凋亡变化
正常对照组细胞生长状态良好,细胞凋亡率3.34±0.78%,损伤组缺氧/复氧损伤组细胞凋亡率38.53±6.15%。根据剂量40mg/L,80mg/L,160mg/L的西洋参茎叶总皂甘诱导细胞凋亡分别是19.65±4.77%,15.32±3.24%,12.64±2.23%(见图2)。结果表明:随着剂量增加大剂量西洋参茎叶总皂甘可明显降低凋亡,与以往文献报道一致[7](p<0.01)。
3 讨论
细胞凋亡又称细胞程序性死亡(PCD)是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束生命的过程,它是一个主动的、高度有序的基因调控过程[8]。随着对细胞凋亡的深入研究,除两条经典死亡受体活化和线粒体损伤介导的传导通路细胞凋亡,近来研究发现过度内质网应激可启动一条新的细胞凋亡信号传导通路[9],内质网功能紊乱将导致细胞Ca2+失衡以及错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集,从而导致内质网应激[10,11,12]。内质网应激可特异性激活Caspase-12.Caspase-3等下游效应蛋白酶,它不同于前两条经典途径,短期的内质网应激有保护细胞作用,但长期的内质网应激将激活一些凋亡信号分子如Chop、JNK、Caspases,可引起细胞凋亡[13]。因此有关细胞凋亡的检测方法也得到广泛发展,流式细胞仪自20世纪70年代后开始应用,细胞凋亡检测从细胞核到细胞膜,从单一色到多色,根据细胞光散射性质结合特异性荧光,细胞发生凋亡时出现特异性变化。在许多细胞凋亡早期会出现胞质内Ca2+浓度迅速持续升高[14]。Annexin V是一种分子量为35-36KD的Ca+依赖性磷脂结合蛋白,在细胞凋亡早期细胞膜磷脂酸丝氨酸外翻细胞膜外表面[15]可与标志的Annexin V-FITC结合[16],利用这一特性可以检测细胞凋亡[17]。但此时细胞膜是完整的而检测核DNA的PI不能进入细胞核。应用流式细胞仪将细胞分为4个亚群区分正常组细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡及死亡细胞比率。本研究采用Raynal P等[18]建立双标记的流式细胞术结合Annexin-FITC/PI荧光染色进行西洋参茎叶总皂甘通过抑制过度内质网应急减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤结果与报道一致[19]。高剂量西洋参茎叶总皂甘降低在缺氧/复氧后心肌细胞凋亡率,应用流式细胞仪检测西洋参茎叶总皂甘通过抑制过度内质网应急降低细胞凋亡具有快速、准确、信息量大的特点。为深入发展研究细胞凋亡机制,提供更加直观、敏锐的方法。
摘要：利用流式细胞仪观察西洋参茎叶总皂甘通诱导大鼠心肌细胞后内质网应急引起细胞凋亡。选用原代培养心肌细胞,将心肌细胞分为正常细胞对照组,缺氧/复氧组和缺氧/复氧后加入西洋参茎叶总皂苷组。按照40mg/L,80mg/L,160mg/L浓度培养24h后,应用流式细胞仪采用Annexin-V/PI诱导凋亡。结果显示应用流式细胞仪检测最终浓度为160mg/L西洋参茎叶总皂苷凋亡率明显低于缺氧/复氧组。流式细胞仪检测由内质网应急诱导细胞凋亡对研究细胞凋亡的机理提供一种快速、准确检测方法。
缺氧复氧 篇4
1 材料与方法
1.1 乳鼠心肌细胞的分离和培养
取出生后1～3d的SD大鼠15只，胰酶消化后以差速贴壁法处理，恒温培养箱培养24h，经鉴定为乳鼠心肌细胞。
1.2 质粒的提取、验证和转染
1.2.1 质粒提取
BioDev质粒小量提取试剂盒提取纯化质粒(pEGFP-αB-crystallin-C3，由美国明尼苏达大学Hormel研究所David Li教授惠赠)后，分光光度计测浓度及OD260/OD28。
1.2.2 PCR反应
引物由Invitrogen公司合成，反应30个循环。
1.2.3 质粒的酶切鉴定
(XhoⅠ、SmaⅠ限制性内切酶购自TaKaRa公司)10μl双酶切体系，37℃反应3h。酶切产物、PCR产物及质粒进行琼脂糖电泳，凝胶成像系统下拍照。
1.2.4 质粒测序
由Invitrogen公司完成。
1.2.5 质粒优化后转染心肌细胞
取生长24h的心肌细胞分为转染组(转染pEGFP-αB-crystallin-C3)、空载质粒组(转染pEGFP-C3)和空白组(无任何质粒转染)，每组16孔，以LipofectamineTM2 000试剂分别转染质粒pEGFP-αB-crystallin-C3及pEGFP-C3。将转染后的24孔板在5%CO2培养箱放置16h后转至95%N2, 5%CO2分别培养6、12、18h后，再转至CO2培养箱5%CO2培养12h进行下一步实验。
1.3 蛋白提取和蛋白印迹检测 (western blot)
以RIPA裂解液(中)(购自碧云天公司)提取蛋白，测定蛋白浓度后，Western Blot分别检测心肌细胞αB-晶体蛋白和caspase-3的活化产物p17的表达。结果用凝胶成像系统摄取并行计算机图像分析，测定各个条带的灰度值，将αB-晶体蛋白条带灰度值与p17条带灰度值相比，每组所得数值求均数。
1.4 统计分析
结果以均数±标准差来表示，多组间均数的比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性，统计分析软件为SPSS12.0。
2 结果
2.1 质粒酶切鉴定
电泳结果如下：泳道1为DNA分子量标准D2 000，泳道2为空载质粒，泳道3为重组质粒，泳道4为双酶切重组质粒产物，泳道5为PCR扩增条带。见图1。可见PCR扩增产物约522bp，酶切产物片断大小相同，证明pEGFP-C3质粒内αB-晶体蛋白基因无丢失。对pEGFP-αB-crystallin-C3测序，测序结果与Genebank序列对比碱基正确。2.2质粒转染心肌细胞转染后24h，倒置荧光显微镜下观察转染细胞，可见转染pEGFP-αB-crystallin-C3和转染pEGFP-C3组中成功转染的细胞显示绿色荧光，转染效率约50%。见图2。空白对照组则无。
2.3 Western Blot检测心肌细胞αB-晶体蛋白表达
Western Blot半定量检测结果显示，在同一缺氧时间条件下，转染组与空白组和空载组相比，αB-晶体蛋白表达量增加 (P<0.05) ;空白组和空载组之间比较，αB-晶体蛋白表达量变化差异无显著性 (P>0.05) ;在转染组，随着缺氧时间延长，αB-晶体蛋白表达量变化差异无显著性 (P>0.05) ，但有下降趋势。见表1。
注：▲与空载组比较P<0.05;*空白组比较P<0.05;转染组各时间段之间比较P>0.05。
2.4 Western Blot检测心肌细胞caspase-3的活化产物p17的表达
Western Blot半定量检测结果显示，在同一缺氧时间条件下，转染组与空白组和空载组之间比较，p17表达量下降 (P<0.05) ，空白组和空载组之间比较差异无显著性 (P>0.05) ;在转染组，p17表达量在各缺氧时间段之间比较，差异无显著性 (P>0.05) ，但有上升趋势;空白组缺氧12h与缺氧6h相比，p17表达量上升 (P<0.05) ，缺氧18h与缺氧6h相比，p17表达量上升 (P<0.05) ;缺氧12h与缺氧18h相比p17表达量变化差异无显著性 (P>0.05) ，但有下降趋势。见表2。
注：▲与空载组比较P<0.05;*空白组比较P<0.05;◆空载组内与缺氧12h、缺氧18h比较P<0.05;★空白组内与缺氧12h、缺氧18h比较P<0.05;转染组各时间段之间比较P>0.05。
3 讨论
细胞的凋亡是一个由多种信号机制构成的复杂的网络，以下几种信号转导途径可能参与了凋亡：caspase-8途径、caspase-9途径、MAPKs激活途径、Bcl-2家族和P53。其中caspase-8途径和caspase-9途径是经典的凋亡诱导信号通路，而MAPKs家族、Bcl-2家族和P53是重要的凋亡调节因子，各信号转导通路交织成网，其中caspase-3是一个重要的结点，它被活化后可能有以下的作用：(1)消化破坏细胞内多种蛋白酶复合体;(2)激活核内核酸酶;(3)通过特异地消化ATPase 4b亚基，破坏细胞的Ca2+泵功能，造成细胞内Ca2+超载;(4) caspase-3对于某些细胞骨架成分及其调节因子也有作用;(5)降解多聚腺苷核糖二磷酸聚合酶[4,5,6]。caspases-3位于凋亡过程的下游，是凋亡的执行者[7]。Black等发现大鼠心肌缺血/再灌注时缺血区左心室肌组织的caspase-3表达水平显著提高，即caspase-3的高表达区域和心肌细胞凋亡发生在同一心肌缺血部位。利用caspase-3抑制剂可显著减少缺血/再灌注心肌细胞凋亡和心肌梗死范围[9]。Yang等[10]实验发现缺氧造成的心肌细胞凋亡程度与时间有关，缺氧时间长短不同，诱导心肌细胞凋亡程度也不同，但心肌细胞凋亡同时也受复氧的影响，而且缺氧/复氧比单纯缺氧更容易诱导心肌细胞凋亡。缺氧导致的心肌细胞损伤，与在体心肌缺血造成的心肌损伤相似[8]。我们对体外培养的心肌细胞行缺氧/复氧培养后，以western blot半定量检测caspase-3活化产物p17的表达，观察到空白组的心肌细胞缺氧6h后，p17表达增加，缺氧12h比缺氧6h p17表达升高，而在缺氧12h后趋于平稳，缺氧12h与缺氧18h相比无明显差异，提示缺氧造成的心肌细胞caspase-3活化，可能存在着一定的时间相关性。
在心肌细胞缺氧/复氧过程中促凋亡因子大量活化，许多因子通过对凋亡的执行者caspase-3直接或间接的作用，促进caspase-3活化，导致凋亡发生增多。αB-晶体蛋白 (αB-crystallin, CryAB) 是小分子热休克蛋白 (small heat shock protein, sHSP) 家族一员，它可以作为分子伴娘识别并结合有聚集倾向的非天然蛋白质或蛋白质折叠过程中的中间产物，稳定靶蛋白的构象，防止它们形成不可逆的蛋白质聚集产物;在有致凋亡因素作用时，CryAB还能对多种细胞因子结合发挥抗凋亡等作用[11]。CryAB作为内源性凋亡负性调节因子，可粘附至pro caspase-3中间活化产物p24，阻止其进一步水解活化，同时抑制caspase-8和caspase-9途径造成的凋亡[3]。在缺血缺氧、氧化应激、渗透压改变等因素诱导心肌细胞发生凋亡后，αB-晶体蛋白表达增多[13]。对多种动物的研究发现，αB-晶体蛋白基因具有高度保守性[12]。因此，本实验选用SD大鼠心肌细胞的αB-晶体蛋白进行研究。Liu等以H2O2诱导C2C12细胞凋亡发现，示CryAB在线粒体途径启动早期即可发挥作用，CryAB可减轻P5对胞核的破坏;同时，在过表达CryAB的C2C12细胞中，P53从胞浆向线粒体的移位显著减少[14,15]，提示CryAB可阻止对线粒体的作用。此外，Lisa等观察到过表达CryAB可抑制活性氧的产生，减少氧自由基形成，同时过表达CryAB还减少了细胞中谷胱苷肽的损失[16]。心肌缺血可诱导CryAB移位直接接合到肌联蛋白、结蛋白的z带部分以及肌动蛋白和z带接头处的伴肌动蛋白，预防其变性或过伸。心肌缺血缺氧早期，CryAB就随着pH的减低与肌动蛋白和结蛋白的亲和力增加，缺血后的再灌注过程中CryAB继续与肌动蛋白和结蛋白结合并抑制其聚集，继续发挥保护作用[3,17,18]。细胞骨架不仅起到支撑细胞的作用，更是心肌细胞内信号的转导通路，因此，CryAB既可能直接保护细胞骨架也可能通过保护细胞骨架来保护细胞内信号的转导。由此，CryAB通过直接或间接的抑制caspase-3的作用，减少了凋亡。Ray等对鼠心脏心梗模型实验发现，在过表达Cry AB的鼠心脏比对照组，心肌梗死面积缩小，凋亡明显减少[19]。
本实验体外培养大鼠乳鼠心肌细胞，以脂质体转染质粒后在缺氧条件下分别培养心肌细胞6、12、18h后再复氧12h，我们观察到转染组内CryAB在缺氧6、12、18h内表达水平没有明显改变，说明在缺氧6～18h内CryAB可能呈持续表达。在同一缺氧时间内，转染CryAB组caspase-3的活化产物p17表达较空载组和空白组明显下降 (P<0.05) ，说明CryAB可能有抑制caspase-3活化，减少凋亡保护心肌细胞的作用;随着缺氧时间的延长(缺氧6～18h)，转染组CryAB表达基本相对稳定，但似乎有下降趋势，提示随着缺氧时间延长，CryAB阻断caspase-3活化，抑制凋亡的作用可能仍有持续。caspase-3位于凋亡的下游，受多种因素影响的过程，在心肌细胞缺氧/复氧过程中，CryAB是否通过作用于其他影响caspase-3活化的因素而抑制caspase-3活化及其对于凋亡路径中其他因素是否有作用尚需进一步的实验观察。
摘要：目的 研究在缺氧/复氧条件下随着缺氧时间延长αB-晶体蛋白对原代培养心肌细胞中caspase-3的影响。 方法以阳离子脂质体 (LipofectamineTM2000) 介导, 将原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞分为转染组 (转染pEGFP-αB-crystallin-C3) 、空载组 (转染pEGFP-C3) 和空白组 (无任何质粒转染) , 转染后分别缺氧培养6、12、18h后复氧12h, Western Blot半定量检测αB-晶体蛋白和caspase-3活化产物p17表达。 结果转染组心肌细胞αB-晶体蛋白表达有下降趋势, 但差异无显著性 (P>0.05) ;转染组p17与空白组和空载组比较, 明显降低 (P<0.05) , 在缺氧6～18h内, 随着缺氧时间延长, 表达相对稳定, 有下降趋势但差异无显著性 (P>0.05) ;在缺氧12h后, 各组p17表达量趋于平稳。结论 在缺氧/复氧条件下, αB-晶体蛋白可能具有抑制caspase-3活化, 抗细胞凋亡作用;在缺氧6～18h内, 随着缺氧时间延长, αB-晶体蛋白抑制caspase-3活化的作用虽有下降趋势, 但基本相对稳定。