慢性间歇性缺氧（精选3篇）
慢性间歇性缺氧 篇1
目前由于打鼾而引起的心肺等疾病近年来逐渐引起研究人员的重视,而且鼾症者中发生率较高的睡眠呼吸暂停综合症(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS),国外资料显示SAS在成年人中的发病率为2%～4%,是多种全身疾病的危险因素[1],今年来的治疗方面以手术治疗和器械治疗,而由此带来的副作用及经济负担可想而知,因此在很大程度上受到人们的抵触,而且人们受传统思维的影响都对鼾症不够重视,因此在预防鼾症危害遇到众多干扰。目前发现心血管系统存在MT受体,表现为高亲合力,具有饱和性、可逆性、稳定性等特点,有实验表明[2],,心脏和主动脉血管存在MT1A和MT1B受体蛋白及其mRNA的表达,即说明心脏和主动脉血管是MT作用的靶器官。其发挥有效的心血管系统细胞保护作用的机制可能为:(1)褪黑素是一种强有力的抗氧化剂,能阻止氧自由基对细胞的损伤;(2)褪黑素能提高心肌超氧化物歧化酶(SOD),降低过氧化脂质(LPO)的含量,从而增强心肌清除自由基的能力。慢性缺氧后红细胞增多,使血液黏滞度增高,也可增加肺血流阻力引起肺心病,心肌和肺组织的谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-PX)活力、SOD及T2AOC活性明显降低,表明慢性缺氧状态下心肌和肺组织抗氧化能力的减弱。为此我们希望通过研究MT对于慢性缺氧下大鼠心肺的保护作用,来寻找一种对人体无明显毒副作用的有效方法。于2009年8月～2010年12月开始如下工作。
1 材料和方法
1.1 动物
选用5周SD大鼠24只(广西桂林医学院动物实验室提供)质量为(117.8g±1.9g),随机分成三组:对照组在(每天22:00～06:00暗室常压常氧)(O2的体积分数为0.21)下饲养加灌服生理盐水(每天18:00～20:00按1mg/kg灌服)、实验组分为1组常压低氧(体积分数为8.5%的O2)箱内(每天22:00～06:00暗室间歇缺氧)饲养加灌服褪黑素购自美国Sigma公司(每天18:00～20:00按1mg/kg灌服)、2组在常压低氧(体积分数为8.5%的O2)箱内(每天22:00～06:00暗室间歇缺氧)饲养同时加灌服生理盐水(每天18:00～20:00按1mg/kg灌服)。
1.2 低氧舱构建及常压下间歇性缺氧动物模型的复制
采用常压间歇性低氧法复制由于夜间打鼾引起机体的慢性间歇缺氧大鼠模型,参照樊再雯[3]等人慢性间隙性缺氧箱并加以改进(本实验室):透明选用厚度为5mm有机玻璃箱(750mm×500 mm×500 mm)可容纳20只成年大鼠生活,箱子顶部有一个塑胶套、直径为300mm的窗口、两侧各有一个进气孔和出气各300mm,出气口与空气接触。箱内中线出有一隔板上有多个小孔约20mm方便气体循环,将箱内分成两个气室,前面各有一个放置孔约100mm,方便操作者拿取大鼠和打扫卫生等各项操作。实验者向缺氧箱内循环充入氮气,每次循环为8min,通过控氧仪监测间歇缺氧舱内的氧浓度来控制输入气体和排气量,使每1次循环间歇缺氧舱内最低氧浓度达到8.5%,然后随着排除低氧气体同时吸入空气(氧气浓度20.9%),使氧浓度逐渐恢复到21%,在气体分析仪(OX-100A浙江建德梅城电化分析仪器厂提供)动态监测下调整混合气氧体积分数(10±1.5)%,箱内CO2和水分分别用CO2吸收剂(Molecular Products Cimited代理商上海景年医疗器械有限公司提供)和无水氯化钙(汕头市西陇化工厂有限公司提供)吸收,每2天更换低氧箱内的和CO2吸收剂和无水氯化钙及垫料(桂林医学院动物实验中心提供)。
标本留取3组大鼠鼠分别在常压常氧和常压间歇性低氧下生活8周后:实验组在常压常氧下分别断髓处死称(AC5-3上海旭日衡器有限公司提供)其体重,立即取心肌与左肺冰生理盐水(桂林医学院附属医院实验室提供)中洗净血液。用滤纸吸干后心脏沿房室环剪去心房,再沿室间隔边缘剪下右心室,用滤纸吸干水份,参照徐小红[4]等人右心室肥大检测加以改进:用分析天平(LIBROR AEU-210Shimadzu)分别称其RH和LH+S。接着将右心室肌剪碎,用滤纸吸干称300mg湿组织加蒸馏水按10%(W/V)制成10%匀浆,4℃,3500 r/min,离心(Sigma 3-5)10min,吸取上清液,分装后于4℃倾出保存备用,肺组织同法处理。对照组同前。
1.3 指标测定
(1)记录3组大鼠最初及最终体质量;计算3组大鼠RH右心室和LH左心室+S室间隔重量。(2)取心肌和肺组织各300 1mg检测GSH-PX活力、SOD活性、T-AOC,3种试剂盒均由(南京建成生物工程研究所提供),采用紫外分光光度计(Biochrom Libra S32PC)测定。
1.4 统计学处理
数据以表示,采用SPSS13.0软件,计量资料方差分析,多个样本均数两两之间比较用SNK-q检验(P<0.05)有统计学意义。
2 结果
实验组1,2与对照组大鼠BW、RV/(LV+S)(g/g)、RV/BW(mg/g)的差异见表1。
3 讨论
近年来流行病学和临床研究表明人类的鼾症是OSAHS的主要原因,OSAHS是一种由多种病因引起的发病率高、危险性大的全身性疾病,表现为睡眠时打鼾和呼吸暂停,因其反复发生的低氧血症和高碳酸血症可导致严重的心脑血管并发症和多脏器功能损害如血压病的独立危险因素,冠状动脉病变在OSAHS患者中易于发生和加重已被流行病学调查所证实[5]。有实验证实[6]慢性间歇性缺氧可使心肌组织中活性氧产生和清除机制失衡,进一步促进氧化应激的发生发展,最终心肌组织受损。若能在慢性间歇性缺氧早期应用MT等外源性的抗氧化剂,切断氧化应激的恶性循环,恢复代谢的平衡状态,则有可能减轻心肌损伤,对慢性间歇性缺氧起到有益的预防和治疗作用。本实验通过模拟人类睡眠时由于打鼾引起的间歇性缺氧对心肺造成损害,很多国内外学者就MT对由缺氧引起的氧化应激为重要发病机制的疾病是否具有积极作用开展了大量的体内外动物实验和部分临床实验[7],而MT对于缺氧造成的心肺损害有一定保护作用。
注:n=24实验1,与对照组比较,*P>0.05;实验2与对照组比较,*P<0.05;实验2与实验1比较,△P<0.05
实验组1,2与对照组大鼠心肌和肺组织GSH-PX活力、SOD活性、T-AOC差异见表2,3。
注:n=24实验1,与对照组比较,#P>0.05;实验2与对照组比较,#P<0.05;实验2与实验1比较,#P<0.05
注:n=24实验1与对照组比较,△P>0.05;实验2与对照组比较,△P<0.05;实验2与实验1比较,△P><0.05洛指标的单位为每mg组织蛋白中的单位含量。
有研究发现在慢性缺氧状态下,促红细胞生成素的合成增加,红细胞增多,血液的氧容量和氧含量增加,组织的供氧量增加,这种代偿作用同文献报道一致[8,9],本实验中发现实验2组与对照组、实验1组比较心肌和肺组织的GSH-PX活力、SOD及T-AOC活性明显降低(P<0.05),表明慢性缺氧状态下大鼠心肌和肺组织抗氧化能力的减弱,而灌服MT的实验1组与对照组这些指标没有明显变化(P>0.05),由此说明MT阻止了缺氧对心肺的损伤的进展。对照组大鼠8周内体质量明显增加,符合正常生理变化过程,而实验2组与对照组大鼠BW却比其缺氧前减轻(P<0.05),提示慢性缺氧可对大鼠BW造成影响,而灌服MT的实验1组与对照组大鼠BW也明显增加(P>0.05);于此同时右心室心肌肥大指数RV/(1V+S)、RV/BW比值,发现实验2组与其它二组比较均明显高(P<0.05),而对照组和低氧1组这些指标没有明显变化(P>0.05),由此可以证明MT对于慢性间歇性缺氧心肺有一定保护作用。由于目前尚未有一种安全的方法和药物来干预,由鼾症导致机体损害的进程,本实验的可能对于预防和研发新药有重要意义。
摘要：目的:探讨褪黑素(MT)对常压下慢性间歇缺氧损伤SD大鼠心肺的保护作用。方法:将24只雄性,5周SD大鼠随机分成三组并模拟人类睡眠时间:对照组在常压常氧下饲养加灌服生理盐水,实验组分为实验1组常压低氧箱内饲养加灌服褪黑素、实验2组在常压低氧箱内饲养同时加灌服生理盐水,8周后检测体重(BW)、右心室/左心室加室间隔比值RV/(LV+S),右心室/体质量(RV/BW)比值以及心肌和肺组织谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-PX)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)的变化。结果:实验2组与实验1组比较大BW明显降低(P<0.05),而RV/(LV+S)及RV/BW明显增加(P<0.05),心肌及肺组织GSH-PX活力、SOD活性、T-AOC均明显降低(P<0.05);实验1组与对照组比较BW无明显差异(P>0.05),而RV/(LV+S)及RV/BW无明显差异(P>0.05),心肌及肺组织GSH-PX活力、SOD活性、T-AOC均无明显差异(P>0.05);实验2组与对照组比较BW明显降低(P<0.05),而RV/(LV+S)及RV/BW却增加(P<0.05),心肌及肺组织GSHPX活力、SOD活性、T-AOC均明显差异(P<0.05)。结论:褪黑素可防止慢性间歇缺氧对心肺的损伤作用。
关键词：褪黑素,慢性缺氧,心肺,保护作用
参考文献
[1] Bradley TD,Floras JS.Obstructive sleep apnoea and itscardiovascular consequences[J].Lancet,2009;373(9657):82-93
[2] Hardeland R,Pandi-Perumal SR.CardinaliDP.Melatonin[J].Int J Biochem CellBio,12006;38(3):313-316
[3]樊再雯,张珍祥,徐永健.BQ123对慢性缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞电压门控钾通道活性的影响[J].中国病理生理杂志,2008;24(9):1784-1788
[4]徐小红,冯华俊,谭建新.常压慢性缺氧致大鼠心肌重构形态学观察[J].临床合理用药,2009;2(8):5-6
[5]董欢霁,郭雪君.睡眠呼吸暂停综合征对心血管损害的动物模型[J].中国比较医学杂志,2007;17(6):359-362
[6]张洁心,刘剑南,陆甘,杨笛,殷国勇.N-乙酰半胱氨酸在慢性间歇缺氧小鼠心肌损伤中的作用研究[J].南京医科大学学报,2009;29(8):1059-1062
[7] MaldonadoMD,Mutillo-CabezasF,TerronMP,et al.The potentialof melatonin in reducing morbidity-mottality after craniocerebraltrauma[J].J PinealRes,2007;42(1 ):1-11
[8] Phillips SA,Olson EB,Morgan BJ,et al.1 Chronic intermittent hy2poxia impairs endothelium2dependent dilation in rat cerebral andskeletal muscle resistance arteries[J].Am J Physiol Heart Ci rcPhysiol,2004;286(1):H38823931
[9] Horigome H,Murakami T,Isobe T,et al.1 Soluble P2selectin andthrombomod ulin2protein C2protein S pathway in cyanotic congeni2tal heart disease with secondary erythrocytosis[J].Thromb Res,2003;112(4):2232-2271
慢性间歇性缺氧 篇2
1 材料与方法
1.1 动物模型
健康成年雄性SD大鼠16只,3~4月龄,体重250 g~300 g,由复旦大学上海医学院实验动物中心提供。随机分为间歇缺氧组和空白对照组(每组8只)。
间歇缺氧模型的建立:大鼠在缺氧仓内每天连续放置8 h(10 am~6 pm),缺氧仓内氧浓度为10~11%,由测氧仪SCY-1监测氧浓度(深圳市三诺仪表有限公司)。缺氧仓侧壁中央备有直径为5 mm的2个孔,分别用于输入纯氮与空气,0.1 MPa的99%纯氮15 s和0.05 MPa的空气15 s交替注入缺氧仓中。连续间歇性缺氧刺激8周。
空白对照组:大鼠在仓内每天放置8 h(10 am~6 pm),持续8周,仓内空气与外界相通。
1.2 动物处死及脑组织处理
8周后处死大鼠。各组大鼠于处死前2 h给予腹腔注射溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)生理盐水液50mg/kg(浓度是10 mg/m L)。水合氯醛麻醉下断头取脑,脑组织置于4%多聚甲醛中固定24 h,石蜡包埋后切片。在海马齿状回(dentate gyrus,DG)部位进行连续冠状切片,每张脑片厚3μm。
1.3 大鼠海马齿状回神经再生检测
将脑片置于4%多聚甲醛固定15 min后,吹干,进行BrdU免疫荧光染色,具体方法按试剂盒说明操作,Ⅰ抗为BrdU antibody(ab6326,Abcam)。显微镜下标本切片中呈红色的为Brdu(+)表达,每张切片的海马齿状回部位在400倍视野下随机选10个阳性细胞区域,测DG区阳性细胞的荧光光密度(optical density,OD)值并求均值,作为此张片的阳性细胞荧光光密度值(具体数值见表1)。
1.4 海马齿状回突触素
采用免疫组织化学法检测突触素,脑片免疫组织化学染色的主要步骤为:(1)3%过氧化氢室温孵育10 min;(2)10%正常山羊血清封闭室温孵育15 min;(3)滴加Ⅰ抗突触素(1∶200稀释,RB-1461-P0,Synaptophysin Ab-4,Neomarke)4℃过夜;(4)EnvisionⅡ抗-酶标多聚物37℃放置30 min;(5)PBS缓冲液洗涤3次,每次3 min;(6)3,3-二氧基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)(华美生物工程公司,洛阳)显色;(7)PBS终止反应。脱水、透明、封片,光镜下观察。
1.5 乙酰胆碱M1受体检测
用免疫组织化学法检测乙酰胆碱M1受体检测,脑片免疫组织化学染色的主要步骤为:(1)3%过氧化氢室温孵育10 min;(2)10%正常山羊血清封闭室温孵育15 min;(3)滴加Ⅰ抗CHRM1(1∶200稀释,BA1543,Muscarinic Acetylcholine Receptor M1Ab,博士德)4℃过夜;(4)EnvisionⅡ抗-酶标多聚物37℃放置30 min;(5)PBS缓冲液洗涤3次,每次3min;(6)3,3-二氧基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)(华美生物工程公司,洛阳)显色;(7)PBS终止反应。脱水、透明、封片,光镜下观察。
1.6 海马齿状回NR1的检测
NR1的检测采用免疫组织化学法,将脑片免疫组织化学染色主要步骤为:(1)3%过氧化氢室温孵育10 min;(2)10%正常山羊血清封闭室温孵育15 min;(3)滴加Ⅰ抗NR1抗体(1∶500稀释,BA0612,博士德)4℃过夜;(4)EnvisionⅡ抗-酶标多聚物37℃放置30 min;(5)PBS缓冲液洗涤3次,每次3 min;(6)3,3-二氧基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)(华美生物工程公司,洛阳)显色;(7)PBS终止反应。脱水、透明、封片,光镜下观察。
突触素、乙酰胆碱M1受体及NR1的半定量分析:于光学显微镜下观察免疫组织化学阳性产物的分布,测定海马齿状回免疫反应产物的光密度(optical density,OD)值,方法是每张切片的海马齿状回部位在200倍视野下随机选取10个不连续视野,取其平均值(具体数值见表1)。
1.6 统计学处理
采用Stata软件进行数据分析,每组样本结果用以均数±标准差表示。BrdU的OD值、CHRM1 OD以及突触素的OD值数据呈偏态分布,采用Wilcoxon秩和检验;NR1的OD值数据满足正态性和方差齐性条件,采用t检验。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 间歇缺氧下BrdU表达增强
采用BrdU(5’bromo-2’deoxyuridine)标志法,BrdU是胸腺嘧啶脱氧核苷类似物,可掺入DNA复制的S期,被用于神经细胞增殖的标记。之所以选择在动物处死前2 h注射BrdU是因为这段时间足够脑神经细胞吸收BrdU,但尚不足被BrdU标志的脑细胞发生分裂、迁移和分化。以BrdU标记神经再生,观察间歇缺氧处理后对海马区神经干细胞的分化增殖的影响。从图1、2可以看到,间歇缺氧组(图2)BrdU表达要高于空白对照组(图1),差异有显著性(P<0.05)(见表2)。
注:图中浅色免疫阳性产物即为BrdU免疫荧光染色结果(标尺为25μm)
注:图中浅色免疫阳性产物即为BrdU免疫荧光染色结果(标尺为25μm)
2.2 间歇缺氧下突触素表达增强
突触素(synaptophysin,SYN)是突触发生和突触重塑的重要标志,它的定位和定量可准确的反映突触的分布及功能状态,从而反映其可塑性。从图3、4可以看到,间歇缺氧组(图4)突触素表达高于空白对照组(图3),差异有显著性(P<0.05)(见表2)。
注:图中棕黄色免疫阳性产物即为突触素免疫组织化学染色结果(标尺为50μm)
注:图中棕黄色免疫阳性产物即为突触素免疫组织化学染色结果(标尺为50μm)
2.3 间歇缺氧下CHRM1表达增强
乙酰胆碱M受体的药理型可分为M1、M2、M3和M4型,其中M1受体亚型约占脑M受体的50%。M1受体主要分布于大脑皮质、海马、纹状体等神经组织中,主要定位于突触后膜,接受突触前末梢乙酞胆碱的刺激,直接参与学习记忆的信息传递。从图5、6可以看到,间歇缺氧组(图6)CHRM1表达高于空白对照组(图5),差异有显著性(P<0.05)(见表3)。
2.4 间歇缺氧下NR1表达增强
NMDA受体是一种谷氨酸受体,属于配体门控离子通道,是由NR1(即功能单位,形成离子通道)和其他不同的亚单位组成的4聚体或5聚体。因此NR1表达可以反映NMDA受体的总体表达情况。从图1、2可以看到,间歇缺氧组(图7)NR1表达要高于空白对照组(图8),差异有显著性(P<0.05)(见表3)。
注:图中棕黄色免疫阳性产物即为CHRM1免疫组织化学染色结果(标尺为50μm)
注:图中棕黄色免疫阳性产物即为NR1免疫组织化学染色结果(标尺为50μm)
注:图中棕黄色免疫阳性产物即为NR1免疫组织化学染色结果(标尺为50μm)
3 讨论
睡眠呼吸暂停低通气综合征对机体的主要影响是造成间歇性缺氧,与卒中后形成的局灶性缺氧及动脉硬化或颈动脉闭塞造成的全脑组织缺氧有显著不同之处。本实验通过对SD大鼠慢性间歇性缺氧来模拟睡眠呼吸暂停综合征,研究间歇性缺氧对海马齿状回神经细胞的影响。研究结果显示,间歇缺氧组齿状回BrdU表达明显高于对照组,说明短时间内间歇性缺氧可能促进海马齿状回神经增殖。在双侧颈动脉闭塞造成的全脑组织缺氧的动物模型中也有类似报道[3]。这说明不论是间歇性缺氧还是持续性缺氧均能促进海马齿状回神经增殖。已经知道,海马齿状回颗粒下层祖细胞主要增殖分化产生齿状回区颗粒层新生神经元,并无证据表明该区祖细胞迁移出海马区[4],这些新生神经元对维持海马区相关的认知功能可能发挥重要作用,即可能是海马区对缺氧刺激的一个代偿机制。
有研究显示,一侧大脑中动脉闭塞所致的局灶性脑缺氧可以刺激双侧脑室下区、海马齿状回颗粒下层的神经再生,并能诱导脑室下区成祖细胞迁移到缺血灶边缘,而且这些新生神经元能合成神经递质乙酰胆碱和GABA[5],而这些神经递质是卒中后恢复过程中新生神经元发挥功能所必需的,说明神经再生能产生有功能的新生神经元。本研究中发现间歇性缺氧组大鼠海马齿状回乙酰胆碱M1受体表达水平明显高于空白对照组,可能是由于间歇性缺氧直接导致M1受体合成增加,也有可能是由于间歇性缺氧后乙酰胆碱释放减少,通过负反馈机制导致突触后膜上的M1受体上调,但确切机制还有待进一步研究。
突触素是一种与突触结构和功能切相关的囊泡吸附蛋白,参与Ca2+依赖的神经递质的释放和突触囊泡的循环,与突触的发生、形成以及突触重塑密切相关。突触素影响突触可塑性的机制可能是通过酪氨酸激酶使突触素磷酸化,从而调节内源性谷氨酸的释放来影响突触的可塑性。本研究中发现间歇性缺氧组大鼠海马齿状回突触素表达水平明显高于空白对照组,其意义可能是导致某些神经递质的释放,如乙酰胆碱等,也可能是新生神经细胞突触发生、形成的结果,还有可能参与突触重塑[6]。脑缺血动物实验中发现,在最初的24 h内,海马区突触连接迅速增加,但随后有80%的突触连接退化[7],与本实验结果不符,可能与不同形式的缺氧所致结果不同有关,慢性间歇缺氧对突触形成或重塑可能有刺激作用。
缺氧对神经再生的影响的可能作用机制是比较复杂的,可能存在多种因素的作用。研究表明,神经递质谷氨酸对幼稚细胞可能有促进增殖的作用,谷氨酸能提高体外培养神经祖细胞的增殖率,增加其再生潜能[8,9]。谷氨酸受体激活后的钙内流引起去极化可能与细胞增值反应有关[10,11];谷氨酸还能刺激产生BDNF,进而促进神经再生[12]。然而,NMDA受体(与谷氨酸结合的一种受体)拮抗剂对脑缺血后神经再生水平影响,存在较大争议[13,14],可能与NMDA受体不同亚单位的功能不同有关[15,16]。本研究显示,间歇缺氧模型组大鼠海马齿状回NR1水平明显高于空白对照组,说明间歇缺氧能刺激NR1表达增加,可能与该区明显增强的神经祖细胞增殖有关。
综上所述,慢性间歇性缺氧能够诱导大鼠海马齿状回的细胞增殖,同时使突触素和乙酰胆碱M1受体表达增加,可能与缺氧诱导的海马齿状回神经细胞代偿性增加有关,NR1可能参与了该神经再生过程。
摘要：目的 研究慢性间歇性缺氧对大鼠海马齿状回细胞增殖及突触形成的影响。方法 建立SD大鼠慢性间歇性缺氧模型,检测海马齿状回细胞增殖、突触素表达、乙酰胆碱M 1受体及N-甲基-D-天门冬氨酸受体1(N R 1)水平。结果 与正常对照组相比,慢性间歇性缺氧模型大鼠海马齿状回BrdU光密度值(O D值)、突触素O D值、乙酰胆碱M 1受体O D值及N-甲基-D-天门冬氨酸受体1O D值均显著增高(均P<0.05)。结论 慢性间歇性缺氧诱导了海马齿状回的细胞增殖,同时使突触素、乙酰胆碱M 1受体和N-甲基-D-天门冬氨酸受体1表达增加,可能与缺氧诱导的海马齿状回神经细胞代偿性增加有关。
慢性间歇性缺氧 篇3
1 材料与方法
1.1 实验试剂
人脐静脉内皮细胞HUVEC和EAhy926(中科院上海细胞生物学研究所);DMEM培养基(Hyclone公司);胎牛血清(FBS)(Gibco公司);BCA试剂盒、核蛋白提取试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒和谷胱甘肽(GSH)试剂盒(南京建成生物工程研究所);抗体(Santa Cruz公司);PVDF膜和ECL化学发光试剂(Millipore公司);TRIzol试剂盒和逆转录试剂盒(Invitrogen公司)。
1.2 分组及处理方法
HUVEC和EAhy926细胞分为对照组、模型组和1%、1.5%、2%异氟烷预处理组。对照组细胞正常培养;IH模型细胞参照Hoffmann等[6]的方法,于5%CO2和95%N2(O2<1%)中37℃培养5 min,再正常培养5 min,每天循环6 h,共4 d;异氟烷预处理组细胞分别用溶解在DMEM中1%、1.5%、2%异氟烷处理3 h后进行IH处理。
1.3 MTT法测定细胞活力
细胞以1×105个/m L接种于96孔板,同“1.2”项方法培养,加5 g/L MTT 20μL培养4 h,弃培养基后加DMSO 150μL溶解结晶。用全自动酶标仪检测490 nm吸光度。重复3次。
1.4 GSH水平、LDH活性及MDA含量测定
细胞培养液离心后取上清,按相应试剂盒说明书测GSH水平、LDH活性和MDA含量,重复3次。
1.5 SOD活性测定
细胞用0.25%胰酶消化,离心,PBS溶解沉淀,超声破碎,按SOD试剂盒说明书测SOD活性,重复3次。
1.6 Real-time PCR检测
TRIzol法提取细胞总RNA,逆转录合成c DNA,定量PCR扩增,扩增体系:SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL,上下游引物各0.5μL,2μL c DNA,dd H2O 7μL。反应条件:94°C,2 min;94°C,30 s;62°C,30 s,30个循环;72°C,5 min。低氧诱导因子(HIF-1α)上下游引物为5'-ATCTGAGGACACGAGCTGCCT-3'和5'-CA-GAAGGACTT-GCTGGCTGATC-3',产物368 bp;核转录因子-B(NF-κB)上下游引物为5'-CTGATGTG-CACCGACAAGTGG-3'和5'-GTT-GATGGTGCTC-AGGGATGAC-3',产物353 bp。各样品复管2次。β-actin为内参。基因表达量由2-ΔΔCt法获得。
1.7 Western blot检测
Trizol抽提细胞总蛋白,用核蛋白提取试剂盒提取核蛋白,BCA法测蛋白浓度。10μg蛋白经10%SDS-PAGE分离并转膜,封闭1 h,分别加入HIF-1α、NF-κB、GAPDH或TBP一抗,4℃孵育过夜,洗膜,加二抗,室温孵育2 h,GAPDH为HIF-1α的内参,TBP为NF-κB的内参,用ECL系统进行化学发光和观察。重复3次。
1.8 统计学方法
采用统计软件SPSS 22.0对数据进行分析,正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 异氟烷增加IH内皮细胞存活力,降低LDH活性
与对照组比较,模型组吸光度值降低,LDH活性均升高,差异有高度统计学意义(P<0.01)。与模型组比较难,随着异氟烷浓度的增加吸光度值增加,LDH活性下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。
注:与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;LDH:乳酸脱氢酶
A:各组细胞存活力;B:各组细胞LDH活力;与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;LDH:乳酸脱氢酶
2.2 异氟烷降低IH内皮细胞MDA含量
与对照组比较,模型组MDA含量增加,差异有高度统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,随着异氟烷浓度的增加MDA含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。
2.3 异氟烷升高IH内皮细胞SOD活性和GSH水平
与对照组比较,模型组培养基中SOD活性和GSH水平显著降低,差异有高度统计学意义(P<0.01),异氟烷预处理显著升高SOD活性和GSH水平,差异有统计学意义(P<0.05),且随着异氟烷浓度的增加SOD活性和GSH水平均升高。见表3、图3。
注:与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;MDA:丙二醛
与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;MDA:丙二醛
2.4 异氟烷对IH内皮细胞HIF-1α和NF-κB表达的影响
q RT-PCR和Western blot结果表明:与对照组比较,模型组HIF-1α和核内NF-κB均高表达,差异有高度统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,随着异氟烷浓度的增加内皮细胞HIF-1αm RNA和蛋白表达均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),而NF-κB m RNA和蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、5。
3 讨论
OSAS机体处于IH环境中,产生大量氧自由基,形成氧化应激状态[7]。OSAS可导致诸多心脑血管疾病,病理基础是血管内皮受损,而IH是引起血管内皮受损的核心环节[8]。本实验用HUVEC和EAhy926细胞IH模拟OSAS IH,模型组吸光度降低,LDH活性升高,表明细胞氧化呼吸功能受损,细胞膜通透性增加。
全身麻醉后OSAS患者术后呼吸系统并发症风险很高[9]。麻药的选择对OSAS患者的安全至关重要。异氟烷是临床常用挥发性卤代麻醉药[10],具有抗氧化的特性,保护细胞DNA损伤[11]。异氟烷预处理对多种器官可产生保护作用。据报道,异氟烷对脑[12]、心脏[13]、心肌[14]、肾[15]、肝和肺[16]等器官缺血再灌注损伤均有保护作用。鉴于缺血再灌注与IH有相似之处,本研究探讨异氟烷对IH内皮细胞的作用,发现异氟烷预处理可降低细胞IH损伤。血管内皮细胞功能异常是引发心血管疾病的关键,内皮细胞缺氧可产生大量活性氧,损伤血管。异氟烷可提高IH脐静脉内皮细胞SOD活性和GSH水平,降低氧自由基,保护细胞。
注:与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;SOD:超氧化物歧化酶;GSH:谷胱甘肽
与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;A:各组细胞SOD活性;B:各组细胞GSH水平;SOD:超氧化物歧化酶;GSH:谷胱甘肽
与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;A:各组HUVEC细胞m RNA表达;B:各组HUVEC细胞蛋白表达;HIF-1α:低氧诱导因子;NF-κB:核转录因子-B
与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;A:各组EAhy926细胞m RNA表达;B:各组EAhy926细胞蛋白表达;HIF-1α:低氧诱导因子;NF-κB:核转录因子-B
OSAS合并心脑血管疾病发病机制复杂,NF-κB依赖的炎性通路和HIF-1依赖的适应性通路尤为重要[17,18]。NF-κB在胞浆内与IκB结合,无活性;受到炎症介质和应激反应等刺激后解离,NF-κB活化入核,促进炎症因子转录。据报道IH可升高EAhy926中NF-κB表达[19]。HIF-1广泛存在于人和哺乳动物细胞内,低氧时才稳定表达[20],能激活200多个基因调控缺氧应答[21]。HIF-1由受缺氧调控的HIF-1α和细胞内稳定表达的HIF-1β组成,只有二聚体才能发挥作用。缺氧时HIF-lα表达增多,与HIF-1β结合入核,激活促血管内皮生长因子、促红细胞生成素和一氧化氮合酶等基因转录[22]。HIF-1α可降低缺血再灌注损伤中线粒体氧化应激的产生,其下游效应因子已糖激酶Ⅱ也可阻止缺血再灌注损伤造成的线粒体功能障碍[22]。结果发现:IH HUVEC和EAhy926细胞HIF-1α和核内NF-κB表达升高,而异氟烷预处理能够升高细胞HIF-1α表达,降低NF-κB表达,提示其可抑制氧化应激所致的炎症损伤。
综上所述,异氟烷可降低细胞IH损伤,为其用于OSAS患者的麻醉提供依据。然而异氟烷在降低细胞IH损伤的同时,是否有其他副作用,还有待深入研究。
摘要：目的 探讨异氟烷对间歇缺氧(IH)人脐静脉内皮细胞的作用。方法 HUVEC和EAhy926细胞分为对照组、模型组及1%、1.5%、2%异氟烷预处理组,测定细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽(GSH)水平,采用Real-time PCR和Western blot法检测低氧诱导因子(HIF-1α)和核转录因子-B(NF-κB)的表达。结果 与对照组比较,模型组细胞活力、SOD活性和GSH水平降低,LDH活性、MDA含量、HIF-1α和NF-κB表达升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,异氟烷预处理组的细胞活力、SOD活性、GSH水平和HIF-1α表达,增加LDH活性、MDA含量和NF-κB表达降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 异氟烷能清除细胞氧自由基,上调HIF-1α表达,下调NF-κB表达,提示其能降低IH引起氧化应激和炎性反应,减轻内皮细胞IH损伤。