和为s的连续正数序列

和为s的连续正数序列（精选2篇）

和为s的连续正数序列 篇1

求最大连续子序列乘积与最大连续子序列和问题有所不同，因为其中有正有负还有可能有0。

假设数组为a[]，直接利用动归来求解，考虑到可能存在负数的情况，我们用Max[i]来表示以a[i]结尾的最大连续子序列的乘积值，用Min[i]表示以a[i]结尾的最小的连续子序列的乘积值，那么状态转移方程为：

Max[i]=max{a[i], Max[i-1]*a[i], Min[i-1]*a[i]}; Min[i]=min{a[i], Max[i-1]*a[i], Min[i-1]*a[i]};初始状态为Max[0]=Min[0]=a[0]。代码如下：

int max_multiple(int *a,int n){ int *Min = new int[n]; int *Max = new int[n](); Min[0]= Max[0] = a[0]; int max = Max[0]; for(int i=1; i

如果不用数组，也可以采用临时变量保存上一次的最大值和最小值，代码如下：

int max_multiple_2(int *a,int n){ int minsofar, maxsofar, max; max = minsofar = maxsofar = a[0]; for(int i=1;i

补一个求三个数最大值的函数max3代码：

int max3(int a, int b, int c) {if (a>=b && a>=c) return a;return max3(b, c, a); }

和为s的连续正数序列 篇2

内蒙古地区猪流行性腹泻时有发生,但相关的流行病学调查、病原的分离鉴定及毒株的进化关系却少有报道。2015年4月份于内蒙古兴安盟地区采集了45份腹泻粪样,经RT-PCR检测确定15份为PEDV阳性。通过对阳性粪样的病毒分离成功分离到CH/NMG/XAM株,并对分离株的S基因进行克隆、测序、序列分析,以明确该毒株的遗传进化关系和序列变异程度,为该地区猪流行性腹泻的防治及疫苗株的筛选提供依据。

1 材料

1.1 临床病料

2015年4月份,于内蒙古兴安盟某猪场采集疑似猪流行性腹泻的粪样及肛门拭子45份。

1.2 主要试剂

RNAisoTMplus、DL-2 000 Marker、Premix TaqTM、Prime ScriptTMⅡ1st Strand c DNA Synthesis Kit,购自宝生物工程(大连)有限公司;TIANgel Midi Purification Kit、p GM-T Ligation Kit、TIANprep Mini Plasmid Kit,购自TIANGEN有限公司;琼脂糖、Golden ViewTM、Tris,购自Invitrogen公司;其他试剂均为分析纯。

1.3 引物的设计

参考CV777株(登录号为AF353511)的M基因序列,利用Primer Primer 5.0软件设计1对特异性引物,引物序列为M-F 5'-CTATTCCCGTTGATGAG-GTG-3',M-R 5'-GCTGAGTAGTCGCCGTGTT-3',用于鉴别诊断PEDV。参考KUIDL-PED-2014-002株的S基因序列(登录号为KJ588063)设计3对可覆盖整个S基因的特异性引物,引物序列:S1-F 5'-AATGGTAAGTTGCTAGTGCGT-3',S1-R5'-GGTTTAGGCGTGCCAGTAATC-3';S2-F 5'-CTTCCTTTGGTGGTCATAGT-3',S2-R 5'-ATT-GCTGGTTCCGCTGTAG-3';S3-F 5'-ATAGT-GCGTCTCTCATCGGT-3',S3-R 5'-GGGCAATA-AAGAACAATGAC-3',用于分段扩增PEDV S全基因序列。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 方法

2.1 样品的处理

向采集的腹泻粪样及肛门拭子中加入适量p H值为7.2的PBS缓冲液(双抗浓度为1 000 U/m L)制成1∶5悬液,置振荡器上充分振荡;反复冻融3次,4℃、3 500 r/min离心10 min;吸取上清液,4℃、12 000 r/min离心5 min;上清液用直径为0.22 nm的一次性滤器过滤除菌,收集滤液于-20℃保存,备用。

2.2 病毒的分离

将过滤除菌的病料上清液接种于生长良好的单层Vero细胞上,加入胰酶使其终浓度维持在6μg/m L,37℃吸附60 min,期间轻摇2次;弃上清液,加入含2%新生犊牛血清的DMEM培养液,置37℃、5%CO2恒温培养箱中连续培养,每天观察细胞病变(CPE)情况,待细胞出现稳定病变时收毒。

2.3 RNA提取及c DNA合成

吸取镜检有细胞病变的细胞毒1.5 m L,反复冻融3次,4℃12 000 r/min离心5 min;吸取上清液400μL,利用RNAisoTMplus提取上清液中的RNA;按照反转录试剂盒使用说明书反转录成c DNA,对反转录产物直接进行PCR扩增或-20℃保存,备用。

2.4 PEDV M、S基因序列的扩增

以c DNA为模板,M-F/M-R为鉴别引物进行M基因扩增,PCR反应体系(总体积为25.0μL):Premix Taq酶12.5μL,c DNA模板4.5μL,上、下游引物各1.0μL,补充dd H2O至25.0μL。

PCR反应条件:95℃5 min;94℃50 s,55℃50 s,72℃60 s,共35个循环;72℃10 min;4℃保存,备用。对M基因鉴定为阳性的c DNA模板进行S基因扩增,PCR反应体系(总体积为50.0μL):Premix Taq酶25.0μL,c DNA模板10.0μL,上、下游引物各2.0μL,补充dd H2O至50.0μL。PCR反应条件:95℃5 min;94℃1 min,50℃1 min,72℃3 min,共38个循环;72℃10 min;4℃保存,备用。扩增反应结束后取7.0μL扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.5 克隆及测序

对凝胶电泳检测为阳性的条带切胶回收,并与p GM-T载体于16℃过夜连接,将连接产物转移至TOP10感受态细胞中过夜培养。挑取单个白色菌落接种于LB培养基中,37℃、180 r/min振荡培养过夜,提取质粒。对重组质粒进行PCR鉴定,将阳性质粒送至生工生物工程上海(股份)有限公司测序。

2.6 序列分析

利用DNAstar软件中的Seq Man功能对S1、S2、S3 3个基因片段进行拼接;利用Meg Align功能对S基因核苷酸及其编码氨基酸序列同源性、位点突变进行分析;利用Protean功能对S蛋白的抗原位点及疏水性进行分析;应用MEGA 6.0软件的邻近法(neighbor-joining method,NJ)对分离毒株及参考毒株进行多序列比对,并构建系统遗传进化树,自举检验次数设为1 000。

3 结果与分析

3.1 PCR鉴定

结果见图1。

M.DL-2 000 Marker;1~3.细胞分离毒;4.阴性对照;5.阳性对照。

由图1可知,细胞分离株的M、S基因均于正确位置扩增出目的条带,且条带清晰,无其他非特异性杂带,表明细胞中确实存在PEDV,可用于S基因的克隆转化。

3.2 S基因核苷酸、氨基酸序列同源性分析

核苷酸及其编码氨基酸序列同源性的比对结果显示,CH/NMG/XAM株与内蒙古赤峰、巴彦淖尔、鄂尔多斯、呼伦贝尔、包头、呼和浩特等地区的分离株同源性较高,核苷酸序列及氨基酸序列的同源性分别为99.5%~99.8%和98.6%~99.9%,其中与呼伦贝尔株(CH/NMG/HLBE)的同源性最高,核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性为99.8%和99.9%。与Vaccine CV777-1994、CV777-1997、83P-5、Brl87、DR13、Chinju99-1999、SM98-1998、CH/S-2011、DX、JS-2004-02、LJB-03、LZC等疫苗株及经典毒株的核苷酸序列同源性为93.5%~96.1%,氨基酸序列同源性为92.5%~95.7%,其中与疫苗株Vaccine CV777-1994的核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分别为93.9%、93.0%。与近几年国内外流行毒株相比,CH/NMG/XAM株与北京LZW/FGE株、韩国KUIDL-PED-2014-001株、墨西哥MEX/124/2014株、加拿大ON/018/2014株、美国USA/Colorado/2013株和USA/Texas128/2014株的同源性较高,核苷酸序列同源性为99.2%、99.8%、99.7%、99.6%、99.7%、99.4%,氨基酸序列同源性为99.4%、99.9%、99.6%、99.5%、99.9%、99.2%。说明CH/NMG/XAM分离株与内蒙古其他盟市分离株及近几年国内外流行毒株的同源性较高,但与经典毒株及疫苗株相差较大。

3.3 S基因遗传进化分析

结果见图2。

由图2可知,进化树可分为G1、G2、G3三大分支,G1、G3又可分为两小分支。CH/NMG/XAM分离株与此前分离的CH/NMG/EEDS(鄂尔多斯)株、CH/NMG/HLBE(呼伦贝尔)株、CH/NMG/BT(包头)株、CH/NMG/CF(赤峰)株、CH/NMG/HHHT(呼和浩特)株、CH/NMG/BYNE(巴彦淖尔)株以及近几年国内外流行毒株(CH/HLJHH2011株、JS-HZ2012株、FJ/ZP-2014株、LZW/FGE株、VN-JFP10131-2013株、KUIDL-PED-2014-001株、MEX/124/2014株、ON/018/2014株、USA/Colorado/2013株和USA/Texas128/2014株)亲缘关系最为密切,同位于G3-2分支。而内蒙古地方株CH/NMG/XLGL(锡林郭勒)株和CH/NMG/WLCB(乌兰察布)株则与Vaccine CV777-1994、CV777-1997、83P-5、Brl 87、DR13、SM98-1998、CH/S-2011、LZC等经典毒株及疫苗株同位于G1-1分支。表明CH/NMG/XAM分离株与大部分内蒙古分离株及近几年国内外流行毒株的亲缘关系较近,而与经典毒株及疫苗株的亲缘关系较远。

3.4 S基因核苷酸及其编码氨基酸序列的变异情况

核苷酸序列比对结果表明,分离株CH/NMG/XAM与疫苗株Vaccine CV777-1994相比,既存在碱基位点的突变也存在碱基的插入和缺失。CH/NMG/XAM分离株共发生252处碱基位点的突变,突变率为6.08%。于164~165位(TTG)、180~181位(CAATTCAAC)、194~195位(G)、404~405位(ATA)、455~456位(ATA)发生碱基的插入,而于462~463位(TGGAAA)存在碱基的缺失。氨基酸序列比对结果显示,S蛋白共存在87处氨基酸位点的突变,其中S1区(1~735 aa)存在71个氨基酸突变位点,占突变位点总数的81.61%,仅S1区的N'端(1~370 aa)就存在60处氨基酸突变位点,占S1区突变位点的84.51%。此外,S1区的58~59位(QGVN)、136~137位(N)、151~152位(H)均存在氨基酸的插入,并于157~158位(NI)存在氨基酸位点的缺失。

3.5 S蛋白疏水性分析

与疫苗株Vaccine CV777-1994相比,CH/NMG/XAM株S蛋白的疏水性发生一定程度的改变,其中1~4位、26~29位、55~75位、125~163位、196~203位、351~357位、634~639位、893~895位、1 023~1 029位、1 174~1 179位、1 234~1 236位、1 259~1 265位等多个区域氨基酸疏水性变异明显,且主要集中于S1区。

3.6 S蛋白抗原位点分析

利用DNAMAN的Protein功能预测Vaccine CV777-1994株和CH/NMG/XAM株S蛋白的抗原位点,预测结果显示,Vaccine CV777-1994株存在58个潜在的抗原位点,而CH/NMG/XAM株存在56个潜在的抗原位点。与Vaccine CV777-1994株相比,CH/NMG/XAM株于60~65位、131~137位各缺失1个抗原位点,且抗原位点的改变主要集中在S1区。

4 讨论

PEDV-TGEV二联灭活疫苗及弱毒疫苗的使用,曾有效地降低了猪流行性腹泻的发病率和死亡率[5],然而自2006年起,猪流行性腹泻开始在我国免疫猪群中再度流行,特别是自2010年10月份起,猪流行性腹泻的流行更趋严重[6]。研究表明,目前流行毒株已发生明显变异,且不再表现出明显的季节性,这可能是导致当前猪流行性腹泻广泛流行的主要原因。

本试验利用Vero细胞对RT-PCR检测为阳性的粪样进行病毒分离,成功分离得到地方株CH/NMG/XAM,并对其S基因进行克隆、测序和序列分析。S基因遗传进化分析结果显示,CH/NMG/XAM株与此前内蒙古其他地区的分离株(CH/NMG/XLGL株、CH/NMG/WLCB株、CH/NMG/TL除外)、国内部分省市流行株(CH/HLJHH2011株、JS-HZ2012株、FJ/ZP-2014株、LZW/FGE株)、越南VN-JFP10131-2013株、韩国KUIDL-PED-2014-001株、墨西哥MEX/124/2014株、加拿大ON/018株、美国USA/Colorado/2013株和USA/Texas128/2014株位于同一分支上。推测CH/NMG/XAM株与赤峰、巴彦淖尔、鄂尔多斯、呼伦贝尔、包头、呼和浩特等地的分离株来自同一溯源,并与美洲近期流行的“亚美型”毒株高度同源,鉴于二者发病时间、流行特点、序列同源性极为相似,笔者推测二者之间或许存在某种关联。Y.K.Kim等[7]证实,在越南发现类似美国和中国的“亚美型”新毒株;C.N.Lin等[8]于中国台湾的部分猪场也发现了类似美国2013年广泛流行的毒株;此外,德国、日本、韩国、乌克兰等地的猪群均发现类似高致病性“亚美型”毒株的感染病例。由此共同证实,“亚美型”毒株正向全球范围迅速扩散,并在传播过程中发生不同程度的变异,其中内蒙古部分地区的流行毒株便有可能是这一新型毒株的变异。

注:●.内蒙古地方株;◆.兴安盟株;▲.疫苗株及经典毒株。

核苷酸序列比对结果表明,CH/NMG/XAM株变异明显,且主要集中于S1区的氨基端,这一比对结果与李一经等[9]对黑龙江和内蒙古10株猪流行性腹泻病毒流行毒株S1基因的序列分析结果一致。核苷酸序列的高突变率导致其所编码的氨基酸序列发生改变,进而影响其所编码蛋白的抗原性和疏水性。抗原性分析显示,CH/NMG/XAM株在60~65位和131~137位缺失两个抗原位点,这一改变与郑逢梅等[10]的预测结果相近。疏水性分析显示,其S1区氨基酸疏水性变化明显,这种改变是否会影响S蛋白的具体功能目前还尚未可知。但可以肯定的是,当前PEDV灭活疫苗及弱毒疫苗保护率的降低与流行毒株的不断变异存在必然联系。

参考文献

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