青霉素酶含量

青霉素酶含量（精选3篇）

青霉素酶含量 篇1

目前, 检测机构在使用高效液相色谱法测定化合物的含量时, 几乎都是使用随行 ( 或同行) 标准来对其进行定性和定量。所谓定性和定量分析中的随行 ( 或同行) 标准, 以下简称随行标准, 就是在运行样品的同时, 也运行一组已知浓度的标准溶液, 通过比较未知样品色谱峰和标准溶液色谱峰之间的相对保留时间和峰面积的对应关系, 从而达到对未知样品进行定性和定量的目的。随行标准分析方法似乎只是行业内一个约定俗成的惯例, 其依据可能主要是进行定性定量时要求色谱条件与标准样品相同[1~3]。随行标准无疑能够满足这一条件, 且有利于提高定性和定量的准确性及精度, 但是它也有非常明显的缺点, 就是需要耗费比较多的标准物质。因为许多标准物质在溶液状态下极不稳定, 无法配成标准贮备液连续使用并保存较长的时间, 检测结束之后标准溶液必须废弃。而标准物质价格昂贵, 不仅在经济上是一个负担, 对资源而言也是一种浪费, 为此, 提出了非随行标准测定化合物含量的概念, 其假设前提为: 在分析条件一定的条件下, 标准样品和未知样品中待测组分的响应因子相同[4]。分析条件包括: 同一台高效液相色谱仪, 同一根色谱柱, 相同的流动相比例, 相同的柱温, 相同的流速, 相同的检测波长, 相同进样体积, 以及同一检测器且其灵敏度和响应正常等。提出非随行标准检测概念的目的, 在于探讨使用已采集的标准溶液的基础数据对不同时间检测的待测组分进行定性和定量的可行性, 有效降低检测成本。非随行标准检测方法要求仪器必须具有良好的稳定性, 否则标准样品和未知样品的响应因子不相等, 就无法进行准确定量[4], 同时也要求仪器具备极佳的重复性才能够准确定性。随着高效液相色谱仪生产技术水平的提高, 目前绝大多数商用高效液相色谱仪均具有良好的稳定性, 可以满足非随行标准检测技术的要求。高效液相色谱仪由于使用了高压输流泵、全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器, 实现了对样品的高速高效和高灵敏度的分离检测; 使用六通阀进样装置可以保证进样的准确性和良好的重现性; 自动进样器的使用可以连续调节进样量, 进样重复性高[5]。

青霉素含量测定的方法文献报道比较多, 有酸碱滴定法、碘量法、汞量法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等。其中高效液相色谱法能较好地分离供试品中可能存在的降解产物、未除尽的原料及中间体等杂质而准确定量, 具有快速、高效、选择性强、重现性好等特点[6]。选择青霉素作为研究对象, 主要是青霉素的水溶液不稳定[7], 且在检测实践中检品特别是青霉素钾 ( 钠) 数量比较多, 检测较为频繁, 需要耗费的标准品数量巨大, 资源浪费问题突出, 有建立非随行标准检测技术的必要性和紧迫性。用非随行标准检测方法对青霉素这类在溶液状态下不稳定的化合物具有可行性的话, 那么该方法对于其他大多数较为稳定的化合物更应具有可行性, 从而也具有较为广阔的推广应用前景和价值。

1 材料和方法

1. 1 仪器和试药Agilent 1260 infinity高效液相色谱仪 ( 配紫外检测器) , BP211D型电子分析天平 ( 德国塞多利斯公司) , 青霉素对照品 ( 中国兽医药品监察所, 批号: K0251006, 含量92. 2% ) , 试验样品青霉素钾 ( 上海公谊兽药厂, 批号: 140608; 北京赛孚制药股份有限公司, 批号: 150101; 江西省和光药业有限公司, 批号: 20141019) , 甲醇为色谱纯, 水为双蒸水, 其他试剂均为分析纯。

1. 2 方法

1. 2. 1色谱条件[8,9]: 色谱柱: Zorbax SB C18 ( 5 μm 4. 6 × 250 mm, PN : 880975 - 902, SN:USCL047272, LN: B12254 ) , 柱温为30 ℃ , 流动相, 0. 5 mol / L磷酸二氢钾溶液 ( 用磷酸调节p H值到3. 5) 甲醇水= 103060 为流动相A, 0. 5 mol / L磷酸二氢钾溶液 ( 用磷酸调节p H值到3. 5) 甲醇水= 105040 为流动相B, AB = 3070;流速为1. 0 m L/min; 检测波长为225 nm; 进样体积为10 μL。

1. 2. 2 对照品溶液的制备: 精密称取青霉素对照品50 mg, 置50 m L量瓶中, 加水20 m L溶解, 再加入0. 01 mol / L KOH 0. 5 m L使溶液呈极微弱碱性, 最后加水稀释并定容至刻度, 混匀, 即得浓度约为1. 0 mg / m L的青霉素对照品溶液。

1. 2. 3供试品溶液的制备: 精密称取青霉素样品100 mg, 置100 m L量瓶中, 加水50 m L溶解, 再加入0. 01 mol / L KOH 1. 0 m L使溶液呈极微弱碱性, 最后加水稀释并定容至刻度, 混匀, 即得浓度约为1. 0 mg / m L的青霉素供试品溶液。

2 结果

2. 1 色谱图按上述色谱条件, 精密量取青霉素对照品溶液和供试品溶液10 μL, 注入高效液相色谱仪, 记录色谱图。对照品溶液和供试品溶液色谱图见图1。

2. 2 线性范围精密量取1. 0 mg / m L青霉素对照品溶液适量, 分别置于10 m L容量瓶中, 加水稀释至刻度, 得含青霉素浓度分别为20、100、200、500、1 000 μg / m L的对照溶液系列。精密吸取各对照溶液10 μL, 注入液相色谱仪, 记录色谱图。青霉素浓度在20 ~ 1 000 μg /m L范围内, 色谱峰有良好的线性关系, 回归方程为Area = 5. 790 4 × Amt -30. 007, 相关系数等于0. 999 8, 标准曲线数据见表1。

2. 3 方法精密度比较5 批分别于不同日期测量的标准溶液的保留时间及单位浓度峰面积 ( 每批2个平行, 每个平行进样各2 针) , 结果表明非随行标准检测方法具有良好的精密度, 特别是单位浓度峰面积的相对标准偏差不大于1. 5%[10], 满足高效液相色谱检测方法对含量稳定性的要求。结果见表2。

备注: 单位浓度峰面积= ( 峰面积 ÷ ( 取样量 × 标示含量) ) × 定容体积

2. 4 室温下青霉素溶液的水解情况取青霉素对照品100 mg, 置100 m L容量瓶中, 加水溶解后分别于0、10、20、40 h测定含量, 计算单位浓度峰面积, 结果: 10、20、40 h单位浓度峰面积分别下降了2. 16% 、5. 83% 、36. 47% 。说明青霉素水溶液在24 h内相对稳定, 其轻微水解及严重水解的色谱图见图2。

2. 5 微量酸碱对青霉素标准溶液降解情况的影响

分别取青霉素标准品100 mg, 置100 m L容量瓶中, 加一定量 ( 约20 m L) 的水溶解, 再分别加浓度为0. 01 mol/L的HCL或KOH溶液各1. 00 m L, 然后加水定容至刻度。立即上机测定, 结果表明, 加入少量酸碱的青霉素均会有分解。其中, 加酸的青霉素含量下降约3. 10% , 且在相对保留时间约0. 33 处有一个很明显的较大的异物峰; 而加碱的青霉素含量下降约1. 10% , 在相对保留时间约0 . 53 处会出现1 个较小的杂质峰。同时, 加酸的青霉素会随着时间的推移加速分解, 而加碱的青霉素含量在较长时间内则会保持在相对稳定的水平。另取3 份样品, 分别加碱处理后测定其单位浓度峰面积, 约26 h再分别测定其单位浓度峰面积, 结果, 后者的单位浓度峰面积平均降低了1 . 89 % 。结果表明, 青霉素在弱碱性溶液中24 h内有比较好的稳定性。加酸或加碱处理后的青霉素标准溶液色谱图见图3。

2. 6 处理样品时水温对青霉素含量的影响实验表明, 用不同温度的少量水处理样品后, 其含量测定结果也显示出一定的差别。实验时分别加1 m L 15、25、35、45、55 ℃ 的水溶解某一青霉素样品, 然后立即加入室温下的蒸馏水稀释并定容后上机测定。结果发现, 35、45、55 ℃的水溶解的样品其含量有比较明显的偏高, 分别为106. 9% 、113. 1% 、105. 1% , 但45 ℃的水溶解的样品含量高得更多。

2. 7 不同的流动相配制方法对青霉素保留时间的影响第一种方法是先取100 m L p H = 3. 5 的0. 5 mol / L磷酸二氢钾溶液置1 000 m L容量中, 然后加入300 m L甲醇 ( 流动相A ) , 或500 m L甲醇 ( 流动相B ) , 充分混匀后再加水定容至刻度, 简称加水定容法; 第二种方法是先取100 m L p H = 3. 5的0. 5 mol/m L磷酸二氢钾溶液置1 000 m L容量中, 然后加入600 m L水 ( 流动相A ) , 或400 m L水 ( 流动相B ) , 然后再加甲醇, 充分混匀后加甲醇定容至刻度, 简称加醇定容法; 第三种方法是分别用量筒准确量取磷酸二氢钾溶液、甲醇和水, 然后再将三者混匀, 简称混容法。分别按A ∶ B = 30 ∶ 70 的比例注入流动相, 待基线平稳后分别运行青霉素标准溶液, 结果加水定容法青霉素色谱峰的保留时间约为14 min, 加醇定容法为10 min, 混容法则为12 min。原因主要是甲醇与水混合后, 溶液的总体积会缩小, 第一种配制法相当于增加了水相的比例, 所以保留时间增加, 第二法则相当于增加了有机相的比例, 故保留时间减少。

2. 8 青霉素溶液的降解规律实验时, 配制1 份含青霉素为1. 0 mg /m L的标准溶液并上机测定, 每30 min进样1 针, 连续进样30 次。结果发现, 第一针进样的峰面积最大, 以后各针的峰面积基本呈现递减的趋势, 但并非是匀速的递减, 而是先快后慢。基本上是样品溶解后的前3 ~ 5 h内会下降快一些, 以后则相对稳定。结合上述2. 4 的结果, 可以认为室温条件下, 青霉素溶液的分解在24 h之内是一个比较缓慢且呈现出先快后慢并逐渐趋于相对平稳的过程。青霉素标准溶液色谱峰面积随测量时间变化情况见表3。

2. 9 方法的应用取3 批注射用青霉素钾样品, 按上述含量测定方法处理后测定其含量, 结果分别为99. 4%、98. 8% 和100. 2% 。

3 讨论与小结

3. 1 色谱条件的优化。《中华人民共和国兽药典》中流动相A∶ B = 70 ∶ 30, 流速为1. 0 m L/min。以该色谱条件运行样品时, 发现青霉素的出峰时间比较晚, 运行一种样品大约需要40 min, 把A ∶ B的比例调整为30 ∶ 70 后, 出峰时间为12 min左右, 建议使用250 mm的C18柱检测时把流动相调整为A ∶ B =30 ∶ 70 比较恰当。

3. 2 样品及对照品溶液处理方法的优化。《中华人民共和国兽药典》和《中华人民共和国药典》中对青霉素样品及对照品的处理均是直接加水溶解并定容, 但是由于青霉素在水溶液中不稳定, 易分解, 同时容易受到水中少量碳酸 ( 来源于空气中的CO2) 、容器中残留的酸碱 ( 如洗涤剂) 以及青霉素水解造成的含量下降等的影响, 处理样品时可加入少量0. 01 mol/L的KOH溶液, 利于保持样品的稳定性。另外, 容器中残留的少量水分及样品溶解不充分和及时可能导致青霉素溶解过程中产热不均从而造成样品局部温度不一致使含量测定出现偏差, 称样时应注意保持容器干燥, 溶解样品时应迅速及时。检验中, 如果多次出现青霉素干燥品含量超过101. 0% 的情况, 可考虑是由于标准样品和未知样品在处理过程中分别受到了少量碳酸和残留碱性洗涤剂的影响; 如果样品平行不好, 则可能是称样时容器未完全干燥或有残留酸碱物质以及样品溶解不迅速及时所致。

3. 3 非随行标准含量测定法的要点是要保证色谱条件的一致性, 色谱条件任何细微的变动均可能带来较大的偏差, 容易导致定性上产生误判和定量上出现较大偏差。因此, 采用非随行标准法测定含量时, 要确保流动相配制、柱温、流速等保持一致。同时, 应随时监测检测器的灵敏度和响应情况、色谱柱的柱效变化, 并定期重新校正标准曲线。建议把非随行标准检测中, 标准样品双样双平行首末次测量结果单位浓度峰面积的相对标准偏差不大于1. 5%, 作为判断是否需要重新校正标准曲线的依据, 并以此作为判断仪器稳定性是否能够满足测量要求的标准。即只要有一种可信的方法证明仪器的稳定性满足要求, 在此期间建立的所有非随行标准曲线均无需重新校正。需要强调的是更换色谱柱后应重新采集标准曲线数据并制作新的标准曲线, 原因是同一类型的色谱柱, 会由于生产厂家和生产批号不同而表现出不同的色谱分离特性[11], 也即响应因子已经不一样了。

3. 4 因青霉素溶液水解过程缓慢且有一定规律可循, 故在使用《中华人民共和国兽药典》中的方法检测数量较多的青霉素样品时, 为避免因水解产生的测量偏差, 应注意适时重新运行标准样品溶液或插入质控样品, 建议插入质控样品或重新运行标准样品溶液的间隔时间为3、6、6 h, 并保证全部样品在24 h内检测完毕。这里的时间间隔从样品处理结束后立即上机测定时开始计算。当然, 也可以酌情对样品进行分批处理和检测。

3. 5 采用非随行标准方法进行测量时, 由于色谱条件不可能完全一致, 如不同时间配制的流动相其组成可能存在细微的差别, 因而不可避免地会出现保留时间产生一定漂移的情况, 虽然保留时间在一定范围内发生漂移对含量产生的影响可以忽略不计, 但是定性的准确性会受到怀疑。因此, 测量时最好插入已经准确定性的留存样品作为质控样品辅助定性, 或者检测时使用二极管阵列检测器通过紫外光谱图进行定性。其次, 色谱柱多次进样后会受到样品基质污染使柱效下降, 此时应及时对色谱柱进行清洁和再生, 以免影响含量测定的准确性。如果含量测量结果偏低同时又属于边缘数据时, 应使用同行标准方法进行仲裁确认。

3. 6 本研究建立了兽用青霉素钾 ( 钠) 含量的非随行标准高效液相色谱测定法, 实验数据表明, 本方法简单, 精密度高, 重现性好, 能够有效控制兽用青霉素钾 ( 钠) 的质量, 特别适合兽药生产企业进行内部质量控制, 并可通过减少对标准品的使用有效降低检测成本, 具有广阔的推广应用前景和价值。

参考文献

[1]汪正范.色谱定性与定量 (第二版) [M].北京:化学工业出版社, 2007.

[2]陈智栋, 何明阳.化工分析技术[M].北京:化学工业出版社, 2010.160.

[3]符斌, 李华昌.分析化学实验室手册[M].北京:化学工业出版社, 2012.116.

[4]安捷伦科技 (中国) 有限公司.Agilent HPLC化学工作站标准操作培训教材[M].203~206.

[5]于世林.高效液相色谱方法及应用 (第二版) [M].北京:化学工业出版社, 2005.12~28.

[6]王炳强, 张正兢.药物分析与检验技术[M].北京:化学工业出版社, 2005, 206~208.

[7]张嫒, 黄利平, 樊海斌.高效液相色谱法测定青霉素钠的含量[J].中国兽药杂志, 2001, 35 (4) :27~28.

[8]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典 (二部) [S].北京:中国农业出版社, 2010.119~122.

[9]国家药典委员会.中华人民共和国药典 (二部) [S].北京:中国医药科技出版社, 2015.596~600.

[10]中国兽医药品监察所.兽药检验操作规程.2005.88.

[11]于世林.高效液相色谱方法及应用 (第二版) [M].北京:化学工业出版社, 2005.80.

青霉素酶含量 篇2

酶制剂作为一种生物活性物质提高青贮饲料营养价值与品质的研究已引起广泛的关注, 其中又以纤维素酶的应用较多。纤维素酶不仅可降解纤维素、半纤维素, 释放水溶性碳水化合物, 增加乳酸菌发酵所需底物含量, 而且能消耗青贮窖内的氧气, 尽快形成厌氧环境, 减少由呼吸与需氧性微生物作用所造成的水溶性碳水化合物损失[2]。因此, 在粗饲料青贮中添加纤维素酶制剂能有效地提高其营养价值, 这已成为当前动物营养学研究中的一个热点。试验通过将不同比例纤维素酶添加于王草中, 研究其对青贮发酵品质及营养成分含量的影响, 以确定王草青贮时纤维素酶的最佳添加比例。

1 材料

试验材料为株高2.0～2.4 m的热研4号王草。试验地位于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所十队实验基地, 北纬19°30′, 东经109°30′, 海拔149 m, 属热带季风气候, 气候特点是夏秋季节高温多雨, 冬春季节低温干旱, 干湿季节明显;土壤为花岗岩发育而成的砖红壤土, 土壤质地较差, 无灌溉条件。添加剂:纤维素酶 (酶活力≥150 000 U/g) , 国药集团化学试剂有限公司生产。

2 方法

2.1 试验设计

试验设6组:直接青贮 (对照CK) 及在原料中分别添加纤维素酶0.05 g/kg (E1) 组、 0.1 g/kg (E2) 组、 0.15 g/kg (E3) 组、 0.2 g/kg (E4) 组、 0.25 g/kg (E5) 组, 每组设3个重复。

2.2 王草青贮调制

王草收割后, 用全自动切短机切至20 mm左右, 晾晒4 h后 (至干物质含量为23%左右) 分别添加不同比例纤维素酶, 装入500 mL广口瓶中, 压实, 密封, 常温 (约25 ℃) 下贮藏30 d。

2.3 王草青贮饲料的取样与测定

青贮饲料调制前和开封后分别取样, 65 ℃ 48 h烘干, 粉碎后密封保存, 待测。对制成的样品参照杨胜[3]的方法分析干物质 (DM) 、中性洗涤纤维 (NDF) 、酸性洗涤纤维 (ADF) ;用蒽酮-硫酸比色法测定水溶性碳水化合物 (WSC) 含量。

2.4 王草青贮饲料品质的实验室评定

取青贮饲料样品20 g, 加入80 mL纯化水, 4 ℃浸泡24 h, 经双层滤纸过滤后静置半小时, 用雷磁pHS-3C精密pH计测定pH值。用高效液相色谱仪 (岛津LC-20A) 测定乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。分析条件:色谱柱, RSpak KC-811 (昭和电气) ;岛津流动相, 3 mmol/L高氯酸溶液;流速, 1 mL/min;柱温, 40 ℃;检测波长, 210 nm。

2.5 青贮饲料Flieg氏评分

Fileg氏评分法是以青贮饲料中的3种主要有机酸——乳酸、醋酸、丁酸的比例为基础进行评分的, Fileg氏评分法适用于常规青贮的鉴定。青贮饲料品质根据这一评分标准分为5个等级:81～100分为优;61～80分为良;41～60分为可;21～40分为中;0～20分为劣。

2.6 数据分析

采用SAS软件包和Excel软件进行数据处理和统计分析, 采用邓肯法对处理间的平均数进行多重比较。

3 结果

3.1 王草化学成分

试验测得王草DM含量为16.24%, NDF含量为66.83%, ADF含量为43.36%, WSC含量为4.59%。

3.2 王草青贮饲料发酵品质 (见表1)

注:同列数据肩标字母完全不同表示差异显著 (P<0.05) , 含有相同字母表示差异不显著 (P>0.05) 。

由表1可知:与CK组相比, 添加纤维素酶能显著降低王草青贮饲料的pH值, 其中E4组pH值最低, 显著低于其他组 (P<0.05) ;E4组乳酸含量显著高于其他各组 (P<0.05) , CK、E1组显著低于其他各组 (P<0.05) , 但二者间无显著差异 (P>0.05) , 表明添加0.1 g/kg以上含量的纤维素酶能有效增加王草青贮饲料乳酸含量;E4组乙酸含量最高, 显著高于其他各组 (P<0.05) , E1组乙酸含量最低;丙酸含量CK、E1组显著高于其他组 (P<0.05) , E5组含量最低;王草青贮饲料丁酸含量都较低, CK组含量最高, 各组间无显著差异 (P>0.05) ;总酸含量E4组显著高于其他处理 (P<0.05) , E1组最低。

3.3 王草青贮饲料Flieg氏评分 (见表2)

由表2可知:包括CK组在内的各组青贮评分均为优 (80分以上) , 表明王草控制水分含量后可以直接青贮;添加纤维素酶各组评分均高于对照组, 表明添加纤维素酶能提高王草青贮品质。

3.4 王草青贮饲料营养成分 (见表3)

注:同列数据肩标字母完全不同表示差异显著 (P<0.05) , 含有相同字母表示差异不显著 (P>0.05) 。

由表3可知:添加纤维素酶显著提高了王草青贮饲料DM含量, 其中E5组最高, CK组最低;与CK组相比, 添加纤维素酶各组ADF含量显著降低 (P<0.05) , E4组最低, 与其他组差异显著 (P<0.05) ;添加纤维素酶降低了NDF含量, 但各组间差异显著 (P>0.05) ;E4组WSC含量最高, CK组WSC含量显著低于其他组 (P<0.05) 。

4 讨论

常规青贮时, 原料中的水分含量应在65%～75%之间, WSC含量应不低于鲜重的3%[4]。试验中王草WSC含量为4.59%, 但由于其DM只有16.24%, 经过晾晒后DM含量上升到23%, 但WSC含量仍未达到3%, 因此调制优质青贮饲料需添加青贮添加剂。

添加纤维素酶各组王草青贮饲料的pH值均在4.0左右, 并且乳酸占总酸的比例均在70%以上, 丁酸含量非常低, 说明在整个发酵过程中以乳酸发酵为主。Flieg氏评分结果表明, 添加纤维素酶能有效改善王草青贮品质。CK组的Flieg氏评分也属于优等 (86.5分) , 但pH值偏高 (4.64) , 不能有效抑制酵母菌、梭菌等有害菌的生长, 不利于青贮饲料的保存, 进而会影响青贮饲料的品质。对于纤维素酶, 许多研究者都认为其与对照组相比能够降低青贮pH值, 增加乳酸含量[5,6], Zhu Y等[7]报道, 细胞降解酶控制意大利黑麦草 (Lolium multiflorum La.) 与三叶草 (Trifolium repens L.) 青贮的pH值, 增加乳酸含量。

与CK组相比, 添加纤维素酶处理后王草青贮饲料DM含量显著提高 (P<0.05) ;ADF含量显著降低 (P<0.05) , NDF含量也有所降低, 但未达到显著水平 (P>0.05) ;WSC含量显著提高 (P<0.05) 。纤维素酶能将青贮原料的结构性碳水化合物降解为单糖或双糖, 为乳酸发酵提供更多可利用的底物。糖类的增加在青贮早期可加速乳酸菌的繁殖, 使青贮饲料pH值快速降低, 可以减少青贮早期植物呼吸作用对糖的氧化和蛋白质的水解[8]。王安等[9]研究表明, 纤维素酶处理组WSC含量高于对照组, 发酵品质较好。Colombatto D等[10]发现, 添加纤维性酶制剂能在显著降低玉米青贮料pH值的同时, 降低ADF、NDF含量, 提高玉米青贮料的营养价值。赵国琦等[11]研究表明, 纤维素酶能显著提高大黍青贮料细胞内容物含量与乳酸含量, 降低NDF与ADF含量。

5 结论

在王草中添加纤维素酶可以显著提高其青贮发酵品质, 降低ADF、NDF含量, 提高WSC含量。从改善王草青贮发酵品质和营养价值综合考虑, 且以王草青贮中添加0.2 g/kg的纤维素酶效果最好。

摘要：为评价添加不同比例纤维素酶对王草青贮发酵品质及碳水化合物含量的影响, 试验设5个纤维素酶组 (添加比例分别为0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 g/kg) 和1个对照 (CK) 组, 评价王草青贮饲料营养成分和青贮品质。结果表明:与对照组相比, 添加纤维素酶能显著降低青贮饲料pH值 (P<0.05) , 提高乳酸含量, 降低丙酸、丁酸含量, 降低中性洗涤纤维 (NDF) 、酸性洗涤纤维 (ADF) 含量, 提高可溶性碳水化合物 (WSC) 含量。说明添加纤维素酶能改善王草青贮品质, 且以添加0.2%水平效果最好。

关键词：王草,纤维素酶,发酵品质,营养成分

参考文献

[1]陈勇, 罗富成, 毛华明, 等.施肥水平和不同株高刈割对王草产量和品质的影响[J].草业科学, 2009, 26 (2) :72-75

[2]DEAND B, ADESOGENAT, KRUEGER N, et al.Effect of fibro-lytic enzymes on the fermentation characteristics, aerobic stability, and digestibility of bermudagrass silage[J].J Dairy Sci, 2005, 88:994-1003.

[3]杨胜.饲料分析及饲料质量检测技术[M].北京:北京农业大学出版社, 1999.

[4]ZHANG J G.Roles of biological additives in silage production andutilization[J].Research Advance in Food Science, 2002 (3) :37-46.

[5]李静, 高兰阳, 沈益新.乳酸菌和纤维素酶对稻草青贮品质的影响[J].南京农业大学学报, 2008, 31 (4) :86-90.

[6]SELMER-OLSEN.Enzymes as silage additives for grass-clovemixtures[J].Grass and Forage Science, 1994, 49 (3) :305-315.

[7]ZHU Y, NISHINO N, KISHIDA Y, et al.Ensiling characteristicand ruminal degradation of Italian ryegrass and Luceme silages trea-ted with cell wall-degrading enzymes[J].Journal of the Scienceof Food and Agriculture, 1999, 79:1987-1992.

[8]胡爽, 王炜, 山其木格, 等.纤维素酶在青贮饲料中的作用及其基因克隆的研究进展[J].新疆农业科学, 2008, 45 (2) :242-247.

[9]王安, 张淑芳, 钟一民, 等.纤维素复合酶作为青贮饲料添加剂的研究[J].东北农业大学学报, 1997, 28 (4) :358-365.

[10]COLOMBATTO D, MOULD F L, BHATM K, et al.In vitro eva-luation of fbrolytic enzymes as additives formaize (Zea maysL.) silage.ⅠandⅡ.Effects of ensiling temperature, enzyme source andaddition level[J].Animal Feed Science and Technology, 2004, 111:111-143.

青霉素酶含量 篇3

青霉素酶是β-内酰胺酶的一种,由于其具有水解青霉素类抗生素的β-内酰胺环的特点在前药研制[1,2]、生物传感器[3]、ELISA检测[4]等方面得到了广泛应用。本研究组在前期工作中构建了一株产青霉素酶的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DB104(pWB-pemp)[5]。本文基于前期研究,以重组菌Bacillus subtilis DB104(pWB-pemp)作为出发菌株,以种子培养基为基础,对发酵培养基成分和发酵条件进行优化,以提高重组菌株产青霉素酶的能力,为此酶建立稳定的发酵工艺奠定了一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DB104/pWB-pemp为天津科技大学工业微生物菌种保藏中心所保藏。

1.1.2 试剂

卡那霉素(kanamycin)购自上海生物工程有限公司;磷酸氢二钾购自天津市北方天医化学试剂厂;磷酸二氢钾购自天津市化学试剂一厂。

1.1.3 培养基

种子培养基:LB培养基。

发酵培养基:在LB培养基中添加一定量的不同碳源、氮源、金属离子及不同浓度的磷酸盐。

1.2 方法

1.2.1 发酵培养

将保存的重组菌种Bacillus subtilis DB104/pWB-pemp接种到含有卡那霉素(30 μg/mL)种子培养基中,于37℃、pH 7.0、180 r/min振荡培养,以对数期中后期菌液作为种子液。以2%的接种量转接种于50mL/500mL的发酵培养基中,发酵培养。

1.2.2 青霉素酶活力测定

酶活力定义:在37℃、pH7.0条件下,每分钟水解 1μmol青霉素G所需要的酶量,用 U表示。测定方法参考文献[6]。

1.2.3 正交试验

由单因素试验拟定A碳源、B氮源、C金属离子、D磷酸盐四个因素各取3个水平,以L9(34) 型正交试验表进行试验,以青霉素酶活力为指标,确定重组菌的培养基最佳配比。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对产酶的影响

分别用5种碳源进行单因素碳源对产酶影响的试验。结果如图1所示,蔗糖是产青霉素酶的最佳碳源,发酵36h酶活力达到1 003.4U/mL。

分别取1%、2%、3%、4%、5%的蔗糖进行试验,比较产青霉素酶活力。结果如图2所示,当蔗糖含量为2%时,产酶活力最佳,达到1 123.7U/mL。

2.2 不同氮源对产酶的影响

试验中研究了8种氮源,包括有机氮源和无机氮源。结果(如图3)表明,当氮源为酵母膏作为氮源时,重组菌所产的青霉素酶活最高,可达到1 218.1U/mL。这可能是因为酵母膏除了为菌体的生长提供所需氮源和生长因子,还提供了大量的Bacillus subtilis DB104所需的组氨酸(该宿主菌为组氨酸缺陷)。

取5个浓度的酵母膏进行试验比较产酶活力,选取最优氮源浓度,结果如图4所示,当酵母膏含量为3%时,产酶活力最佳,达到1 408U/mL。

2.3 不同金属离子对产酶的影响

选择6种金属离子,比较不同金属离子对菌体产酶的影响。结果显示K+、Zn2+、Ca2+、Fe2+对菌体产酶表现出抑制作用,Na+对产酶没有明显促进或抑制,Mg2+促进产酶。进一步研究不同浓度镁离子对产酶的影响,结果(图5)表明,当添加0.2mmol/L镁离子时产酶最佳,可达1 578.2U/mL。因此,选择0.2mmol/L镁离子作为产酶所需金属离子浓度。

2.4 磷酸盐对产酶的影响

发酵结果如图6,磷酸盐浓度为0.4%时,产酶最佳达到1 730.8U/mL。

2.5 培养基正交实验

以青霉素酶活力为指标,确定重组菌的最佳培养基成分配比,正交试验结果与分析见表1和图7。

由效应曲线(图7)可以得知,培养基中四种成分最佳因素水平组合为A2B3C1D2,即2%蔗糖、3.5%酵母膏、0.1mmol/L镁离子、0.4%磷酸氢二钠。

对正交试验中所得最佳配合进行实验验证。结果发现,在最优培养基组合条件下,所产青霉素酶活力可达1 949.5U/mL,该数值高于正交实验中出现的结果,说明所选培养基配比为最优组合。

2.6 pH值对产酶的影响

选择5.5～8.5之间的7个初始pH值对产酶结果进行研究。结果如图8所示。从图中可知,培养基初始pH值为7.0时酶活最高。初始pH值过高或过低,酶活性均会下降。

2.7 接种量对产酶的影响

由图9可知,对于重组菌来说接种量太低,菌体生长缓慢,由于菌体数量太低,减少了蛋白的分泌总量;接种量太大,也会造成菌体早衰,导致发酵后劲不足。当接种量为3%时,其产酶活力最高达到2 042.7U/mL。因此,确定最佳接种量为3%。

2.8 摇瓶装液量对发酵产酶的影响

由图10可知,随着装液量的增加(由50mL增加到100mL),菌体产酶水平呈现先增加后减少的趋势。 500mL三

2.8 温度对发酵产酶的影响

角瓶装液量是70mL时,即装液量为14%,产酶活力最高可达2 227U/mL。装液量太少,则水分在长期的发酵过程中会蒸发较多,造成底物浓度过大,从而影响产酶;而装液量过多则造成溶氧不足,产酶也不高。

图11结果显示,随着温度的升高,酶促反应也相应加快;达到一定温度后温度升高,酶失活越快,菌体易于衰老,影响产物生成。由图可知,28℃～32℃范围内不利于产酶,37℃发酵液中酶活力达到最大,为2 227.8U/mL。

3 讨论

国内报道的产生青霉素酶的蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63301[7],存在产酶量低、培养基价格较高等问题。Susan J Thornwell等人[8]将青霉素酶基因进行了异源表达,每毫升发酵液可获得900～1 500U/mL。国内还未见有青霉素酶异源表达报道。此次,发酵优化后酶活力达2 227.8U/mL,为先前本实验室摇瓶发酵结果(1 580U/mL)的1.41倍。本研究中产青霉素酶活力高于国内外现有水平,而且生产成本较低,为今后建立工程菌稳定的发酵工艺和规模化生产奠定了基础。

参考文献

[1]Xiaoping Tang,Tingwei Cai,Peng George Wang.Synthesis of beta-lac-tamase activated nitric oxide donors[J].Bioorganic&Medicinal Chem-istry Letters,2003,13(10):1687-1690.

[2]王芳,仪宏,王丽丽.羟胺法测定青霉素酶酶活的研究[J].中国抗生素杂志,2010,35(4):316-319.

[3]Sarkar.A novel amperometric biosensor for detection of penicillin inmilk[J].Journal of the Indian Chemical Society,1999,76(10):495-497.

[4]严兵,彭开松,薛秀恒,等.青霉素酶特异性抗血清间接ELISA方法的建立[J].动物医学进展,2010,31(9):47-50.

[5]赵洪坤,刘兴旺,邱强,等.青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达[J].中国生物工程杂志,2007,27(12):31-35.

[6]Amram Samuni.A direct spectrophotometric assay and determination ofMichaelis constants for the beta-lactamase reaction[J].Analytical Bio-chemistry,1975,63(1):17-26.

[7]林毅,陈风义,刘琳,等.蜡状芽孢杆菌产青霉素酶的研究进展[J].河北工业科技,2008,25(2):125-128.