猪繁殖与呼吸综合症

2024-11-14

猪繁殖与呼吸综合症（精选10篇）

猪繁殖与呼吸综合症篇1

猪繁殖与呼吸综合征俗称猪蓝耳病, 是一种病毒性传染病。该病自1995年底和2006年夏、秋在我国暴发以来, 已成为我国养猪生产中主要的繁殖障碍疾病之一。该病是由猪繁殖与呼吸综合征 (俗称蓝耳病) 病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病。仔猪发病率可达100%, 死亡率可达50%以上, 母猪流产率可达30%以上, 育肥猪也可发病死亡。本病给猪场和养猪户造成了严重的经济损失, 严重影响了养猪业的发展。

1 传播途径

本病是由病毒所引起, 呈流行性传播。其传播途径主要有接触传播、空气传播、交配或人工授精传播。临床观察表明, 在自然条件下, 不同年龄、品种、性别的猪均可感染猪蓝耳病, 其它动物未见发病。

2 流行特点

猪繁殖与呼吸综合征在猪群中感染率高, 血清学阳性率地区差异明显 (10%～88%) 。该病毒的隐性感染和持续性感染是流行病学上的一个重要特征。被感染的大龄猪群, 如果营养状况、管理水平、卫生条件都比较好, 一般不会表现出临床症状。但是如果营养状况、管理水平、卫生条件都比较差, 再发生其他病原体的混合或继发感染, 猪群则可表现出一系列的呼吸道症状, 出现高死亡率, 并随时都可能出现母猪繁殖障碍。病毒在感染猪的血清、淋巴结、脾脏、肺脏等组织后, 可以存活很长时间, 并可向环境排毒。

该病能引起猪的免疫抑制, 造成猪瘟等病的免疫失败和致使许多本来致病力不强的病原也发生致病作用。蓝耳病病毒分美洲型和欧洲型两个血清型, 这两种类型的毒株之间存在着显著的抗原差异性, 只有很少的交叉反应。我国流行的毒株均属于美洲型, 存在变异性。

3 临床和病理特征

3.1 临床特征

发病猪精神萎靡, 食欲减退, 体温升高到40～42.5℃;部分猪耳后及边缘发绀, 四肢末端及腹部有呈紫红色斑块, 个别猪全身发红;流鼻液、打喷嚏、咳嗽, 眼分泌物增多, 猪群便秘, 粪便秘结呈球状, 尿黄混浊而少, 呼吸困难, 有的出现严重的腹式呼吸;部分猪脊背部有出血点或铁锈样充血;病程稍长的病猪全身苍白呈现贫血, 被毛粗乱;怀孕后期母猪流产或产死胎、弱仔。

3.2 病理特征

剖检可见脾脏边缘或表面出现梗死灶, 显微镜下见出血性梗死;肾脏呈土黄色, 表面可见针尖至小米粒大出血点斑, 皮下、扁桃体、心脏、膀胱、肝脏和肠道均可见出血点和出血斑。显微镜下见肾间质性炎。心脏、肝脏和膀胱出血性、渗出性炎症病变;部分病例可见胃肠道出血、溃疡、坏死。

4 防治措施

4.1 杜绝病原引入, 实行全进全出

饲养人员要固定, 谢绝一切场外人员与猪群接触, 不吃从市场购买的猪肉及其制品, 购进猪要坚持先隔养、后进场的原则。要绝对避免不同日龄、不同猪群混养, 彻底实行养猪生产各个阶段的全进全出制。

4.2 科学管理, 全面营养

制定规范的消毒计划, 定期消毒, 同时做好圈舍场地的清洁卫生、保温;加大猪舍通风量和采用凉水喷雾等降温措施, 做好防暑降温工作减少热应激, 提高猪群机体对各种病原微生物的抵抗力。饲喂全价配合饲料, 提高饲养的质量和猪群的采食量。

4.3 无害化处理猪粪尿

为消除其危害, 应定时清除粪尿及污染物并送至贮粪池, 经高温杀灭病毒、细菌和寄生虫及虫卵后再施肥上地, 不经发酵无害化处理不得随意使用, 以防止传播疾病。

4.4 加强免疫, 注重预防

该病重在预防, 当猪群大规模发病时, 治疗效果一般不理想, 应在疫病未发生之前在饲料或饮水中添加抗生素进行预防, 应在发病高峰期前加药预防, 当疫病发生时, 针对细菌和支原体进行抗菌药物治疗, 可减少损失。在饮水和饲料中同时投药, 结合注射对病猪进行治疗, 以减少细菌二次感染引起的死亡。目前猪场临床较敏感药物有支原净等, 猪场可根据本场情况采用联合用药的办法, 严格制定和执行本场的预防保健计划, 从母猪保健开始, 严格控制细菌、病毒、寄生虫等疾病。

4.4.1 商品猪

1日龄猪瘟弱毒疫苗超免, 20日龄猪瘟弱毒疫苗二免, 23～25日龄高致病性猪蓝耳病灭活疫苗, 55日龄进行猪伪狂犬基因缺失弱毒疫苗和口蹄疫灭活疫苗免疫, 猪瘟弱毒疫苗三免。

4.4.2 种母猪

口蹄疫灭活疫苗间隔4～6个月免疫1次, 初产母猪配种前完成猪瘟弱毒疫苗、高致病性猪蓝耳病灭活疫苗、猪细小病毒灭活疫苗和猪伪狂犬基因缺失弱毒疫苗的免疫。经产母猪配种前完成猪瘟弱毒疫苗和高致病性猪蓝耳病灭活疫苗的免疫, 母猪产前4～6周完成猪伪狂犬基因缺失弱毒疫苗和大肠杆菌双价基因工程苗的免疫, 后备母猪红黄痢应进行二次免疫。

猪繁殖与呼吸综合症篇2

摘要：猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。现已遍及世界各主要养猪国家和地区，成为危害养猪业最严重的传染病之一。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；病原学；致病机理病原学及症状

猪蓝耳病最早于1987年在美国的北卡罗来纳州首次暴发。1991年荷兰首先分离到PRRSV，并命名为Le1ystad病毒(LV)，1992年美国也分离到VR2332毒株。我国于1996年郭宝清等专家首次从国内发病猪群中分离出PRRSV,从而证实我国存在本病，并且分离和鉴定了猪繁殖与呼吸综合征病毒。目前该病在我国广泛存在，是我国流行的主要猪病之一，主要造成母猪繁殖

[1]障碍和大量仔猪死亡，给养猪业造成严重经济损失。

PRRSV为单股正链RNA病毒，国际病毒分类委员会(ICTV)第七次报告将其归于套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属。PRRSV的病毒粒子呈球形或卵圆形，直径约为45～65 nm，呈2O面体对称，囊膜表面有较小纤突，在蔗糖中的浮密度为1.14 g/mL，在氯化铯梯度中浮密度

3为1．19 g/cm。PRRSV对外界环境的抵抗力相对较弱，对脂溶剂、热、低于5或高于7的pH值敏感。研究表明PRRSV的Marc145细胞培养物能凝集禽类和哺乳动物的红细胞，而且病毒经低温-8O、乙醚处理后血凝价可提高4～8倍。

巨噬细胞是PRRSV的专嗜细胞。PRRSV也可在单核细胞、神经胶质细胞、猪睾丸细胞以及传代细胞(MA一104、MARC一145、CL2621、HS．2H)中增殖，但病毒对6～8周龄仔猪的PAM最为敏感。PRRSV在这些细胞中增殖可产生CPE，表现为细胞的圆缩，聚集脱落和迅速崩解。不同的毒株对各种细胞的敏感性不一样，欧洲型毒株对PAMs最为敏感，对传代细胞敏感性差，而美洲型毒株似乎可适应多种细胞，不同毒株在同一细胞系或不同毒株在相同的细胞系上的感染滴度也有差异PRRSV具有抗体依赖性增强作用(ADE)，但不同分离株对ADE的敏感性不尽相同。

国内外的研究表明，PRRSV抗原性差异较大，具有快速变异的特征，而且同型分离株之间的重组概率也较高。根据抗原性差异，可将PRRSV分为欧洲型和美洲型，前者主要流行于欧洲，后者主要流行于美洲和亚太地区，但近来在欧洲也分离到美洲型毒株，在北美分离到类欧洲型的美洲型毒株。我国目前的流行毒株仍属于美洲型。不同的PRRSV毒株对猪的致病力差异很大，而且PRRSV还可引起免疫抑制和持续性感染。

高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株引起的一种急性高致死性传染病。不同年龄、品种和性别的猪均能感染,但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。仔猪感染后症状最为明显，出现呼吸困难，肌肉震颤，后肢麻痹，共济失调，食欲不振，部分出现耳朵和躯体末端皮肤发绀，发病率可达100％，死亡率可达80％。公猪表现为咳嗽，精神沉郁，呼吸急促和运动障碍，精子质量下降，射精量减少；母猪则主要出现流产、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍，流产率可达30％以上。育肥猪发病率较低，但也可发病死亡，易继发感染多杀性巴氏杆菌（PM）、链球菌（SS）、猪副嗜血杆菌（HP）、放线杆菌（AS）、支原体（MHR）、圆环病毒（PCV－2）等，本病与其他疾病同时存在，是死亡率大幅上升的根本原因。病原结构及基因组

猪繁殖与呼吸综合征病毒为不分节段，聚腺苷酸化，有囊膜的单股正链RNA病毒，PRRS病毒粒子呈球形，直径为48～83 nm，核衣壳直径为25～30nm，外绕一脂质双层膜，含一个

[2]球形立体对称、具有电子致密性的二十面体核衣壳，表面有明显突起(Conzelmann等，1993 ；

[3]Meulenberg等,1994)。

[4]PRRSV基因组全长为15 kb左右，含有8个开放阅读框架(ORFs)(Benfield等，1992a)。

病毒基因组的每个读码框都和相邻的读码框有部分重叠。5’端有一段非编码区(non-coding region，NCR)序列，随后是复制酶基因ORFl(包括0RFla和ORFlb)和结构蛋白基因ORF2～7，[5]以及3’端非编码区序列和一个Poly(A)(Benfield等，1992b)。

病毒的复制是从复制酶基因ORFla、ORFlb的表达开始，然后PRRSV的RNA通过产生6个mRNA进行基因表达，其转录机制为先导一引物转录机制。转录过程中，先导序列连接到每个mRNA中，产生相同的长度超过200个碱基的5’端先导序列亚基因组smRNA，且3’末端也有相同序

[6]列(CCGG／AAATT)的嵌套式结构(Pastemak等，2004)。致病机理

PRRSV通过呼吸道或生殖道侵入猪体后，主要侵害肺泡及血液等组织的巨噬细胞。首先通过呼吸道与猪肺泡巨噬细胞(PAM)上的受体结合，再经胞吞作用进入PAM，并在PAM内迅速增殖(特别是尚未成熟的PAM最适合PRRSV繁殖)，使PAM破裂、溶解、崩溃，数量减少，存活的PAM也表现功能低下，使肺泡功能发牛障碍，进而仔猪表现典型的呼吸道症状。这种对未

[7]成年猪PAM的嗜好与发病严重常见于仔猪相一致(Mengeling等，1995)。感染猪的PAM显著

减少，其比例可由正常的90％降至50％甚至更少。在PAM中增殖的PRRSV还可转移到局部淋巴

[8]组织的巨噬细胞和单核细胞内进一步增殖(Bautisa等，1996)。有试验表明感染PRRSV后3～d内血液中的淋巴细胞及单核细胞也显著降低。由于巨噬细胞的大量破坏，使其对异物的非特异性吞噬清除功能大为降低，机体的非特异性免疫功能下降。同时因PRRSV的增殖导致PAM减少，PAM依赖于超氧负离子而发挥杀菌作用的功能也随之下降，易继发其它细菌或病毒感染，而使疾病的症状加重，如PRRS患猪可继发感染猪伪狂犬病、副猪嗜血杆菌病、猪链球

[9]菌病、猪圆环病毒2型等(Van Alistine等，1996)，这是PRRS常和其它疾病同时存在的根

本原因。

PRRSV随着PAM的大量崩解而进入血液循环及淋巴循环，在血液巨噬细胞和单核细胞内增殖，并分布到全身各组织器官的巨噬细胞内，导致病毒血症的出现及全身淋巴结的肿大和相应器官不同程度的损伤。猪在接种病毒后24h可出现病毒血症，平均持续约28d，最长可达56d。随着病毒在PAM、淋巴结等处的大量增殖，可在数小时至数天内造成肺、淋巴结的损伤和微循环障碍，主要表现为特征性间质性肺炎和淋巴结的肿大，支气管坏死和肺的广泛性出血，下颌淋巴结、肠淋巴结及扁桃体弥散出血及水肿，但较少出现耳部发绀的症状。PRRSV可感染公猪生殖系统，导致睾丸内精子数量减少，公猪表现繁殖性能降低，并通过精液将PRRSV

[10]传染给母猪，引起母猪的繁殖障碍(Sur等，1998)。

PRRSV在感染猪体内能诱发中和抗体的产生，但低滴度的中和抗体(亚中和水平抗体)不但不能有效清除血液中的病毒，反而与病毒形成病毒--抗体复合物，病毒借助抗体的Fc片段

[11]与Fc受体阳性细胞(如PAM等)结合，促进病毒进入细胞而建立感染(Yoon等，2001)，亦即

所谓的抗体依赖性增强作用(antibody-dependent enhancement，ADE)，进而导致持续性感染。在妊娠后期的胎儿已出现主动免疫应答，产生的抗体对经胎盘感染的PRRSV出现ADE效应，这可能是PRRSV感染以妊娠母猪在怀孕后期流产为特征的主要原因之一；另外，仔猪对PRRSV的易感性与亚中和水平母源抗体之间有关，说明PRRSV的致病机理与ADE有关(仇华吉等，1999)。PRRSV的ADE现象在体内和体外都已被证实，在PAM培养物中加入一定滴度的PRRSV抗体，可使PRRSV增殖滴度提高10～100倍；在病毒中加入一定的PRRSV抗体，再注射妊娠中期的胎儿，结果致病性显著高于单独注射PRRSV，同时在临床上常见到刚断奶仔猪呼吸道症状比育成猪严重得多，表明ADE对PRRSV的致病性有重要影响，也说明PRRSV抗体在不同水平时所起的作用完全不同，就象一把“双刃剑”，妨碍了PRRS的免疫防制和根除。

PRRSV另一个重要生物学特征是在猪体内存在持续感染(persistent infection)，即病毒在猪体内持续存在，但不表现临床症状，可持续数月甚至更长时间，导致长期的病毒血症。研究结果表明，PRRSV引起的病毒血症在猪群中可持续6～7周，甚至达16个月。持续感染与宿主因素、病毒因素等有关：①处于亚临床感染的猪常伴有病毒血症，这常被人们所忽视，尽管病毒血症持续时间长短不一，但亚临床感染的猪已成为PRRSV的主要携带者和重要的传染源，不仅有向外界排毒的可能，且在孕后感染胎儿，产下病毒血症的仔猪，感染健康猪，导致PRRSV在猪群中的循环传播，成为PRRSV持续性感染的重要原因；②在病毒方面，PRRSV嗜好在PAM、单核细胞等免疫相关细胞中增殖，导致免疫细胞的损伤，造成猪的免疫抑制(SUR)；③因PRRSV具有广泛的抗原变异性，特别是在病毒粒子表面具有诱导中和抗体功能的囊膜糖蛋白(GP5/E、GP4、GP3)抗原表位发生抗中和突变时，使之得以逃避免疫系统的识别和清除，造成长期的病毒血症和持续性感染，并诱发继发感染；④具有诱导中和抗体功能的囊膜糖蛋白(GP5/E、GP4)如过度糖基化，会影响中和抗体发挥中和病毒的作用。在持续性感染期间，PRRSV仍以较低的速度复制，病毒基因组5’非编码区、3’非编码区和核衣壳蛋白基因(0RF7)都保持高度的遗传稳定性，表明持续性感染的出现并不是多聚酶识别位点或转录起始位点突变的结果，而是糖蛋白基因(ORF2～5)和膜基质蛋白基因(ORF6)的突变与持续性感染有关。

PRRSV第3个重要的生物学特征是存在较强的基因突变，除病毒基质蛋白M基因和核衣壳蛋白N基因较保守外，其他基因的保守性较低。各分离株的毒力、抗原性差异较大，所引起的呼吸道症状、繁殖障碍的能力和病变的差异也较大。这种变异性使机体被动免疫和主动免疫对PRRSV的识别能力降低，从而PRRSV能逃避免疫系统的识别及中和抗体或细胞毒T细胞的杀伤作用。一般而言，欧洲分离到的毒株为欧洲型。美洲及其他地区分离到的毒株为美洲型。目前中国分离到的PRRSV毒株经鉴定均为美洲型，但推测欧洲型毒株在中国的出现只是时间问题。

由于PRRSV具有独特的ADE作用、持续性感染及较强的抗原基因变异性的生物学特性，加之社会因素(不良饲养管理、引种等)与自然因素(空气传播、鸟类带毒等)的影响，使得PRRS成为极难控制与净化的猪传染病之一。[12]结语

目前，随着分子生物学、分子免疫学等学科的发展，对PRRSV的研究正在不断深入。但很多尚未解决的问题仍然困扰着许多兽医工作者，特别是PRRSV的进化与来源、致病的分子机制、病毒在体内的复制与免疫学机制、病毒结构蛋白与功能的关系以及抗原变异的分子基础等，将是对PRRSV进行进一步研究的重点。

参考文献

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猪繁殖与呼吸综合症篇3

摘要：为了解猪繁殖与呼吸道综合征在新疆的流行现状，以及病毒毒株的分子生物学特征，对疑似该病病料进行地方毒株的分离，并对其进行鉴定。采集新疆乌鲁木齐市七道湾某猪场疑似PRRS病死的猪只肺脏及淋巴结等组织病料，将其处理后接种到Marc-145细胞上，并盲传3代；对分离株进行毒力测定（TCID50），应用RT-PCR方法对出现CPE的细胞培养物进行分子检测。结果显示，分离到的新疆病毒株可发生细胞病变，在Marc-145细胞上的TCID50为10-5·mL-1。RT-PCR检测结果用琼脂糖凝胶电泳鉴定基因序列，将测序结果与GenBank已发表的PRRSV毒株基因序列进行对比分析。研究证明所分离到的病毒为PRRSV，命名为XJ-Q。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；分离；鉴定

中图分类号：S852.651 文献标识码： A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.11.008

猪繁殖与呼吸道综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）俗称蓝耳病，是猪群发生以繁殖障碍和呼吸系统症状为特征的一种急性、高度传染的病毒性传染病。其临床特征是仔猪出现不同程度的呼吸道病症及待产母猪的繁殖障碍，如木乃伊胎、弱仔、死胎或流产，死亡率高[1]。该病于20世纪80年代末、90年代初在美国报道，而后迅速传遍世界各个养猪国家，在猪群密集、流动频繁的地区更易流行，常造成严重经济损失[2]，严重影响了养猪业的生产安全。1987年PRRS首先发现于美国，1991年，Wensvoort等首次利用猪肺泡巨噬细胞（PAM）从中分离出了PRRS病原（Lelystad）[2]。中国于1996年由郭宝清等[3-6]首次从流产胎儿中分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV），从而证实我国也存在猪繁殖与呼吸综合征，之后迅速蔓延至全国各地区[7-8]。为了解该病在新疆的流行现状，及PRRSV抗体依赖性和高变异性增强等特点，进一步丰富 PRRSV毒株基因组的信息数据，笔者对采自新疆乌鲁木齐七道湾地区的病料组织处理后经Marc-145细胞培养后得到的培养物进行毒力测定、RT-PCR鉴定及测序鉴定，得到新疆地方毒株，为进一步了解该病的流行现状及其生物学特性提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集在新疆乌鲁木齐市某养猪场无菌采集疑似猪蓝耳病死猪的肺脏、淋巴结等组织病料，-70 ℃保存备用。

1.1.2 细胞及血清 Marc-145细胞系，由畜牧科学院兽医研究所传染病实验室提供；胎牛血清（FBS）为生工生物产品。

1.1.3 主要试剂及试剂盒胰蛋白酶和青链霉素实验室保存，DMEM培养基、Trizol试剂为生工生物产品；TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）、DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 病料处理青链霉素清洗病料数次，剪碎、研磨，加入适量的DMEM培养液将其稀释至1∶3，反复冻融3次，分装至1.5 mL无菌离心管中，3 000 r·min-1离心10 min后留上清液，0.22 μm过滤膜除菌，保留滤液为待分离病毒液，保存在-70 ℃备用。

1.2.2 细胞培养复苏Marc-145细胞：从液氮罐中取出细胞冻存管，瞬时放于37 ℃水浴恒温锅内，同时用镊子轻轻摇晃冻存管2 min将管内物质完全融化后，在生物安全柜内用移液器取出Marc-145细胞移入离心管中，加入无FBS DMEM至4.5 mL，1 000 r·min-1离心5 min。倒掉上清液，补加细胞生长液至7 mL，用吸管慢慢吹打混匀，移入培养瓶中，在倒置显微镜下观察细胞是否吹打散开，放入37 ℃的CO2培养箱中，左右摇晃，拧上培养瓶瓶盖（不可拧紧，稍有空隙，保证CO2能进入瓶内）。隔夜后，弃去旧培养液，用无FBS DMEM培养液洗1次瓶内细胞，再加入7 mL生长液（含10%胎牛血清FBS），酒精棉球擦拭瓶盖及培养瓶上半身，放入培养箱内，如此传至第3代进行病毒分离。

1.2.3 病毒分离将1.2.1处理后的病料上清液经0.22 μm过滤除菌，取1 mL过滤菌液接种于单层的Marc-145细胞，37 ℃温箱中吸附60～90 min，期间每30 min摇晃1次，使病毒液均匀接触细胞层，而后加入维持液（含2%胎牛血清）至7 mL，放于5% CO2 37 ℃培养箱培养3～5 d。盲传3代，观察细胞病变（CPE）。

1.2.4 病毒的电镜观察取致细胞病变的细胞培养物，反复冻融3次，1 000 r·min-1离心15 min，浓缩后加0.8%甲醛灭活，2%磷钨酸负染，透射电镜观察。

1.2.5 病毒TCID50滴定将长成单层的Marc-145细胞消化后移入96孔培养板内，每孔细胞单层生长大约80%密度，用于接种病毒，步骤如下。

待测病毒液稀释：将病毒液置于灭菌后的EP管中，采用维持液培养基进行10倍递增稀释，取10-3～10-7稀释度，每个稀释度5个孔，每孔加入病毒液100 μL，同时设置2列对照孔（用维持液代替病毒液）。置于37 ℃ 5% CO2培养箱中吸附1 h，之后弃去病毒液，用无血清的DMEM洗涤后，加入100 μL维持液培养48 h后逐日观察，直至第5天记录出现CPE的孔数，计算CPE比率。

按Reed-Muench两式法计算TCID50。

1.2.6 病毒RNA的提取及RT-PCR 病毒RNA的提取：取750 μL病毒液，按照生工生物公司Trizol剂盒的操作步骤提取病毒总RNA。

RT-PCR反应。按照TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）试剂盒，利用自行设计的特异性引物，在PCR反应管中加以下溶液及试剂：RNA模板0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·（LdNTPs 2.5 μL）-1，引物（上、下游引物）1 μL，MgCl2 5 μL，RNase Inhibitor（4 μ·μL-1） 0.5 μL，AMVRTase 0.5 μL，AMV-Optimized Tap 0.5 μL，用无RNA酶水补足25 μL。PCR反应条件：预变性温度50 ℃，时间30 min；预变性94 ℃，时间2 min；变性温度94 ℃，时间30 s；退火温度56 ℃，时间30 s；延伸温度72 ℃，时间1 min，循环次数30；延伸温度72 ℃，时间10 min。

电泳：取PCR扩增产物5 μL用0.8%琼脂糖凝胶（含0.5 μg·mL-1EB）电泳，100 V电压40 min进行电泳检测。

2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

2.2 病毒的电镜观察

2.3 PRRSV分离株TCID50测定结果

统计接种病毒的96孔细胞培养板，在5 d后出现CPE的情况，并用Reed-Muench法计算距离比得出TCID50结果为10-5·（100μL-1），即PRRSV分离株在Marc-145细胞上的增殖毒价为TCID50105·mL-1。

2.4 RT-PCR鉴定结果

琼脂糖凝胶电泳结果表明，利用RT-PCR方法扩增出大小与预计结果一致的片段434 bp（图3）。将测得的序列与Gen Bank 数据库中已知序列进行比对及相似性分析，结果表明，此分离病毒为PRRSV。

3 结论与讨论

细胞分离、鉴定时PRRSV是最常用、也是最准确的诊断方法之一。PRRSV分离主要使用低成本的传代细胞如Marc-145细胞、猪肺泡巨噬细胞PAM[2]、CL2621细胞[9]。根据PRRSV分离株不同细胞嗜性也不同[10-11]。PRRSV更偏爱在PAM上复制，且亲嗜性最高，但是PAM制备技术难度较大，CL2621细胞是专利细胞。目前对PRRSV既敏感又方便的细胞为Marc-145和从Marc-145中克隆出的HS2H细胞。有实验证明，PRRSV新疆分离株适宜在Marc-145细胞上生长[12]，并从中分离到病毒，故本研究采用Marc-145细胞进行PRRSV的分离培养，同时也证实了新疆地区分离株在Marc-145细胞上培养有很好的增殖并能产生典型的CPE。

对PRRSV的检测方法很多，包括血清中和试验（SN）、核酸探针杂交技术、间接免疫荧光抗体试验（IFA）、过氧化酶单层试验（IPMA）、胶体金抗体检测技术（GIA）、乳胶凝集试验（LAT）、RT-PCR及重组蛋白分子诊断技术[13-14]等。实验室检测方法有：病毒的分离（VI），间接免疫荧光（IFA），血清中和试验（SVN），ELISA，RT-PCR等。猪繁殖与呼吸综合征的检测方法众多，各有优点，其中病毒的分离、免疫荧光抗体染色法和免疫过氧化物酶染色法等均需细胞培养才行，因工作量大、周期长，故不利于在基层推广应用。而过氧化物酶单层试验需要大量猪肺泡巨噬细胞，同间接免疫荧光试验一样，在检测时会因为操作活毒而产生实验室安全隐患，并且过氧化物酶单层试验与间接免疫荧光试验不适合大范围检测，RT-PCR方法则相对快速、简便、特异性强。ELISA和IFA在众多检测PRRSV的方法中，步骤较为繁琐，不适合快速诊断，而RT-PCR可快速鉴别诊断PRRSV，故本试验采用RT-PCR方法进行分离病毒的检测。

本研究分离国内新疆毒株，选用Marc-145细胞进行分离培养，连续传代，盲传3代即产生明显的细胞病变。根据分离病毒毒株致Marc-145的CPE、毒价滴定、RT-PCR反应以及与GenBank上登陆的基因序列对比，证实所分离的病毒为PRRSV，与有关文献报道一致[15]，成功地从组织病料中分离得到猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），将其命名为PRRSV新疆株（XJ-Q）。细胞出现CPE后取其感染物，从中提取RNA并通过PCR法鉴定，结果与预期相符，从而实现了对所获得分离培养物进行快速、确切的鉴定。成功分离获得的新疆分离株将为新疆PRRSV基因遗传变异分析的研究奠定基础。

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