表达抑制

表达抑制（共8篇）

表达抑制 篇1

0 引言

Stathmin基因定位于人染色体1p35～36.1上,这个区域是肿瘤细胞基因组DNA杂合性缺失或丢失频率非常高的位点。stathmin蛋白含有149个氨基酸,分子量为19kD,是一种微管不稳定蛋白,通过自身的磷酸化和去磷酸化调节细胞微管系统的动态平衡[1],在多种恶性肿瘤中异常高表达。RNAi技术是通过19-31nt的小分子干扰RNA与特异性mRNA结合,达到特定基因沉默的目的,具有高效性和特异性的特点,避免了传统基因敲除的致死性,在基因治疗及基因功能研究上应用广泛[2,3]。本实验通过构建stathmin基因SiRNA质粒表达载体,探讨特异性沉默鼻咽癌5-8F细胞系stathmin基因对鼻咽癌细胞stathmin基因表达的影响,为鼻咽癌的基因治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

鼻咽癌5-8F细胞株(中南大学湘雅医学院提供);JM109大肠杆菌株(桂林医学院科学实验中心保藏);质粒表达载体pGenesil1.1(武汉晶赛公司)。

1.1.2 实验试剂

限制性内切酶EcoRⅠ、MluⅠ和SalⅠ为Promega公司产品;DL2000 DNA、DL1000 Marker、T4 DNA连接酶和RT-PCR试剂盒为Takara公司产品;质粒提取试剂盒为天根公司产品;1640培养基购自GIBCO公司;小牛血清购自四季青公司;脂质体购自QIAGEN公司;兔抗人stathmin抗体为Bioworld公司产品;小鼠抗人β-actin抗体、辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG二抗和BCA蛋白定量试剂盒为碧云天公司产品。

1.1.3 引物合成

GAPDH上游引物:5’-TCAGCCGCATCTTCTTTTG-3’;

下游引物:5’-GATGGCATGGACTGTGGTC-3’,产物594bp。

Stathmin上游引物:5’-ATGGCTTCTTCTGATATCCAGG-3’;

下游引物:5’-TTAGTCAGCTTCAGTCTCGTCA-3’,产物449bp。

引物由Invitrogen公司合成。

1.1.4 仪器

多功能高速冷冻离心机(德国Eppendorf);UV-2401紫外可见分光光度计(日本岛津公司);PCR扩增仪(德国BIOMETRA);小型垂直电泳转印系统(美国伯乐);全自动数码成像分析系统(英国SYNGENE);制冰机(日本);DYCP-31系列水平电泳仪;CO2培养箱。

1.2 方法

1.2.1 用于Stathmin沉默的目标DNA片段的设计与合成

根据GeneBank Stathmin基因序列及SiRNA设计原则,设计、合成用于Stathmin 特异性干扰DNA片段(目的基因SiRNA干扰序列为粗斜体字部分)命名为STM,该序列经过BLAST比较,与人基因库其它基因均无同源性。

STM正义链:5’-CACCGCGAGAGAAGGATAAGCACATTTCAAGACGATGTGCTTATCCTTCTCTCGCTTTTTTG-3’;

STM反义链:5’-TCAAAAAAGCGAGAGAAGGATAAGCACATCGTCTTGAAATGTGCTTATCCTTCTCTCGC-3’。

1.2.2 Stathmin基因SiRNA质粒表达载体的构建

将合成的单链DNA片段进行退火,形成双链DNA片段;采用EcoRⅠ酶切质粒表达载体pGenesil1.1,用1%琼脂糖凝胶电泳回收线性化质粒载体;采用T4连接酶将目标双链DNA片段与线性化的质粒载体连接,命名为:pGenesil1.1-STM;连接产物转染感受态JM109大肠杆菌,用卡那霉素抗性LB平板进行筛选,挑取单个菌落进行扩增。采用质粒提取试剂盒提取质粒;用MluⅠ和SalⅠ双酶切和测序对质粒进行鉴定。

1.2.3 通用阴性对照质粒表达载体

通用阴性对照质粒表达载体pGenesil-1.1HK为武汉晶赛生物公司产品,其编码的siRNA为GACTTCATAAGGCGCATGC,该序列与人基因库的基因无同源性。鉴定方法同上。

1.2.4 质粒表达载体转入鼻咽癌5-8F细胞的效率分析

取对数生长期5-8F细胞,按10×105细胞/孔接种于6孔板。第2d细胞培养至约50%融合时进行质粒表达载体转染。设:1)对照组(脂质体试剂);2)阴性对照组(转染pGenesil 1.1-HK);3)Stathmin特异性组(转染pGenesil 1.1-STM)。操作按照GIAGEN公司脂质体Effectene使用说明书进行。载体转染细胞24h后换液,48h后在荧光显微镜下观察转染效率并拍照。

1.2.5 RT-PCR检测stathmin基因的表达

转染48h后收集细胞,采用Trizol法提取总RNA,测定浓度,各组取0.77μg总RNA,以GAPDH为内参,按一步法RT-PCR试剂盒使用说明书进行操作;RT-PCR反应条件如下:50℃ 30min,94℃ 3min,94℃ 30s,62℃ 30s,72℃ 1min,30个循环,最后72℃、5min。反应完成后,取5μl产物于2%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

1.2.6 Western Blot检测stathmin蛋白表达

细胞转染48h后,去上清,用PBS洗2次,加入蛋白裂解液,置冰上15min,收集裂解液,超声波处理,12 000r/min、30min,取上清,测定蛋白浓度。取蛋白50μg加入点样buffer,转入制好的15%SDS-PAGE凝胶点样孔中,点入预染蛋白Marker作参照;电泳分离后,采用电转法将蛋白转移到PVDF膜上(100V,300mA,1.5h)。采用5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜2h后,加入一抗(30℃、50r/min,孵育2h),用TBST洗3次,每次5min;加入辣根过氧化物酶标记的二抗(30℃、50r/min,孵育2h),TBST洗3次,每次5min;在暗室中加入发光剂,压片、洗片。

2 结果与分析

2.1 Stathmin基因SiRNA质粒表达载体的鉴定与分析

MluⅠ和SalⅠ双酶切通用阴性对照pGenesil-1.1HK质粒表达载体和目标基因pGenesil1.1-STM质粒表达载体,有约316bp大小的酶切片段,其结果与预测相符合(见图1)。测序结果表明,构建的质粒载体序列与设计序列完全一致,插入方式与位点正确(见图2),表明构建质粒表达载体可靠。

M:DNA Marker;1:p Genesil1.1-HK;2:p Genesil1.1-STM.

A:阴性对照pGenesil1.1-HK;B:stathmin基因pGenesil1.1-STM。

A:Negative control group pGenesil1.1-HK;B:stathmin pGenesil1.1-STM.

2.2 构建的质粒表达载体转染效率分析

质粒载体pGenesil1.1能表达绿色荧光蛋白,质粒转入细胞后能进行转染效率分析,转染效率为78.8±6.8%。

2.3 Stathmin基因SiRNA质粒表达载体抑制stathmin的mRNA表达

与脂质体组和阴性对照pGenesil1.1-HK组比较,stathmin基因特异性pGenesil1.1-STM组stathmin表达明显降低;脂质体组和阴性对照pGenesil1.1-HK组比较,stathmin表达无明显差别(见图3)。

2.4 Stathmin基因SiRNA质粒表达载体抑制stathmin的蛋白表达

与脂质体组和阴性对照pGenesil1.1-HK组比较,stathmin基因特异性pGenesil1.1-STM组stathmin蛋白表达明显降低;脂质体组和阴性对照pGenesil1.1-HK组比较,stathmin蛋白表达无明显差别(见图4)。

3 讨论

Stathmin基因在多种人类恶性肿瘤中异常高表达,Stathmin的表达产物是一种高度保守的细胞胞浆蛋白,蛋白的4个丝氨酸残基(Ser16,Ser25,Ser38,Ser63)的磷酸化和去磷酸化调节细胞微管系统的动态平衡,维持细胞正常的生物学行为[4]。stathmin基因作为一个潜在的肿瘤基因治疗新的靶基因受到越来越多的关注[5]。RNAi对基因的沉默具有高效性和特异性,使得RNAi技术得到越来越多的应用。为了研究stathmin在鼻咽癌中的生物学作用,我们构建stathmin特异性SiRNA表达载体。根据SiRNA设计原则,我们选择在stathmin基因启动子下游找到开始第一个AA二聚体,记录AA下游19～23个碱基并将此列为目的干扰序列,计算目的干扰序列中嘌呤和嘧啶的含量百分比(G/C),要求G/C比值接近50%,并通过BLAST网络确认SiRNA干扰序列的唯一性,如G/C不能达到要求或者唯一性不好,则找下一个AA二聚体[6,7],最终我们选择了序列5’-GCGAGAGAAGGATAAGCACAT-3’(G/C 47.6%)为干扰序列。常用的载体有腺病毒载体、逆转录病毒载体、真核细胞表达质粒、纳米多聚物及分子偶联载体[8]等。腺病毒等病毒载体有高效转染和高表达的优点,但病毒载体本身的毒性反应和免疫反应的缺点也比较突出[9,10]。而质粒载体则安全、较容易获得并大量扩增、转染细胞后表达稳定、持续时间长[11]。车彪[12]等成功构建的stathmin siRNA表达载体能有效抑制骨肉瘤LM8细胞中stathmin基因的表达。有研究表明[13]Stathmin在 NPC组织中高表达,其表达水平与 NPC分化、分期等相关,提示 stathmin可以作为NPC潜在的分子标志物。本实验采用质粒表达载体pGenesil1.1,插入干扰序列后的重组质粒转染鼻咽癌5-8F细胞系,RT-PCR和Western Blot检测揭示,重组质粒表达载体转染后,stathmin基因在鼻咽癌中的表达明显下降。表明构建的stathmin基因SiRNA质粒表达载体能沉默stathmin,为进一步研究stathmin基因在鼻咽癌5-8F细胞系中的生物学作用和鼻咽癌的基因治疗提供了技术条件。

表达抑制 篇2

用体外转录法制备小干扰RNA抑制Hela细胞CUEDC2基因表达

CUEDC2是一个广泛表达于各种真核生物、功能尚不明确的.基因.利用一种改进的体外转录方法获得包含CUEDC2基因靶序列的长链RNA,进而通过RNA酶H切割引导序列形成成熟siRNA.转染Hela细胞并进行免疫印迹检测.结果显示,运用此方法得到的siRNA能够有效地抑制细胞中内源CUEDC2的表达,此项方法为CUEDC2的深入功能分析奠定了基础.

作 者：李涛 高彦飞 巩伟丽 靳宝锋  作者单位：国家生物医学分析中心,北京,100850 刊 名：科学技术与工程  ISTIC英文刊名：SCIENCE TECHNOLOGY AND ENGINEERING 年，卷(期)：2010 10(15) 分类号：Q344.13 关键词：体外转录   小干扰RNA   CUEDC2  

★ 大鼠CD40基因RNA干扰真核表达载体的构建及鉴定

表达抑制 篇3

根据MYB类转录因子所含有的MYB结构域的数目, 可被简单地分成3个亚类[3]:一是只含1个MYB结构的MYB蛋白亚类成员, 二是含有2个MYB结构域的R2R3亚类成员, 三是含有3个MYB结构域的R1R2R3亚类成员。以前有相关的研究表明, MYB类转录因子广泛地在植物的各种反应中发生作用, 包括细胞形态发生、次生代谢等。蔡新忠等[4]的研究结果证明MYB基因在番茄的抗旱中发挥一定的作用。Urao等[5]从拟南芥中分离出1个MYB基因Atmyb2, 该基因的表达受到干旱、高盐以及ABA等的诱导, 体外EMSA表明Atmyb2蛋白能够与MYB识别位点TAACTG进行特异性的结合。Abe等在分析一个足以响应干旱和ABA诱导的来源于rd22基因启动子的67 bp DNA序列时, 鉴定了2个顺式作用元件, 即MYC和MYB识别位点。瞬时表达分析表明Atmyb2能够促进rd22启动子驱动的报告基因的表达。Dene Kamp等[6]对拟南芥中MYB类转录因子At Myb102的研究发现, 经过Na Cl和ABA处理后, 与对照相比, At Myb102的表达明显要高, 在受到ABA处理后, 其在拟南芥的根、茎、叶、小花中的表达量会得到显著的提高。通过基因芯片技术, 笔者所在试验室实定了1个PEG6000胁迫抑制表达的基因。该基因编码MYB类转录因子, 命名为Os SRMYB1。本研究将通过序列比对、结构域分析、表达特性研究等手段分析明确Os SRMYB1在非生物胁迫中可能的功能, 为进一步深入分析Os SRMYB1的生物学功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料及处理

水稻粳稻 (Oryza sativa L.sub Japonica) 品种韭菜青由笔者所在实验室内保存提供。水稻种子置于30℃环境中催芽2 d, 将种子均匀地点播于96孔板中, 于28℃培养箱中水培生长, 条件为:光照16 h、黑暗8 h。营养液采用国际水稻所用的常规营养液配方[7], 待幼苗生长至3~4叶时, 对幼苗按以下步骤处理:一是冷处理, 将幼苗置于4℃环境中;二是模拟干旱处理, 水稻幼苗营养液中加入20%的PEG6000;三是H2O2处理, 水稻幼苗营养液中加入100 mmol/L H2O2;四是ABA处理, 水稻幼苗营养液中加入0.05 mmol/L ABA。分时段 (0、1、3、6、12、24、48 h) 收集水稻幼苗地上部样品, 液氮速冻后于-80℃保存, 用于RNA的提取。

1.2 总RNA的提取

提取总RNA时, 参照Invitrogen公司的Trizol试剂完成。在1%普通琼脂糖凝胶电泳上将总RNA分离出来, 经过一定的分析, 对总RNA的质量以及浓度进行判断。将符合要求的总RNA置于-80℃的环境条件下保存备用。

1.3 c DNA第一链的合成

参照MBI公司的反转录系统的操作手册进行c DNA第一链的合成。取总RNA 2μg置于DEPC-H2O中进行稀释, 总体积调至12μL, 在逆转录酶的作用下于PCR扩增仪上保温1 h, 温度控制在42℃下即可;再在70℃下保温10 min, 最后置于-20℃中保存备用。

1.4 Quantitative Real-time PCR分析

以水稻18s r RNA作为内参, 进行实时荧光定量PCR试验。20μL PCR反应体系包括:10μL 2×SYBR Green supermix reagent (包括反应缓冲液, d NTPs, SYBR Green染料) , 1.0μL c DNA模板, 20 nmol/L基因特异引物, 8μL dd H2O。其中, 用于该Real-time PCR分析的引物序列见表1。

1.5 Os SRMYB1基因的生物信息学分析

参考Gramene数据库中的Os SRMYB1基因序列信息 (LOC_Os12g03150.1) [8], 根据Primer Premier 5对引物Os SR MYB1-F (5′-GAACTATAGCTAGCCAAGTAGCCATG-3′) 及Os SRMYB1-R (5′-GTTCTTGATGTCGTTGTCGGTG-3′) 进行设计, 模板选择水稻耐旱品种韭菜青c DNA, 通过PCR对Os SRMYB1基因的全长进行扩增, 将其与p MD18-T载体进行连接并进行序列的测定。利用SMART网站 (http://smart.embl-heidelberg.de/) 对获得的序列进行蛋白序列结构域进行分析。利用Rice oligonucleotide array database分析其在水稻不同组织中的表达。此外, 利用genevestigator数据库分析其在不同胁迫下的表达情况以及其共表达基因。运用Clustal X与MEGA 4软件对Os SRMYB1进行多重序列比对与进化树构建。

2 结果与分析

2.1 Os SRMYB1的克隆及蛋白特性分析

以韭菜青c DNA为模板, 通过PCR扩增获得Os SRMYB1基因全长并进行测序及序列分析, 结果表明Os SRMYB1的ORF长度为1 599 bp, 蛋白产物由311个氨基酸构成, 分子量为34.06 KDa, 等电点为-3.0。利用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) 分析该蛋白的结构域, 结果表明该蛋白包含SANT结构域 (图1) , 为MYB家族蛋白。

2.2 Os SRMYB1与其他非生物胁迫相关MYB类锌指蛋白的序列比对与进化树构建

选取非生物胁迫相关MYB类锌指蛋白Atmyb102、Atmyb2、Gm MYB92、Gm MYB76和Os SRMYB1, 利用Clustal X与MEGA4软件进行序列比对及进化分析。由图2、图3可知, Os SRMYB1与其他4种MYB类锌指蛋白的氨基酸序列显著相似, 特别是在其保守结构域内氨基酸序列高度保守。

2.3 Os SRMYB1在不同组织及各种处理条件下的表达

利用Rice oligonucleotide array database, 分析Os SRMYB1在水稻不同组织中的表达, 结果分析表明Os SRMYB1基因在根、茎、叶片、叶鞘、穗等不同组织中均有表达 (图4) , 其在叶中表达水平较高。

利用Gene vestigator数据库分析Os SRMYB1在不同胁迫下的表达情况, 结果表明Os SRMYB1的表达受非生物胁迫影响, 说明Os SRMYB1可能参与非生物胁迫响应。为了进一步分析Os SRMYB1在非生物胁迫中的功能, 利用Real-time PCR分析了Os SRMYB11在H2O2、20%PEG、低温 (4℃) 及ABA处理下的表达 (图5) 。由表5可知, Os SRMYB1表达受H2O2诱导, 而在20%PEG处理下其表达受抑制, 表明Os SRMYB1可能参与了干旱、氧化胁迫等非生物胁迫的响应。

2.4 Os SRMYB1的共表达与共调节基因分析

利用Genevestigator软件对Os SRMYB1可能的共表达及共调节基因进行分析, 结果如图6、图7所示。Os SRMYB1的共表达基因为LOC_Os09g37050, 编码RING-H2锌指蛋白, 根据genevestigator分析该基因受NAA、GA3诱导。Os SRMYB1的共调节基因为LOC_Os02g44320, 编码蛋白酶抑制剂蛋白, 根据genevestigator分析该基因受冷害、H2O2诱导。

3 结论与讨论

现有的研究表明, 水稻中有多个基因家族参与非生物胁迫的应答, 如GT转录因子家族[9]、TIFY基因家族[10]、BURP基因家族[11]、类BRX基因家族[12]等。Os SRMYB1为MYB类锌指蛋白, 已有研究结果表明MYB类锌指蛋白亦可能参与非生物胁迫响应, 如大豆Gm MYB92、Gm MYB76及拟南芥Atmyb102、Atmyb2蛋白。研究表明Os SRMYB1是一种在细胞内普遍存在且大量表达的多聚体核糖体蛋白质, 在基因表达、抗逆响应中起重要作用。在组织表达分析中Os SRMYB1在新叶与幼穗中含量较高, 表明Os SRMYB1可能在主要在分生组织中表达。

本研究克隆了Os SRMYB1基因, 并通过氨基酸序列比对、蛋白结构域分析、基因表达特性等分析表明Os SRMYB1可能参与非生物胁迫响应, 为进一步深入分析Os SRMYB1的生物学功能提供基础。与大多数已经报道的植物MYB类转录因子不同, 本研究发现的Os SRMYB1受渗透胁迫的负调节, 表明该基因可能在植物响应非生物胁迫过程中发挥了负向调控的作用。进一步将通过转基因技术获得过量和RNA干涉抑制表达Os SRMYB1基因的水稻转基因植物, 深入研究其参与的非生物胁迫应答机制。

摘要：通过基因芯片技术, 鉴定了一个PEG6000胁迫抑制表达基因。该基因编码MYB转录因子, 命名为OsSRMYB1。荧光定量PCR研究结果表明, 该基因的表达显著受PEG6000抑制, 受氧化胁迫诱导, 而低温和ABA处理下该基因的表达未发生显著变化。组织表达分析结果表明, OsSRMYB1基因在水稻不同组织中均有表达, 在叶中表达量较高。在不同生长阶段的穗中, OsSRMYB1基因在发育中的穗中表达较高, 在成熟穗和幼穗中表达量较低。本研究为进一步深入分析OsSRMYB1的生物学功能提供参考。

关键词：MYB,水稻,渗透胁迫,穗发育,转录因子

参考文献

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表达抑制 篇4

G250(又称MN/CAⅨ)基因,位于染色体9p12~p13上[1],它对细胞转化有重要的调节作用,可诱导细胞向恶性表型分化[2],也有研究显示G250可在转录水平调控肿瘤细胞的生长与转移[3,4]。因此,它极有可能是一个潜在的基因治疗的分子靶点。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是目前阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效且简单的方法[5,6]。运用RNAi进行研究的领域不断扩大,如通过阻断特定基因以提高肿瘤细胞对化疗药的敏感性[7]的方法已经开始用于治疗部分疾病的临床实验[8]。本实验以肾癌相关抗原G250为靶标,设计了针对G250基因的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),观察其对肾癌786-0细胞株G250基因表达的影响,为进一步利用si RNA技术以G250基因作为靶点进行肾癌的基因研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肾癌786-0细胞株及大肠杆菌DH-5α(南方医院泌尿外科保存);空载体p RNAT-U6.1/Neo(Gen Script公司),各种限制性内切酶及T4DNA连接酶(Promega公司),Trizol、LipofectamineTM2000及Thermo Script RT-PCR Kit(Invitrogen公司),Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix Kit(Stratagene公司),BCA Protein Assay Reagent Kit及发光检测试剂盒(Pierce公司),PCR产物纯化及回收试剂盒(上海生工公司),质粒提取试剂盒(Quagen公司),RIPA裂解液及SDS-PAGE 5×蛋白上样缓冲液(碧云天生物技术研究所);兔抗人G250多克隆抗体和HRP标记的羊抗兔多克隆Ig G(Abcam公司),兔抗人多克隆β-actin抗体(中衫金桥生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA靶序列的设计和筛选

G250 m RNA的全长序列从美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基因库(Genebank,登录号:AJ010588)检索得出。应用Primer express软件按照si RNA的设计原则寻找含21个碱基的特异性序列。此4条靶序列及基因位点见附表。

再利用Blast软件对选择的靶序列进行同源性分析,根据p RNAT-U6.1/Neo质粒的结构,以si RNA序列为基础,应用合成具有编码发夹结构si RNA的DNA oligos插入片段的方法,按照将si RNA靶序列转换成为转录模版寡核苷酸序列的要求,分别设计4条发夹si RNA转录模版的DNA双链,以上序列由南京金思特(Gen Script)公司合成。

按此方案设计出4对GC含量分别为47.7%、41.0%、47.4%和36.0%且Tm值分别为76.0℃、75.0℃、77.7℃和73.0℃的特异性干扰片段的核苷酸序列:

F1:5'-GGATCCCGTAGCACTCAGCATCACTGT CTTTGATATCCGAGACAGTGATGCTGAGTGCTATTT TTTCCAAAAGCTT-3';R1:5'-AAGCTTTTGGAAAAA ATAGCACTCAGCATCACTGTCTCGGATATCAAAGA CAGTGATGCTGAGTGCTACGGGATCC-3';F2:5'-G GATCCCATATTGGAAGTAGCGGCTGAATTGATATC CGTTCAGCCGCTACTTCCAATATTTTTTTCCAAAAG CTT-3';R2:5'-AAGCTTTTGGAAAAAAATATTGGA AGTAGCGGCTGAACGGATATCAATTCAGCCGCTAC TTCCAATATGGGATCC-3';F3:5'-GGATCCCGTTC TTGAGGATCTCCAGGAGCTTGATATCCGGCTCCTG GAGATCCTCAAGAATTTTTTCCAAAAGCTT-3';R3:5'-AAGCTTTTGGAAAAAATTCTTGAGGATCTCCAG GAGCCGGATATCAAGCTCCTGGAGATCCTCAAGAA CGGGATCC-3';F4:5'-GGATCCCATTTAGGCTTAAC TTCAGGTATTGATATCCGTACCTGAAGTTAAGCCTA AATTTTTTTCCAAAAGCTT-3';R4:5'-AAGCTTTT GGAAAAAAATTTAGGCTTAACTTCAGGTACGGATA TCAATACCTGAAGTTAAGCCTAAATGGGATCC-3'。

另外设计1条发夹结构无意义的si RNA转录模板的DNA片段作为阴性对照,命名为G250siRNA-n。

1.2.2 质粒的构建

各取1μL终浓度为1μg/μL的合成寡核苷酸链的正义链和反义链,同1μL20×SSC Buffer混合,补充总体积至20μL。加热至95℃保持10 min,然后自然冷却至室温。取退火后寡核苷酸双链8μL,与相应体积ATP、T4磷酸化酶和dd H2O混合至25μL,37℃反应30 min。用Bam HⅠ和HindⅢ双酶切质粒p RNAT-U6.1/Neo,37℃反应2 h,琼脂糖凝胶电泳,回收6 380 bp片断。将sh RNA寡核酸双链和p RNAT-U6.1/Neo酶切产物按3∶1混合,T4DNA连接酶27℃连接过夜,转化感受态DH-5α大肠杆菌中。然后提取待测的重组质粒(命名为psh RNA-G250),将其和空质粒用限制性内切酶KpnⅠ进行酶切。酶切鉴定正确后取1 m L转化菌液,送南京金思特科技公司测序。

1.2.3 786-0细胞培养及siRNA转染

用含胎牛血清的RPMI 1640培养基,在37℃和50 m L/L二氧化碳的条件下培养细胞。转染前24 h,传代至24孔板,每孔1.5×105个细胞。用LipofectamineTM2000进行转染。转染后6 h换成完全培养基,继续培养72 h。

1.2.4 定量PCR(Q-PCR)检测细胞转染后G250m RNA的表达

用Trizol提取转染48 h后的各组细胞总RNA,Promega试剂盒逆转录成c DNA。定量PCR反应以β-actin为内参照。G250上游引物为5'-AGAGGCTGGATCTTGGAGAATG-3',下游引物为5'-GGAAGTGGCATAATGAGCAGGA-3',扩增产物为91 bp;β-actin上游引物为5'-GAAATCGTGCGT GACATTAAGG-3',下游引物为5'-TCAGGCAGCTC GTAGCTCTTCT-3',扩增产物为115 bp,退火温度63℃,40循环。

1.2.5 Western-blot检测细胞转染后G250蛋白的表达

将转染后继续培养72 h的各组786-0细胞进行处理,提取蛋白,用聚丙烯酰胺凝胶对蛋白进行电泳分离,转膜后用anti-G250(一抗)进行孵育,然后孵育带过氧化根酶的二抗,在Kodak IS2000R图像工作站上采集信号并分析。

2 结果

2.1 重组质粒psh RNA-G250测序

测序结果表明,连接到载体p RNAT-U6.1/Neo质粒中的G250基因si RNA特异性序列与G250基因中相应核苷酸片断序列完全吻合,证明5条目的序列均正确插入到p RNAT-U6.1/Neo中,分别得到重组质粒psh RNA-G250-1~psh RNA-G250-4及阴性对照重组质粒psh RNA-G250-n。

2.2 si RNA对G250基因表达的抑制

图1显示了实验各组m RNA的相对表达量,psh RNA-G250-1~psh RNA-G250-4各组的抑制效率分别为35.56%、49.27%、45.88%和65.13%,其中si RNA-4序列对G250 m RNA的抑制效率最高,其次是si RNA-2。

2.3 si RNA转染后G250蛋白表达的变化

重组质粒转染肾癌786-0细胞72 h后,含干扰序列的肾癌786-0细胞中G250蛋白的表达量均有不同程度下降;其中si RNA-4序列构建的重组质粒转染肾癌786-0细胞后,G250蛋白的表达量下降最明显,而阴性对照组G250蛋白的表达无明显变化。见图2。

1:psh RNA-G250-0;2:psh RNA-G250-n;3-6:psh RNA-G250-1~psh RNA-G250-4

3 讨论

本实验在成功构建肾癌相关抗原G250 si RNA表达载体的基础上[9],利用荧光定量RT-PCR及Western-blot的方法,以管家基因β-actin为内对照,对不同的si RNA表达载体转染肾癌786-0细胞后的G250 m RNA及其蛋白表达进行了检测,以寻找具有较高抑制效率的si RNA序列。

所有利用RNAi技术的研究中,靶位点的选择是RNAi成功的关键。本实验也参照了ELBASHIR的设计原则[10],包括G/C含量在35%~65%之间,避免4个A、T、C和G相连的序列,Blast分析排除同源性。目标序列设计4对si RNA,以保证至少有1对si RNA能有效抑制靶基因的表达,而且茎环结构的碱基数目设计为10个。另外,由于RNAi主要是通过双链RNA被切割成21~23 nt大小的RNA双链复合物(si RNA),再靶向切割同源性靶m RNA而实现[11],所以本实验没有考虑RNA二级结构的影响,因为有研究提示m RNA二级结构对si RNA的作用没有明显影响[12]。但也有研究认为RNA二级结构对si RNA的作用有影响甚至影响非常显著[13]。

为了避免载体影响RNA的干扰效果,本实验选择了一种能表达si RNA、且含有U6启动子的质粒构建重组体。当重组体进入细胞后就能在细胞内高效、稳定地表达si RNA分子,从而产生基因沉默效应,避免了将外源性si RNA直接导入的不足,且内源性表达si RNA在细胞内酶的作用下能迅速形成si RNA抑制基因的表达。该方法避免了被RNase降解的缺点,可以达到稳定的基因沉默效果[14]。转染阴性对照与空白对照组G250 m RNA的表达没有明显差异,说明载体的选择与构建正确,符合实验的设计要求,提示U6启动子也是表达si RNA的理想启动子[15]。

研究[16]显示,si RNA表达载体转染哺乳动物细胞后12 h就开始出现基因静默效应,随着时间延长,干扰效率随之增加,24~48 h逐渐明显,而48~72 h最显著。这说明了表达载体的RNAi作用呈现剂量和时间依赖性效应。所以本实验选择转染后48 h检测G250基因的表达量和转染后72 h检测G250蛋白的表达量,以更准确地测定si RNA的干扰效果。本实验显示,在表达载体转染细胞48 h后,不同的si RNA表达载体对肾癌786-0细胞G250 m RNA的表达都表现出一定的抑制作用,转染细胞72 h后各实验组G250蛋白均有不同程度下降,其下降程度与m RNA下降程度相对应,在蛋白水平也证实了si RNA的抑制作用。抑制效率最高与最低者相距约30%,说明不同si RNA序列对基因的转录后沉默效率是不同的,产生这种差异的真正原因目前还不甚清楚,要确定哪个RNAi序列的沉默效果最好,必须在转染后通过检测目的基因m RNA或蛋白的表达才能得出结论。因此,要筛选出对特定目的基因高效抑制的si RNA序列,必须通过实验手段。本实验通过对构建不同序列的si RNA表达载体转染后抑制效率的测定,找到了具有较高抑制效率的si RNA序列,可用于后续实验。

表达抑制 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

30例胆脂瘤组织标本均取自中南大学湘雅二医院2007年8月~2008年10月后天继发性胆脂瘤型中耳炎手术患者。男17例,女13例;年龄17~56岁,中位年龄42岁。另外收集15例外耳道正常皮肤组织标本作为对照组。所有标本常规甲醛固定、梯度酒精脱水和二甲苯透明,常规石蜡包埋,作4μm厚的连续切片,以备免疫组织化学应用。且每块组织的连续切片中,均取一张留做HE染色对照。30例胆脂瘤组织标本经HE染色,镜下确诊为胆脂瘤,即具有上皮组织、上皮下结缔组织及囊内容物等胆脂瘤的3个基本特征。

1.2 试剂

PTEN为鼠抗人即用型单克隆抗体,工作浓度1∶100,DAB显色剂以及SP免疫组织化学试剂盒(过氧化物酶标记的链霉卵白素试剂盒)均购自北京中杉金桥生物科技公司。

1.3 免疫组织化学S P染色方法

参照说明书行PTEN免疫组织化学SP法检测,步骤如下:二甲苯脱蜡,梯度酒精水化。3%过氧化氢去离子水孵育10 min,PBS冲洗3次,每次3 min。高压修复法行抗原修复,冷却后PBS冲洗3次,每次3min。滴加试剂A(封闭用正常山羊血清工作液)室温孵育10 min,倾去,勿洗。滴加适当比例的一抗(即用型鼠抗人PTEN单克隆抗体),4℃冰箱内过夜。PBS冲洗3次,每次3 min。滴加试剂B(生物素化二抗工作液),室温孵育10~15 min,PBS冲洗3次,每次3min。滴加试剂C(辣根酶标记链霉卵白素工作液),室温孵育10~15 min,PBS冲洗3次,每次3 min。滴加新鲜配制的DAB溶液显色,显微镜下观察以适度为止。自来水冲洗,苏木素复染。梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。阳性对照组采用已知阳性片为标准,阴性对照采用PBS缓冲液取代第一抗体,以排除非特异性着色。

1.4 结果判定

胆脂瘤和正常外耳道皮肤之上皮层包含有基底层、基底上细胞层和表层即角质层3层。PTEN阳性表达为细胞胞核呈现棕黄色。参用文献[5]方法观察PTEN蛋白的分布和阳性率,在阳性标准基础上,先按染色强度计分:无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,深褐色为3分。然后每张切片在高倍镜(400倍显微镜)下随机选取5个不重叠视野,每个视野各计数200个细胞,按阳性细胞所占的百分比计分:0分为没有细胞着色,1分为阳性细胞≤20%,2分为阳性细胞21%~50%,3分为阳性细胞>50%。最后将染色强度计分与阳性细胞百分比计分的乘积作为评判标准,3分为免疫反应阳性(+),否则计为免疫反应阴性(-)。

1.5 统计学分析

数据应用SPSS 16.0软件包进行统计学处理,率的比较采用计数资料χ2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

PTEN阳性表达以胆脂瘤组织和外耳道皮肤组织的上皮细胞胞核内出现棕黄色颗粒为标准,阳性细胞主要分布于基底层和基底上细胞层。PTEN在15例外耳道皮肤组织中有14例为阳性表达,阳性率为93.3%,而在30例中耳胆脂瘤组织标本中只有11例PTEN为阳性表达,阳性率仅为36.7%,余19例均为阴性表达。中耳胆脂瘤上皮组织中PTEN的阳性表达率较正常外耳道皮肤组织低,两组间比较,差异具有统计学意义(P<0.01)(附表,图1、2)。

注:1)统计方法为四格表χ2检验(χ2=13.005,P=0.000);2)胆脂瘤组和外耳道皮肤组PTEN阳性率比较,P<0.01

3 讨论

中耳胆脂瘤发病机制不清,主要认为与上皮细胞过度增殖、骨质破坏吸收和细胞凋亡有关。反映细胞增殖状态的度量指标PCNA和Ki-67在胆脂瘤上皮中的表达均显著增加[6]。近来有研究表明,中耳胆脂瘤上皮细胞凋亡受到抑制[7],细胞凋亡是由基因控制的个别细胞发生的自主有序死亡,同时,凋亡又是控制细胞过度增殖的一种正常细胞功能。

PTEN是在1997年发现的第1个具有磷酸酶活性肿瘤抑制基因,定位于人染色体10q23,具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性[8]。PTEN具有诱导细胞周期停止和启动细胞凋亡的作用,该基因如果异常和表达缺失可导致细胞抗凋亡,表现为细胞过度增殖。以往对于PTEN的研究多集中在肿瘤性疾病中,证实PTEN基因在机体多种肿瘤中有缺失或失活,如胃癌、恶性胶质瘤、前列腺癌和膀胱癌等[1,9,10]。近来研究证实,PTEN缺失还和一些非肿瘤性疾病的发病机制密切相关,如瘢痕疙瘩的发生[11]。中耳胆脂瘤虽然是非真性肿瘤,但其上皮细胞具有酷似肿瘤细胞的异常增殖和抗凋亡能力,使人们推断胆脂瘤上皮细胞可能也存在PTEN异常表达。由此,笔者检测了PTEN在中耳胆脂瘤中的表达情况,以探讨肿瘤抑制基因PTEN在中耳胆脂瘤上皮过度增殖和抗凋亡过程中的可能作用机制及意义。

对于PTEN基因与中耳胆脂瘤的关系,国外研究文献极少,国内仅有个别报道[12]认为,中耳胆脂瘤上皮和正常外耳道皮肤中均有PTEN的表达,阳性表达定位于细胞质,且两者表达差异并无统计学意义,作者解释是在胆脂瘤形成过程中,PTEN的作用更趋向于维持上皮细胞的正常生理状态,而不是发生基因异常导致细胞非正常增殖。然而笔者的研究恰恰发现PTEN主要在中耳胆脂瘤上皮和正常外耳道皮肤的细胞核着色,中耳胆脂瘤组PTEN阳性率为36.7%,正常外耳道皮肤组阳性率为93.3%,两者差异具有统计学意义(P<0.01)。正常外耳道皮肤组表现出了较强的细胞核着色,主要分布于基底层和基底上细胞层;而胆脂瘤组则表现出较弱的细胞核着色,主要分布于基底层。这些结果提示,PTEN表达缺失可能参与了中耳胆脂瘤的发生与发展。笔者推测可能是由于PTEN表达缺失,使其诱导细胞周期停止和启动细胞凋亡的功能丧失,从而导致中耳胆脂瘤上皮细胞的过度增殖与抗凋亡。

PTEN表达缺失继而丧失对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase-Akt/protein kinase B,PI3K-Akt/PKB)信号通路的拮抗可能是导致胆脂瘤上皮过度增殖和抗凋亡的重要机制。PI3K-Akt/PKB信号传导通路是已知的上皮细胞抗凋亡的最重要的细胞通路之一,在多种生长因子介导的细胞存活中发挥重要作用[13]。PI3K活化后可使磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)转变为第二信使磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)。在PIP3作用下,Akt结构域活性环中的Thr308位点和C端疏水模序中的Ser473位点发生磷酸化后即被激活,激活后的Akt通过直接磷酸化或失活BAD、前Caspase-9等促调亡蛋白而抑制细胞凋亡,从而促进细胞增殖[13]。PTEN是PI3K-Akt/PKB通路的拮抗剂,通过降低PIP3水平,阻断PI3K-Akt/PKB信号通路,实现对细胞凋亡的调控。本研究发现中耳胆脂瘤上皮中PTEN蛋白表达显著降低,则PTEN对PI3K-Akt/PKB信号通路的拮抗作用会明显减弱,即PI3K-Akt/PKB信号通路在中耳胆脂瘤上皮中很可能处于一种激活状态,从而导致胆脂瘤上皮细胞过度增殖和抗凋亡。

表达抑制 篇6

1.1 临床资料

收集本院普外科1994年～2011年收治的胃癌患者25例,其中男18例,女7例,年龄在19～81岁,所有病例均经胃镜病理检查确诊为腺癌。胃癌临床TNM分期:I期4例,II期6例,III期12例,IV期3例。病理分级:高、中、低分化分别为:5例,11例,9例。

25例胃癌组织标本均取自根治性胃癌切除术,手术切除的肿瘤标本,取石蜡切片及新鲜组织标本。石蜡切片供常规病理检查及免疫组化之用;新鲜组织标本供mRNA检测。胃癌组和正常组25例分别取肿瘤组织及瘤旁10cm处的正常黏膜组织。

1.2 实验方法

RT-PCR检测XIAP基因mRNA表达Trizol(Invitrogen公司)一步反向法抽提胃癌组织和癌旁正常组织RNA,在UV3000紫外分光光度仪上测定吸光度值,鉴定RNA纯度,A260/A280比值在1.8～2.0之间。PCR引物设计及反应条件如下:XIAP:预期产物片段大小为293bp,退火温度:52℃;Sense:5’-TCAGCAGTTGGAAGACACAG-3’,Antisense:5’-AGTCCAGCACTTGCTAACTC-3’。内参照GAPDH:预期产物片段大小为456 bp,退火温度:52℃;Sense:5’-TTCTCCCCATTCCGTCTTCC-3’,Antisense:5’-GTACATGGT ATTCACCACCC-3’。两步法RT-PCR:(1)逆转录反应:20µL反应体系含:模板11.5µL,随即六合引物1.0µL,5×Reaction Buffer 4.0µL,RNase Inhibitor 1.0µL,Dntp Mix 2.0µL,AMV 1.0µL;反应条件:70℃5 min,37℃5 min,37℃60 min,70℃10 min,4℃保存。(2)聚合酶链反应:50µL反应体系含:cDNA 1μL,10×buffer 5μL,25mmol/L MgCl2 3μL,2.5 mmol/L dNTP 5μL,Tap酶0.5μL,上下游引物各1μL,去离子水补至50μL,GAPDH作内参照。PCR仪扩增条件:94℃变性4min,按94℃30s,52℃(或54℃)40s,72℃45 s,进行35个循环,最后一个循环72℃延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统分析,以XIAP和GAPDH光密度比值相对定量。

1.3 免疫组化染色方法

标本经10%甲醛固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色后进行病理分级和组织分型,免疫组化采用SP法,第一抗体XIAP购自福建迈新生物公司,DAB显色,苏木精复染。以TBS取代第一抗作为阴性对照,以试剂公司提供的阳性片作阳性对照。

1.4 结果判定

根据阳性细胞在全部组织细胞中所占比例以及阳性细胞染色强度判定实验结果:(1)按显色细胞数积分,阳性细胞数<25%为1分,阳性细胞数25%～50%为2分,阳性细胞数>50%为3分。(2)按细胞显色深浅积分,未着色细胞0分,浅黄色1分,棕黄色2分,深棕色3分。积分数=(1)×(2):0分(-),1～2分(+),3～4分(++),6～9分(+++)。至少随即选取5～10个HPF。

1.5 统计方法

实验数据均采用SPSS10.0统计软件进行分析,癌与癌旁组织间采用配对资料t检验,不同组间表达的结果处理用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 胃癌组织及癌旁正常组织XIAP mRNA表达

胃癌组织XIAP的特异性条带为293bp,25例胃癌中XIAP mRNA的阳性表达率为88.0%(22/25)。癌旁组织中XIAP mRNA的阳性表达率为36.0%(9/25),二者差异有显著性(P=0.000)。

2.2 免疫组化结果

XIAP的阳性染色定位于胞浆(图1)。25例胃癌中:21例XIAP阳性表达(84.0%),25例癌旁组织中:6例XIAP阳性表达(24.0%),两者差异有显著性(P=0.000)。XIAP表达强度在不同病理分级间差异有显著性(P=0.002),即肿瘤分化越低,XIAP表达越高。而XIAP在不同临床分期间差异无显著性(P=0.116)。

3 讨论

胃癌发生的其中一个因素就是凋亡过程受到抑制。人类凋亡抑制基因家族共有8个成员:BIRC1-BIRC8,他们编码的蛋白构成凋亡抑制蛋白IAPs(inhibitor of apoptosis proteins)家族[1],X染色体连锁的凋亡抑制基因是凋亡抑制基因家族中重要的成员之一,其编码的蛋白XIAP通过选择性的抑制caspase-3,-7和-9,同时参与肿瘤细胞对化疗药物耐药性的产生。Li等[2]发现在卵巢癌中XIAP表达越高,对化疗的敏感性越差。Tamm等[3]对60个人类癌细胞系的研究表明XIAP在多数癌细胞系中表达,肿瘤细胞系中高水平的XIAP蛋白出乎意料地与一些抗癌药物的药物敏感性相关。本研究结果表明,XIAPmRNA在癌旁组织低表达,而在癌组织中高表达,提示XIAP等抗凋亡因子的异常表达导致凋亡失调,从而促进胃癌的生长和存活,与胃癌的发生和发展有密切的关系。Schimmer等[4]通过对XIAP功能的拮抗,使得肿瘤细胞凋亡增多,并且提高了肿瘤细胞的化疗敏感性。XIAP因子可能作为治疗胃癌的潜在治疗靶点,且与胃癌对化疗药物的敏感性有一定关系。Ramp等[5]发现XIAP表达越高肿瘤的恶性度越高。肿瘤的病理分级和临床分期是判断肿瘤愈后的一个重要指标。本研究显示,胃癌组织分化越低,恶性程度越高,XIAP表达阳性率及表达强度愈高;但XIAP与胃癌的临床分期之间,统计学显示差异无显著性。有研究表明,XIAP在肿瘤组织中表达升高,参与肿瘤新生血管的形成[6]。本实验表明分化差的胃癌生长及转移的速度更快,XIAP可以促进血管的生成,使肿瘤对缺氧有更强的适应力。

注:A:低分化胃腺癌组织中XIAP表达(+++),积分为9分;B:中分化胃腺癌组织中XIAP表达(++),积分为4分

参考文献

[1]Nachmias B,Ashhab Y,Ben-Yehuda D.The inhibitor of apoptosisproteins family(IAPs):an emerging therapeutic target in cancer[J].Semin Cancer Biol,2004,14(4):231-243.

[2]Li J,Feng Q,Kim JM,et al.Human ovarian cancer and cisplatinresistance:possible role of inhibitor of apoptosis proteins[J].Endocrinology,2001,142(1):370-380.

[3]Tamm I,Kornblau SM,Segall H,et al.Expression and prognosticsignificance of IAP-family genes in human cancers and myeloidleukemias[J].Clin Cancer Res,2000,6(5):1796-1803.

[4]SchimmerAD,Welsh K,Pinilla C,et al.Small-molecule antagonistsof apoptosis suppressor XIAP exhibit broad antitumor activity[J].Cancer Cell,2004,5(1):25-35.

[5]Ramp U,Krieg T,Caliskan E,et al.XIAP exp ression is an indep-endent prognostic marker in clear2cell renal carcinomas[J].HumPathol,2004,35(8):1022-1028.

表达抑制 篇7

灰姑娘与白马王子是爱情“白日梦”最重要的模式, 但本文讨论的重点是:韩剧并不是对这一模式的简单重复, 而是进行了变体, 使之具有陌生化的效果。如灰姑娘可以爱撒谎, 泼辣, 就“王子”而言, 虽然仍旧强势主动, 但同时温柔体贴、善解人意, 富有“女性气质”。这种男女性格的变奏说到底是为了满足女性作为观看的主要收视群体的诉求。随着大众传媒的飞速发展和西方对生活空间的无边渗透, 大众传媒在大众读者和大众意义上都发生了重大转移, 越来越私人化和女性化。当代传媒强调的是认同身份, 而不是权力, 故而其主流和卖点常常是“女性的”而非“男性的”, 如时装、消费、名流和各种中产阶级品位的生活方式及格调等[2]。下文就考察《我的女孩》中最重要的两个转折点:第一集中两人初次相遇和第十五集中两人于两年后再次相遇, 从男女主角的不同表现来分析此间男女主角气质、性格的变奏, 对于该剧作为一个女性化叙事文本的意义。

第一集中的初次相遇即“奠定”了两人的地位和角色气质。女主角珠裕邻是导游, 活泼开朗美丽, 但也是一个厚脸皮、“演技”一流的女人。为了让迟到的游客登上飞机, 她又开始大展演技, 骗机场服务人员, 谎称自己变心的男朋友在飞机上想与之见最后一面, 上飞机后与富家公子 (男一号) 薛功灿有了死缠烂打的邂逅。该场景中, 男主角是坐着的, 高高在上, 拥有优越感的男性, 看着趴在地上的女主角近乎神经质的“表演” (哭诉男友变心) , 眼里满是不耐烦和不屑。电视剧中通过细节的表现更是将男主角对女主角最初的厌恶刻画得生动细致。这一段情境告诉观众男主角是一个富有的、受过良好教育的成功人士, 女主角则是一个富有喜剧色彩的小丑式的为了生活“竭尽所能”的底层人物。

该剧中的男主角符合典型“白马王子”标准:富有、孝顺, 而女主角的性格较为复杂, 对于传统意义的“贤良淑德”来说, 她爱撒谎, 见钱眼开, 为了赚钱几乎不择手段, 但是使这个形象“高大”的是她勤劳、撒的小谎总是闹剧, 不会冲破道德法律底线, 更重要的是她始终对撒谎充满负罪感。女主角与父亲的深厚感情也是丰富这个人物的重要线索, 虽然父亲是一个好赌没有责任心的男人, 而这也是造成她生活颠沛流离的原因, 她的生活很无奈, 但是她坚强乐观。从第一集中两人同时出现的场景中的关系来看, 女主角始终处于弱势。后来被撞了同男主角“交涉、勒索”却因为不知道要索赔什么而被笑话, 之后男主角请女主角为其中国客人充当翻译, 男性一直扮演了一个“施与者”的角色与“上帝”形象, 女主角与男主角面对面交谈时只有谦卑, 说谎时的伶牙俐齿全然无踪。

当第十五集, 女主角消失了两年, 男主角终于找到她, 但是女主角因为和男主角的爷爷有契约 (即不再与男主角见面) 而避开男主角时, 男主角并没有选择用强硬的方式命令女主角回到自己身边, 而是用扔掉信用卡、扔掉手机的方式“赖”在女主角身边, 说:“我现在是乞丐一个, 珠裕邻你负责吧。”而此时的女主角已经在辛勤工作下买了自己的车 (具有了稳定的经济基础) , 男主角看到时也非常惊讶。于是我们在场景中看到女主角驾着自己的车载男主角去吃饭, 去看病 (相比之下, 之前一直是男主角开车的场景) , 而此过程中为了使男主角离开自己, 女主角不断使脸色, 甚至有鄙夷的目光, 不相信昔日富家公子能低三下四扮可怜求人同情。

至此, 男女主角在爱情中主动和被动的角色完全被调换, 女方取得主动, 但是笔者认为这种“主动”是有条件的。两年后, 看似女主角相对于男主角而言享有爱情主动权, 但其实女主角被男主角的爷爷所设置的道德困境深深捆绑住, 为了弥补两年前所撒下的谎, 她答应放弃与男主角的爱情在先。而这背后, 正是被掩盖的父权制的真正面孔。即在道德困境面前对女性主动“自我归罪”的要求。为了符合道德 (不能撒谎, 即使是有理由的, 被迫的) , 她放弃了女性自我 (对爱情的追求) 。和道德归罪不同, “自我归罪是个人的一种生存状态, 由社会的或意识形态的他人归罪来审判自己, 自己让自己变成有罪的人”[3]。女性主义者认为, 在父权制社会, 女人被迫接受她们自身卑贱低下的形象, 她们已经把这样一幅自身低贱的图像内化了, 因而甚至在阻碍前进的一些客观障碍已经消失之后, 她们也可能无法利用新的发展机遇。在剧中, 女主角撒谎成为男主角失散的“妹妹”虽是受男主角之托, 但她无论如何还是撒谎了, 虽然与男主角一家相处得无比愉快, 当真相被揭露, 她还是作为一个“骗子”被无条件驱逐, 并且带上深深的负罪感。有意思的是, 作为谎言的真正“制造者”的男主角却没有受到道德处罚, 这里, “道德”只看到了谎言的行使者———女主角, 却忽略了谎言的制作者, 不仅因为男主角享有话语上的优势, 更因为他是出于“孝心”而制造的谎言, 这个“道德”足以掩盖“不道德”。泰勒强调一种平等的“承认的政治”, 号召一种“本真性”的道德观念, 即依据自己的道德情感、遵循生命内在的声音, 做出自己的独立的决定[4], 但是在本剧中清楚地看到, 女主角的全部痛苦都来自于她不能释放内心的情感, 两年前是因为怕“乱伦禁忌”, 两年后是因为“道德归罪”。这样的女性从来都没有改变其真正的受压抑的地位。

费斯克重点分析了以肥皂剧为代表的女性受众审美, 认为肥皂剧文本的开放性和多义性, 女性的社会角色, 以及她们的去中心女性主体性是女性受众审美的特点所在。就韩国青春偶像剧《我的女孩》的分析结果来看, 笔者对以上观点有限的赞同。一方面, 通过分析剧中男女主角性格的变化可以看出电视剧制作者力图彰显女性主体地位的成分, 肯定女性欲望, 这是因为它需要迎合受众———现代年轻女性。言情剧一方面为人们提供了一条贯穿线把它的观众连接在一个集体的梦幻中, 一个对他们自己的文化经验理想化的幻景之中[5]。但是另一方面, 电视剧中的叙事及故事必然会折射出特定时代背景, 浸透主流意识形态, 它们不仅是主流意识形态的物化、形象化展现, 而且也在不知不觉中塑造着活动于社会之中的“大众”[6]。所以整个意识形态必定又是保守的。因此, 《我的女孩》文本展现的关于女性欲望的表达和抑制的悖论实则是女性意识、男权社会和商业资本的一场博弈。

参考文献

[1]韩卫娟, 2006, “韩流”何以席卷年轻女性——以偶像剧及言情剧为例从传播学角度分析, 中国电视, 06期

[2]陆扬, 王毅, 2000, 大众文化与传媒, 上海:三联书店

[3]刘小枫, 1999, 沉重的肉身——现代性伦理的叙事纬语, 上海:上海人民出版社

[4]查尔斯.泰勒, 2001, 自我的根源——现代认同的形成, 南京:译林出版社

[5]迈克尔.奥肖内西, 2001, “大众文化:大众电视与霸权”, 选自[英]安德鲁.古德温、加里.惠内尔编著, 《电视的真相》, 北京:中央编译出版社

表达抑制 篇8

1 材料与方法

1.1 研究对象与实验分组 实验于1999年6月至2001年2月在南方医科大学完成。取8个月龄新西兰兔24只,雄性,体重(2.5±0.2) kg。随机抽签法分为对照组、骨形态发生蛋白组(bone morphogentic protein,BMP)和诱导型一氧化氮合酶抑制剂S-甲基异硫脲(S-methylisothiourea,SMT)组,每组8只。动物由南方医科大学提供。

动物模型和标本处理:8月龄新西兰兔24只,随机分为对照组、BMP组和SMT各8只。在右侧股骨髁间关节面上作直径4.5 mm、深达髓腔的全层缺损。a)对照组:软骨缺损不充填任何物质;b)BMP组:缺损用BMP纤维蛋白凝胶复合物充填;c)SMT组:缺损应用胶原复合BMP充填,术后按5 mg·kg-1·12 h-1皮下注射SMT。术后1年各组处死动物,制作石蜡切片用于检测。

1.2 苦味酸-天狼猩红染色显示胶原分布:石蜡切片,0.1%的天狼猩红饱和苦味酸溶液(0.1 g天狼猩红溶于100 mL苦味酸溶液)染60 min,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,封片。偏振光显微镜下观察。

1.3 软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原图像分析 在40倍视野下,每张切片上选择10个纵向视野,以正常软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原色度为参照。利用Leica-Q500MC图像分析仪,在交互式操作方式下进行测试,获得关于胶原的体视学定量指标。将获得的体视学参数值按体视学原理和计算公式求得每例标本的形态学定量参数值,得到各型胶原含量。软骨厚度图像分析:利用Leica-Q500MC图像分析仪,100倍视野下测量修复组织表面Ⅱ型胶原显示的厚度来间接测量软骨厚度。

1.4 统计学分析 SPSS 8.0软件包完成统计处理,数值均以undefined表示,Paired-samples T test作均数的显著性检验。

2 结 果

2.1 偏振光显微镜下观察

在偏振光显微镜下,Ⅰ型胶原表现为较强的双折光,紧密排列,为黄色或红色的纤维。Ⅱ型胶原显示弱的双折光,呈现绿色混合颜色的疏松纤维。术后1年,对照组修复组织内基本未见绿色纤维,以致密粗大黄色纤维为主,与软骨下骨结构也有明显差别;术后1年,BMP组基本以黄色和红色纤维为主,中间夹杂很少量绿色弱折光纤维;术后1年,SMT组仍可见大量绿色弱折光纤维,但局部有异位骨化。

2.2 软骨修复组织Ⅰ/Ⅱ胶原分布图像分析结果

经图像分析,SMT组术后1年Ⅰ型胶原占65.9%,Ⅱ型胶原30.7%。分别与对照组Ⅰ型胶原(94.6%)、BMP组Ⅰ型胶原(88.5%),对照组Ⅱ型胶原(4.5%)、BMP组的Ⅱ型胶原(10.8%)相比,差异有显著性意义(P<0.05)(见表1)。

2.3 软骨厚度的测量

经图像分析,1年后SMT组软骨厚度(1.85±0.56) mm明显高于BMP组(0.67±0.31) mm及对照组(0.24±0.10) mm,其差异有显著性意义(P<0.05)(见表1)。

3 讨 论

NO作为体内重要的信号传导分子,已证实在骨关节炎发病和转归方面有重要作用。我们以前的研究也提示iNOS抑制剂SMT能提高软骨修复组织的质量[1,2],但由于技术的原因,均未能对软骨修复组织内胶原变化,特别是Ⅰ型和Ⅱ型胶原作定量分析,以阐明修复组织胶原的变化规律,从而提高修复组织质量。天狼猩红是阴离子强酸染料,易与胶原纤维中的碱性基团反应。胶原纤维在偏振光下有正的单轴双折光属性,与天狼猩红结合可增强双折射,提高分辨率[3]。Junqueira等[4]最早将苦味酸-天狼猩红染色法应用于组织切片的胶原检测,国内也曾用于纤维表达等方面的研究[5,6]。

既往研究虽然采用了多种方法促进软骨修复,许多报告均能在早期获得缺损区透明软骨的生成。但是这些修复组织无论是在生物学结构和形态方面,还是生物力学方面,均与正常软骨不同。而且这些修复软骨组织较差的功能及耐用性,随后导致退行性退变,被纤维组织代替[7,8]。Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的成分,可作为软骨的表型标记,决定了关节软骨特性,是评价软骨修复质量的标志之一。既往采用免疫组化技术不仅抗体来源不易,价格昂贵,操作费时,而且只能在不同切片上观察胶原的分布情况。而苦味酸-天狼猩红染色法可以在一张切片上同时显示出各种胶原的分布及其相互的关系,有利于观察软骨修复过程中各种胶原变化的规律。随着计算机分析技术的成熟,根据不同的颜色和灰度定量分析胶原分布成为可能。我们首次采用苦味酸-天狼猩红染色法并与病理体视学方法结合,检测软骨修复组织中Ⅰ型和Ⅱ型胶原的分布,以观察一氧化氮合酶抑制剂SMT对软骨表型维持的影响。但天狼猩红染色对于区分Ⅱ型和Ⅲ型胶原尚不理想,我们采用正常软骨的Ⅱ型胶原为基准来校正软骨修复组织中Ⅱ型胶原,以此区分Ⅲ型胶原。同时,软骨修复中Ⅲ型胶原的表达较少。图像分析结果显示,SMT组软骨修复组织在术后1年Ⅰ型胶原明显少于BMP组和对照组,Ⅱ型胶原多于BMP组和对照组。

本实验结果提示,SMT的应用对维持软骨修复组织的表型方面具有积极作用。但软骨的修复组织与正常软骨相比仍然有一定差距,尤其是异位骨化及接合处的退变。但苦味酸-天狼猩红染色法无疑是一种观察软骨修复组织中胶原类型、分布、含量及变化较理想的方法。

参考文献

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[2]孙炜,王吉兴,金大地,等.一氧化氮合酶抑制剂长期作用对兔关节软骨缺损修复的影响[J].中华医学杂志,2002,82(1):23-26.

[3]周明芳,程天民,冯正直.抑郁对大鼠创面愈合过程中胶原含量的影响[J].第三军医大学学报,2008,30(13):1293-1295.

[4]Junqueira LC,Cossermlli W,Brentani R.Differential staining of collagens of type,and by Sirius Red and polarization microscopy[J].Arch HistolJpn,1978,41(3):267-274.

[5]姬文婕,周欣,杨磊.天狼猩红-偏振光法观察染石英小鼠肺组织胶原纤维的动态变化[J].中华劳动卫生职业病杂志,2004,22(5):361-363.

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