人参总皂甙论文

人参总皂甙论文（精选7篇）

人参总皂甙论文 篇1

失眠症是目前最常见的睡眠障碍之一, 严重影响人类的睡眠质量及身心健康。失眠患者常伴有头痛、头晕和全身不适等多种躯体形式障碍和自主神经功能障碍。交感神经皮肤反应 (sympathetic skin response, SSR) 是人体接受刺激后出现的皮肤-交感神经泌汗体表电压变化的反应, 是客观反映自主神经功能的电生理指标, 20 世纪80 年代开始应用于临床。由于该方法无创、简便、敏感, 此后在临床应用越来越广泛。SSR主要反应自主神经小纤维功能状态, Dellantonio等[1]认为可以较其他方法能更敏感和早期发现自主神经功能障碍。文献[2] 报道, 在周围神经病变和中枢神经系统疾病中, 均发现SSR的异常率明显增高, 提示合并自主神经功能障碍, 经治疗后功能障碍得到改善。国内小样本的文献[3] 报道, 失眠患者SSR异常率增高, 潜伏期延长、波幅降低, 提示失眠症患者存在自主神经功能障碍。目前大多数失眠症患者对西药潜在的不良反应存有担忧, 因此导致西医治疗患者的依从性下降或拒绝服用西药治疗。传统中医中药由于副作用小, 容易被患者接受。近年来中药治疗失眠的报道很多, 药理学研究认为, 人参对中枢神经系统具有调节的作用, 人参总皂甙Rb类有中枢镇静安定作用, 但目前尚未见有人参总皂甙对失眠患者SSR影响的研究报道, 为此本文观察失眠症患者SSR变化, 以及人参总皂甙对失眠症患者SSR的影响, 探讨中药改善自主神经功能障碍的神经电生理学机制, 为拓宽失眠的药物治疗选择提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

被调查患者年龄19~69 岁, 均来自于2015 年1-11 月在武警后勤学院脑科医院门诊就诊的失眠症患者, 符合《中国精神障碍针对分类与标准》第3 版 (CCM-3) 失眠症诊断标准。入选标准: (1) 病程至少2 个月以上; (2) 无进行性中枢神经系统疾病及其他系统的疾病; (3) 头部CT或MRI未见明显异常; (4) 性别不限; (5) 知情同意。排除标准: (1) 各种疾病引起的继发性睡眠障碍; (2) 认知障碍; (3) 头部CT或MRI提示有器质性疾病或全身性疾病者; (4) 近半年行外科手术者; (5) 近2 个月内改服睡眠药物者或服用其他药物者; (6) 假性失眠, 睡眠卫生和睡眠环境不良, 昼夜节律失调性睡眠障碍。

入选符合条件的患者60 例, 其中男28 例 (47%) , 女32 例 (53%) ;均为右利手;年龄19~69 岁, 平均 (43.88±11.90) 岁;病程2~120 个月, 平均 (43.42±10.67) 个月。将60 例失眠症患者分为两组, 单纯人参总皂甙治疗组 (R组, 30 例) , 人参总皂甙治疗+ 基础用药组 (RJ组, 30 例) 。对照组来自笔者所在医院职工和家属, 无躯体疾病和精神疾病合并的睡眠障碍, 同30 例, 男16 例, 女14 例, 年龄21~61 岁, 平均 (42.30±11.50) 岁。三组研究对象一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 患者前期治疗情况

本组资料纳入患者60 例, 其中30 例患者近2 个月内未服用任何抗失眠药物, 30 例近2 个月内一直服用各种抗失眠的西药, 包括苯二氮类 ( 舒乐安定、氯硝安定、劳拉) 和非苯二氮类 ( 佐匹克隆、酒石酸唑吡坦) 。

1.3 药物服用方法

60 例患者分为两组, 30 例近2 个月未服用任何抗失眠药物的患者为单纯人参总皂甙治疗组 (R组) , 服用中药振源胶囊 ( 生产企业:吉林省集安益盛药业股份有限公司;规格:0.25 g×24 s, 批准文号:国药准字Z22026091, 所含成份:人参总皂甙) , 口服, 0.25 g/ 次, 3 次/d, 饭前服用, 连续服用1 个月 (30 d) 。30 例近2 个月服用各种抗失眠药物者在基础用药不变的基础上添加振源胶囊, 服用方法同上, 设为人参总皂甙治疗+ 基础用药组 (RJ组) 。正常对照组不服用任何药物。

1.4 交感神经皮肤反应 (SSR) 检测

1.4.1 检测方法由同一神经电生理医生完成所有纳入研究患者的检测。检查室安静、偏暗, 室温22℃ ~24℃。受检者清醒、放松、保持皮肤温度32℃ ~36℃。采用4 通道Nicolet肌电图/诱发电位仪 ( 美国Nicolet公司) 监测仪, 电刺激方法, 刺激患者的腕部正中神经和踝部胫神经, 地线靠近端, 手足背安放参考电极, 手、足心记录。刺激时程0.1~0.2 ms, 带通0.3~60 Hz, 分析时间5~10 s, 灵敏度0.1~1.0 m V/cm, 超强电流10~40 m A, 间隔15 s~1 min, 每例重复刺激4 次。测量SSR起始潜伏期, 取4 次的平均值, SSR波幅测定取4 次中波幅最高者。

1.4.2 异常SSR的判定标准正常值范围参考简明肌电图学手册, 2006 年由北京协和医院制定, 笔者所在肌电图室环境与其一致。异常SSR的判定标准: (1) 一个或一个以上肢体SSR缺失; (2) 潜伏期延长; (3) 波幅减低。上述三项中任何一项异常均为异常SSR[4]。

1.5 统计学处理

用Excel建库, SPSS 17.0 统计软件处理数据, 计数资料以率 (%) 表示, 比较采用字2检验。正态分布资料计量资料用均数± 标准差表示, 非正态分布数据转换后比较采用t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 失眠症患者SSR异常率以及人参总皂甙治疗对SSR异常率的影响

60 例失眠症患者在治疗前SSR总的异常率为90.0%, 其中未服药治疗的患者SSR异常率为41.7%, 服用各种抗失眠西药治疗的患者SSR的异常率为48.3%;60 例患者中, 潜伏期异常者20.0%, 波幅异常者31.7%, 波幅和潜伏期均异常者20.0%, 其中4 例患者SSR缺失, 与对照组比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。治疗30 d后60 例失眠症患者的SSR总的异常率为53.3%, 其中R组患者的SSR异常率为18.3%, RJ组患者的SSR异常率为35.0%, 60 例患者中潜伏期异常者11.7%, 波幅异常者30.0%, 波幅和潜伏期均异常者11.7%, 与治疗前比较SSR潜伏期和波幅异常率均得到明显改善, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。

2.2 治疗前后患者SSR潜伏期和波幅的变化

治疗前, R组和RJ组SSR的潜伏期均明显延长, 与对照组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;R组和RJ组SSR波幅均明显减低, 与对照组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;R组和RJ组潜伏期和波幅的组间比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 。

治疗30 d, R组和RJ组SSR的潜伏期均明显缩短, 与治前比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;R组和RJ组SSR波幅均明显增高, 与治疗前比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;R组和RJ组的潜伏期和波幅的组间比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 。详见表1。

3 讨论

近年来, 失眠的发病率呈逐年上升趋势, 严重影响人们的身心健康。据统计全世界失眠患者发病率为27%[5], 美国失眠患者的发病率为35%, 我国普通人群失眠患者高达45.4%[6]。失眠患者常常处于睡眠剥夺状态, 常伴有头痛、头晕、恶心、乏力、食欲不振、腹痛、烦躁, 注意力不集中, 疲乏, 情绪紊乱等不适, 也可伴随应激、呼吸、免疫及内分泌功能不全等多种躯体形式障碍和自主神经功能障碍[7], 严重影响患者的工作、学习和生活。

早在1879 年Vigouroux首先在实验中观察到了皮肤电现象。1890 年Tarchanoff描述了可由人的情感或感觉诱发的皮肤电流反应 (galvanic skin response, GSR) 。到20 世纪80 年代中期, 随着电生理检查仪器的改进, Shahani等开始应用电刺激、平均技术和皮肤表面电极在掌心或足心记录到了一个双相电位, 称为交感神经皮肤反应 (SSR) 或外周自主表面电位 (PASP) , 此后逐渐应用于临床。

SSR为脑和脊髓参与下的皮肤催汗反射, 所记录到的是与汗腺分泌活动有关的表皮电压变化, 电刺激的传入纤维为粗大的皮肤A类有髓感觉纤维, 反射弧的中枢部分目前尚未完全明了, 包括中脑网状结构和下丘脑等结构, 大脑皮层对SSR也有调节作用, 额叶可能参与SSR的引出, 顶叶参与波幅调整。位于脊髓中间外侧柱的节前神经元接受来自脑干网状结构的催汗冲动, 其发出的节前纤维到椎旁神经节换元, 节后无髓的C型胆碱能纤维支配汗腺的活动。节后纤维释放的冲动引起汗腺膜对钾离子的通透性改变导致出汗;同时表皮电压发生改变, 也就是用表面电极记录到的SSR。SSR不仅反映了节后交感神经的功能状况, 还反映了感觉传入和中枢处理过程。SSR潜伏期反映了引起排汗神经冲动在整个反射弧的传导时程, SSR波幅反映的是交感节后纤维与汗腺的兴奋程度。

文献[8] 报道, 在周围神经病变如糖尿病、格林巴利综合征、酒精中毒性周围神经病变、神经源性阳痿, 以及中枢神经系统疾病如脑梗死、帕金森病和多发性硬化以及其他疾病如慢性肾功能衰竭、白癜风等中, 均发现SSR的异常率明显增高, 提示合并自主神经功能障碍, 经治疗后功能障碍得到改善。国内文献[9] 小样本的研究报道, 失眠患者SSR异常率增高, 潜伏期延长、波幅降低, 提示失眠症患者存在自主神经功能障碍。

动物和人体药理学研究证实, 人参总皂甙具有多种作用机制: (1) 对中枢神经系统的作用。人参总皂甙能调节中枢神经系统兴奋过程和抑制过程的平衡, 从而调节神经功能, 使紧张造成的紊乱过程得以恢复[10]。既有镇静安定作用, 亦有镇痛、肌松和降温作用。人参亦具有中枢拟胆碱活性和拟儿茶酚胺活性[11], 能增强胆碱系统功能, 增加Ach的合成和释放, 同时提高中枢M- 胆碱受体密度, 从而改善学习记忆。同时人参总皂甙能增加脑血流量和脑能量代谢, 能提高脑摄氧能力, 对脑缺血/ 再灌注损伤均有保护作用[12], 能使动物大脑更合理地利用能量物质葡萄糖, 氧化产能, 合成更多的ATP供学习记忆等活动之用。 (2) 对心血管系统作用。人参总皂甙能提高心肌收缩力, 对心肌具有保护作用, 对心肌细胞内c AMP及c GMP含量具双向调节作用, 维持c AMP和c GMP的平衡, 对抗在应激状态下心律紊乱。并保护心肌毛细血管内皮细胞及减轻线粒体损伤[13]。同时可扩张血管、降压, 能显著地提高动物耐缺氧的能力[14]。 (3) 其他作用。人参总皂甙能增加肝脏的解毒功能[15], 调节内分泌, 通过释放垂体ACTH, 刺激肾上腺皮质来增加肾上腺皮质激素分泌活性, 同时具有降低血糖作用[16]。本研究主要观察人参总皂甙对交感神经皮肤反应的影响, 研究结果证实, 人参总皂甙能缩短SSR的潜伏期, 增高SSR波幅, 明显改善失眠患者SSR的异常, 提示人参总皂甙能改善失眠患者的自主神经功能障碍, 其作用机制尚不清楚, 推测可能与上述多种作用机制共同作用有关, 有待于进一步研究。

总之, 本研究结果提示绝大部分失眠症患者SSR明显异常, 提示失眠症患者存在自主神经功能障碍。人参总皂甙能明显改善失眠症患者SSR潜伏期和波幅异常, 提示该药对失眠症患者的自主神经功能的障碍有明显改善作用, 同时提示SSR检查作为客观的评价自主神经功能的方法, 可做为评估失眠症药物治疗效果的客观指标, 为进一步指导治疗及评估治疗效果提供帮助。

摘要：目的:探讨人参总皂甙对失眠症患者的交感神经皮肤反应 (SSR) 的影响。方法:将60例失眠症患者分为两组, 单纯人参总皂甙治疗组 (R组, 30例) , 人参总皂甙治疗+基础用药组 (RJ组, 30例) , 同时选择30例性别、年龄相匹配的健康成人为对照组。对两组患者在治疗前后以及对照组分别采用电刺激法进行SSR检查, 记录各组SSR的异常率和SSR的潜伏期及波幅, 并进行相关统计分析。结果:60例失眠症患者在治疗前SSR总的异常率为90.0%, 治疗30 d后SSR总的异常率为53.3%, 与治疗前比较SSR潜伏期和波幅异常率均得到明显改善, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论:人参总皂甙能明显改善失眠症患者SSR, 改善患者的自主神经功能。

关键词：失眠,交感神经皮肤反应,人参总皂甙

三七总皂甙磷脂复合物制备研究 篇2

关键词：三七总皂甙:磷脂复合物,含量测定

三七为五加科人参属植物[1], 始载于《本草纲目》, 为常用传统中药之一, 主产于云南和广西, 是传统名贵中药材。三七性平, 味甘, 微苦, 含有多种类型的化学成分, 药理作用广泛, 具有化瘀止血、活血定痛之功。三七对中枢神经有镇痛作用, 对缺血性脑损伤有保护作用, 对心血管系统具有改善心肌缺血状态、止血等作用[2,3,4,5]。已有研究表明[6]:三七的主要成分为三七总皂甙, Rb1和Rg1是人参属植物所共有的成分, 且含量最高, 而Rl是三七特征皂甙成分, 但其在三七生药中含量很低, 因此本文主要以三七皂甙Rg1和Rb1作为研究对象。三七皂甙Rg1和Rb1单体Caco-2细胞转运透过系数 (Papp) 极低 (1×10-7~1×10-8cm/s) , 黏膜透过性差, 三七皂苷Rg1和Rb1的大鼠绝对生物利用度分别为0.7l%和3.29%, 口服吸收差[7]。因此, 其属于口服难吸收成分, 而且根据药物溶解性及胃肠道渗透性可将其归为BcsⅢ或Ⅳ类。

药物磷脂复合物是将药物与磷脂在适宜条件下进行复合得到的一类物质。天然活性成分磷脂复合物的理化性质和生物药剂学性质较原化合物均有不同程度的改变, 通过与磷脂复合形成载体系统或前体药物, 可改善药物经胃肠道或经皮吸收, 故可获得较高的血药浓度, 且药物在体内消除变慢, 生物利用度显著提高[8]。为了提高三七总皂甙的生物利用度, 本实验制备了三七总皂甙磷脂复合物, 并对其性质进行了研究, 为三七总皂甙的综合开发利用建立一定的实验基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200型高效液相色谱仪 (Agilent公司) ;UV-2550型紫外分光光度计 (日本岛津公司) ;NETZSCHSTA499综合热分析仪 (德国) 。

1.2 试药

三七总皂甙 (昆明双星科技开发有限公司提供) ;乙腈 (色谱纯, 国药集团化学试剂有限公司) ;超纯水 (实验室自制) ;所用其他试剂均为AR级。

2 方法与结果

2.1 三七总皂甙磷脂复合物制备

利用三七总皂甙脂溶性差, 不溶于四氢呋喃, 而磷脂和三七总皂甙磷脂复合物均易溶于四氢呋喃的特性, 按摩尔比1∶2的比例将三七总皂甙和磷脂后混匀, 磁力搅拌至澄明, 减压蒸发除去反应溶剂, 加入适量四氢呋喃充分溶解其中的剩余物质, 然后进行抽滤, 收集沉淀物。再用少量四氢呋喃洗涤沉淀物, 再次减压蒸干, 收集沉淀物, 减压干燥24h后称重, 即得未与磷脂复合的三七总皂甙。

2.2 三七总皂甙磷脂复合物复合率测定

三七总皂甙初始投药量与沉淀量的差值即为与磷脂复合的三七总皂甙的量, 通过下式可计算出三七总皂甙与磷脂的结合百分率 (M) :

其中A为三七总皂甙的初始投药量;B为沉淀量。

计算得三七总皂甙磷脂复合物的复合率为98.3%, 表明工艺可行。

2.3 三七总皂甙磷脂复合物光谱学分析

取一定量的三七总皂甙、磷脂、三七总皂甙与磷脂的物理混合物及三七总皂甙磷脂复合物, 分别对其进行紫外、差示扫描量热分析。

2.3.1 UV扫描

以体积分数为75%乙醇做溶剂进行紫外检测, 结果表明, 三七总皂甙、磷脂、三七总皂甙磷脂混合物和三七总皂甙磷脂复合物的紫外图谱相同, 最大吸收峰均在197nm处, 只是复合物的吸光度明显比前两种小, 表明磷脂复合物中三七总皂甙发色基团的结构未发生变化。由于磷脂的极性键与三七总皂甙发生了较强的相互作用, 导致其吸光度减小了。

2.3.2 差示扫描量热 (DSC) 分析

分别称取三七总皂苷、磷脂、三七总皂苷与磷脂物理混合物及三七总皂甙磷脂复合物适量, 置浅铝皿中, 程序升温, 升温速度10℃/min, 20~500℃进行扫描, N2流速0.2mL/min, 差示扫描量热结果见图1, 可见三七总皂甙与磷脂物理混合物相变温度图为两种物质的叠加。形成复合物后, 相变温度降低, 出现此现象可能是三七总皂甙的极性基团与磷脂的极性基团部分发生分子间相互作用, 磷脂的两条长脂肪酸链对三七总皂甙进行包裹, 使其高度分散于磷脂中, 进而改变了药物相变温度, 使其特征峰明显改变, 这也证明形成了复合物, 三七总皂甙磷脂复合物不同于其物理混合物。

2.4 三七总皂甙磷脂复合物中三七总皂甙含量测定

色谱条件:色谱柱:Kromasil C18 (4.6mm×250mm, 5μm) ;流速:1.00mL/min;检测波长:197nm;柱温:室温;进样量:20μL。采用二元梯度洗脱:A相为乙腈, B相为水, 梯度洗脱:0min→5min→20min→45min→67min→82min;流动相A∶B比例为10∶90, 20∶80, 35∶65, 43∶57, 58∶42, 75∶25。

2.5 三七总皂甙磷脂复合物油水分配系数的测定

药物的脂溶性与其在胃肠道的渗透性密切相关, 因此通过测定药物及其磷脂复合物在不同体系中的油水分配系数, 可以描述药物脂溶性大小。

采用摇瓶法测定, 分别量取pH为2、3、4、5、6的水20mL, 置磨口三角瓶中, 各2份, 分别加入适量的三七总皂甙及其磷脂复合物, 25℃振摇12h至溶解平衡, 移至离心管中, 3 000r·min-1离心20min。取上层液10mL, 置磨口三角瓶中, 分别加入正辛醇10mL, 25℃振摇至溶解平衡 (预试验表明平衡时间为24h) , 3 000r·min-1离心20min。分别量取水相和正辛醇相2mL置10mL量瓶中, 甲醇定容后测定, 三七总皂甙及其磷脂复合物正辛醇/水分配系数测定结果见表1。

从表1可以看出, 复合物对于三七总皂甙在正辛醇中的溶解度提高了50多倍, 在水中的溶解度提高了4倍多, P值提高10倍多。结果表明, 磷脂能有效地提高三七总皂甙的正辛醇/水表观分配系数, 提高了三七总皂甙的溶解性能。

3 讨论

三七总皂甙磷脂复合物在正辛醇/水系统中进行表观油水分配系数的测定, 结果显示药物形成磷脂复合物后使药物的脂溶性得到了显著性提高。这可能是因为:三七总皂甙与磷脂的极性基团发生了较强的相互作用, 而磷脂的两个长链脂肪酸不参与复合反应, 可以自由移动, 包裹磷脂的极性部分形成一个亲脂性的表面, 使复合物的脂溶性较原料药显著提高。

本文制备的三七总皂甙磷脂复合物很好地解决了该药物脂溶性差的问题, 同时该复合物还可以作为制剂中间体制备微丸等固体、液体制剂, 为三七总皂甙制剂的开发提供了新的思路。

参考文献

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人参皂甙药理活性的研究进展 篇3

1 人参皂甙的分类

人参皂甙作为人参的主要活性物质, 属于三萜类皂甙。根据苷元的结构类型, 人参皂甙可分为3类:原人参二醇型, 主要包括人参皂甙Rb1、Rc、Rh2等;原人参三醇型, 主要包括人参皂甙Re、Rf、Rg1等;齐墩果酸型, 主要包括人参皂甙Rh3等。

2 人参皂甙的药理活性

2.1 抗肿瘤作用

人参皂甙Rd能够抑制He La细胞生长, 并呈剂量依赖关系。人参皂甙Rd对人H838肺癌细胞生长的抑制率达到20%~90%[1]。研究发现, 人参皂苷Rb1作为一种钙离子拮抗药, 能够逆转肿瘤细胞耐药性。人参皂甙Rh2能抑制肿瘤细胞生长, 可以保护人体免疫器官, 预防肿瘤复发和转移。

2.2 保护心脑血管的作用

胡瑜等报道人参皂甙Rb3对大鼠局灶性脑缺血损伤有保护作用, 能够减轻脑水肿程度, 提高血清中超氧化物歧化酶含量[2]。人参皂甙Rg1能够减缓脑缺血再灌注损伤症状, 降低对减轻线粒体损伤, 降低血清中丙二醛含量。人参皂甙Rb和Re对心肌缺血引起的心肌损伤起到保护作用, 降低心肌细胞凋亡率。

2.3 保护神经系统的作用

研究表明, 人参皂甙Rb能够调节神经元干细胞球分化程度。同时, 人参皂甙Rb对雪旺细胞增殖有明显促进作用, 能促进损伤的神经元细胞修复与再生。人参皂甙Rb和Rc对小鼠的中枢神经系统有镇痛作用。人参皂甙Rg1和Rg2能够刺激中枢神经系统兴奋。人参皂甙Rb2和Rg1对神经细胞具有明显抗缺血保护作用, 从而提高神经细胞抗氧化能力[3]。

2.4 提高免疫力的作用

人参皂甙Rd能够诱发免疫反应, 主要通过调节免疫细胞因子的数量和基因表达。人参总皂甙对正常人外周血T细胞有增殖作用, 增强小鼠免疫功能。人参皂甙Rg1通过促进T辅助细胞功能, 提高老年人的免疫力。人参皂甙Rb1能够抑制细胞因子产生, 阻止组胺的释放[4]。

2.5 抗衰老的作用

王红丽等报道, 口服人参皂苷能够提高衰老模型小鼠皮肤中SOD酶活力和羟脯氨酸含量, 增强皮肤对自由基的保护作用。程俊霖等研究发现, 口服人参总皂苷对D-半乳糖所诱导的小鼠皮肤具有抗衰老作用, 能够提高小鼠皮肤组织中羟脯氨酸含量, 及皮肤组织中SOD酶活力, 与对照组差异显著。

2.6 提高记忆力的作用

人参皂甙Rb1能够提高小鼠的学习记忆能力。人参皂甙Rd通过提高中枢胆碱能系统活性, 达到改善记忆力, 提升学习能力的功效。

2.7 其他作用

降低血脂作用, 人参皂甙Re能够提高胰岛素的功效, 调节血糖和血脂的浓度。镇痛作用, 人参皂甙Rd具有缓解疼痛功效。抗辐射作用, 人参皂甙Rg1能够减缓由辐射所引起的细胞凋亡。保护软骨作用, 人参皂甙Rb1可抑制软骨细胞凋亡。刺激垂体-肾上腺皮质系统作用。

3 展望

人参具有多种药理活性, 人参皂苷作为人参的主要活性成分之一, 具有抗肿瘤、保护心脑血管、保护神经系统、提高免疫力、抗衰老、提高记忆力等诸多功效。目前, 已开发人参皂甙相关药品用于心血管疾病、皮肤创伤以及炎症等疾病治疗。但是, 对于人参皂甙组分和剂量对其药理活性影响仍需进行深入研究, 以完善人参皂甙药理作用机制, 促进人参皂甙在医药学领域广泛应用。

摘要：人参作为传统中药, 有着悠久的应用历史。人参皂甙作为人参主要有效成分之一, 具有广泛的医学药用价值, 受到国内外的普遍重视。本文对人参皂甙的药理活性, 以及疾病治疗方面的应用进行综述。

关键词：人参皂甙,药理活性,研究进展

参考文献

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人参总皂甙论文 篇4

1 材料和仪器

1.1 试验材料和试剂

人参皂甙 (质量分数为30%) 由黑龙江烟草工业有限责任公司提供。部分人参皂甙分子量如表1所示。由表1可知, 人参皂甙的分子量为800~1 200, 熔点为190~210℃。

Rb1、Re和Rg1标准品 (≥98%, HPLC色谱纯) 由华南农业大学生物材料研究所提供;卷烟样品 (烟丝平均质量为0.75 g) 由华南农业大学烟草研究室提供;甲醇 (≥99.9, HPLC色谱纯) 由天津市Kermel化学试剂有限公司生产;无水乙醇 (≥99.7%, 分析纯) 由国药集团化学试剂有限公司生产;乙腈 (≥99.9%, HPLC色谱纯) 由英国Lab-scan公司生产。

1.2 试验仪器

采用美国Agilent公司生产的AGILENT 6890N气相色谱仪;采用南京科捷分析仪器有限公司生产的AS5150A超声波清洗器;采用梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司生产的AR2140型电子分析天平;采用美国Agilent公司生产的Agilent 1200LC/6410B-MS液相色谱/串联四级杆质谱联用仪;采用上海一恒科学仪器有限公司生产的LHS-150SC恒温恒湿箱;采用上海雅荣生化仪器设备有限公司生产的RE-52AA旋转蒸发仪;采用上海精宏试验设备有限公司生产的DHG-9070A电热恒温鼓风烘箱;采用江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司生产的JB-4定时双向电子恒温磁力搅拌器;采用上海和呈仪器有限公司生产的DZF-6030真空恒温干燥箱。

2 试验方法

2.1 逸出温度与分子结构关系的试验方法

2.1.1 样品处理

用分析天平称取0.84 g, 质量分数为30%的人参皂甙, 将质量分数为20%的乙醇稀释成25 m L, 质量分数为1%的溶液。

2.1.2 气相色谱检测

用气相色谱检测不同温度下 (80~400℃) 人参皂甙的逸出情况。Supelco18275-06A PTE-5Capillary (30 m×0.25 mm, 0.25μm) 的载气流速为3 m L/min, 载气为氮气, FID检测器的检测温度为300℃, 进样量为1μL。

2.2 人参皂甙添加于烟丝中逸出率的测定

2.2.1 人参皂甙样品的准备工作

分别取0.75g、1.5g和2.25g, 质量分数为30%的人参皂甙, 并用质量分数为20%的乙醇稀释成的5 m L的溶液。

2.2.2 人参皂甙卷烟样品的准备工作

将卷烟150支 (平均支重0.95 g, 烟丝重0.75 g) 置于在恒温恒湿培养箱中, 在相对湿度60%5%和温度22℃2℃的环境中平衡水分48 h, 分3组每组50支准确称量;利用微量注射器取25μL的人参皂甙乙醇溶液均匀注射到卷烟样品烟丝中 (开始注射点和结束注射点分别为距离烟丝端5 mm和55 mm的位置) , 并将添加人参皂甙的香烟置于恒温恒湿培养箱中, 在相对湿度60%5%和温度22℃2℃的环境中平衡水分48 h。

2.2.3 卷烟烟气中人参皂甙的捕集

采用吸烟机模拟人的吸烟过程, 并用甲醇吸收主流烟气中的人参皂甙。吸烟机每次抽吸2 s, 间隔40 s, 环境温度为22℃±2℃, 相对湿度为60%±5%, 在上述条件下收集人参卷烟滤嘴和吸收人参皂甙的甲醇溶液。

2.2.4 待测样品溶液的制备

取质量分数为30%的人参皂甙0.75 g, 将质量分数为20%乙醇稀释成的5 m L的溶液作对照试验, 编号为溶液A0;将3种质量分数不同的已吸收人参皂甙的甲醇溶液浓缩至小体积过滤, 滤液继续浓缩至浸膏, 然后置于真空恒温干燥箱 (50℃) 干燥, 并用甲醇溶解定容至25 m L, 编号为A1、A2和A3;精密称取经吸烟机吸完的卷烟烟嘴, 根据质量分成3组, 置于3个烧杯中, 加入适量的甲醇超声提取4次后合并提取液, 浓缩至小体积过滤, 滤液继续浓缩至浸膏, 置于真空恒温干燥箱 (50℃) 干燥, 并用甲醇溶解定容至25 m L, 编号为B1、B2和B3。

2.2.5 HPLC色谱条件

Thermo-C18 (150 mm×2.1 mm, 2.4μm) 色谱柱 (美国Agilent公司) 的流动相为乙腈-水 (含0.2%的甲酸) , 流速为0.3 m L/min, 进样量为2.0μL, 柱温为25℃。

2.2.6 MS质谱条件

离子源为电子喷雾 (ESI) 离子源, 采用正离子电离模式, 干燥的 (N2) 温度为350℃, 流量为9.00 L·min;雾化气 (N2) 的压力为275.8 KPa, 电喷雾电压为4 000 V, 扫描方式为多反应监测 (MRM) 模式;定量监测离子对Rb1为1 132→365、Rg1为823→203、Re为969→789.

2.2.7 人参皂甙的含量分析

分别取待测样品溶液各2.0μL注入液相色谱/串联四级杆质谱联用仪, 以外标法测定其中人参皂甙Rb1, Rg1和Re的含量。

3 结果和分析

3.1 人参皂甙的逸出温度与分子结构的关系

气相色谱的检测结果表明, 进样温度在80~400℃, 气相色谱均未检测出皂甙分子的逸出。

从分子结构可看出, 人参皂甙Rb1、Rc、Re、Rf、Rg1和Rd均含有多个羟基, 分子间存在较多的氢键, 且分子量较大、分子间作用力强、沸点高, 不容易逸出。由此可见, 人参皂甙的逸出温度与其分子结构有密切关系。

3.2 添加于烟丝中逸出率的测定结果

3.2.1 Rb1、Rg1和Re的质量浓度分析

按照上述测定方法测定溶液中人参皂甙Rb1、Rg1和Re的质量浓度, 测定结果如表2所示。

3.2.2 烟丝中人参皂甙Rb1、Rg1和Re的质量浓度

利用微量注射器分别取25μL质量分数不同的人参皂甙乙醇溶液均匀注射到卷烟样品烟丝中, 恒温恒湿48 h。根据人参皂甙Rb1、Rg1和Re的各项参数计算每支香烟中人参皂甙的质量浓度如表3所示。由表3可看出, 每支香烟中人参皂甙Rb1的质量浓度最大。

3.2.3 烟嘴中Rb1、Rg1和Re吸附量的测定

准确称取经吸烟机吸完的卷烟烟嘴, 用甲醇超声提取, 经浓缩、干燥和甲醇定容后编为B1、B2和B3溶液, 并用外标法测定的人参皂甙Rb1、Rg1和Re的质量浓度如表4所示。

由表4可知, 在上述试验条件下, 编号为B2的溶液中未检测到人参皂甙Rb1、Rg1和Re;编号为B1和B3的溶液中未检测到人参皂甙Rg1和Re, 烟嘴吸附人参皂甙Rb1的吸附率随着添加到卷烟样品烟丝中人参皂甙的量的增加而减小。

3.2.4 烟气中Rb1, Rg1和Re逸出率的测定

烟气中人参皂甙Rb1的质量浓度和逸出率如表5所示。

3种质量浓度不同的吸收人参皂甙的甲醇溶液经浓缩、干燥和甲醇定容后编为A1、A2和A3溶液, 并用外标法测定的人参皂甙Rb1、Rg1和Re。结果表明, 3种溶液中未检测到人参皂甙Rg1和Re。由表5可知, 在上述试验条件下, 人参皂甙Rb1的逸出率随着添加到卷烟样品烟丝中人参皂甙的量的增加而降低。

4 结束语

本文只对人参皂甙在卷烟主流烟气中逸出率进行了初步研究, 对其加入卷烟中的减害作用还需要进一步研究。

摘要：通过初步研究人参皂甙在卷烟主流烟气中的逸出率得出了以下结论:1气相色谱检测结果表明, 进样温度在80400℃时, 气相色谱均检测不出皂甙分子的逸出。由此可见, 人参皂甙的逸出温度与其分子结构有密切关系。2人参皂甙原液中的Rb1、Rg1和Re的质量分数分别为3.573 3 mg/g、13.773 3 mg/g和3.320 0 mg/g。每支香烟中Rb1型人参皂甙的含量最大。人参皂甙Rb1的逸出率随着添加到卷烟样品烟丝中人参皂甙的量的增加而降低。3在试验条件下, 烟气中未检测到的人参皂甙Re, 人参皂甙Rg1的逸出率比Rb1的高。

人参总皂甙论文 篇5

1 20 (R) -人参皂甙Rg3特点及单体理化性质

20 (R) -人参皂甙Rg3单体最早发现于1980年, 发现者为北川勋 (日本) , 其分子式为C42H72O13, 经测量, 其相对分子量为784.30, 在甲醇及乙醇溶液中能够较好地溶解, 水中溶解度较差, 在乙醚及氯仿中则完全无法溶解。其同型异构体及降解产物分别为20 (S) -人参皂甙及20 (R) 人参皂甙Rh2, 其中以20 (R) -人参皂甙Rg3在抗肿瘤方面作用最强。20 (R) -人参皂甙Rg3提取自红参, 据临床研究表明, 其提取率极低 (约0.003%) [5,6]。其中, 人参经晒干或烘干步骤后再进行蒸制即为红参。

2 20 (R) -人参皂甙Rg3单体抗肿瘤作用机制

2.1 降低肿瘤细胞增殖活性

据医学研究表明, 西洋参根切片后加热, 能够产生多种物质, 包括Ginsenoside Rg3、Re、Rg2等5种代表性物质。其中Ginsenoside Rg3抑制肿瘤细胞增殖活性作用最强, 主要包括SW-480、NSCLC及HT-29这3种分属于不同细胞系的肿瘤细胞。20 (R) -人参皂甙Rg3对阿霉素耐受的人红白血病细胞株 (即K562/ADM) 、乳腺癌细胞系中的MCF-7细胞、人肺腺癌细胞系中的A549肿瘤细胞以及视网膜细胞瘤中HXO-RB44肿瘤细胞等肿瘤细胞具有较好地增殖抑制作用, 同时还能推迟肿瘤生长周期, 延肿瘤病情发展, 提高患者存活率[7,8]。G2→M期及S→G2期是肿瘤细胞增殖中不可或缺的重要环节, 20 (R) -人参皂甙Rg3能够有效影响其发展进程, 造成S及G2期肿瘤细胞数量逐渐增多, 而G0/G1期细胞数量逐渐减少, 进而导致肿瘤细胞增值过程中有丝分裂前期RNA和DNA, 以及相关蛋白质生成, 减弱肿瘤细胞增殖活性。20 (R) 人参皂甙-Rg3与减弱肿瘤细胞增殖活跃程度对应用剂量及应用实践具有明显的依赖性[9]。

2.2 促进肿瘤细胞凋亡

人参皂甙Rg3能够诱导多种肿瘤细胞株进入凋亡过程, 其诱导作用与药物浓度、作用时间呈一定的正相关性[10]。其诱导作用的可能性机制为caspase-3在体内的表达及活跃程度提升, 或者一氧化氮 (NO) 释放量。在膀胱癌细胞系中, 人参皂甙Rg3通过提升caspase-3活跃程度来诱导EJ细胞开始凋亡进程;在巨噬细胞株 (RAW264.7) 中, 通过NO合酶合成量逐渐提高, 进而导致NO分泌量得到升高, 同时线粒体受到一定的损伤, 促使凋亡内途径得到激活, 最终造成细胞进入凋亡过程[11]。

2.3 降低肿瘤细胞粘附率, 减弱其浸润作用, 抑制转移情况

国外医学研究学者指出, 20 (R) 人参皂甙及其同型异构体20 (S) 人参皂甙对肿瘤细胞中B16-BL16的抑制作用比较明显, 其主要作用于肿瘤细胞对正常细胞基质层中的粘连蛋白部分及纤维连接蛋白结构上, 抑制肿瘤细胞的粘附作用, 还对重建基底膜的肿瘤细胞浸润过程起到缓解、抑制作用。上述两种作用均与人参皂甙Rg3的应用剂量关系比较密切。医学研究表明, 除人参皂甙Rg3以外的多种人参皂甙, 如人参皂甙Rb等的抑制作用均不明显, 或作用力比较弱[12]。在荷兰小鼠实验中, 通过连续静脉注射人参皂甙Rg3 (100) , 2个星期后处死实验小鼠, 经检测后发现连续注射人参皂甙小组实验小鼠肺转移灶数量情况明显好于对照组, 这说明人参皂甙Rg3对B16-BL6肿瘤细胞的肺转移具有明显降低作用。

国内学者指出将人参皂甙Rg3与三氧化二砷单独或联合应用以对人肝癌肿瘤细胞中SMMC-7721细胞对体内正常细胞的粘附作用具有明显的抑制作用, 同时还能减弱其游走能力及基底膜的穿透作用, 而且联合应用效果明显好于单独应用效果。利用小鼠膀胱癌细胞模型 (隶属于BBT739癌细胞系) 支持上述观点, 对膀胱癌在小鼠体内的肺转移过程具有明显的抑制作用, 能够有效降低其发生率[13]。

肿瘤细胞对正常细胞的浸润作用与钙离子在细胞内的浓度关系比价密切, 其可能性作用机制为1-油酰溶血磷脂酸受到人参皂甙Rg3的抑制, 导致细胞内钙离子逐渐上升, 减缓癌细胞对单层细胞的浸润程度, 降低浸润率[14,15]。需要注意的是, 在LPA的蛋白酪氨酸磷酸化发展过程中, 人参皂甙Rg3产生的影响不大, 但若人参皂甙Rg3浓度逐渐上升, 甚至能够降低MM1侵袭细胞程度时, 通过对LPA产生完全的抑制作用, 以抑制肿瘤侵袭及转移的作用。其中, LPA能够对钙离子的释放产生暂时性诱导作用[16]。

此外, 肿瘤患者体内NO合成量的逐渐升高也能够对肿瘤的浸润及转移过程产生明显抑制作用, 可作用机制在于人参皂甙Rg3对NF-B活性的激活, 促使巨噬细胞中Raw164.7细胞株加快合成NO合酶, 提高NO浓度, 减少细胞内游离钙浓度, 扩张相关血管, 对学校办的聚集及粘附也有一定的抑制作用[17,18]。

2.4 减缓肿瘤内血管新生速度

其机制主要包括: (1) 对肿瘤细胞中如VEGF等血管生成因子进行移植, 与应用剂量具有一定的正相关性; (2) 对癌症诱导下进行的血管内皮细胞增殖及转移作用具有明显的抑制作用, 且与人参皂甙Rg3应用剂量具有明显的正相关性[19]; (3) 人参皂甙Rg3对由内皮细胞合成的基质金属蛋白酶具有一定的活性抑制作用, 促使细胞间质以及细胞外基质等部位的降解程度减轻, 以达到干扰肿瘤内皮细胞及细胞外基质二者之间相互作用的目的, 最终抑制血管肿瘤血管新生。

2.5 淋巴系统转移与逆转耐药性

据临床研究表明人参皂甙Rg3对肿瘤细胞的淋巴道转移具有明显的抑制作用, 其可能与金属基质蛋白的表达, 细胞受到诱导后开始凋亡等有关。而肿瘤细胞具有一定的耐药性, 人参皂甙Rg3能够明显逆转肿瘤细胞多药耐药性, 如阿霉素等, 其可能性机制在于人参皂甙Rg3使细胞内钙离子浓度发生变化, 促使细胞膜上多种转运蛋白活跃程度降低, 最后导致其逆转耐药[20]。此外, 人参皂甙Rg3还可缓解化疗药物带给患者机体的毒性作用, 减轻不良表现, 提高患者生活质量。

而在现代中医医学研究中发现, 在常规化疗治疗中加入人参皂甙Rg3药物进行治疗, 治疗效果明显优于单独应用常规西药化疗者, 不良症状也较少, 值得进一步研究。

人参总皂甙论文 篇6

仪器与材料

仪器:日本SHIMADZU高效液相色谱仪;LC-10ATVP泵;SPD-10AVP检测器;N2000工作站;KQ3200型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) 。

材料:人参果总皂苷由吉林集安益盛药业股份有限责任公司提供。人参皂苷Rd对照品 (批号111818-201001) 、人参皂苷Re对照品 (批号110754-200218) , 购自中国药品生物制品检定所。乙腈, 甲醇均为色谱纯, 水为蒸馏水, 其余试剂均为国产分析纯。

方法与结果

色谱条件:Apollo C18色谱柱 (250mm×4.6mm, 5μm) ;流速1.0ml/分;检测波长203nm;柱温25℃。流动相为乙腈-水梯度洗脱, 洗脱条件, 见表1。

在以上色谱条件下, 供试品色谱中, 在与人参皂苷Re对照品和人参皂苷Rd对照品色谱相同的保留时间处有色谱峰, 并与其他组分基本达到基线分离。见图1A、图1B。

对照品溶液的制备:取人参皂苷Re和人参皂苷Rd对照品适量, 精密称定, 加甲醇制成每1ml含人参皂苷Re 0.726mg和人参皂苷Rd 0.434mg的混合溶液, 0.45μm滤膜滤过。

供试品溶液的制备:取人参果总皂苷粉末30mg, 精密称定, 置10ml量瓶中, 加甲醇超声使溶解并稀释至刻度, 0.45μm滤膜滤过, 取续滤液。

检测波长的选择:分别吸取人参皂苷Re和人参皂苷Rd对照品溶液适量, 以甲醇为空白, 在190~370nm波长处扫描, 结果可见人参皂苷Re及人参皂苷Rd对照品溶液在203nm处有最大吸收, 故最终选择203nm为测定波长。

线性关系考察:分别精密吸取对照品混合液4、7、10、13、19μl进样。以峰面积 (Y轴) 与对照品质量 (X轴) , 绘制标准曲线。结果表明, 人参皂苷Re2.904~13.794μg, 线性关系良好, 回归方程Y=182766X-12079, 相关系数r=0.9993;人参皂苷Rd 1.736~8.246μg, 线性关系良好, 回归方程Y=185851X-11006, 相关系数r=0.9990。

精密度试验:精密吸取供试品溶液10μl, 连续重复进样6次, 依法检测, 结果人参皂苷Re峰面积的RSD值0.9%, 人参皂苷Rd峰面积的RSD值1.8%, 表明仪器系统精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液10μl, 分别在0、2、5、8、12小时进样, 依法检测, 结果人参皂苷Re峰面积的RSD值1.6%, 人参皂苷Rd峰面积的RSD值1.1%, 表明供试品溶液在12小时内稳定。

重现性试验:取同一批次的人参果总皂苷, 按供试品溶液制备方法制备6份样品, 分别检测, 计算人参皂苷Re、Rd含量, 结果人参皂苷Re平均含量19.1%, RSD值1.5%, 人参皂苷Rd平均含量12.8%, RSD值1.9%。

加样回收率试验:取重现性试验同批次的人参果总皂苷15mg, 6份, 精密称定, 分别精密加入人参皂苷Re和人参皂苷Rd对照品, 按供试品溶液制备方法制备供试品溶液, 依法检测, 计算人参皂苷Re和人参皂苷Rd回收率, 结果人参皂苷Re平均回收率98.5%, RSD值1.0%, 人参皂苷Rd平均含量97.8%, RSD值0.7%。见表2和表3。

样品含量测定及含量限度的确定:按含量测定项下方法, 测定了10批“人参果总皂苷”中人参皂苷Re和人参皂苷Rd的含量, 见表4。

根据上述测定结果, 10批样品中人参皂苷Re的平均含量19.35%, 且均高于14.0%;人参皂苷Rd的平均含量12.05%, 且均高于8.0%。考虑原料药产地、加工及生产等因素的影响, 限定本品含人参皂苷Re (C48H82O18) 计不得少于14.0%;含人参皂苷Rd (C48H82O19) 不得少于8.0%。

讨论

在本研究中曾对供试品溶液的制备和色谱条件分别进行了考察。在对供试品溶液制备方法考察中发现, 利用D101型大孔吸附树脂柱 (内径1.5cm, 柱高15cm) 法与超声法提取所得的样品, 经测定其色谱峰分离度及含量基本一致, 并且后者操作更简便、快速, 因此在制备供试品溶液时选用超声法。

在探索色谱条件的实验中发现, 采用乙腈-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱时, 色谱图基线有漂移现象, 选用乙腈-水为流动相进行梯度洗脱时, 各色谱峰峰型及基线均好, 进一步考察乙腈-水梯度比例, 最终采用梯度浓度为19:81, 29:71, 40:60和19:81, 24:76, 37:63时, 图谱中各色谱峰峰型及分离度均较好, 同时在70分钟内洗脱完毕, 故确定该流动相为人参果总皂苷中人参皂苷Re及人参皂苷Rd液相测定的流动相。

综上所述, 本试验建立了高效液相色谱法测定人参果总皂苷中人参皂苷Re和人参皂苷Rd含量的方法, 并规定了它们的含量限度, 为评价人参果总皂苷的质量提供了实验依据, 建议可将此方法收录于新版中国药典中。

参考文献

[1] 孙成贺.人参果中人参皂苷分离技术及提取物HPLC指纹图谱研究[D].北京:中国农科院, 2008.

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1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

人参总皂苷(TSPG)由重庆市中药研究所惠赠,RPMI-1640培养液配成200μg·ml-1的工作液,正压过滤除菌备用;人红白血病细胞株(K562细胞)由本校检验系惠赠,在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中常规培养,每2～3d换液传代。

1.1.2 试剂

小牛血清(BS,杭州四季青公司),SP检测试剂盒、DAB显色试剂盒、Fitc荧光抗体(中杉金桥公司),细胞裂解液(Biovision,ING),ELISA试剂(Invitrogen公司),抗STAT3包含STAT3α和STAT3β(Anti-STAT3α,Anti-STAT3β,相对分子质量分别为84kD和79kD)、羊抗兔IgG抗体、β-actin抗体(博士德生物公司),预染marker(Fermrntas公司),SDS-PAGE凝胶配制试剂(碧云天),PI染料(Sigma公司)。

1.1.3 仪器

酶标仪(SUNRISE,奥地利TECAN公司),生物显微镜(TE2000-U,Nikon公司),图象分析仪(CM-2000B,北航生物图象分析系统),电泳仪(DYY-11,北京六一厂),激光共聚焦(LCS-SP2,德国莱卡公司公司)。

1.1.4 培养基

RPMI-1640培养基购于GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法

(1)取对数生长期的细胞进行分组培养。

对照组:常规培养;TSPG组:常规培养基础上加入TSPG 200μg·ml-1,分别作用6、12、24、36、48h。

(2)蛋白提取:

离心收集各组细胞,调整细胞浓度为5×106个/ml,分别取各组细胞悬液20μl,加入100μl细胞浆裂解液,冰上放置30min,25 000×g离心15min,吸上清为细胞浆蛋白,Bradford法[8]测定蛋白浓度,并调整全细胞总蛋白浓度,-70℃保存备用;余下各组细胞分别加入100μl细胞核裂解液,冰上放置30min后,25 000×g离心15min,吸上清为细胞核蛋白,Bradford法测定蛋白浓度,并调整全细胞总蛋白浓度,-70℃保存备用。

(3)ELISA双抗夹心法:

方法按试剂盒说明书进行。结果于酶标仪450nm处读取吸光度值。

1.2.2 SP免疫细胞化学法

实验分组同上,分别作用12h、36h。4%多聚甲醛固定细胞10min,1% Triton-PBS打孔并固定5min,PBS洗涤离心后甩片到经多聚赖氨酸包被的载片上,以兔抗人STAT3单克隆抗体(1%Triton-PBS稀释)进行免疫细胞化学SP法染色。图象分析仪分析平均光密度值。

1.2.3 Western blotting法

(1)细胞分组培养和蛋白提取同ELISA法。

(2)Western blotting:取每组蛋白提取液各20μl与20μl凝胶加样缓冲液混匀,100℃煮沸5min,进行SDS-PAGE。积层胶电泳电压60V,分离胶电泳电压120V,转移到聚偏二氟乙烯印记膜(PVDF)上,5%脱脂奶粉封闭2h,加入兔抗人STAT3-抗或β-actin抗体,室温1.5h。TTBS漂洗后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗,室温2h。TBS充分洗膜4次,DAB显色。晾干、扫描并进行图像分析。

1.2.4 激光共聚焦

实验分组同上,分别作用12、36h。4%多聚甲醛固定细胞10min,1%Triton-PBS打孔并固定5min,PBS洗涤后离心甩片,0.5%小牛血清封闭,,兔抗人STAT3-抗4℃过夜,FITC荧光二抗暗室孵育40min,PI染料复染细胞核,荧光共聚焦显微镜分析。

1.2.5 统计方法

数据均以s表示,所有统计分析均使用SPSS10.0统计软件完成。采用方差分析(ANOVA)和t检验。

2 结果和分析

2.1 ELISA检测TSPG诱导后K562细胞浆和核内STAT3蛋白表达4

对各组K562细胞培养不同时间的吸光度值进行比较见表1(P<0.01)。

2.2 SP免疫细胞化学法检测TSPG诱导后K562细胞浆和核内STAT3蛋白表达

STAT3蛋白位于细胞浆及细胞核。对照组,细胞浆内呈深棕色月芽状分布,细胞核内呈浅棕色(图1A),TSPG作用12h,细胞浆内呈浅棕色,细胞核内呈深棕色(图1B),作用36h与对照组比较无明显差异(图1C)。图象分析仪分析各组细胞平均光密度值见表2(P<0.05)。

注:与对照组相比较,*P<0.01。Compared with control group, *P<0.01.

2.3 Western blotting法检测TSPG诱导后K562细胞浆和核内STAT3蛋白表达

结果显示:TSPG诱导k562细胞浆和核内STAT3蛋白表达和时间相关(P<0.05),其中以12h变化最明显。对照组和TSPG组间比较有显著性差异(P<0.01)。各组吸光度值与β-actin吸光度值的比较见图2A、2B。

注:与对照组相比较,*P<0.05。

Note:Compared with control group, * P<0.05.

Lane 1,2,3,4,5,6: TSPG control,6h,12h,24h,36h,48h respectively.

*the absorbance folds of all groups compared with β-actin.

2.4 激光共聚焦检测TSPG诱导后k562细胞浆和核内STAT3蛋白表达

STAT3蛋白Fitc荧光抗体标记后为绿色,PI染料复染细胞核为红色,对照组STAT3蛋白绿色荧光标记呈月牙状主要分布在细胞浆内,细胞核内较少,见图3A,TSPG作用12h时细胞浆内STAT3蛋白绿色荧光标记减少,核内绿色荧光标记增多,与红色细胞核颜色叠加呈现橙色,见图3B,36h蛋白表达与对照组比较无显著差别,见图3C,所有图片平均荧光值见表3。

注:与对照组相比较,*P<0.05。

Note:Compared with control group, *P<0.05.

3 讨论

K562细胞是具有多向分化潜能的人红白血病细胞株,在药物等诱导因素的作用下可向红系、粒系和巨核系细胞分化,是研究诱导因素对细胞增殖分化的理想模型。本室研究表明:TSPG体外作用能明显抑制K562细胞增殖,并能诱导其向较为成熟的红系、粒系细胞分化[9]。但TSPG促进白血病细胞分化的分子机制目前尚不清楚。现代血液学理论认为:血细胞的增殖分化与成熟的全过程都受到造血调控因子的精密调节,造血调控主要在造血干/祖细胞阶段进行。红细胞起源于红系造血祖细胞(CFU-E、BFU-E),粒细胞和单核巨噬细胞起源于粒单核系祖细胞(CFU-GM),造血祖细胞膜表面存在与相应造血调控因子相结合的受体,当造血调控因子与受体结合,启动调控信号向核内转导,引起核内某些基因转录增强或其它基因转录抑制,表现出蛋白质合成改变,最终导致细胞分化和成熟。我们前期研究结果显示:TSPG作用K562细胞后,其细胞表面表达造血生长因子受体EPO-R和GM-CSF-R的阳性细胞率有所提高,这与TSPG对正常人造血祖细胞生长因子表面受体表达的影响结果一致[10]。近来研究也表明:TSPG能使K562细胞EPO-R位置重塑,即在EPO-R总数不变的情况下,位置发生变化,胞膜中的EPO-R转移到胞质中[11]。但表达EPO-R、GM-CSF-R的阳性细胞增多或者EPO-R位置重塑有何意义?是否启动信号转导系统?受体介导的信号转导途径中哪些具体环节会发生变化?文献尚未见报道。诱导细胞分化的信号和转导途径多种多样,本文应用研究JAKs-STATs途径在正常造血细胞生成中所起作用的思路,选择JAKs-STATs途径中终末环节——信号传导及转录活化因子(STATS)中Stat3来分析TSPG参与白血病细胞分化成熟的可能机制。

本实验结果显示TSPG诱导K562细胞后Stat3由浆内向核内转移,Stat3的活化增多,其中作用12h时变化最为明显。Stat3作为STATS家族的一员,广泛表达于不同类型的组织和细胞中,是胞浆中的潜在转录因子,其蛋白由750～795个氨基酸组成,分子量89～92kD。在细胞因子、生长因子等外界信号分子的刺激下Stat3被激活进入细胞核,在核内与特异性的DNA启动子结合,在基因特定启动子上调控转录,参与细胞的分化、增殖、凋亡等一系列生理功能的调控[12]。

STAT家族作为JAK家族的重要底物,二者构成重要的JAK-STAT信号转导途径。细胞因子、生长因子等通过与细胞表面的受体结合而向靶细胞传递信息,细胞因子受体经常组成性的与JAK家族相联系,细胞因子诱导受体的聚合反应,从而使JAK相互靠近并引起交互的磷酸化而致JAK活化,活化的JAK能磷酸化受体胞浆结构域中的酪氨酸残基,而募集含SH2结构域的信号分子STAT,STAT蛋白通过其SH2结构域与酪氨酸磷酸化受体结合,并通过JAK使其特殊的C端蛋白酪氨酸残基磷酸化,磷酸化的STAT从受体上解离,并借其SH2结构域形成二聚体,随后入核[13]。