产甲烷菌（共7篇）
产甲烷菌 篇1
0 引言
沼气发酵是一个微生物协同作用的过程，由多种产甲烷细菌与非产甲烷细菌相互作用、相互制约共同完成。产甲烷菌是沼气发酵微生态系统中食物链末端的一群成员。在厌氧条件下，产甲烷细菌利用非产甲烷细菌的中间产物和最终代谢产物作为营养物质和能源而生长繁殖，最终产生大量甲烷和二氧化碳等[1]。
所有的产甲烷菌都是专性严格厌氧菌，对氧非常敏感，遇氧后会立即受到抑制，不能生长繁殖，有的还会死亡[2]。长期以来，人们对产甲烷菌的分离、培养、分类、生理代谢、细菌结构和基因排列等方面做了大量的研究，并取得了一定的研究成果[3,4,5,6,7,8]。在沼气发酵过程中产甲烷菌的种类、数量和活性决定了沼气的产量[9,10,11]。由于产甲烷菌生境的特殊性，目前在实验室能纯培养出的产甲烷菌种类是有限的，另外沼气池内菌群结构复杂、微生态环境的不可控性等都制约着沼气工程的规模化发展。近年来产甲烷菌的人工培养及沼气池的菌群结构、代谢调控逐渐成为研究热点[12,13,14,15,16,17,18,19]。
本文报道了一种产甲烷优势菌群的筛选方法，用该方法筛选到4个产能持续稳定产甲烷的优势菌群，为产甲烷菌群的人工培养提供了一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
1号污泥样品取自重庆啤酒厂厌氧消化池，2号污泥样品取自重庆污水处理厂，3号、4号污泥取自重庆光大集团不同污水处理池，5号污泥样品取自重庆理工大学家属区化粪池。
1.1.2 培养基
乙酸钠培养基含微量元素、维生素混合液基详见参考文献[20]，所加维生素液中盐酸吡哆醇用盐酸硫胺代替，维生素B12用片剂，浓度不变。
1.1.3 仪器
SD-3000B气相色谱仪;SKP-02B恒温培养箱;XFS-280高压灭菌锅。
1.2 方法
1.2.1 气体分析检测方法
沼气中气体浓度用气相色谱仪检测，主要技术参数为:色谱柱填料为苯乙烯高分子多孔小球，柱长2m，载气为N2，流速为25mL/min,TCD检测器，电流为80mA，柱箱温度为50℃，汽化室80℃，检测室温度分别为120℃，柱前压力0.13Mpa，进样量为0.5mL。
1.2.2 培养基的除氧
将灭菌培养基20mL加入到100mL的无菌三角瓶中，用可调电炉加热至沸腾后通入氮气3～5min以去除培养基中的溶解氧，(以培养基中刃天青的颜色变化判断，无氧时刃天青无色)，之后按2%(V/V)的比例迅速加入称量好的固体Na2S，用4层透明胶带密封瓶口。
1.2.3 产甲烷菌群的驯化筛选
在除氧培养基中用注射器注入1号、2号污泥样品20mL密封，于恒温培养箱中37℃静止培养，开始第一轮驯化。定时检测产甲烷量的变化。每轮驯化每个样品均设3个重复。
当样品产甲烷量持续上升或急剧下降时，用注射器从第一轮的驯化液中吸取15mL注入25mL除氧乙酸钠培养基，同条件进行第二轮驯化。
按同样的方法，第三轮驯化在三角瓶中注入40mL无菌培养基和10mL经第二轮驯化的培养液。逐渐加大驯化液中培养基和培养液的比率，直至用人工培养基对产甲烷菌群能成功培养传代，并能保证持续稳定的产甲烷量为驯化成功。
1.2.4 产甲烷菌群的筛选方法的验证
用1.2.3的方法对3号、4号、5号样品进行驯化。
2 结果与分析
2.1 第一轮驯化结果
图1为1号和2号污泥样品第一轮富集驯化过程中沼气甲烷含量随时间的变化。从图中可以看出1号污泥样品在发酵的1～6d内甲烷产量呈逐渐上升的趋势，第6d后由于体系进入少量氧气，甲烷产量下降。在相同的发酵时间内2号污泥样品产生的气体中甲烷含量则一直呈上升趋势。
比较发现在相同的发酵时间内2号污泥样品的甲烷产量较1号的高很多，2号样品驯化体系中氧气含量比1号低。在驯化前6d 2个样品中氧气含量逐渐下降，2号样品中几乎检测不到氧气谱峰。第8d检测时1号污泥样品中氧气含量上升，产甲烷量迅速降低，表明体系中即使少量的氧气进入对产甲烷菌的代谢活动用明显的影响。因此在驯化和测样过程中要将整个体系密封好，严格控制氧气。
由于2号样品产甲烷量稳定，1号样品产甲烷量降低，这时更换新鲜培养基进入第二轮驯化。
2.2 第二轮的驯化结果
在第二轮的驯化中，1号和2号两个样品的CH4产量相比第一轮的驯化，产甲烷高峰出现得更快，而且持续时间也相对较长;1号样品在前5d中的CH4产量明显比2号样品要高，到第5d 1号和2号样品甲烷产量分别达到63 m L和54mL，均超过系统气体总量的50%。但是2号样品CH4产量相对1号样品持续稳定。结果表明驯化过程增强了菌种产甲烷的能力。
2.3 第三轮的驯化结果
第三轮驯化过程中，1号和2号样品菌群迅速适应环境，环境中更早呈现无氧环境，利于产甲烷菌群的生长，CH4产量持续增高。结果表明:经过三轮驯化，1号和2号样品可以完全在人工培养基中生长，产甲烷量持续稳定，驯化获得成功。
2.4 产甲烷菌群的筛选方法的验证
采用2.3所述的方法，对3、4、5号污泥样品进行驯化。驯化液包括培养基20mL，污泥样品20mL。
2.4.1 第一轮驯化结果
由图4可知，3号和5号样品产甲烷较多且产量逐步上升，最高分到45 m L和36 m L,4号样品产量很少，且呈产量逐步降低的趋势。
2.4.2 第二轮驯化结果
在第一轮驯化的基础上，更换新鲜培养基对3、4、5号样品进行第二轮驯化，第二轮驯化液为40mL培养基和10mL驯化后菌液的混合液。
从图5可以看出，3号和5号样品产甲烷量直线上升，在培养至第7d甲烷产量分别为52mL和38mL,4号样品甲烷产量很小，随时间变化不大。
经过这两轮驯化，3号和5号样品中的菌群能在人工培养基中迅速生长，产甲烷量持续上升，驯化成功。4号样品中菌群产甲烷量很低，在驯化过程中被淘汰。
3 讨论
本试验建立了一套驯化筛选产甲烷优势菌群的方法，筛选到4个产甲烷较高且持续稳定的优势菌群，即用乙酸钠培养基对1号、2号、3号、5号污泥样品驯化后的1号、2号、3号、5号菌群。
建立产甲烷菌群的筛选驯化方法突破了以往对甲烷菌单菌的研究模式，以相对粗放的环境条件筛选产的甲烷优势菌群，既能保证产气量，增强了环境条件的可控性，通过菌群中的微生物相互协调为产甲烷菌提供了难以人工实现的厌氧条件。实验中驯化后期，配制培养基时已经不需要充氮气置换空气，表明筛选到的产甲烷优势菌群适应了氧化还原电位相对高的环境。
近年来，国内外对产甲烷菌群的研究也有少量报道，但有些是用成分不可控的天然原料为培养基[14]，对后期菌种的传代不利;有些产甲烷菌群的生长周期很长[17]。作者课题组筛选到4个产甲烷优势菌群在培养6～7d后均能持续稳定地产甲烷，比自然环境中产甲烷菌较快地进入产甲烷阶段，对实现产甲烷菌的人工规模培养有重要意义。
菌群中微生物的组成结构对产甲烷菌的产气量影响很大，后期将对菌群的组成结构及产甲烷条件优化做进一步研究。
产甲烷菌 篇2
一个Ⅱ型甲烷氧化菌中甲烷单加氧酶羟基化酶的分离纯化和理化性质
甲烷氧化细菌能够催化甲烷和一系列小分子烃类化合物的羟基化反应,对控制全球变暖起着重要作用,在工业催化和生物除污中具有非凡的潜能.应用层析方法纯化了Ⅱ型甲烷氧化细菌Methylosinus trichosporium IMV 3011中甲烷单加氧酶的羟基化酶,并对其进行了表征.凝胶过滤法测定了该酶分子量为201.3kD;SDS-PAGE表明羟基化酶含有三个亚基(αβγ),分子量分别为58kD、36kD和23kD,比较两种方法证明该羟基化酶是一个同型二聚体构型(αβγ)2,总分子量为234kD.薄层等电聚焦测定该酶的等电点为5.2.酶的比活力为603.6nmol/(min・mg),活力回收为34.3%.HPLC法测定该酶的纯度在95%以上.原子吸收光谱显示每分子羟基化酶中含有3.02个Fe原子.羟基化酶的稳定性pH值为6.2～7.5,稳定性温度为低于35℃.菌株IMV 3011的`细胞表观构型呈现了长型、稍微弯曲的杆状形态.
作 者：华绍烽 李树本 辛嘉英 牛建中 夏春谷 唐威 胡宵雪 HUA Shao-Feng LI Shu-Ben XIN Jia-Ying NIU Jian-Zhong XIA Chun-Gu TANG Wei HU Xiao-Xue 作者单位：中国科学院兰州化学物理研究所/羰基合成与选择氧化国家重点实验室,兰州,730000 刊 名：生物工程学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 22(6) 分类号：Q814.1 关键词：甲烷氧化细菌 甲烷单加氧酶 羟基化酶 纯化 理化性质产甲烷菌 篇3
1产甲烷古菌研究中主要应用的几种分子生物学研究方法
基于16S r DNA分子生物学技术的不断发展,如限制性片段长度多态性分析( RFLP) 、末端限制性片段长度多态性分析( T - RFLP) 、荧光原位杂交技术( FISH) 、分子克隆技术等被逐步引入到环境微生物学研究中,可以有效克服传统方法中的许多缺点,大大提高分析检测的速度及结果的准确性和全面性。目前,对自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌的群落组成和结构的分析,采用较多的分子手段是T -RFLP和变性梯度凝胶电泳( DGGE) 技术。应用此类技术进行微生物生态研究( 主要是土壤、厌氧消化器、污水处理系统等) 的报道较多,但应用此类技术对沼气发酵微生物的细菌类群、数量、活性等进行的研究不多,特别是对农村沼气池产甲烷古菌类群的分子生态学研究报道很少。
1. 1 RFLP
RFLP首先根据比较基因组学的研究结果选取一段具有系统进化标记特征的DNA序列作为目的分析序列,用通用引物将其扩增,然后对扩增产物进行限制性内切酶消化,再对消化后的样品进行琼脂糖凝胶或聚丙烯酰氨凝胶电泳,用溴化乙锭或硝酸银染色,对于不同微生物种群,其酶切片段的数量或大小不同,于是电泳图谱呈现多态性。
1. 2 T - RFLP
T - RFLP在技术上与RFLP相似,只是其中的一个引物的5'端用荧光物质标记。对PCR产物进行特异性酶切后就产生了许多不同长度的限制性片段,其中带有荧光标记的目标片段就可以被DNA自动测序仪检测到。目前,T - RLFP技术是微生物分子生态学研究中最有力的研究手段之一,主要应用于微生物群落组成、结构及微生物系统发育等研究。
1. 3 16S r DNA
16S r DNA存在于所有的原核生物中,由于其遗传的高度保守性,现已成为细菌分类鉴定的标准分子生物学方法,同时也是研究微生物分子生态学的重要技术手段。16S r DNA序列分析的非培养技术为揭示自然界中微生物种类和遗传多样性开辟了一条全新的途径。
1. 4 DNA指纹技术的DGGE
DGGE技术能有效分析复杂微生物群落结构及其多样性,且无需培养微生物。DGGE技术已成为研究微生物多样性的强有力工具,且越来越受到重视。研究表明,PCR - DGGE技术可以使碱基序列稍有区别的PCR扩增产物( 实际上是混合物) 在变性剂( 去离子甲酰胺和尿素) 浓度逐步提高的聚丙烯酰胺凝胶中具有不同的迁移位点,从而实现不同序列的分离,若在PCR引物的5'末端( 或模板的另一端) 连接上一段长度为30 ~ 50( 通常为40) 个碱基富含GC的核苷酸序列- GC夹( GC - clamp) ,那么在扩增双链的一端就可以形成一个人工高温解链区。于是,片段的其他部分因处在低温解链区而可以对其进行分析,这样甚至可以分辨仅相差一个碱基同等长度的核酸序列。DGGE已被广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能提供群落中优势种类信息和同时分析多个样品,具有灵敏度高、速度快,结果全面、客观,可以同时对微生物或多个样品进行检测,以及可以和多种分析方法进行结合应用,并对样品结构进行跟踪。
1. 5 其他分子生物学技术
除以上技术,荧光原位杂交( FISH) 、克隆文库、实时荧光定量PCR ( real - time quantitative PCR) 、16S rRNA等技术都已被广泛应用于低温环境中产甲烷古菌的研究。O. Stabnikova等[1]以特异的16S rRNA寡核苷酸为探针,应用FISH技术对厌氧环境中的产甲烷古菌进行定量分析。裴彩霞等[2]采用产甲烷菌特异性引物Met86F/Met1340R研究了山羊瘤胃产甲烷古菌16S rRNA基因的多样性,结果表明,所有克隆经限制性内切酶酶切后共获得16 个OTU,绝大多数为甲烷短杆菌。邓丽娟等[3]利用古菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,分别构建新疆两典型微咸水湖赛里木湖和柴窝堡湖水的古菌16S rRNA基因克隆文库,结果表明,两典型微咸水湖泊中古菌类群多样性较低,且群落组成差异大。丁建南等[4]采用实时荧光定量PCR技术,对选育的低温沼气功能菌群中的产甲烷菌种群结构和数量进行了研究。
2 国外利用现代分子生物学技术对低温产甲烷古菌研究中的应用
P. Merila等[5]以mcr A作为标记基因,利用T -RFLP技术分析了芬兰5 个泥炭地中产甲烷菌的多样性,结果检测到甲烷八叠球菌目( Methanosarcinaceae) 。M. Keyser等[6]应用DGGE技术测定了存在于3 种不同UASB生物反应器污泥颗粒中的产甲烷古菌的指纹图谱,同时进行了产甲烷古菌的鉴定,并由得到的数据建立了一个能快速鉴定UASB颗粒微生物中的古菌群的DGGE标记物。M. Lanthier等[7]以PCR - DGGE技术分析了目标细菌和产甲烷古菌等生物膜上的持留情况,并以FISH技术对生物膜上的细菌和产甲烷古菌进行特异性分析,得知生物膜上的微生物室以细菌为主( 占70% ) ,产甲烷古菌最少( 占10% ) 。J. Kim等[8]利用DGGE技术对微生物群落的结构和动态进行了分析,并根据回收结果与GenBank对比,得出在一定条件下,增加的产甲烷速率周期可能是由于产甲烷菌的丰度增加,并检测出优势菌为产甲烷菌群,为甲酸甲烷杆菌和甲烷杆菌属,具有100% 的序列相似性。D. Zhao等[9]利用实时荧光定量PCR和克隆技术对一个富营养湖泊沉积物的垂直分布的氨氧化的古菌和细菌进行研究,结果表明,在这个湖泊中,其古菌和细菌的丰度随着湖泊深度的增加而增加,且种类变化不大。E. Catao等[10]从两个不同植被类型的土壤中扩增古细菌特异性16S rRNA基因,结果表明,在所有塞拉多的土壤样品中,所有片段的测序是Archaeainto,且不同区域的菌群结构不同。C. Zhu等[11]对中温条件下,以猪粪便为底物的模拟发酵罐进行亚基A基因的PCR扩展和克隆测序,克隆库包括123 个克隆测序,分析结果显示,在检测到甲烷的沼气中,57. 7% 的克隆隶属于甲烷杆菌目( Methanobacteriales) ,34. 2% 为甲烷微菌目( Methanomicrobiales) ,2. 4% 为甲烷八叠球菌目( Methanosarcinales) ,约5. 7% 的克隆属于非保密广古菌门。
3 国内利用现代分子生物学技术对低温产甲烷古菌研究中的应用
蒋建林等[12]采用PCR - RFLP方法分析了沼气池厌氧活性污泥微生物群落的结构和多样性,并酶切分析得出大多数克隆体的16S r DNA序列与Gen Bank数据库中未培养细菌的相似性极高。佘晨兴等[13]采用PCR - RFLP技术及测序分析对闽江河口互花米草沼泽湿地产甲烷古菌的多样性及垂向分布进行了研究,系统发育分析结果表明,该地区湿地产甲烷古菌的多样性划分为Methanobacteriales、Methanomirobiales和Methanosarcinales。林青等[14]利用T - RLFP技术研究了塌陷区次生植物对土壤古菌群落的影响,结果表明,群落间多样性差异大,相似性低。丁建南等[4]运用16S r DNA PCR和实时荧光q PCR技术,对选育的低温沼气功能菌群中的产甲烷菌种群结构和数量进行了研究,结果表明,低温沼气功能菌群的产甲烷菌多样性远离于常温沼气功能菌群。H. H. Lang等[15]利用分子生物学方法构建16S DNA基因文库,研究了鸡粪沼气池发酵液中产甲烷菌的菌群结构,结果发现,产甲烷菌属( Methanogenium ) 占总数的92% 。何志刚等[16]扩增和克隆宏基因组DNA中古菌16S r DNA长约1. 2 kb的片段,构建牛粪沼液的16S r DNA基因文库在60 个克隆中18 个属于甲烷八叠球菌属( Methanosarcina) ,与其中Methanosarcina AK - 16 菌株的同源性最高,相似性为99% ; 并首次分析了低温( 4 ℃) 条件下以牛粪为主要发酵原料的沼气池产气高峰期的优势产甲烷菌群,结果发现,产甲烷菌微生物群落具有很高的多样性。孔维涛等[17]通过对16S r DNA克隆及测序分析得出,试验沼泥样品中主要优势菌属为甲烷八叠球菌属、甲烷鬃毛菌属和甲烷粒菌属,利用DGGE技术推测甲烷八叠球菌属与低温产沼气有密切相关性。陈金全等[18]对珠江口沉积物甲烷相关古菌16S r DNA文库进行构建分析,结果发现,甲烷相关古菌群落结构主要可以分为3 类,分别为甲烷鬃毛菌属( Methanosaeta ) 、Methanomicrobiales和ethanosacinales / ANME。王彦伟等[19]利用DGGE技术对不同地区低温沼气池中沼泥进行发酵前期、后期产甲烷古菌群落变化的研究,对部分优势条带切胶、测序,结果显示,在沼气发酵过程中产甲烷粒菌属( Methanocorpusculum) 、Methanosarcina、Methanosaeta占优势。宋金龙等[20]对从北京周边地区户用沼气池中采集的沼泥进行了富集培养及基因组DNA的提取,采用DGGE技术分析沼气池中微生物种群基因的多样性,以及富集前后的微生物群落区系变化,并回收优势的DNA片段进行序列分析,结果表明,微生物群落在沼气池的不同层次上呈现出空间分布多样性的差异,序列比对的结果显示,沼气池中的优势古菌菌群为Methanosaeta与甲烷螺菌属( Methanospirillum) 。王庆等[21]基于mcr A克隆文库和PCR - DGGE技术,对农村户用沼气池中产甲烷古菌微生物的群落结构进行了分析,mcr A克隆文库结果显示,沼气池中产甲烷古菌主要以产甲烷囊菌属( Methanocullwus) 和小甲烷粒菌属( Methanocorpusculum parvum) 为主; PCR - DGGE技术分析结果显示,沼气池中的古菌主要以产Methanobacteriales和Methanocorpusculum为主。刘青等[22]采用PCR - RFLP方法对东太平洋海隆深海热液区3 个站位沉积物中的古菌多样性进行了初步研究,结果表明,在沉积物中古菌多样性较为丰富,其中优势菌群为奇古菌门的亚硝化侏儒菌属( Nitrosopumilus) 和广古菌门的热原体纲( Thermoplasmata) 。曾军等[23]对新疆沙湾冷泉沉积物中的古菌进行了研究,结果表明,古菌类群多样性较低,但存在大量高度适应此低温、贫营养环境的泉古菌类群。景晓明[24]采用PCR - DGGE分析方法对氨氧化古菌进行了分析,结果表明,各施肥处理下氨氧化古菌的群落结构受施肥差异的影响较小,而施肥方式增加了黄泥田水稻土中氨氧化古菌的多样性。4 低温产甲烷古菌基因克隆研究
由于厌氧生物处理过程一般都在中温或高温条件下发生,所以一般对嗜温和嗜热产甲烷菌的研究较为深入。但因地球生物圈中绝大部分( 约75% ) 属于低温环境,向自然界排放甲烷最多的是嗜冷产甲烷菌。据研究,1992 年第1 株嗜冷产甲烷菌得以分离培养,而应用于低温沼气发酵的产甲烷菌的研究却鲜有报道。有关研究表明,在低温发酵的不同时期,甲烷菌数量明显,优势菌群也不同。目前,已获得培养的甲烷古菌多数为中温菌和高温菌,迄今只有少数几株耐低温的甲烷古菌获得培养沼气技术,且在改善农村能源、环境、卫生条件等方面发挥着积极作用,是实现农业可持续发展的有效途径。但目前沼气工作推广的最大技术难点是中国北方地区冬季温度过低,不适于沼气发酵微生物的生长和产气。如何在北方寒冷地区开发利用沼气是个亟待解决的问题。
丁维新等[25]研究发现,甲烷菌对温度非常敏感,温度是制约甲烷菌活性的最重要因素,在温度低于17 ℃ 时,甲烷菌活性几乎停止产甲烷代谢。特别是在寒冷的冬季,气温普遍较低,沼气产量急剧下降,严重限制了厌氧发酵和沼气生产,这在一定程度上影响了沼气技术的推广使用。因此,产甲烷过程及产甲烷的研究越来越受到人们的重视。蒋娜等[26]研究发现,古菌的冷适应机制研究仍处于开始阶段,主要原因是目前古菌难以培养,获得的嗜冷古菌菌株很少。随着培养手段及先进研究手段的提升,对古菌的冷适应机制将有新的认识,并促进对其生态学行为的理解。嗜冷厌氧消化的一个主要优势是可以增加经济效益,因为它大大减少或者省去了加热发酵原料而消耗的能量; 裴占江等[27]对厌氧发酵过程中不同温度条件下产甲烷微生物菌群的发酵性能进行了研究,结果表明: 在10 ~ 35 ℃区间,产甲烷菌的产气能力随着温度的升高而增强; 温度在20 ℃ 以下时不适宜产甲烷菌的生长。随着温度的升高,甲烷含量也随之增加。35 ℃ 时,甲烷含量最高,可以达到70% 以上;10 ℃ 、15 ℃ 时,甲烷含量最低,只有30% 左右。在青藏高原地区的低温条件下,通过滚管技术分离了一类耐低温产甲烷菌,并利用气相色谱法测定了产气活性,结果表明,这类甲烷菌最低产气温度为8 ℃。洒威等[28]对选育的低温沼气功能菌群中的产甲烷菌种群结构和数量进行了研究,并与常温沼气功能菌群进行了比较分析。在总共33 个产甲烷菌分类单元中低温沼气功能菌群占20 个,低温沼气功能菌群的产甲烷菌多样性远高于常温沼气功能菌群。低温沼气功能菌群以对温度要求较低的中低温产甲烷菌为主,而常温沼气功能菌群则以中高温产甲烷菌占优势。虽然两类菌群的产甲烷菌在多样性和种群结构方面存在较大差异,但在产甲烷菌数量方面并没有明显的不同,这表明不同沼泥样品发酵前期、后期产甲烷古菌的优势群落差异明显且数量上也存在较大差异,主要变化的产甲烷古菌的优势群落为甲烷菌属( Methanocorpu) 菌群,与常温沼气功能菌群一样,已经形成了稳定的产甲烷菌种群。
对产甲烷细菌的分析与研究 篇4
1 产甲烷细菌的形态特征
尽管产甲烷细菌的种类较少, 但它们在形态上仍有明显的差别, 可分为杆状, 球状, 螺旋状和八叠球状四类。产甲烷细菌均不形成芽孢。革兰氏染色不定, 有的具有鞭毛。球形菌呈正圆形或椭圆形, 直径一般为0.3 μm～5 μm, 有的成对或者成链状队列。杆菌有的为短杆状, 两端钝圆。八叠球菌革兰氏染色呈阳性, 这种细菌在沼气池中大量存在。
2 产甲烷细菌的生理特征
2.1 产甲烷细菌来源
产甲烷细菌属于古细菌的水生古细菌门, 细胞壁不含肽聚糖。产甲烷细菌个体有球形, 杆形和螺旋形。由遗传因素决定, 产甲烷细菌在正常生活中可呈现八叠球形, 有的连成长链。它是最早发现的古细菌, 只能生活在无氧的极端恶劣环境中[3]。
2.2 产甲烷细菌是严格专性厌氧菌
产甲烷细菌都生活在没有氧气的厌氧环境中, 对氧气非常敏感, 实验表明, 当介质中含有0.1%的氧时, 对甲烷菌的生长出现明显的抑制作用。遇氧不能生长繁殖, 最终导致死亡。
2.3 产甲烷细菌生长特别缓慢
产甲烷细菌在自然界中生长特别缓慢, 即使在人工培养条件下, 也要经过18 天乃至几十天长出菌落, 主要原因:能够利用的底物很少, 而且为简单物质, 仅有二氧化碳, 氢气, 乙酸, 甲酸甲醇和甲胺等, 所以释放的能量很少, 为生物合成提供能量少, 不利于生物生长繁殖, 世代时间一般很长, 有的十几天才可繁殖一代。
2.4 产甲烷细菌对环境影响非常敏感
对产甲烷细菌来说最适宜的温度0 ℃～80 ℃, 产甲烷细菌在氧化还原电位低于-330 mV, 严格厌氧的条件下生存, 最适宜的氧化还原电位值-540 mV～-590 mV。
3 产甲烷细菌的营养特征
不同的产甲烷细菌生长过程中所需要碳源是不一样的。产甲烷细菌不能直接利用除乙酸外的二氧化碳以上的有机物。一般常见的产甲烷细菌分为三个种群:氧化氢产甲烷菌 (HOM) , 氧化氢利用乙酸产甲烷菌 (HOAM) 和非氧化氢利用乙酸产甲烷菌 (NHOM) 。尽管这一类并不严格, 但在厌氧反应器中, 以上种群常分别能够出现在不同的生境中, 构成优势种, 对实际工程的运行具有重要意义。所有的产甲烷细菌都能利用铵离子, 有的产甲烷菌需酪蛋白的胰消化物, 它可刺激产甲烷细菌生长, 所以, 分离产甲烷细菌时, 培养基中要加入胰酶解酪蛋白。产甲烷细菌在生活中需要某些维生素, 尤其是B族维生素。产甲烷细菌在生活中还需要某些微量元素, 如镍、钴、钼等, 所需量一般为:Ni<0.1 μmol, Co<0.01 μmol, Mo<0.01 μmol。
4 产甲烷细菌的分离
4.1 在完全无氧的条件下制备培养基
在无氧条件下制备培养基的目的就是要消除培养基中的氧, 这就是产甲烷细菌的必要条件, 否则导致分离失败分离产甲烷细菌的基础培养基成分 (质量分数) 。
一般为:氯化铵0.1 mL;酵母汁0.2 mL;氯化镁0.01 mL;磷酸氢二钾0.4 mL;磷酸二氢钾0.02 mL;半光氨酸0.05 mL;胰酶解酪蛋白0.2 mL;牛瘤胃液30 mL;pH≈7;115 ℃高压蒸汽灭菌30 min;使用前每5 mL培养基加入1%和5%碳酸氢钠各0.1 mL。
4.2 往培养基里加还原剂——树脂天青
树脂天青既是还原剂又是氧化剂, 它可以把培养基里残留的溶解氧去掉, 树脂天青在有氧的条件下呈紫色或粉红色, 无氧呈无色 (培养基的颜色) , 它是一种较为理想的氧化还原电位指示剂, 是培养专性厌氧细菌不可缺少的。
4.3 在无氧条件下分装试管
培养基分装试管也要在无氧的条件下进行, 可用二氧化碳、氢气、氮气来驱除空气的办法达到无氧的要求。
4.4 滚管
采用无菌注射器接种后, 让试管滚动, 目的是让培养基凝固在试管上, 增加产甲烷细菌生长表面积, 使产甲烷细菌充分与氢气和二氧化碳接触。
以上条件具备了, 才可能把产甲烷细菌分离成功。
5 产甲烷细菌在废水处理中的应用
5.1 颗粒污泥
因为产甲烷细菌具有一定的耐酸, 高温特性, 低pH值下, 颗粒污泥对有机物的去除率高于分散的产甲烷细菌, 在pH值为4～5的情况下, 两者对COD去除率分别为26%和16%, 说明颗粒污泥的耐酸性更强。颗粒污泥的耐酸性与其结构和微生物组成有很大关系。对于酸性水及高浓度甲醇水处理效果较好。实验表明, 产甲烷细菌中的甲烷毛状菌, 具有细胞丝状提结构, 这些细菌具有极强的吸附能力, 在水流及生成气体上升时产生缓和的搅动下丝状体间的相互网络变大, 其他分解有机物的细菌在其表面上生成粘质物, 有粘质物形成的被膜层使污泥保持颗粒状[4]。
5.2废水厌氧生物处理工艺
厌氧法在废水处理中可以处理高浓度有机废水, 能耗低, 运行费用少, 污泥产率低, 需要附加营养少, 并且可以回收沼气。因此被广泛应用于废水处理, 可以分为厌氧活性污泥法和厌氧生物膜法, 长期以来, 以厌氧活性污泥法为主, 包括普通生物滤池、厌氧接触消化池、升流式厌氧污泥床 (UASB) 厌氧发酵2厌氧处理。
5.3产甲烷细菌的工作机理
产甲烷细菌是厌氧消化过程中最后一个工作阶段的生理群, 它们将有关菌群产生的甲酸、乙酸、甲基胺、H2/CO2转化为CH4, 同时形成氢离子。
6产甲烷细菌的农村应用
农村的厌氧沼气发酵就是利用秸杆、稻草等粉碎, 一般粉碎成1 mm～2 mm碎料。这样可以增加与微生物的接触面积, 在产甲烷细菌作用下产生甲烷, 作为能源。高浓度的有机废水也可以沼气发酵, 如酒精蒸馏废液、豆腐黄浆水、纸浆废水、中药厂废水等, 都是制取沼气很好的原料。
7结语
产甲烷细菌是厌氧生物处理的最后一阶段, 由于产甲烷细菌在废弃物厌氧消化、高浓度有机物废水处理、反刍动物瘤胃中食物消化等过程起着重要作用, 产甲烷细菌具有独特的代谢调控机制及对环境的适应性。因此对产甲烷细菌的生态、生理、营养及在水处理中应用有着极为重要的作用, 有必要充分利用产甲烷细菌进行废水处理以实现甲烷资源化利用。
参考文献
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[2]郑中华, 张辉.三株产甲烷细菌的表面研究[J].应用与环境生物学报, 1999 (6) :79-80.
产甲烷菌 篇5
1 实验装置及实验工况
实验装置整体结构如图2所示,主要包括超细水雾发生系统、爆炸实验管道、气体输送系统、信号采集与处理系统等4部分。其中爆炸实验管是长度为1 m,宽度和高度均为10cm的长方体,两端采用边长12cm的矩形法兰和密封垫密封,左侧中心留孔40mm以便连接气体输送系统。气体输送系统包括一个40L的99.9%的压缩甲烷气体钢瓶,一个40L的压缩空气钢瓶,D08-3B/ZM型气体质量流量控制器(控制进入爆炸实验管内的甲烷气体体积分数),气体流量控制阀,相关PVC气路。。爆炸传播管由四面透明的亚克力玻璃粘合组成,两端用法兰密封,在爆炸实验管的底部长方形亚克力玻璃板一侧安装有脉冲点火电极和两个气体压力传感器,并布置泄压口。实验过程中,检测到的压力传感器信号途经信号采集系统传送至计算机,以便进行后续处理。超声雾化发生器内部注入配置好的甲烷氧化菌溶液,启动后产生具有气体一样良好扩散性的含甲烷氧化菌的超细水雾,实验过程中将超细水雾从泄压口注入,随后使用安全泄压膜型密封钢圈密封泄压口。实验中初始压力为标准大气压(0.1MPa),初始环境温度为15℃,电极放电电压约为30kV。
1.压力传感器-1;2.压力传感器-2;3.压力采集处理系统;4.点火系统;5.压力分析工作站;6.实验空间;7.泄压口;8.超细水雾发生装置;9.控制阀;10.流量控制器;11.甲烷气瓶;12.空气气瓶
实验时,将爆炸实验管道内部抽真空,甲烷气瓶和空气气瓶阀门打开,开启气体质量流量控制器,调节气体流量控制阀,确保实验工况所规定的甲烷体积分数后,关闭气体流量控制阀。即刻启动压力采集系统及其相关工作站,按照表1不同实验组的预处理时间要求开启超细水雾发生系统电源,达到相关的预处理时间后,立刻启动引爆系统,实时测量受限空间内部压力变化状况。实验结束后,实验管道内部通风15min,再开始第二次实验。
2 实验结果与分析
2.1 含菌超细水雾的预处理时间对甲烷气体的爆炸最大压力的影响
以工况2为例,甲烷的体积分数为9.5%时,雾化量在3.5mL时,喷雾后超细水雾弥散于整个受限空间中,当施加雾化量达到3.5mL时,无预处理时间直接启动引爆电极,肉眼可观察到实验管道内的甲烷与空气混合气体瞬间发生爆炸,有橙色火焰从实验管道内引爆电极的一端迅速传播至另一端,与此同时,含甲烷氧化菌的超细水雾也随着压力波从实验管道内的一端传播到另一端,最终冲破安全泄压阀的薄膜,从受限空间内泄漏。
表2和图3给出了设定工况下甲烷气体的最大爆炸压力分布状况。在没有预处理时间条件下,喷入含甲烷氧化菌的超细水雾立即启动点火电极,爆炸最大压力在近端与远端达到最大值,分别是0.041、0.022 MPa;当预处理时间达到1h后启动点火电极,近端与远端的爆炸最大压力与无预处理时间条件下基本无明显差别。当预处理时间达到3h时启动点火电极,近端和远端处的最大爆炸压力分别为0.035、0.016 MPa;当预处理时间达到5h时,近端和远端处的最大爆炸压力分别为0.026、0.012 MPa;而当预处理时间达到13h时,近端和远端处的最大爆炸压力分别为0.018、0.005 MPa,与无预处理时间相比,出现了明显的下降趋势。随着预处理时间以2h为时间间隔逐渐递增,近端和远端的最大爆炸压力呈现缓慢下降趋势,这是由于3.2mL的含菌超细水雾喷入实验管道内,无论是以雾化形式存在还是附着于试验管道器壁上,均随着预处理时间的增加,不断地氧化甲烷,使甲烷浓度降低造成的。
在不同预处理时间状况下,甲烷气体的最大爆炸压力随着预处理时间的增加而减小。每个不同的预处理时间条件下,靠近点火电极的近端爆炸压力值比远端处爆炸压力值大2~3倍,表明爆炸波传播过程中爆炸压力逐渐衰减。含甲烷氧化菌的超细水雾与甲烷气体发生生物化学反应的时间越长,无论是近端还是远端,爆炸最大压力均呈现减小的趋势。同时也说明了在该实验条件下,随着时间的增长,含甲烷氧化菌的超细水雾逐渐消耗实验管道内的甲烷。
2.2 等量含菌超细水雾对不同体积分数甲烷爆炸压力的影响
不同甲烷体积分数条件下甲烷爆炸的最大压力的分布状况,如表3和图4所示。
可以看出,当菌液雾化量为3.5mL,预处理时间为13h,甲烷爆炸的最大压力在近端和远端分布呈现一定的规律。甲烷的体积分数为5.0%、6.5%、7.5%时均未发生爆炸。甲烷体积分数达9.5%时,在近端与远端的爆炸最大压力分别是0.019、0.005 MPa;甲烷体积分数达到11.5%时,在近端与远端的爆炸最大压力与甲烷的体积分数为9.5%时基本无差异。甲烷的体积分数达到12.5%时,在近端与远端的爆炸最大压力分别是0.020、0.007 MPa;随后伴随甲烷的体积分数分别为13.5%、14.5%、15.5%,在近端与远端的爆炸最大压力逐渐增大。甲烷的体积分数为15.5%时,在近端与远端的爆炸最大压力分别是0.032、0.015 MPa,该值与无预处理时间时的甲烷气体的最大爆炸压力值接近,这主要是由于预处理时间为13h,甲烷氧化菌不断地氧化消耗甲烷,使得实验管道内甲烷的体积分数下降造成的。
2.3 不同雾化量对同一体积分数甲烷气体的爆炸最大压力的影响
表4和图5展示了不同菌液雾化量条件下甲烷爆炸的最大压力的分布状况。甲烷的体积分数为15%,预处理时间为13h,甲烷爆炸的最大压力在近端和远端分布呈现一定的规律。当不施加含菌超细水雾时,15%的甲烷气体的爆炸最大压力在预处理13h时达到最大值;当菌液雾化量为0.5mL时,甲烷气体的爆炸最大压力与未施加菌液时相比无明显变化,这表明0.5mL的菌液雾化量不足以降低甲烷气体的爆炸最大压力;当菌液雾化量达到1.5mL时,在近端与远端的爆炸最大压力分别是0.025、0.011 MPa;随后菌液雾化量增加到2.5mL,在近端与远端的爆炸最大压力分别是0.019、0.005 MPa;当菌液雾化量达到3.5mL时,在近端与远端的爆炸最大压力达到该组实验最小值,此后当菌液雾化量增加到4.5mL或者更大值时,甲烷气体均未发生爆炸。这表明该实验条件下,菌液雾化量为4.5mL时就能完全抑制甲烷气体的爆炸。
3 结论
(1)甲烷的体积分数为9.5%、菌液雾化量在3.5mL时,在不同预处理时间状况下,甲烷气体的最大爆炸压力随着预处理时间的增加而减小。每个不同的预处理时间条件下,靠近点火电极近端的爆炸压力始终大于远端的爆炸压力,含甲烷氧化菌的超细水雾与甲烷气体发生生物化学反应的时间越长。无论是近端压力还是远端压力,爆炸最大压力均呈现减小的趋势。
(2)菌液雾化量为3.5mL、预处理时间为13h、甲烷的体积分数低于7.5%时,均未发生爆炸。甲烷的体积分数为15.5%时,实验管道内在近端与远端的甲烷气体爆炸最大压力分别达到该组实验的最大值,表明甲烷氧化菌在13h内不断地氧化消耗甲烷,与甲烷发生生物化学反应,使实验管道内甲烷的体积分数下降。
(3)甲烷的体积分数为15%、预处理时间为13h、菌液雾化量达到3.5mL时,在近端与远端的爆炸最大压力达到该组实验最小值。菌液雾化量增加到4.5mL或更大值时,甲烷气体均未发生爆炸。这表明菌液雾化量为4.5mL以上时就完全抑制甲烷气体的爆炸。
参考文献
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产甲烷菌 篇6
国内外大多采用三氯化磷和环氧乙烷经酯化、重排、酸解的方法制取乙烯利[1,2,3,4,5]。该工艺存在生产规模小、原料成本高、产品收率低等问题。如何降低生产成本,提高产品收率是努力追求的目标。合成乙烯利的关键步骤为酸解反应,也是决定生产成本的关键一步。选用工业副产物作为原料,一方面能充分利用废弃物,减少污染;另一方面能降低生产成本,提高利用价值。本文采用甲烷氯化物副产的盐酸取代合成盐酸合成了乙烯利,讨论了反应温度,时间,副产盐酸杂质含量对收率的影响。
1 实验部分
1.1 主要原料及仪器
2-氯乙基膦酸二酯(自制);合成盐酸(含量33.9﹪,工业级);甲烷氯化物副产盐酸(含量32.6﹪);浓硫酸(含量98.8﹪,工业级)。
1.2 反应原理
(1)中间体2-氯乙基膦酸二酯的制备
(2)2-氯乙基膦酸二酯酸解
1.3 乙烯利合成步骤
第一步,按文献[3,4,5]制备中间体2-氯乙基膦酸二酯。
第二步,酸解:重排产物二酯与工业副产盐酸在浓硫酸存在的条件下进行酸解。反应生成的二氯乙烷经冷凝回收,未反应完的氯化氢气体用水吸收成稀盐酸。酸解反应一段时间后产品为浅棕色至棕色液体。
1.4 样品测试
按照HG2311-1992《乙烯利原药》和HG2312-1992《乙烯利水剂准检测》标准检测。合成乙烯利未经进一步分离提纯,直接采用酸碱法滴定。
2 结果与讨论
2.1 反应温度的影响
反应温度对乙烯利产物的生成有着重要的影响,工业合成盐酸工艺条件的研究已有许多报道,但对甲烷氯化物副产盐酸作为反应原料的研究较少。为了确定工业副产盐酸工艺条件,本实验改变酸解温度,恒定其他条件进行了实验。产物未经纯化直接测定含量。实验结果如图1所示。
由图1可知,随反应温度的增加,乙烯利收率提高,在180℃时达到最高。当继续升高温度时收率下降,且产物外观颜色明显加深。这是由于随反应温度升高,体系反应活化能增加,反应速度增大,当温度升高到一定程度后,副反应增多,使得产品颜色加深。本实验确定反应温度为180℃。
2.2 反应时间的影响
反应时间也直接影响产物的收率,本实验恒定反应温度180℃,改变时间考察反应时间对产物收率的影响。实验结果如图2所示。
由图2可知,随反应时间的增加,乙烯利收率提高,在酸解64 h时收率达到最大。继续升高温度,收率略有下降,但颜色有明显加深的现象。这也是由于反应时间的延长,副反应增多的缘故。本实验确定反应时间为64 h。通过对比发现,采用甲烷氯化物副产盐酸与工业盐酸(以前工业合成盐酸实验结果未列出)对乙烯利合成反应温度和反应时间基本上无影响。
2.3 工业副产盐酸杂质的影响
实验所用工业副产盐酸为甲烷氯化物副产盐酸,杂质为少量甲烷氯化物,其含量如表1所示。
采用工业合成盐酸和副产盐酸按反应温度180℃,反应时间64 h酸解工艺条件分别制取了乙烯利。合成物检测结果如表2、表3所示。
注: EP07-01为合成盐酸制备的乙烯利,EP07-02为甲烷氯化物副产盐酸制备的乙烯利
由表2和表3可知,少量甲烷氯化物的存在对乙烯利收率和产品质量几乎没有影响。这是因为甲烷氯化物为惰性化学物质,对酸解反应几乎没有影响。
注:EP07-01-02为合成盐酸制备的乙烯利水剂,EP07-02-02为甲烷氯化物副产盐酸制备的乙烯利水剂。
从表3可知,利用合成盐酸酸解得到的乙烯利EP07-01,副产盐酸酸解得到的乙烯利EP07-02分别配成相应的水剂EP07-01-02和EP07-02-02均符合标准HG2312-1992水剂技术要求。由表2,3可知少量甲烷氯化物的存在对乙烯利含量几乎没有影响。这是因为甲烷氯化物为惰性化学物质,对酸解几乎没有影响。
3 结论
本文采用甲烷氯化物副产盐酸来代替工业合成盐酸制备了乙烯利,并研究了反应时间,温度,盐酸杂质含量对乙烯利收率的影响。实验得出如下结论 :
(1)当反应温度为180℃,反应时间为64 h时乙烯利产率最高,产品色泽理想。
(2)通过对比发现甲烷氯化物副产盐酸杂质对产品收率,产品质量没有影响。
用甲烷氯化物副产盐酸代替工业盐酸能够生产出符合产品质量技术要求的产品,能较大幅度降低生产成本,为乙烯利产品提高了市场竞争力。此方法投入生产以来,为公司创造了明显的经济效益。
参考文献
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[4]Jonathan M K,Robert F M.US 4 4328026,1982.
产甲烷菌 篇7
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 土壤样品
土壤样品来自于大港油田天然气库上方微渗漏土壤, 采样点位于地下水位以上的氧化带, 采样深度为1.0m。采得的土壤样品为黄色的亚粘土, 有一定的湿度。
1.1.2 试剂
实验中所使用的纯甲烷气体购于北京天佑顺气体公司, 纯度为99.99%。Taq酶、引物合成及其它生化试剂购自大连宝生物公司, 其它试剂均为化学纯以上。
1.1.3 仪器
LS-B50L立式压力蒸汽灭菌锅, BS124S电子天平, THZ-C-1恒温摇床, UV-2102C紫外可见分光光度计, LRH-250生化培养箱, BCD-2158H生化冷藏冰箱, 日本岛津GC-14C气相色谱仪。
1.1.4 培养基
1.1.4. 1 LB培养基
酵母粉5g;胰蛋白胨10g;氯化钠5g;去离子水1 000m L。
1.1.4. 2 改进的NMS[9] (Higgens nitrate minimal salt)
培养基 (MNMS) [10]:KH2PO41.06g;Na2HPO4·12H2O 4.34g;Na NO31.70g;K2SO40.34g;Mg SO4·7H2O 0.074g;Fe SO4·7H2O0.024g;Cu SO4·5H2O 1.25mg;微量元素溶液4m L, 去离子水1 000m L, p H 7.0。
微量元素溶液组成 (mg/L) :Zn SO4·7H2O 0.287;Mn SO4·7H2O 0.223;H3BO30.062;Na2Mo O4·2H2O 0.048;Co Cl2·6H2O 0.048;KI 0.083;Ca Cl2·2H2O 3.5, pH 7.0。
1.1.4. 3 固体培养基:
上述培养基中加1.8%的琼脂[11]。
1.2 方法
1.2.1 菌株的富集与分离
菌株筛选:将土样碾碎, 称取0.2g放入20mL MNMS培养基中, 在30℃摇床上振荡。2h后取液体1mL作为种子接入分装了10mL MNMS培养基的玻璃培养瓶中, 加盖密封橡胶塞。用已灭菌的医用注射器抽取瓶内一定体积的空气, 通过已灭菌的气体过滤器注入相同体积的甲烷, 使瓶中甲烷与空气的体积比为1:9, 30℃、170r/min倒置培养, 菌液浑浊后移取其中1mL培养液作为种子接入新鲜的MNMS培养基中。如此选择性传代培养[12], 得到了能以甲烷作为惟一碳源和能源的混合菌群。
菌株培养:按5%接种量接种后, 加盖密封橡胶塞。用已灭菌的医用注射器抽取瓶内空气, 通过已灭菌的气体过滤器注入相同体积的甲烷, 使瓶中甲烷与空气的体积比约为1:9, 30℃、170r/min摇床倒置培养。
菌株纯种分离:培养液稀释涂MNMS固体平板 (琼脂含量为1.8%) , 将平板置于真空干燥器中, 密封后用真空泵抽取干燥器中一定体积的空气, 然后再加入一定比例的甲烷。之后将干燥器置于30℃培养箱, 培养1~2w, 挑取单菌落在上述固体平板上划线分离[13]。同上操作, 分离纯化数次。在相同培养条件下设置不含甲烷的对照实验。
1.2.2 菌体形态与培养特征的观察
菌体染色后在光学显微镜下观察细胞形态。MNMS琼脂培养平板上观察菌落特征。
1.2.3 生理生化性质测定
按照微生物学实验方法[14], 对该菌株进行生理生化性质测定, 分别包括:淀粉水解实验、甲基红实验、柠檬酸盐利用实验、过氧化氢酶实验、硝酸盐还原实验、吲哚实验、V.P.实验、葡萄糖发酵实验等, 每次做3组平行实验, 记录结果。
惟一碳源利用试验:采用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、蔗糖为惟一碳源, 糖醇浓度1%, 以基本培养基加入1%相应碳源摇床培养, 在30℃摇床36h后观察生长情况, 每次做3组平行实验, 记录结果。
惟一氮源试验:氯化铵、硝酸钠、亚硝酸钠作为惟一氮源, 铵态、硝态氮浓度为0.05%, 于30℃摇床, 36h后观察生长情况, 每次做3组平行实验, 记录结果。
1.2.4 16S r DNA序列分析
用TIANGEN细菌基因组总DNA提取试剂盒提取该菌株DNA, 以基因组DNA为模板, PCR扩增16S r DNA, 引物1序列为:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′, 引物2序列为:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′, PCR扩增反应体系:10×缓冲液5μL, d NTP (25mmol/L) 4μL, 引物1 (25pmol/μL) 2μL, 引物2 (25pmol/μL) 2μL, Mg2+ (25mmol/L) 4μL, 模板2μL, Taq DNA聚合酶2.5U, dd H2O补足至总体积50μL。反应参数:95℃变性10min;95℃变性2min, 55℃退火30s, 72℃延伸4min, 35个循环;72℃延伸20min, 4℃保持。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。PCR扩增产物参照文献[11]方法, 经克隆后送北京奥科生物测序。测序结果在Gen Bank中进行BLAST分析。
1.2.5 菌株生长曲线的测定
将该菌株接种到MNMS液体培养基中, 30℃、170r/min摇床倒置培养, 每12h取样1次, 于560nm处用722型紫外分光光度计, 测定该波长处的光密度值 (optical density, OD560) 。每次做3组平行实验取平均值, 绘制菌株的生长曲线。
1.2.6 温度和培养基p H值对菌株生长的影响
在基本培养基不变的情况下, 改变生长条件, 每次做3组平行实验, 分别在不同温度和不同p H下进行培养, 以OD (560nm) 值来衡量达到的菌浓, 来研究该菌株的较适宜的生长条件。
1.2.7 菌株利用甲烷能力的测定
绘制标准曲线:采用日本岛津GC-14C气相色谱仪进行甲烷含量的测定, 填充柱型号为SE-30, 氢火焰检测器, 检测器温度为50℃, 按外标法以峰面积计算甲烷含量, 进样口温度为50℃, 柱箱温度为40℃;总压300k Pa, 填充柱分压100k Pa, 载气压力100k Pa, 氢气发生器压力50KPa, 空气压缩机压力50k Pa。将纯甲烷气依次稀释, 得到5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%等系列浓度的甲烷气, 根据已知浓度的甲烷气测其对应的色谱峰面积 (高度) , 绘制峰面积———浓度曲线图。未知气体样品甲烷浓度的测定条件同上所述, 根据测得样品的色谱峰面积, 在标准曲线上计算出对应的甲烷浓度。用气相色谱仪检测到气相中甲烷浓度的降低, 来证实该菌株具有氧化利用甲烷的能力。
土壤样品中的细菌经富集、分离、再培养、再挑菌落等步骤反复纯化后, 得到纯菌株K3。以气相中加甲烷和气相中不加甲烷做平行对照, 检测该菌株利用甲烷的性能, 挑取单菌落于盛有10m L培养基的培养瓶中, 气相部分含有体积比为10%甲烷气体, 倒置密闭于培养瓶中30℃、170r/min摇床振荡培养7d。分别在不同的培养时间从培养瓶气相中取样10μL用气相色谱仪检测甲烷含量, 测定方法同上。
2 结果和分析
2.1 菌株的分离及形态、培养特征
按照1.4的富集方法, 经过数次富集后得到能利用甲烷的细菌培养液, 如图1所示, 其中左边为空白培养基对照, 右边为富集培养基。富集后的培养液变浑浊, 且在液面上有一层悬浮的菌体。
按照富集、分离、纯化方法, 得到的1株能够利用甲烷作为碳源的细菌, 记为K3。该菌纯培养物或单菌落培养7d后, 肉眼观察菌落形态, 在平板上形成的菌落呈圆形, 边缘略粗糙, 中央突起, 大小约为0.5~1mm, 浅黄色不透明, 湿润, 容易挑起。液体培养基中, 菌团附着于瓶壁上, 呈白色略微黄色。取少量单菌落经简单染色, 用光学显微镜进行观察。菌体呈圆形或球形, 大小为0.4~0.6μm乃至1~2μm, 细菌单生, 革兰氏染色为阴性。整个视野内菌体形态基本一致。图2是分离得到的纯种菌株的平板菌落形态。
2.2 该菌株的生理生化特性鉴定
按照细菌的生理生化特性鉴定分析方法, 记录K3的生理生化特性。基本生理生化特性结果 (见表1) 表明, 该菌株能发酵葡萄糖产酸, 能将柠檬酸分解为二氧化碳, 含有的过氧化氢酶能产生阳性反应, 并且能够还原硝酸盐;碳源试验结果表明, 该菌株能以葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖作为惟一碳源, 不能利用果糖、鼠李糖、海藻糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖作为惟一碳源;惟一氮源试验结果表明, 该菌株能能以硝酸钠和氯化铵为氮源, 不能利用亚硝酸纳作为惟一氮源。
2.3 该菌株的16S r RNA分子生物学鉴定
提取该菌株的DNA后, 进行16S r DNA扩增, 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证 (如图3) , 将扩增产物送北京奥科生物测序。将该测序结果输入基因银行 (www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中, 按照测得的序列, 与基因银行进行序列BLAST比对, 记录最大相似性, 然后运用Clustal X6.0软件进行分析, 绘制系统发育树如图4。
从比对的结果以及系统发育分析可知:菌株K3与Pseudoxanthomonas相似度最高, 与Simazine-degrading bacterium、Xanthomonas、Drinking water bacterium及未培养微生物等菌属的相似度也较高。从分子生物学角度来看, 该菌株与大多数Pseudoxanthomonas (假黄单胞菌) 序列相似度达到93%, 属于与假黄单胞菌不同的新属或基因银行中未登录的属类。
2.4 菌株的生长曲线测定
根据生长曲线的测定方法, 记录实验结果, 描绘生长曲线如图5, 从该菌株生长曲线中可以看出, 该菌生长周期约为7d, 其中迟滞期相对较短, 培养12h后进入对数生长期, 在60~72h后, 菌液的光密度达到峰值, 72h之后即进入生长稳定期。
2.5 温度和培养基p H值对细菌生长的影响
按照菌株的培养方法, 改变温度和p H值, 测定在不同条件下的生长曲线, 如图6、图7, 从生长曲线中能达到的最大OD值 (560nm) 判断最佳的生长条件。
从该菌株在不同温度和p H值下的生长情况曲线图中可以看出, 该菌株在不同温度和p H值下能较好地适应, 生长过程都经历了迟滞期、对数生长期、稳定期几个阶段, 生长周期约为7d, 迟滞期相对较短, 培养12h后进入对数期, 在60~72h后, 菌液的光密度达到峰值, 随后进入生长稳定期。比较20℃、30℃、40℃不同温度下菌株的生长曲线可以看出, 在30℃时该菌株能达到的OD峰值最大, 反映在该温度下菌浓值能达到最大, 并且稳定期相对较长, 因此该菌株的适宜生长温度为30℃;比较p H值分别为5、7、9时的生长情况曲线图可以看出, 在p H 7时, 该菌株能达到的OD峰值最大, 反映在该p H下菌浓值能达到最大, 说明该菌株的适宜生长p H值为7。
2.6 该菌株利用甲烷的能力测定
测定纯甲烷气体的气相色谱峰, 分析甲烷的出峰时间和峰面积, 根据不同甲烷含量和相应的峰面积 (相同进样量) , 绘制标准曲线。对该菌株进行培养, 在不同培养时间取气体样品, 对比标准曲线, 分析气体中的甲烷含量, 做出K3的甲烷利用曲线如图8。
从该菌株利用甲烷曲线图来看, 该菌株在培养12h后, 培养瓶中的甲烷含量浓度即有所下降, 培养36h后, 培养瓶中的甲烷含量浓度降低约40%, 培养120h后, 培养瓶中的甲烷含量浓度降低约60%。表明该菌能较好地利用甲烷。赵艮贵[13]从晋阳湖水中分离得到一株铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) , 也具有利用甲烷的能力, 在适当条件下, 溶氧变化可在100s内达到平衡, 溶氧消耗量与通入甲烷气体含量在0~16%呈线性关系, 能初步应用于甲烷气的检测中。K3与该铜绿假单胞菌属于不同菌属。这也说明自然界中能利用甲烷的细菌远不止甲烷氧化菌群[10], 还可能有更多潜在的利用甲烷作为碳源的微生物类群存在。
3 讨论
3.1 结论
(1) 从大港天然气库土壤中分离得到1株甲烷利用细菌, 对该菌株进行了常规形态学观察和生理生化特性试验。 (2) 该菌在以甲烷作为碳源的液体培养基中生长72h后OD值可达到0.8左右, 之后OD值基本维持在此水平。该菌株的最佳生长温度为30℃, 最佳生长p H值为7左右。 (3) 16S r RNA基因的分子鉴定结果表明, K3与Pseudoxanthomonas等菌属的最大相似度为93%, 属于新属或基因银行中未登录的属。 (4) 甲烷利用特性的气相色谱分析表明, 120h后培养瓶中的甲烷浓度约降低60%, 说明该菌株具有利用甲烷的性质。
3.2 讨论
(1) 该K3菌株虽然不属于甲烷氧化菌属, 但是它具有利用甲烷的能力, 并且能利用甲烷作为惟一碳源生长, 这说明自然界中能利用甲烷的细菌远不止甲烷氧化菌群, 还可能有更多潜在的利用甲烷作为碳源的微生物类群存在。探讨这类甲烷利用菌的类型和特性具有十分重要的意义。 (2) 从已发现的甲烷利用菌类型来看, 大多数属于假单胞菌属, 这可能是由于这类微生物能利用的碳源非常广泛而引起的, 其具体的作用机理有待进一步研究。 (3) 在自然界中存在甲烷的环境中能发现甲烷利用菌, 如天然气库土壤、沼泽地、水稻田、煤矿、森林、深水库底、海洋等环境中均有可能存在甲烷利用菌, 这对于以后分离这类菌群或发现新的菌种指明了一条道路和方向。 (4) 依据甲烷利用菌的性能, 如降解甲烷的快慢和能力大小等方面, 有望能应用于甲烷检测、煤矿瓦斯治理、天然气勘探、基因工程改造、生物工程等方面。
摘要：目的:研究土壤中能利用甲烷的细菌类型及特性。方法:运用传统的富集、分离、纯化方法得到1株甲烷利用菌, 结果:该菌株在显微镜下呈球形, 在液体培养基中生长72h后OD值可达到0.8左右, 其最适生长温度30℃, 最佳pH值7左右。对该菌株进行了16SrDNA扩增, 测序结果表明其与Pseudoxanthomonas菌属的序列相似性为93%, 其生理生化特征和分子鉴定结果表明, 该菌与假黄单胞菌为不同的属。甲烷消耗气相色谱分析结论显示, 120h后培养瓶中的甲烷浓度降低60%左右, 说明该菌株具有较好的利用甲烷的性能。