抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用

抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用（精选3篇）

抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用 篇1

抑制性消减杂交技术在对虾基因克隆中的应用

抑制性消减杂交技术是一项筛选、分离未知差异表达基因的试验方法,该技术具有快速、简便、灵敏、特异、高效,所需起始样本量较少等优点.利用该技术构建对虾组织消减cDNA文库,鉴定差异表达相关基因及其表达特性.通过对对虾差异性表达的`免疫相关基因、抗病基因及其他性状基因的了解,旨在为进一步研究对虾抗病机理奠定基础,为利用抗病基因进行抗病育种提供一个有效途径,为提高对虾的经济效益提供前景.

作 者：赵永贞 蒋伟明 陈秀荔 李咏梅 张彦明 黎铭 陈晓汉 ZHAO Yong-zhen JIANG Wei-ming CHEN Xiu-li LI Yong-mei ZHANG Yan-ming LI Ming CHEN Xiao-han 作者单位：赵永贞,蒋伟明,陈秀荔,李咏梅,黎铭,陈晓汉,ZHAO Yong-zhen,JIANG Wei-ming,CHEN Xiu-li,LI Yong-mei,LI Ming,CHEN Xiao-han(广西水产研究所广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁,530021)

张彦明,ZHANG Yan-ming(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵,712100)

刊 名：动物医学进展 PKU英文刊名：PROGRESS IN VETERINARY MEDICINE年，卷(期)：29(4)分类号：Q78 S945.46关键词：抑制性消减杂交 对虾 差异表达基因 cDNA文库

抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用 篇2

1 SSH技术的特点

SSH是20世纪90年代末出现的一种新的筛选差异表达基因技术, 它以m RNA为模板, 分为检测方和驱动方, 经反转录酶催化, 在体外反转录成c DNA, 酶切后加上接头, 基于DNA复性二级动力学进行杂交, 经过两次PCR得到差异片段后, 与适当的载体 (常用质粒或噬菌体载体) 连接后转化受体菌, 使每个细菌内含有一段c DNA, 并能繁殖扩增, 这样包含着细胞全部m RNA信息的c DNA克隆集合就被构建成该组织细胞的消减c DNA文库。该技术应用两次差减杂交和两次抑制性PCR, 对差减杂交后丰度有较大差别的片段含量相对趋于一致, 即使某些低丰度表达的差异基因也可以被克隆出, 从而达到富集差异表达基因的目的。该方法具有假阳性低、特异性高、灵敏度高、效率高、操作简单等优点, 与其他差异基因分离方法相比表现了独特的优越性[2,3]。当然, SSH也有不足之处:对材料要求较高, 不能同时进行数个材料间或不同处理样本间的比较;对于材料间存在过多差异, 当存在小片段缺失时就不能被有效检测, 一些低丰度变化的转录因子、细胞因子等亦不能被检测;SSH主要依赖于PCR技术, 如进行预扩增则可能导致一些序列的丢失[4,5]。

2 构建消减c DNA文库在细菌VBNC状态研究中的应用

2.1研究背景

年, 徐怀恕等用常规方法在适宜条件下培养海水中霍乱弧菌和大肠埃希菌时, 发现这些菌尽管是活的, 可是已完全丧失了在培养基上产生菌落的能力, 这种细菌的特殊存在形式由此成为学者研究的对象。1985年, Colwell[7]首次提出了“微生物活的非可培养状态” (Viable but non-culturable state, VBNC) 概念, 并于2000年汇编了处于微生物VBNC状态的研究综述及专著[8]。

细菌VBNC状态是指细菌在处于不良的环境条件下, 细菌形态发生变化, 表现为细胞缩成球形或体积增大, 细胞伸长, 且在常规培养条件下不能生长繁殖, 但仍然具有代谢活性的一种生命活动状态。它是大部分细菌在其生活史中具有的一种特殊存在形式, 在一定的条件下可复苏并具有一定致病性。随着生物技术的发展与进步, 通过近30年的研究发现, 具有VBNC状态的细菌种类越来越多, 不仅仅局限于当初发现的16个种属的30多种细菌, 现已扩大到20个种属的60多种细菌。这些有关细菌VBNC的报道主要集中于流行病学、预防医学、植物病理学及病原菌分子遗传学等领域, 其中不仅包括病原菌的VBNC状态, 研究发现, 益生菌也同样存在这种状态;同样, 在土壤、空气、水、动植物体内均存在能进入VBNC状态的细菌。从上述细菌种类及数量上不难看出, 进入VBNC状态的细菌在自然界中是普遍存在的, 并且很多研究者认为非芽孢形成菌在面对不良环境时进入VBNC状态是它们选择的最适生存策略[9,10,11]。

通过查找大量相关资料, 通过基因组比较分析对细菌进入VBNC状态在其致病性、毒力及耐药性等方面的研究显示, 进入VBNC状态的细菌其毒力不会很快消失, 依然保存部分或全部毒力, 一旦复苏便具有一定的感染性和致病性。但也并非所有的VBNC病原菌都具有毒性, 细菌进入VBNC状态时间越久, 其完整性越易遭到破坏, 感染性和致病性也随即下降, 甚至丧失。但是其耐药性在整个VBNC状态过程中几乎不受影响。由于细菌的这种特殊存在形式在不良环境中丧失了在培养基上生长的能力, 但却保留了原菌 (尤其是病原菌) 的抗原成分及其毒力因子, 使其具有与原菌相似的致病性, 耐药性也增加, 这就大大增加了检测难度, 极容易漏检。近年来, 由于人们已逐渐认识、承认和接纳了这一状态, 因此, 现在大多数学者已将研究细菌VBNC状态成为在公共卫生安全、食品检测、水质安全监察方面的研究热点。

从基因组研究着手, 进行VBNC状态菌株特有的核酸片段的分析, 探索VBNC菌与标准菌表型差异的分子基础, 为菌株遗传分化关系分析、建立分子鉴别新体系及分子流行病学研究提供了新思路。

2.2 SSH在原核生物相关差异基因克隆上的应用

1996年, Diatchenko等[12]首次报道了SSH方法, 指出这种方法是一种高效寻找差异表达基因的新方法。1998年Akopyants等[13,14]根据原核生物核酸的结构特点对SSH技术进行改良, 用于细菌基因组比较分析研究, 证明SSH方法是鉴定细菌间遗传差异的简单有效方法, 可以对密切相关的菌株进行基因组全面差异比较。对于遗传关系较近的两株菌, 某一株菌所具有的而在另一株菌中所缺少的基因可能具有重要的分子生物学意义, 这些基因可能与细菌的药物抗性、毒力因子、修饰限制系统等方面相关, SSH技术已在真核生物中筛选差异表达基因得到广泛的应用, 技术相对成熟, 由于原核生物没有真核生物m RNA成熟的复杂过程, 所以可以直接从基因组水平筛选差异基因。

2.2.1 SSH在细菌相关毒力基因及耐药基因筛选上的应用

SSH技术最初由Akopyants等用于研究幽门螺杆菌致病株的致病基因, 后来相继应用于不同种类细菌的致病株毒力、致病性和耐药性相关基因的挖掘上。

细菌的致病性不是由单一致病因子决定, 而是多种毒力基因表达参与的过程。这些毒力基因在不同致病性的同一细菌菌株中表达丰度明显不同, 毒力基因的寻找与鉴定是细菌致病机制研究的重点[15]。

李淼等[16,17]采用SSH这一技术筛选副猪嗜血杆菌 (HPS) 有毒力菌株SW124 (血清4型) 和无毒力菌株H465 (血清11型) 之间的差异基因, 经同源性分析比较, 在HPSSW124菌株中共获得7个差异基因片段, 其中5个片段分别编码不同功能蛋白, 其余2个差异基因片段与功能未知蛋白或假定蛋白编码基因有关, 这些差异基因在HPS不同血清型的有毒力菌株中分布比较广泛。参考一些国外研究文献发现, Sack等[18]通过SSH方法, 以HPS血清型5型标准菌株作为研究对象, 成功筛选获得5个差异基因, 其中包括假定的溶血素操纵子、假定的铁转运子以及2个假定的噬菌体相关基因等;Zhou等[19]选择相同毒力菌株为研究对象, 鉴定获得了完全不同的15种差异基因。而李淼采用的是血清型4型标准菌株为研究对象, 获得了与上述两项研究结果不相同的差异基因, 由此揭示, HPS不同毒力菌株之间存在着大量的差异表达基因。

细菌的耐药性分为天然耐药和获得性耐药, 无论是何种方式导致的细菌多重耐药都是多基因、多蛋白质参与的复杂过程, 而以往的研究多局限于某一机制中个别基因及蛋白质, 不但难以解释细菌多重耐药的全部现象, 更不能全面揭示细菌多重耐药的分子机制。在获得耐药菌株与标准株或敏感株的基础上, 使用SSH技术可以建立完整的基因文库, 减少传统技术大批量筛选、克隆耐药相关基因的盲目性, 极大地提高了特异性。

张运玲等[20]以结核杆菌耐多药菌株c DNA为检测组 (Tester) , 敏感株c DNA为驱动组 (Driver) , 应用SSH进行了基因组差异研究, 共获得113个差异表达c DNA片段, 这些差异基因可能参与耐多药形成的相关基因结论。研究表明, SSH技术是筛选新功能基因的有效方法;多种已知或未知基因均参与结核杆菌耐多药的调节, 大规模筛选与克隆这些基因为进一步研究结核杆菌耐多药机制的产生奠定了必要的理论基础。

宋春花等应用研究志贺菌诱导耐多药株与其敏感株间的差异基因, 筛选耐多药的相关基因, 探讨基因表达差异与志贺菌诱导耐多药的相关性。试验成功构建了志贺菌诱导耐多药株特异性c DNA消减杂交文库, 并选取部分阳性克隆进行杂交筛选, 对获得的12个诱导耐多药差异片段中的6个基因片段经克隆测序, 并与GenBank数据库进行初步比对, 发现其中3个未知基因可能为新基因, 另3个已知基因分别为16Sr RNA核糖体基因、位点特异性Ⅰ型脱氧核糖核酸酶 (Hsds) 、预测的rep蛋白质 (解螺旋酶) 等相关基因。试验方法有效地证明, SSH方法建立c DNA消减文库, 对于多基因参与的志贺菌耐多药复杂过程, 筛选的新基因片段并为进一步克隆其全长基因进而研究其功能打下基础是成功的。

2.2.2 SSH在细菌种属进化关系的分析中的应用

李求春等[22,23]应用SSH分别对鸡白痢沙门氏菌C79-13与肠炎沙门氏菌50041、鸡白痢沙门氏菌C79-13与鸡伤寒沙门氏菌Sg9进行基因组片段的差异分析, 构建有关鸡白痢沙门氏菌的两组差减文库。经对阳性克隆的筛选, 并对部分片段进行测序和同源性分析。试验结果表明, 在鸡白痢沙门氏菌C79-13与肠炎沙门氏菌50041的差减文库中, 经分析的序列主要分为3类, 即质粒转移相关序列、Ⅲ型分泌系统相关序列和未知功能序列, 其中2个差减片段与编码福氏志贺菌侵入质粒抗原Ipa J蛋白基因的同源性达50%;在鸡白痢沙门氏菌C79-13与鸡伤寒沙门氏菌Sg9构建的差减文库中, 筛选出的240个阳性克隆制备的质粒, 其PCR扩增片段大小在100~2 000 bp。试验证明所构建的差减文库可为鸡白痢沙门氏菌特异性致病基因和其致病机理的研究提供重要的依据, 也对进一步筛选、克隆鸡白痢沙门氏菌特有的核酸片段, 探索鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌表型差异的分子基础, 为菌株遗传分化关系分析、建立分子鉴别新体系及分子流行病学研究提供了重要基础。

Park等[24]针对快速鉴定DNA序列具有高度同源性的肺炎链球菌与其他草绿色链球菌设计试验, 将肺炎链球菌KCTC 5 080株与缓症链球菌KCTC 3 556株应用SSH技术获得34个肺炎链球菌特异性克隆。从中选取包含cps A基因 (编码假膜多糖生物合成) 在内的DNA序列, 克隆设计出肺炎链球菌特异性引物, 建立检验肺炎链球菌的PCR方法, 并用49株草绿色链球菌 (含26株肺炎链球菌) 、54株其他链球菌、14株乳球菌、14株肠球菌、3株漫游球菌对该引物的特异性进行评估对比, 并与已有的引物进行比较分析。结果表明, 基于cps A基因设计的引物对肺炎链球菌具有高度特异性, 其效果好于现有的引物。这一发现对于肺炎链球菌与其他草绿色链球菌的快速鉴定与区分提供了极好的参考价值。

因此, 学者们为研究细菌基因组差异, 构建c DNA消减文库是相对有效的方法之一。近些年, 由于有学者已注意到SSH技术在细菌鉴定[25]、检测探针构建[26]、可能与毒力有关的致病毒力岛鉴定[27]及插入序列发现[28]等方面应用中存在优越性, 构建高质量SSH文库是研究细菌相关差异基因的关键一步。通过比较基因组之间的差异, 不难发现, 这种方法已在探索细菌的致病分子机理、筛选及鉴定毒力基因成为研究热点[29,30]。

3 SSH在研究细菌VBNC发生机制中应用前景

在没有预先要求的基因序列的信息研究中, 通过建立细菌VBNC状态消减c DNA文库并从中筛选出所需要的目的基因可直接用于该目的基因的表达, SSH可以在转录水平研究细菌在不同生理时期、温度、环境变化等条件下的基因表达差异, 更接近于真实的差异, 因其具有灵敏度高、重复性好的特点, 已被广泛用于寻找差异基因的研究。细菌VBNC状态这种特殊细菌存在形式都是由于基因的选择性表达所致, 用SSH方法通过对特异性差异表达基因进行分离、克隆及序列分析, 一旦差异基因被鉴定为其代表性的检测序列, 即可通过对大量样本进行扩增和相应生物信息学分析, 继而研究其合成的氨基酸组成、蛋白质的结构和功能等, 有助于进一步阐释这些生命现象发生、发展的分子机制, 为细菌VBNC状态提供相关依据, 并且, 对于病原微生物的功能与结构的研究尤其是毒力相关的关键性位点或功能域的定位, 一直是病原学的研究热点, 在研究某些致病菌在进入VBNC状态后与正常菌株之间的毒力差异, 寻找新的毒力基因过程中, 运用SSH的意义显得尤为突出。

抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用 篇3

关键词：抑制消减杂交；差异表达基因；瓜菜；抗病；逆境胁迫

随着分子生物学的迅速发展以及部分生物的基因组全序列测序的陆续完成．生命科学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能及表达调控的功能基因组研究。因此．大量基因克隆的新技术也不断涌现．其中以1992年Liang等提出的mRNA差异显示技术(mRNA differential display re—verse transcription PCR．DDRT-PCR)，1994年Hubank等提出的代表性差别分析(representational diffefence analysis．RDA)技术．1996年Diatehenko等提出的抑制消减杂交(suppression subtractive hybriion，SSH)技术及1998年Kang等提出的交互差减RNA差别显示技术(reciprocalsubtraction differential RNA display，RSDD)为代表。

抑制消减杂交(SSH)技术是一种能高效快速克隆差异表达基因的新技术．该技术是Diatehenko等在抑制PCR(sup-pression polymerase chain reaction)的基础上建立起来的筛选差异表达基因的方法．通过该技术人们可以比较同一细胞或组织在不同的生长发育阶段或不同的生理条件下基因表达的差异，并富集、分离、克隆出这些差异表达基因进行功能研究。ssH起初多应用在动物(包括人类)等生物医学领域，而在植物研究领域尤其是瓜菜作物研究中只得到初步应用。在瓜菜作物上应用该技术．通过分离克隆相关差异表达基因可以为分析其生长发育和抗病、抗逆性规律，阐明作用机理提供重要的信息基础。本文在介绍SSH技术原理及特点的同时．着重总结其在瓜类和蔬菜作物研究上的应用进展情况。

1抑制消减杂交技术

1．1基本原理

抑制消减杂交(SSH)主要基于抑制性PCR与eDNA消减杂交(subwaefive hybridization)技术。所谓抑制性PCR就是通过利用含引物序列的双链接头(adaptor)，使非目的片段两端接上同一接头．该接头具有反向末端重复序列，在退火时链内退火优于链间退火．使非目的序列片段产生类似“锅柄”的互补结构．在PCR时无法与引物配对．从而选择性抑制非目的序列的扩增。SSH的消减富集则运用了杂交二级动力学原理．即高丰度单链在退火时杂交形成双链的速度快于低丰度单链．从而使原来在丰度上有差别的单链相对含量达到基本一致．即低丰度差异表达的基因不会丢失．而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。

SSH基本过程：(1)提取2种差异细胞或组织的mRNA，其中包含差异表达基因的为检测组(Tester)，另1组为驱动组(Driver)，分别反转录合成eDNA，并用限制性内切酶Rsa I酶切为平头末端dscDNA片段。(2)将酶切后的Tester eDNA分为2份，1份与接头l(adaptorl)连接．另1份与接头2R(adaptor2R)连接．接头3’端与eDNA片段5’端连接。接头外侧序列(图l中接头黑色部分)与第1次PCR引物(PCR primerl)相同，而接头内侧序列分别与第2次PCR2个引物(nested primerl和nestedprimer2R)相同。(3)分别向连接不同接头的TestercDNA中加入过量Driver eDNA．进行第l轮杂交．得到4种产物：a为差异表达的单链tester eDNA~b为自身退火的TestereDNA；e为异源退火Tester／Driver eDNA(共有序列形成异源杂交产物)：d为自身退火的Driver cDNA。第2轮杂交时．将第1次2份杂交产物在新鲜变性DrivereDNA存在的条件下混合杂交，进一步去除共有序列．杂交完毕产物中形成一种特殊类型的e型分子．它是检测组中含有的而驱动组中没有的eDNA片段．由第1轮杂交中形成的连接有不同接头a片段退火形成。(4)2次选择性PCR扩增：第2轮杂交后补平接头．第1次PCR扩增时引物为PCRprimer 1．a、d型分子无引物结合位点不能扩增：c型分子为单接头，只能线性扩增Ib型分子两端接头相同。由于接头上有退火温度很高的反向重复序列．形成“锅柄”结构．受抑制PCR效应。故不能被扩增。只有目标片段形成的e型分子两端连有不同接头。以指数级大量扩增。第2次PCR扩增时。换用接头内侧引物(nested primerl和nested primer 2R)进一步选择性扩增目标片段。经过2轮消减杂交和2轮选择性PCR．目标片段已被大大富集．其产物可以直接用于克隆构建消减文库。

1．2特点

SSH技术操作流程比较简单、周期短．且有市售的试剂盒可供利用．技术难度不大；该技术方法可以使低丰度的mRNA得到高于1000倍的富集．灵敏度高．较适于在转录水平上研究生物基因的差异表达：1次SSH反应可同时分离上百至上千个差异表达的基因片段．适用于大规模的基因表达分析。效率高且假阳性率低。但SSH技术仍有它的不足之处，如所需的起始mRNA量较大(一般为几ug)，如果mRNA量不够．2次差减后有些关键的、低丰度表达的差异eDNA片段可能检测不到．而且SSH获得的eDNA片段一般较短。要想获得全长序列就要用这些基因片段作为探针从eDNA文库中筛出全长基因。

2抑制消减杂交技术在瓜菜作物研究中的应用

目前SSH技术在医学研究领域已有成功的报道．国内外学者已成功将SSH技术运用于研究机体各种疾病相关基因表达、免疫细胞和组织的基因调控、肿瘤相关基因以及某些耐药性基因的克隆等方面。实践证明，SSH技术也特别适合于研究植物发育阶段转型前后、个体内不同器官之间以及受环境因子影响较大的差异表达基因的克隆。

2．1在瓜菜作物发育生物学中的应用

植物体内大部分基因都是时空表达和诱导表达的．在植体内的不同发育时期、不同组织器官基因的表达不同。研究不同发育阶段、不同组织器官基因的差异表达．对于研究瓜菜类作物的生长、发育和衰老等规律并应用到实践育种中具有重要的意义。

肖钢等以授粉后27 d的种子mRNA为检测组．授粉后7 d的种子mRNA为驱动组利用SSH技术构建了甘蓝型油菜种子发育期基因差异表达文库，得到560个克隆．对456个PCR阳性克隆进行斑点杂交．得到201个上调的阳性斑点杂交克隆，测序得到有效ESTs序列198个。BLASTN结果显

示，134个ESTs可能是新基因．另外64个ESTs序列在油菜或拟南芥核酸数据库中存在同源序列．这64个ESTs序列和编码已知功能蛋白(主要是能量代谢、物质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的基因有高度相似性．马春泉等㈣利用SSH技术构建了甜菜M14品系在花期的ZAP表达载体的eDNA文库．获得的M14品系特异表达的2个EST片段即eDNAMe286和Me284；采用RACE技术获得了基因M14286 cDNA片段的全长序列。生物信息学分析发现M14品系特异表达基因M14286的eDNA片段与eDNA片段Me284分别与大花马齿苋(Portulaca grandilrIora)及瓶子草(Sarracenlapurpurea)的26S核糖体RNA具有很高的同源性。

周增光等以矮化突变的甘蓝型油菜茎尖为检测组．野生型茎尖为驱动组．通过SSH构建了与植株高矮性状关系最密切的茎尖差异表达eDNA差减文库．利用反向消减cDNA文库斑点印迹筛选得到30个阳性克隆．序列测定和同源性比对分析表明，所得克隆的功能涉及第2信使、转录因子、激素代谢、蛋白质降解及转运等多个方面．为进一步认识油菜植株矮化机理奠定了基础。Park等通过SSH技术构建了绿色和红色莴苣(生菜)叶片的差减文库，利用no．hem杂交技术检测到566个克隆中有53个在红叶片中过量表达．其中6个上调基因中CHS、F3H和DFR基因的表达与紫外线照射下莴苣叶片中花青素的积累正相关．这对进一步研究蔬菜作物的次级代谢提供了有价值的资源。Zhou等通过SSH和RT-PCR技术研究了甘蓝型油菜无瓣花突变体Apet 33-10的花器官形态发生和差异表达基因．发现在花器官形成过程中不能观测到花瓣原基而其他器官形成正常．在Apet 33-10早期花芽分化中有18个基因表达下调．这些基因与包括花瓣特异表达．钙离子信号转导，mRNA加工。蛋白合成与降解，细胞骨架构建．核酸结合和生物碱的合成等相关。Terefe等以黄瓜两性花花芽eDNA为检测组．以雌株花芽eDNA为驱动组．通过抑制消减杂交得到了178个eDNA克隆。其中选出21个做点杂交发现有11个克隆是仅在黄瓜两性花花芽中表达的、10个是雌株花芽中差异表达的。为进一步分离决定花性型的基因提供了基础。植物花性型的分化是一个高度复杂的、在一定遗传背景控制下的生理生化及形态发生过程．瓜类不同花性型的研究一直以来都是育种研究的重点．用SSH技术分离相关的诱导表达型基因和不同花性型差异表达基因．揭示瓜类作物花性型分化的分子机制．对于其育种工作具有重要的理论和实践价值。

2．2在瓜菜抗病虫研究中的应用

病虫害的发生是影响瓜菜作物高产和优质的重要因素．探索瓜菜作物抗病、抗虫基因作用的分子机制是开展和实施瓜菜基因工程的重要基础．SSH技术的应用无疑为这类研究提供了一种很有效的工具。

Kirankamar等㈣从SSH文库中分离到600个Pro基因在番茄里过量表达而可能产生的特异基因．然后结合微阵列技术分析了Pro过量表达的抗性株与感病株在接种番茄叶霉菌后的不同时间里这些基因的表达谱．最终鉴定出223个Pro过量表达的特异应答基因。茆振川等以含Ⅳ基因的辣椒为试验材料，接种南方根结线虫12、24、36 h的根尖材料作为检测组，相应的未接种的根尖材料作为驱动组．构建1个南方根结线虫诱导Ⅳ基因表达早期的正向抑制消减杂交eDNA文库，并结合文库高密度点阵膜杂交差异筛选．获得237个ESTs，在GenBank上进行比对分析得到148个功能已知的EST序列，获得68个已知的表达上调的抗性相关ESTs．分离出了具有NBS-LRR结构的抗线虫蛋白和类LRR抗性蛋白的基因，防御作用相关的类萌芽素(GLP)、HSR203J蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因，抗性相关的WRKY、ERFBP等转录因子基因，以及G蛋白、14-3-3蛋白等多种信号蛋白基因．为了解抗线虫机制提供了依据。

Xu等利用SSH技术构建了尖孢镰刀菌诱导西瓜根的消减文库．共得到562个高质量的ESTs．经过功能注释后发现，最普遍的一类EST序列是与病害和防御相关的，约占33．5％．其次是与信号转导作用相关的EST序列约占13．1％．序列分析认为系统自身获得性抗病是西瓜对尖孢镰刀菌产生抗性的主要原因。赵熙等_1句成功利用SSH技术构建了富集大白菜干烧心病的相关基因的消减cDNA文库．采用PCR方法对该文库进行了重组子鉴定．共得到831个重组子．该文-库的构建成功地为深入研究大白菜干烧心发病后基因的表达奠定了基础．为进一步探讨研究大白菜干烧心病的致病机理提供了参考。

2．3在逆境胁迫下差异表达基因研究中的应用

植物在不同的逆境条件下会表现出具有一定的抗性．分析不同逆境胁迫下的差异表达基因及分离克隆差异表达基因并进行功能分析．有助于阐明逆境调控通路．对进一步揭示逆境胁迫的分子调控途径具有重要的作用．

Maya等利用SSH和cDNA-AFLP技术研究鉴定了氟乐灵除草剂诱导甜瓜抗镰刀菌枯萎病．消减文库得到共123个克隆。经过测序分析，其中60个为未知基因，35％的克隆为已经报道的与胁迫、防御相关的基因．随机挑选32个克隆进行进一步分析发现：当用氟乐灵处理时1／3的基因上调．而甜瓜植株用高盐处理时有4个胁迫相关基因的表达增强．说明氟乐灵能够诱导植株的胁迫应答反应．从而保护植株防卫镰刀菌枯萎病。解莉楠等以盐碱胁迫下的羊草地上部分cDNA为检测组．非盐碱条件下生长的羊草地上部分cDNA为驱动组，利用抑制性消减杂交技术构建了盐碱胁迫下羊草消减文库，筛选出1920个阳性克隆．将得到的552个非重复序列与GenBank中的序列进行比对．其中有548个与数据库中的序列有同源性，其中功能已知的339个．功能未知序列209个，获得了与盐碱胁迫相关的基因．为抗逆基因的克隆及系统研究盐碱胁迫下羊草相关基因的表达奠定了基础。Mi等通过抑制消减杂交技术分离鉴定了黄瓜的低光照诱导的基因，以100 txmol／m2·s处理的幼苗eDNA为检测组．800Ixm01／m2-s处理的幼苗cDNA为驱动组构建了消减eDNA文库，得到768个重组子克隆，其中246个为低光照诱导克隆．经过测序比对64个ESTs中有50个在GenneBank中能够找到同源序列，14个ESTs为分离得到的新基因。Thay等利用SSH技术从6度处理48 h的玉米幼苗中分离鉴定一些新的基因．这些冷冻诱导基因与起信号转导和光合作用调节的已知蛋白功能近似。通过RT-PCR选出1组基因分别命名为：ZmC016．ZmACAI，ZmDREB2A和ZmERF3，证实这些基因都是低温逆境胁迫下表达的。SSH技术在植物逆境胁迫基因的克隆中成功应用．为更深入利用该技术分离瓜菜作物抗性基因提供了重要的方法指导。

3结语

当前将瓜菜作物研究的重点一直放在育种工作中。而抗病虫性和抗逆性一直是重要的育种目标．但由于对相当部分病虫胁迫机制并不清楚．发挥抗性的主效或专一基因需要进一步明确．启动抗性反应的信号转导等问题需要进行深入的研究。SSH技术的出现和成熟无疑将成为瓜菜作物差异基因表达研究的强有力工具。利用该技术可以广泛地开启各种病虫胁迫、逆境胁迫条件下的基因差异表达的研究．深入了解抗病虫的机理机制．将为优良品种的选育提供理论依据和资源。