培养鉴定

2024-06-20

培养鉴定（共11篇）

培养鉴定篇1

珠宝玉石质量检验师考试制度从1997年开始实施, 第一批质检师于1997年10月29日诞生。截至目前, 全国共有注册鉴定师797人。世界已发现的宝石有二百多种, 要想较快地掌握这么多矿物的特点确是一件不容易的事, 好在自然界重要的珠宝原石品种总数或珠宝市场上首饰宝石种类为二十五种左右。因此, 初学者只要记住这二十五种宝石矿物的鉴别特点及其相互间的区别, 就可胜任鉴别工作了。以上海为例, 目前上海地区具有珠宝鉴定证书的专业人员不过数百人, 珠宝鉴定方面的老专家仅为十余人, 具有国际水准的高级珠宝鉴定、顾问人才更是“一将难求”。结合行业当前现状, 一些公司和学校建立培养模式, 开展宝石鉴定师课程, 利用就业为导向, 以求尽快弥补行业人才短缺状况。

一、高效优质的教学大纲和人才培养计划

公司和学校的培养应紧密结合市场需求, 制订教学大纲和人才培养计划。珠宝专业自1999年以来3次修订教学大纲, 每年都深入到企事业单位座谈、探讨如何更合理地制订教学大纲, 调整人才培养计划, 更新专业课程的设置, 将教学大纲和人才培养计划修订得更加合理, 更加有利于学生的发展, 更加有利于企业和科研研究的实际需要。

强化技能操作和动手能力。在教学计划的制订、人才培养规划的实施、专业课程的设置等方面, 加强培养同学们的动手能力。珠宝专业在成立时应建设了实验、实训室、首饰镶嵌与制作实验实训室、宝石鉴定实验室, 学校每年下拨固定经费用于实验实训设备的添置和维护, 使得珠宝专业的实验室建设达到了全世界一流的水平。同学们通过在这些实验、实训室的长期培训和强化训练, 进入企业工作后基本都能马上上手, 使企业缩短了新进人员的培训时间和磨合期。

贯彻落实“1张文凭+3张职业资格证书”的办学模式。珠宝专业是具有专业性、特殊性的行业, 没有相应的职业资格证书, 就无法跨入行业门槛。因此要求每位同学在拿到毕业证书以前都应该考出相应的专业职业资格证书, 此举深受广大用人单位的欢迎, 使学校教育、教学和企业实际需要更紧密地联系起来。

把职业道德、职业操守的教育渗透到每门专业课中。珠宝专业除了在常规教学中开设职业道德教育课程以外, 还将职业道德教育和专业课程教学紧密结合起来, 使同学们在学习中了解到珠宝专业的特殊性并且始终牢记职业道德、职业操守的重要性。用人单位在对毕业生的评价中就这样评价:××学校毕业生显示出良好的职业道德操守, 无论是在实习期间, 还是上岗工作, 都能够遵守劳动纪律, 讲究诚信, 责任心比较强, 具有良好的团队协作精神。

二、专业知识与英语相结合的培养理念

随着人们对珠宝需求的增多, 珠宝鉴定师逐渐变得火热起来。中国的珠宝鉴定业由于种种历史原因曾一度萧条, 断层几十年, 专业人才严重匮乏。要想与世界先进的珠宝鉴定相接轨, 需要我们的学生掌握熟练的英语, 这样才有机会和能力翻译英语著作和与国际学校交流。通过几年的教学实践, 综合各大企事业单位对毕业生的评价, 我国培养的珠宝鉴定专业学生, 其职业能力、社会综合竞争力都是数一数二的, 结合学校教学、科研、产业开发, 广开渠道, 本着多国家、多层次、多学科、多形式交流合作的外事宗旨, 学校和企业积极开展国际间的学术交流, 以合作办学、合作科学研究等多种方式增强整体实力, 取得了长足进步, 为学校和企业逐步发展成为现代型、开放型、国际型大学作出了应有的贡献。例如, 中国地质大学先后承办各种规模、各种学科的国际会议达17次。多个国家的百余名专家及国内众多地质学家、学者对会议的成功也给予了肯定和好评。

大部分珠宝鉴定师不能对证书的英文进行翻译, 有的连证书的出具机构也不能准确表达。珠宝首饰检测鉴定证书是珠宝价值的惟一凭证, 珠宝鉴定师要看懂英语鉴定证书。“国外检测证书是国外实验室根据自己的标准出具相关的报告和证书, 而有关实验室的标准甚至要略低于我国的国家标准。”省珠宝玉石首饰行业协会副秘书长米粮川表示, 由于这些国际认证是否权威机构出具很难辨别, 同时国外检测鉴定证书难查真伪, 此外, 珠宝商家大部分用国外检测鉴定证书, 珠宝鉴定师应将英文翻译成中文, 以告知消费者相关珠宝的真实情况。珠宝鉴定专业之所以具有较强的职业竞争力和社会适应力, 当鉴别者手中拿到一块未知珠宝时, 只要细心按以下鉴定步骤去观察, 便可将一些矿物的范围缩小, 最后得出一个正确的矿物名称.对其他品牌具有国际认证的珠宝产品进行了了解。

三、“师徒模式”的珠宝鉴定师培养方式

我国是一个历史悠久的文明古国, 其文物及艺术品资源雄厚, 更能成为世界文物及艺术品市场的主导。对此感到我国文物及艺术品市场的专业人才奇缺已是燃眉之急了。如何尽快地培养新型高级珠宝鉴定师专业人才是当前值得考虑的大事。任何一门经济领域的发展都是由市场促使人才的培养, 再由人才促使市场的发展, 没有人才市场难以成熟更难以前进, 所以抓人才是至关重要的。

想让每一个读书人大学一毕业就能担任鉴定师这是不现实的。可以说再好的优秀生经过三五年书本上的学习, 绝不能成才。主要是课堂里学的知识太有限, 学校里的设备、实物、标本都远远跟不上需要, 只是光从书本上学还不能建立起明确的概念。不曾见过实物的人, 虽然理论上一套一套能说的很多, 针对某一具体问题则表现得茫然了。珠宝的鉴定, 确实需要知识面的广度和深度都非常高, 与一般学科不可同日而语。就是从事文物艺术品活动几十年的老一辈也感到知识远远不够, 真是只有“活到老, 学到老”, 永做小学生。

学校里最大的缺陷就是没有实物, 就算有实物的地方, 也不让动手去摸去闻去看……也就无法辨认真假。从事珠宝鉴定必须是实践性特别强的, 对真的要细摸细看, 对假的也要细摸细看。不见真的识不破假的, 没有假的也比不出真的来。学校里这点是不可能满足学生要求的, 只有在真正的大收藏家家里才有可能学到、看到、摸到……。鉴定文物及艺术品有许多真知是来自个人的经验总结, 这些东西尤其是一些秘诀, 很难在书上出现。就算是课堂里请来大专家, 在当众之下也不一定会吐真言, 想学到专家行家们积蓄一生的精髓谈何容易。也只有在心诚求教的感昭下, 师父才会教给你一招一术。师父教弟子不仅看你的心诚不诚, 还要看你的求学精神、为人道义、知识基础等等, 才能决定此人可教不可教。否则就难了, 因为在这里能真正体会到知识就是财富。文物及艺术品投资这一行是非常特殊的一行, 同时能真正涉入到这一行且又有相当水平的鉴定人才确实太少太少。老一辈鉴定师相对当前形势而言也永远跟不上形势, 尤其是针对现代高仿手段之精良, 还用完全传统的鉴定手段, 仅凭经验去鉴别恐怕也感到束手无策、难保不会“走眼”。

四、专业宝石鉴定实验室的建设

高级珠宝要鉴定其历史价值, 除了从设计款式而论, 就是看镶嵌于高级珠宝上宝石的稀有性及保用价值。随着大自然的变化, 人类的开采, 天然矿绝无仅有, 发掘纯天然、高质素及卡数的宝石的机会愈来愈少, 有些宝石产地甚至已绝迹。故此, 一颗高品质稀有的宝石, 如克什米尔的蓝宝石及缅甸红宝等, 其历史保用价值都是非常高的。要断定一件高级珠宝的历史价值, 就要先断定其宝石的天然性及品质的真确性, 故此宝石证书可说是一件高级珠宝作品的价值证明书。以确定真假古董珠宝, 鉴赏者的经验、仪器的协助及证书的明证实是必需。

在当今珠宝首饰市场上, 无论是优化处理的还是合成的宝石材料。其种类和数量都在增加。在某些情况下, 它们呈现出与贵重天然宝石极其相似的外观特征, 尽管某些经处理的或合成的宝石材料常显示出其独特的宝石学性质。但对于珠宝商, 尤其是对那些缺乏宝石学专业培训或刚刚入门使用常规宝石鉴定方法或设备的珠宝商, 鉴定起来十分困难。因此, 到专业宝石鉴定实验室去鉴定宝石样品就显得非常必要。在专业实验室中, 先进的科学仪器必须由受过培训的专业人员操作, 宝石的准确鉴定对维护天然宝石的商业价值及消费者的信心都至关重要介绍了几种优化处理及合成宝石材料的鉴定实例。这些材料对当今的宝石鉴定提出了挑战。专业人士说:“真正要做到理论和实践操作相结合, 一个完备的工作室体制首先是意识上的开放, 其次是制作上的开放。学生所想的东西在导师的指导下, 由技师来指导制作, 制作的过程中遇到什么问题, 由学生和技师共同来解决问题。这样可以有效地达到阶段性研究目标。”“珠宝鉴定师是一个风险很大的职业。”从事这一行有心理压力, 一旦某件珠宝的鉴定结果出了问题, 鉴定师就要负责。

展望未来, 任重而道远, 为了使我国珠宝鉴定工作上一个新台阶, 进一步推动学校和企业对外交流与国际合作工作的发展, 扩大学校和企业在国际上的知名度和影响力, 应继续拓展对外交流渠道, 聘请高层次人才。

摘要：随着人们生活水平的不断提高, 对珠宝饰品的需求与日俱增, 珠宝首饰正成为继住房、汽车之后的又一消费热点。国内外珠宝供应商不断增多, 市场竞争日益激烈, 从先期鉴别、设计制作, 到后期的销售、评估等环节的珠宝人才全面紧缺, 有丰富行业经验和较高技术水平的从业人士非常抢手。所以, 对于珠宝鉴定师的培养工作迫在眉睫。

关键词：珠宝鉴定师,人才,培养

参考文献

[1]何明跃, 余晓艳:努力培养新世纪高素质、高技能珠宝人才, 中国地质教育, 2002 (2) :41～43

[2]李娅莉, 袁心强:中国珠宝教育的特点及发展方向, 宝石和宝石学杂志, 2002 (1) :45～47

[3]邵学民:引进国外智力发展珠宝教育, 宝石和宝石学杂志, 2001 (3) :4～6

[4]Joan Evans.A History of JeWellery1100—1870[M].New York:Dover Publications, 1989

培养鉴定篇2

除了在思想上，行动上靠近党组织以外，xx-x还在能力上要求入党。近半年来，xx-x把更多的时间和经历投入到知识的汲取上，从课堂的授课到课后的读书自学，从专业书本到课外读物，他都投之以最大的兴趣和毅力，并在本学期的期末考试中取得了很好的成绩，各科学分平均在以上。

通过经常性的对政治基础的学习，使xx-x一方面深刻体会了老一辈共-产-党人创业的艰辛，一方面也看到了转型中的中国社会所面临的许多问题，并坚信在共-产-党的领导下这些问题可以得到妥当的解决，并愿意为此奉献自己的力量，为中国和-谐社会的建构，为中国的富强奉献自己的毕生精力。

近半年来xx-x在挫折与困难中培养自己独立坚强的个性，在学习中锻炼自己的毅力和品质，在人际关系中坚持“以诚待人”的理念，以求自身人格塑造的不断完善，入党个人鉴定《入党积极分子培养鉴定》。人无完人，虽然仍然存在各方面的不足，但他能努力克服缺点，不断追求进步。希望在党组织的培养和帮助下，xx-x能发扬优点，摒弃缺点，为争取早日成为一名合格党员而努力奋斗，不辜负党组织的期望。

xx-x能按照共-产-党员的标准要求自己，积极组织、参与活动，处处起到表率作用。无论是在学习、劳动还是生活中，都能严于律己，团结同学，勤奋争先，积极上进，并以帮助他人为快乐，是老师的好助手，同学的好伙伴，深受老师和同学的好评，并多次受到老师和学校的表彰。

xx-x思想要求进步，认真学习党的路线、方针和政策。能够以科学的发展观认识世界，关心时政发展，紧跟时政动态，并且努力学习和钻研专业知识，力争理论联系实际，用所学的专业知识来分析和解释现实经济社会问题。

xx-x以助人为乐，对待需要帮助的同学能够给予极大的热忱。他对自己一直严格要求，有理想，又追求，乐观向上，自信坚强，并且爱好广泛，是各类文体活动的积极分子，是德、智、体全面发展的优秀青年。

加入中国共-产-党是xx-x一直以来追求奋斗的目标，在任何时候都能以党员的标准要求自己。在理论学习的过程中认真领悟共-产主义真谛，用马克思主义的思想武装自己的头脑，将崇高的理想落实在生活的每一点一滴。在他的不懈努力下，无论在思想、政治、学习等各个方面都取得了优异的成绩。

该同学思想进步，特别是通过学习马克思主义哲学，“三个代表”，思想更提高了一个层次，时刻以党员的思想来要求自己。

在学习方面尤其肯下苦工夫，学习成绩优秀，不但努力学习本专业知识，而且还广泛阅读课外书，文笔清新秀丽。在学习方面起带头模范作用，关心和帮助同学的学习。

该同学积极主动向党组织靠拢，能经受得起严峻考验。生活作风严谨，严于律己，宽于待人，积极主动关心和帮助同学，用热情感化了很多同学。虽然现在还只是入党积极分子，但却以党员的身份来严格要求自己。与班主任，其他同学开展了不少积极有意义的集体活动，比如辩论会，班级茶话会，外出游玩等。

该同志学习刻苦勤奋，成绩优异，除了学习课内的知识外，还经常喜欢阅读其他的课外书，有一定的诗书文笔。

培养鉴定篇3

【关键词】过程化；高技能；维修电工；资格鉴定

一、引言

技能人才，特别是高技能人才是国家核心竞争力的重要体现。培养造就一大批具有高超技艺和精湛技能的高技能人才，是我国产业升级和产业链提升的人力资源保证，是增强我国核心竞争力和自主创新能力的重要举措。

近年来，我国高等职业教育蓬勃发展，高等职业教育作为高等教育中的一个类型，肩负着培养面向生产、建设、服务和管理第一线需要的高技能人才的使命。1993年，党的十四届六中全会提出要实行学历文凭和职业资格证书并重的制度，之后《劳动法》和《职业教育法》又对实行职业资格证书制度做出明确规定。2006年，国家教育部在16号文件中指出：高等职业教育要逐步构建专业认证体系，与劳动、人事及相关行业部门密切合作，使有条件的高等职业院校都建立职业技能鉴定机构，开展职业技能鉴定，推行“双证书”制度，强化学生职业能力的培养。为适应社会经济发展需要，体现高职教育的办学目的和服务社会功能，各高职院校纷纷开展了职业技能培训和鉴定工作，大力鼓励学生参加职业资格认定，提高高职教育水平，增强毕业学生的就业、创业和工作能力。

二、高职院校维修电工职业技能培养和资格鉴定现状

“维修电工”是首批实行劳动就业准入制度的工种之一，其高技能人才培养和资格鉴定工作已开展多年，各高职院校对该工种的技能培训也较为成熟。国家也建立了相应的题库以便对鉴定考核工作进行规范。但随着各高职院校对高职学生维修电工职业技能培养与资格鉴定工作的深入与成熟，以目前的培训方法和鉴定方式，在培训效果和鉴定结果方面已逐渐展现出较多弊端，主要表现在以下三个方面：

（一）鉴定方式单一，形式化严重，重结果、轻过程。

目前，维修电工职业资格鉴定仍采用“理论+实操”这种“一次性”考核方式。这种“一考定成败”的考核方式无法全面地考察学生职业能力、职业技能和职业素质水平，不利于学生技能水平的真正提高。忽略了职业资格培养的过程，只看重考核结果，有悖于职业技能鉴定初衷，造成较多获取了职业资格证书的学生持证但不能上岗，也大大降低了职业资格证书在社会上的认同度。

（二）职业资格证书单一，无法全面反映学生水平。

维修电工基本上涵盖了与电类相关的所有知识点与技能点，维修电工职业资格证书是学生全面掌握电类知识及技能的凭证。然而，由于考核时间、地点和设备的约束，每次考核的知识点和技能点有限，有的学生进行突击准备，虽未掌握所有维修电工所要求的知识点和技能点，依旧通过考核获得了职业资格证书；而有的学生已扎实掌握维修电工某方面的所有知识和技能，却因为没有通过考核无法获得职业资格证书，而不能从事该方面的工作。

（三）培训内容与高职课堂教学内容重复。

目前维修电工职业资格证书已经成为大部分高职院校电类专业学生毕业的必备条件之一，并且维修电工所要求的知识点和技能点基本上同时是电类专业学生在校期间所学专业课程要求掌握的内容。因此，培训内容与日常专业教学内容几乎完全重复，不仅造成资源浪费，更挫伤学生的学习积极性，使培训流于形式。

三、“过程化”的维修电工高技能人才培养与资格鉴定模式

环顾世界，各发达国家都已制定了适合于本国的职业资格证书制度。如德国的“双元制”实行教考分离制度，学生在企业接受职业技能和相关的专业知识培训，在学校接受职业专业理论和普通文化知识教育，其职业教育考试内容灵活，结果实用。英国BTEC在职业技术资格方面有广泛性和权威性。其考核以学生为主体，对学生学习成果的考核，以学生取得的实际成果为标准，这些成果都是学生在完成学习任务的过程中逐渐积累的。

鉴于目前维修电工职业技能培养和资格鉴定存在的弊端，本文拟借鉴国外发达国家的职业资格证书制度，与当地职业技能鉴定中心合作，结合电类专业教学实际，对维修电工职业技能培养和资格鉴定进行改革，以“过程化”的技能培养和资格鉴定方式代替目前“一次性”的培训和鉴定方式，即将维修电工所要求的知识点和技能点一一融入于电类专业的多门课程当中，以课程的考核代替职业资格鉴定；将职业资格证书由“一本制”改为“多本制”，即增加“维修电工—电子技术”、“维修电工—电工技术”、“维修电工—电机与机床技术”、“维修电工—电力技术”和“维修电工—PLC技术”等分类证书，持有某分类证书便可从事相关行业工作，若取得所有分类证书可换领最终的“维修电工职业资格证书”。具体实施方案如下：

（一）维修电工鉴定考核知识点和技能点与电类专业课程对应。

维修电工所要求的理论知识鉴定点与操作技能点众多，大致可以分为电子技术部分、电工技术部分、电机与机床部分、电力技术部分、PLC部分等等。若要将维修电工所要求的知识点和技能点融入于电类专业的多门课程当中，则必须先将维修电工所要求的理论知识鉴定点与操作技能点进行分类，并将各分类内容的知识点和技能点与相应课程的教学知识点和技能点一一对应，这样才能将整个维修电工的培训过程融于课堂教学当中。

（二）设计满足维修电工职业资格鉴定标准的高职电类专业课程考核体系。

目前，高职院校电类专业每门课程的考核基本已经转变为理论考核加技能考核的方式，但依然没有摆脱期末一次性考核以及理论考试占大头的模式。为了能更好的将“过程化”的维修电工技能培养和资格鉴定融合入专业课程的教学与考核当中，我们应重新设计高职电类专业每门课程的考核方式与体系。首先要使之包含维修电工鉴定考核的所有知识点和技能点，其次理论考核和技能考核应分到学期各个阶段，分模块分项目进行，将维修电工职业资格鉴定的“一次性考核”融于日常课程教学的“过程化”考核当中。

（三）设计合理的维修电工职业资格证书的分类证书。

根据维修电工知识点和技能点的分类，合理设计分类证书，制定分类证书制度。与当地职业技能鉴定中心协商，将维修电工职业资格证书由“一本制”改为“多本制”，即增加“维修电工—电子技术”、“维修电工—电工技术”、“维修电工—电机与机床技术”、“维修电工—电力技术”和“维修电工—PLC技术”等分类证书，持有某分类证书便可从事相关行业工作，若取得所有分类证书可换领最终的“维修电工职业资格证书”。例如，设置“维修电工—电子技术”职业资格证书，若学生通过校内电子技术部分的考核，可颁发“维修电工—电子技术”职业资格证书，持该证书可从事电子技术相关的工作。

四、小结

国家职业资格证书制度是高技能人才培养的保障，各高职院校推行“双证书”制度，大力鼓励学生参加职业资格认定，提高高职教育水平，增强毕业学生的就业、创业和工作能力。然而，高职院校在学生职业技能培养与资格鉴定上存在较多弊端。以维修电工职业资格为例，主要表现为鉴定方式单一、职业资格证书单一以及培训内容与高职课堂教学内容重复等。结合高职院校电类专业的教学实际，提出了“过程化”的维修电工高技能人才培养与资格鉴定模式。从而在高职院校更好地推行双证书制度，更好地培养高技能人才。

【参考文献】

[1]庄建源.维修电工技能考核现状与国家题库建设刍议[J].职业，2010（12）

[2]程桢.国外职业资格证书制度与我国的“双证书”制度的探析[J].哈尔滨职业技术学院学报，2011（04）

[3]王佳庆.多段分组式教学考核方法简析[J].职业教育研究，2011（08）

[4]易志芬.利用模块化教学及考核模式将一次性技能鉴定转变为学习过程鉴定—以技校维修电工专业教学为例[J].职业，2011（15）

[5]王维毅.高职应用电子技术专业学生职业能力过程化考核与实施[J].教育教学论坛，2011（02）

（基金项目：2014年浙江省人力资源和社会保障科学研究课题（R2014S013）；义乌市一般科技计划项目（2014Y53031））

初中生数学思维的鉴定与培养篇4

教学可以分解为“教”与“学”, “教”是教师的教学行为, “学”是学生的学习行为, 数学思维与将数学教学的关系就可以说成是数学思维与“教”“学”的关系。第一, 数学思维与“教”的关系; 数学思维是教师一切教学行为和活动的根本目的, 是教师进行数学教学的主要内容, 教师要在有限的教学时间内, 通过一系列的思维形式和逻辑方法的使用和传播, 让学生逐渐形成一种较强的数学思维, 帮助学生更加有效的学习初中数学。第二, 数学思维与“学”的关系;在传统的教学模式中, 学生学习数学只是为了简单的学会加减乘除, 而新时期的新教育背景要求学生要真正的学会数学, 掌握一定的数学思维, 不仅能够通过所学轻松应对考试, 还能利用良好的数学思维灵活的运用数学知识。总之, 数学思维在数学教学中扮演着非常重要的角色, 对教师的“教”和学生的“学”都起到了至关重要的作用。

二、初中生数学思维的有效鉴定

鉴定, 是指在学生经过一段时间的学习过后, 教师对学生的学习成果所做出的相关总结和评价。对初中生的数学思维进行科学的鉴定, 就是教师在一个时期的数学思维教学后, 通过一定的形式和方法来对学生的数学思维发展程度所进行的考核和检验, 并给出总结或评定的一种教学行为。利用科学合理的方法所得到的鉴定结果, 可以帮助教师准确地掌握学生数学思维能力的掌握程度和发展情况, 以便教师根据鉴定结果规划以后的数学思维培养力度和方式, 推动学生的数学思维得到进一步的发展和提高。一般情况下, 教师可以通过笔试测验、口述讨论, 甚至可以是数学游戏等形式来对学生的数学思维进行鉴定。此外, 教师还可以根据每个学生的不同表现, 给出教师自己的专业总结或评价, 给学生提出改进和提高的方法和建议, 让学生快速有效地找到补救方向, 不断努力, 达到锻炼和提高数学思维能力的效果。

三、培养和提高初中生数学思维的具体策略

1. 创设教学情境, 培养初中生良好的思维习惯

在传统的教学模式中, 初中数学通常是以按部就班的方式来进行本本教育的, 即根据书本上的知识排列顺序逐字逐句地为学生进行讲解, 这种言传声教的教学方法既老套又枯燥, 很难引起学生的高度重视, 得不到较高的教学效果。新课程改革要求教师把数学思维作为初中数学教学的重点内容, 为了能够更好地完成这一教学任务, 教师必须首先从改进教学模式着手进行。当代教师在进行初中数学教学的过程中, 要善于运用情景教学模式, 如通过大量提问来创建问题情境、通过话题引入来创建教学氛围等, 让学生在轻松愉悦的教学气氛中学习数学, 在教师的牵引和指导下进入思考模式, 逐渐形成一种良好的思维习惯, 并最终养成一种较为科学的数学思维。例如, 在教学《相交线与平行线》这一课时, 教师首先可以通过播放一段自制的动画视屏或者一段简短的影视资料来作为课题引入, 先将学生的注意力集中到教学内容上, 再适当地提出一些相关问题, 激发学生的兴趣和思维。长此以往, 初中生就会形成一种爱联想、善结合、常问为什么的细微方式, 这种思维方式有助于学生养成良好的数学思维。

2. 培养初中生的思维灵活性和多向性

初中数学教学不仅要培养学生养成良好的数学思维, 还应培养学生思维的多向性, 要教会学生从多方面、多角度去思考和看待问题, 尽可能地将数学思维解放。这种所谓的开放性思维, 实际上也包含了举一反三的数学创新思维。一方面, 通过教师的言传身教, 对学生的思维套路进行既定的熏陶和引导, 让学生养成思维惯性;另一方面, 要善于鼓励学生自发地寻找数学乐趣, 或者说是数学知识的两点, 令学生喜好探求, 善于变通深思。以综合应用题的讲解教学为例, 学生常常苦于综合题型中知识交错, 难以分解透彻, 只能依靠教师日常传授的解题思路按部就班地完成解题, 如此与其说是在培养学生, 还不如说是在打造一群“数学机器”。学生的在这种环境下养成的“定向思维”, 将会阻碍学生在数学学习道路上获得更高的成就。因此, 教师可以通过如下两个方面培养学生灵活的多向性思维: ( 1) 尽可能多地向学生宣讲多种入手解题的途径, 以及多种具体解题思路, 先向学生展现数学思维的活跃性与多向性; ( 2) 鼓励学生参与积极讨论, 找寻可能存在的各种解题办法, 教师从旁指点, 激发学生探知热情。

3. 建立系统的评价体系

学生数学思维的鉴定与培养, 都应当有一定的标准, 或者是检验途径, 实现总结、研究、实践相结合的教育模式, 因此建立系统的评价体系尤为重要。可以分为如下三个层次: 一是基本层次, 及学生对数学理应具备的尊重心态, 以及学习数学知识的基础思维模式, 如数学基础知识的掌握和运用;二是巩固层次, 即学生在掌握基础知识之余, 逐渐形成的数学技能和素养;三是拓展层次, 即学生拥有的数学方面创造性能力, 包含自主研究能力和自主创新能力等。

四、总结

总之, 数学思维的鉴定与培养是当代初中数学教学的一个重要任务, 教师要不定期地对学生的数学思维发展情况进行鉴定和评价, 及时的设置和更新初中生的数学思维培养新目标, 不断地提高当代初中生的数学思维能力。数学思维是数学教师展开教学的必备条件和根本目的, 只有初中生的数学思维得到连续不断、高质高效的开发和锻炼, 初中数学教学才能取得更加优异的教学效果。当代初中数学教师要严格遵循新课改的要求任教, 始终把数学思维教学放在第一位, 随时随地地采取教学措施来对初中生的数学思想和逻辑思维进行锻炼和培养, 不断提高学生的数学思维能力, 以最终获取更好的教学效果。

摘要：良好的数学思维能力是学生学好数学的一个必备要素, 近段时间以来, 数学思维成为了当代数学教师的一个重要教学内容, 特别是在新课程改革以后, 培养和提高学生数学思维能力的重要性体现得更加明显。在初中数学教学阶段, 是培养学生数学思维的关键性阶段, 初中生处于好奇心和学习性极强的生理时期, 教师应该把握时机, 在充分认识数学思维与数学教学的关系的基础上, 对学生的数学思维发展状况进行科学的鉴定, 在结合一系列的方法和措施来对初中生的数学思维进行锻炼和培养。

关键词：初中生,数学思维,鉴定,培养策略

参考文献

[1]谢芸兰.新课改背景下初中生数学思维的培养[J].中学生数理化 (教与学) , 2013, (11) .

[2]吴健.初中教学中培养学生数学思维能力的实践研究[D].东北师范大学, 2011.

培养培训综合评价和鉴定考核方案篇5

学生综合评价和鉴定考核方案

为加快构建现代职业教育体系，改革学生评价模式，根据自治区党委关于《加快构建现代职业教育体系的若干意见》，根据国家职业资格标准和学校制定的“工学结合的人才培养模式”特制定本评价考核办法：

一．评定考核范围评定考核范围包括我校招录的初中学历毕业的 “2.5+0.5”培养模式相关专业的学生和社会培训的学员。

二．考核评定工作 1.学生顶岗实训成绩由学生顶岗实习期间的实习指导教师按照学生顶岗实习成绩评定办法进行考核评定。

2.学生强化实训的平时成绩分为理论成绩和实操成绩。理论成绩按照模拟考试成绩进行总评。实操成绩由校内实习指导教师按照我校制定的实训成绩考核办法对学生的出勤，安全文明生产以及单元训练课题进行综合评定。

3.学生职业技能鉴定考核由我校国家职业技能鉴定所依据国家职业技能鉴定考核标准组织实施。聘请的考评员应至少包括一名在企业的具有相关专业考评资格的考评员参与鉴定考核。

4.面向企事业单位的员工及各类社会培训人员，培训课时应不少于国家标准规定课时，培训结束后，根据具体情况进行最终评定成绩的评价或鉴定考核。

三．申报条件 1，申报学生的各科理论成绩和操行应符合毕业考核标准。

2.申报学生按学校计划完成了在分配企业的顶岗实习内容和规定课时 3.申报学生在顶岗实训和强化实训期间无重大违纪和安全事故。

4，申报学生符合国家职业资格的其它相关条件（工龄要求除外）

5.面向社会培训的各类人员，申报条件必须符合国家职业标准的规定。

四．成绩核算 1.顶岗实习成绩考核与成绩评定

学生在顶岗实习期间接受学校和企业的双重指导，校企双方要加强对学生的工作过程控制和考核，实行校企双方考核制度。双方共同填写《学生实习签定表》。

学生顶岗实习作单独一门成绩计。考核分两部分：一是企业评价占 40%；二是学校指导教师对学生的评价，占总成绩的 60%。

学生要写出实习报告，学校指导教师要对学生实习报告及时进行批阅、检查，给出评价。

2.强化实训成绩考核与成绩评定学生强化实训期间的理论成绩按照模拟考试次数进行总评（数次模拟考试的成绩总和除以模拟考试次数），实操成绩考核内容包括职业素养和课题单元训练考核。即按（职业素养 40%+课题单元总评60%）的比例进行核算。

3.学生职业鉴定考核与成绩评定学生职业技能鉴定按照国家职业标准规定考核内容分为理论考试和实操考试。最终评定办法按照：理论模拟考试总评 20%+理论鉴定成绩 80%=理论成绩。实操考核的最终成绩按照（定岗实习考核成绩10%+强化实训考核成绩 10%+职业技能鉴定成绩 80%）的比例进行核

算。

4、企事业单位的员工及各类社会人员成绩评定（1）凡是参加初、中、高级、技师和高级技师职业技能鉴定的人员，按照国家职业标准规定的条件，严格审查上报，由我校国家职业技能鉴定所依据国家职业技能鉴定考核标准规范组织实施，鉴定成绩作为最终评定成绩。技师和高级技师增加论文答辩考核并按有关规定核算答辩成绩。

（2）不参加职业技能鉴定的培训学员，按照培训等级，由职业培训与鉴定中心依据国家职业技能鉴定考核标准组织相关人员进行命题，并组织实施，考核成绩作为最终评定成绩。

六、评价反馈 1.在校学习学生对教学的反馈评价按照学校相关的管理规定和评价内容进行。

2.各类培训学员和企业对培训的评价反馈由职业培训与鉴定中心组织评价。

（1）考核成绩汇总表

(2)

平时成绩考核表

(3)企业学员评教反馈表（4）委培企业评价反馈表（5）各工种职业资格鉴定考核标准

西北煤矿机械制造机高级技工学校

2012 年 5 月 10 日

附件一

西北煤矿机机械制造高级技工学校鉴定考核成绩汇总表鉴定班级:

鉴定工种：

鉴定人数：

实习指导：

序号姓名

理论考核实操考核综合模拟鉴定总评顶岗实训鉴定总评 1

成绩汇总：

汇总日期附件二

平时成绩考核表专业班级

实习指导

实习时间

年月

日至

****年**月**日

序号学生姓名实习纪律劳动保护安全文明设备保养课题作业合计 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4

注: 1平时成绩考核共计五项,每项每天考核四次，满分４分,根据表现情况酌情扣分

每周汇总一次, 考核成绩累加除于考核次数为最终考核成绩。

附件三：

西北煤矿机械制造机高级技工学校企业培训学员评议及反馈表（正面用原表）

学员姓名

培训时间

培训工种

自我鉴定：（包括培训的收获、存在不足及努力方向）

对校企合作有何合理化建议：

培训学员满意度问卷调查：（反面）

1、你对本期培训的总体评价：

（1）很好（）；（2）好（）；

（3）一般（）；（4）不好（）。

2、你对培训单位方提供的场所、设备及实习条件的评价：

（1）很好（）；（2）好（）；（3）一般（）；（4）不好（）。

3、你对企业指导教师的评价：

（1）很好（）；（2）好（）；（3）一般（）；（4）不好（）。

4、你对校方指导教师的评价：

（1）很好（）；（2）好（）；

（3）一般（）；（4）不好（）。

5，．你认为培训的理论课时和实践课安排比例

（1）合理；（2）较合理；（3）不合理；（4）建议课时比例

：

6.你对培训的组织管理工作（1）很好（）；（2）好（）；

（3）一般（）；（4）不好（）。

7.你认为培训的后勤服务质量（1）很好；（2）好（）；（3）一般（）；（4）不好（）。

8、你认为这次培训对你今后的学习及工作有帮助吗？（1）很有帮助（）；（2）有一定的帮助（）；（3）没有帮助（）。

9、经过这次培训你认为你比培训前有进步了吗？（1）进步很大（）；（2）有所进步（）；（3）没有进步（）。

10、你认为培训考核成绩或技能鉴定成绩是否公正：

（1）非常公正（）；（2）比较公正（）；（3）不公正（）。

****年**月**日

附件四

西北煤矿机械制造机高级技工学校

委托培训企业评价反馈表企业名称

培训工种

培训时间

培训意见

培训建议

培训评价：

（1）

满意

（2）较满意

（3）不满意

企业签章：

填表人：

所在部门：

联系电话：

****年**月**日附件四：机电专业各工种高级工以上国家职业资格鉴定标准

一．数控车工，数控铣工国家职业标准(一)高级数控车工国家职业标准 1.1

职业名称

数控车工。

1.2

职业定义

从事编制数控加工程序并操作数控车床进行零件车削加工的人员。

1.3

职业等级

本职业共设四个等级，分别为：中级（国家职业资格四级）、高级（国家职业资格三级）、技师（国家职业资格二级）、高级技师（国家职业资格一级）。

1.8.2

申报条件 ──中级（略）

──高级（具备以下条件之一者）

（1）

取得本职业中级职业资格证书后，连续从事本职业工作 2年以上，经本职业高级正规培训达规定标准学时数，并取得结业证书。

（2）

取得本职业中级职业资格证书后，连续从事本职业工作 4年以上。

（3）

取得经劳动保障行政部门审核认定的、以高级技能为培养目标的职业学校本职业或相关专业毕业证书。

（4）

大专以上本专业或相关专业毕业生，经本职业高级正规培训达规定标准学时数，并取得结业证书。

3．工作要求 3．2 高级 3．3

职业功能工作内容技能要求相关知识一、加工准备(一)读图与绘图 1．能读懂中等复杂程度（如：刀架）的装配图 2．能根据装配图拆画零件图 3．能测绘零件 1 ．根据装配图拆画零件图的方法 2 ．零件的测绘方法(二)制定加工工艺能编制复杂零件的数控车床加工工艺文件复杂零件数控车床的加工工艺文件的制定

职业功能工作内容技能要求相关知识（三）零件定位与装夹 1．能选择和使用数控车床组合夹具和专用夹具 2．能分析并计算车床夹具的定位误差 3．能设计与自制装夹辅具（如心轴、轴套、定位件等）．数控车床组合夹具和专用夹具的使用、调整方法 2 ．专用夹具的使用方法 3 ．夹具定位误差的分析与计算方法（四）刀具准备 1．能选择各种刀具及刀具附件 2．能根据难加工材料的特点，选择刀具的材料、结构和几何参数 3．能刃磨特殊车削刀具 1 ．专用刀具的种类、用途、特点和刃磨方法 2 ．切削难加工材料时的刀具材料和几何参数的确定方法二、数控编程（一）手工编程能运用变量编程编制含有公式曲线的零件数控加工程序 1 ．固定循环和子程序的编程方法 2 ．变量编程的规则和方法

职业功能工作内容技能要求相关知识（二）计算机辅助编程能用计算机绘图软件绘制装配图

计算机绘图软件的使用方法

（三）数控加工仿真能利用数控加工仿真软件实施加工过程仿真以及加工代码检查、干涉检查、工时估算数控加工仿真软件的使用方法三、零件加工（一）轮廓加工能进行细长、薄壁零件加工，并达到以下要求：

(1)轴径公差等级：IT6(2)孔径公差等级：IT7(3)形位公差等级：IT8(4)表面粗糙度：R1.6 细长、薄壁零件加工的特点及装夹、车削方法

职业功能工作内容技能要求相关知识（二）螺纹加工 1.能进行单线和多线等节距的T 形螺纹、锥螺纹加工，并达到以下要求：

(1)尺寸公差等级：IT6(2)形位公差等级：IT8(3)表面粗糙度：R1.6 2.能进行变节距螺纹的加工，并达到以下要求：

(1)尺寸公差等级：IT6(2)形位公差等级：IT7(3)表面粗糙度：R1.6 1 ． T 形螺纹、锥螺纹加工中的参数计算 2 ．变节距螺纹的车削加工方法

职业功能工作内容技能要求相关知识（三）孔加工能进行深孔加工，并达到以下要求：

(1)尺寸公差等级：IT6(2)形位公差等级：IT8(3)表面粗糙度：R1.6 深孔的加工方法（四）配合件加工能按装配图上的技术要求对套件进行零件加工和组装，配合全差达到 IT7 级套件的加工方法

（五）零件精度检验 1．能在加工过程中使用百分表、千分表等进行在线测量，并进行加工技术参数的调整 2．能够进行多线螺纹的检验 3．能进行加工误差分析 1 ．百分表、千分表的使用方法 2 ．多线螺纹的精度检验方法 3 ．误差分析的方法

职业功能工作内容技能要求相关知识四、数控车床维护与精度检验（一）数控车床日常维护 1．能制定数控车床的日常维护规程 2．能监督检查数控车床的日常维护状况 1 ．数控车诃维护管理基本知识 2 ．数控机床维护操作规程的制定方法（二）数控车床故障诊断 1．能判断数控车床机械、液压、气压和冷却系统的一般故障 2．能判断数控车床控制与电器系统的一般故障 3．能够判断数控车床刀架的一般故障 1 ．数控车床机械故障的诊断方法 2 ．数控车床液压、气压元器件的基本原理 3 ．数控机床电器元件的基本原理 4 ．数控车床刀架结构

职业功能工作内容技能要求相关知识（三）机床精度检验 1 ．能利用量具、量规对机床主轴的垂直平等度、机床水平等一般机床几何精度进行检验 2．能进行机床切削精度检验 1 ．机床几何精度检验内容及方法 2 ．机床切削精度检验内容及方法 3．3 技师职业功能工作内容技能要求相关知识一、加工准备(一)读图与绘图 1．能绘制工装装配图 2．能读懂常用数控车床的机械结构图及装配图 1 ．工装装配图的画法 2 ．常用数控车床的机械原理图及装配图的画法

职业功能工作内容技能要求相关知识(二)制定加工工艺 1．能编制高难度、高精密、特殊材料零件的数控加工多工种工艺文件 2．能对零件的数控加工工艺进行合理性分析，并提出改进建议 3．能推广应用新知识、新技术、新工艺、新材料 1 ．零件的多工种工艺分析方法 2 ．数控加工工艺方案合理性的分析方法及改进措施 3 ．特殊材料的加工方法 4 ．新知识、新技术、新工艺、新材料（三）零件定位与装夹能设计与制作零件的专用夹具专用夹具的设计与制造方法（四）刀具准备 1．能依据切削条件和刀具条件估算刀具的使用寿命 2．根据刀具寿命计算并设置相关参数 3．能推广应用新刀具 1 ．切削刀具的选用原则 2 ．延长刀具寿命的方法 3 ．刀具新材料、新技术 4 ．刀具使用寿命的参数设定方法二、数控编程（一）手工编程能编制车削中心、车铣中心的三轴及三轴以上（含旋转轴）的加工程序编制车削中心、车铣中心加工程序的方法

职业功能工作内容技能要求相关知识（二）计算机辅助编程 1．能用计算机辅助设计/制造软件进行车削零件的造型和生成加工轨迹 2．能根据不同的数控系统进行后置处理并生成加工代码 1 ．三维造型和编辑 2 ．计算机辅助设计/制造软件（三维）的使用方法

（三）数控加工仿真能利用数控加工仿真软件分析和优化数控加工工艺数控加工仿真软件的使用方法三、零件加工（一）轮廓加工 1．能编制数控加工程序车削多拐曲轴达到以下要求：

（1）直径公差等级：IT6（2）表面粗糙度：R1.6 2．能编制数控加工程序对适合在车削中心加工的带有车削、铣削等工序的复杂零件进行加工 1 ．多拐曲轴车削加工的基本知识 2 ．车削加工中心加工复杂零件的车削方法（二）配合件加工能进行两件（含两件）以上具有多处尺寸链配合的零件加工与配合多尺寸链配合的零件加工方法

职业功能工作内容技能要求相关知识（三）零件精度检验能根据测量结果对加工误差进行分析并提出改进措施 1 ．精密零件的精度检验方法 2 ．检具设计知识四、数控车床维护与精度检验（一）数控车床维修 1．能实施数控车床的一般维修 2．能借助字典阅读数控设备的主要外文信息 1 ．数控车床常用机械故障的维修方法 2 ．数控车床专业外文知识（二）数控车床故障诊断和排除 1．能排除数控车床机械、液压、气压和冷却系统的一般故障 2．能排除数控车床控制与电器系统的一般故障 3．能够排除数控车床刀架的一般故障 1 ．数控车床液压、气压元件的维修方法 2 ．数控车床电器元件的维修方法 3 ．数控车床数控系统的基本原理 4 ．数控车床刀架维修方法

职业功能工作内容技能要求相关知识

（三）机床精度检验 1．能利用量具、量规对机床定位精度、重复定位精度、主轴精度、刀架的转位精度进行精度检验 2．能根据机床切削精度判断机床精度误差 1 ．机床定位精度检验、重复定位精度检验的内容及方法 2 ．机床动态特性的基本原理五、培训与管理（一）操作指导能指导本职业中级、高级工进行实际操作操作指导书的编制方法（二）理论培训 1．能对本职业中级、高级工和技师进行理论培训 2．能系统地讲授各种切削刀具的特点和使用方法 1 ．培训教材编写方法 2 ．切削刀具的特点和使用方法（三）质量管理能在本职工作中认真贯彻各项质量标准相关质量标准（四）生产管理能协助部门领导进行生产计划、调度及人员的管理生产管理基本知识（五）技术发造与创新能进行加工工艺、夹具、刀具的改进数控加工工艺综合知识

3．4 高级技师职业功能工作内容技能要求相关知识一、工艺分析与设计(一)读图与绘图 1．能绘制复杂工装装配图 2．能读懂常用数控车床的电气、液压原理图．复杂工装设计方法 2 ．常用数控车床电气、液压原理图的画法(二)制定加工工艺 1．能对高难度、高精密零件的数控加工工艺方案进行优化并实施 2．能编制多轴车削中心的数控加工工艺文件 3．能对零件加工工艺提出改进建议 1 ．复杂、精密零件加工工艺的系统知识 2 ．车削中心、车铣中心加工工艺文件编制方法（三）零件定位与装夹能对现有的数控车床夹具进行误差分析并提出改进建议误差分析方法

（四）刀具准备能根据零件要求设计刀具，并提出制造方法刀具的设计与制造知识二、零件加工（一）异形零件加工能解决高难度（如十字座类、连杆类、叉架类等异形零件）零件车削加工的技术问题、并制定工艺措施高难度零件的加工方法

职业功能工作内容技能要求相关知识（二）零件精度检验能制定高难度零件加工过程中的精度检验方法在机械加工全过程中影响质量的因素及提高质量的措施三、数控车床维护与精度检验（一）数控车床维修 1．能组织并实施数控车床的重大维修 2．能借助字典看懂数控设备的主要外文技术资料 3．能针对机床运行现状合理调整数控系统相关参数

数控车床大修方法数控系统机床参数信息表（二）数控车床故障故障诊断和排除 1．能分析数控车床机械、液压、气压和冷却系统故障产生的原因，并能提出改进措施减少故障率 2．能根据机床电路图或可编程逻辑控制器（PLC）梯形图检查出故障发生点，并提出机床维修方案 1 ．数控车床数控系统的控制方法 2 ．数控机床机械、液压、气压和冷却系统结构调整和维修方法 3 ．机床电路图使用方法 4 ．可编程逻辑控制器（PLC）的使用方法

职业功能工作内容技能要求相关知识（三）机床精度检验 1．能利用激光干涉仪或其他设备对数控车床进行定位精度、重复定位精度、导轨垂直平行度的检验 2．能通过调整和修改机床参数对可补偿的机床误差进行精度补偿 1 ．激光干涉仪的使用方法 2 ．误差统计和计算方法 3 ．数控系统中机床误差的补偿（四）数控设备网络化能借助网络设备和软件系统实现数控设备的网络化管理数控设备网络接口及相关技术四、培训与管理（一）操作指导能指导本职业中级、高级工和技师进行实际操作操作理论教学指导书的编写方法（二）理论培训能对本职业中级、高级工和技师进行理论培训教学计划与大纲的编制方法（三）质量管理能应用全面质量管理知识，实现操作过程的质量分析与控制质量分析与控制方法

（四）技术改造与创新能组织实施技术改造和创新，并撰写相应的论文科技论文撰写方法

（二）．数控铣工国家职业标准 1．职业概况 1．1 职业名称数控铣工。

1．2 职业定义从事编制数控加工程序并操作数控铣床进行零件铣削加工的人员。

1．3 职业等级本职业共设四个等级，分别为：中级（国家职业资格四级）、高级（国家职业资格三级）、技师（国家职业资格二级）、高级技师（国家职业资格一级）。

1．4 职业环境室内、常温。

1． 5 职业能力特征具有较强的计算能力和空间感，形体知觉及色觉正常，手指、手臂灵活，动作协调。

1． 6 基本文化程度高中毕业（或同等学历）。

1．7 培训要求 1．7．1 培训期限全日制职业学校教育，根据其培养目标和教学计划确定。晋级培训期限：中级不少于 400 标准学时；高级不少于 300 标准学时；技师不少于 300 标准学时；高级技师不少于 300 标准学时。

1．7．2 培训教师培训中、高级人员的教师应取得本职业技师及以上职业资格证书或相关专业中级及以上专业技术职称任职资格；培训技师的教师应取

得本职业高级技师职业资格证书或相关专业高级专业技术职称任职资格；培训高级技师的教师应取得本职业高级技师职业资格证书 2 年以上或取得相关专业高级专业技术职称任职资格 2 年以上。

1．7．3 培训场地设备满足教学要求的标准教室、计算机机房及配套的软件、数控铣床及必要的刀具、夹具、量具和辅助设备等。

1．8 鉴定要求 1．8．1 适用对象从事或准备从事本职业的人员。

1．8．2 申报条件 ——中级：（略）

——高级：（具备以下条件之一者）

（1）取得本职业中级职业资格证书后，连续从事本职业工作 2 年以上，经本职业高级正规培训，达到规定标准学时数，并取得结业证书。

（2）取得本职业中级职业资格证书后，连续从事本职业工作 4 年以上。

（3）取得劳动保障行政部门审核认定的，以高级技能为培养目标的职业学校本职业（或相关专业）毕业证书。

（4）大专以上本专业或相关专业毕业生，经本职业高级正规培训，达到规定标准学时数，并取得结业证书。

1．8．3 鉴定方式分为理论知识考试和技能操作考核。理论知识考试采用闭卷方式，技能操作（含软件应用）考核采用现场实际操作和计算机软件操作方式。理论知识考试和技能操作（含软件应用）考核均实行百分制，成绩皆达 60 分及以上者为合格。技师和高级技师还需进行综合评审。

1．8．4 考评人员与考生配比理论知识考试考评人员与考生配比为 1：15，每个标准教室不少于 2 名相应级别的考评员；技能操作（含软件应用）考核考评员与考生配比为 1：2，且不少于 3 名相应级别的考评员；综合评审委员不少于 5 人。

1．8．5 鉴定时间理论知识考试为 120 分钟，技能操作考核中实操时间为：中级、高级不少于 240 分钟，技师和高级技师不少于 300 分钟，技能操作考核中软件应用考试时间为不超过 120 分钟，技师和高级技师的综合评审时间不少于 45 分钟。

1．8．6 鉴定场所设备理论知识考试在标准教室里进行，软件应用考试在计算机机房进行，技能操作考核在配备必要的数控铣床及必要的刀具、夹具、量具和辅助设备的场所进行

2．基本要求 2．1 职业道德 2．1．1 职业道德基本知识 2．1．2 职业守则（1）

遵守国家法律、法规和有关规定；（2）

具有高度的责任心、爱岗敬业、团结合作；

（3）

严格执行相关标准、工作程序与规范、工艺文件和安全操作规程；（4）

学习新知识新技能、勇于开拓和创新；（5）

爱护设备、系统及工具、夹具、量具；（6）

着装整洁，符合规定；保持工作环境清洁有序，文明生产。

2．2 基础知识 2．2．1 基础理论知识（1）机械制图（2）工程材料及金属热处理知识（3）机电控制知识（4）计算机基础知识（5）专业英语基础 2．2．2 机械加工基础知识（1）机械原理（2）常用设备知识（分类、用途、基本结构及维护保养方法）

（3）常用金属切削刀具知识（4）典型零件加工工艺（5）设备润滑和冷却液的使用方法（6）工具、夹具、量具的使用与维护知识（7）铣工、镗工基本操作知识

2．2．3 安全文明生产与环境保护知识（1）安全操作与劳动保护知识（2）文明生产知识（3）环境保护知识 2．2．4 质量管理知识（1）企业的质量方针（2）岗位质量要求（3）岗位质量保证措施与责任 2．2．5 相关法律、法规知识（1）劳动法的相关知识（2）环境保护法的相关知识（3）知识产权保护法的相关知 3．工作要求本标准对中级、高级、技师和高级技师的技能要求依次递进，高级别涵盖低级别的要求。

3.1 中级(略)3.2 高级职业功能工作内容技能要求相关知识一、加工准备（一）读图与绘图 1.能读懂装配图并拆画零件图 2.能够测绘零件 3.能够读懂数控铣床主轴系统、进给系统的机构装配图 1.根据装配图拆画零件图的方法 2.零件的测绘方法 3.数控铣床主轴与进给系统基本构造知识。

（二）制定加工工艺能编制二维、简单三维曲面零件的铣削加工工艺文件

复杂零件数控加工工艺的制定（三）零件定位与装夹 1.能选择和使用组合夹具和专用夹具 2.能选择和使用专用夹具装夹异型零件 3.能分析并计算夹具的定位误差 4.能够设计与自制装夹辅具（如轴套、定位件等）

1.数控铣床组合夹具和专用夹具的使用、调整方法 2.专用夹具的使用方法 3.夹具定位误差的分析与计算方法 4.装夹辅具的设计与制造方法（四）刀具准备 1.能够选用专用工具（刀具和其他）

2.能够根据难加工材料的特点，选择刀具的材料、结构和几何参数

1.专用刀具的种类、用途、特点和刃磨方法 2.切削难加工材料时的刀具材料和几何参数的确定方法二、数控编程（一）手工编程 1.能够编制较复杂的二维轮廓铣削程序 2.能够根据加工要求编制二次曲面的铣削程序 3.能够运用固定循环、子程序进行零件的加工程序编制 4.能够进行变量编程

1.较复杂二维节点的计算方法 2.二次曲面几何体外轮廓节点计算 3.固定循环和子程序的编程方法 4.变量编程的规则和方法

（二）计算机辅助编程 1.能够利用 CAD/CAM软件进行中等复杂程度的实体造型（含曲面造型）

2.能够生成平面轮廓、平面区域、三维曲面、曲面轮廓、曲面区域、曲线的刀具轨迹 3.能进行刀具参数的设定 4.能进行加工参数的设置 5.能确定刀具的切入切出位置与轨迹 6.能够编辑刀具轨迹 7.能够根据不同的数控系统生成 G 代码 1．实体造型的方法 2．曲面造型的方法 3．刀具参数的设置方法 4．刀具轨迹生成的方法 5．各种材料切削用量的数据 6．有关刀具切入切出的方法对加工质量影响的知识 7．轨迹编辑的方法 8．后置处理程序的设置和使用方法

（三）数控加工仿真能利用数控加工仿真软件实施加工过程仿真、加工代码检查与干涉检查数控加工仿真软件的使用方法三、数控铣床操作（一）程序调试与运行能够在机床中断加工后正确恢复加工程序的中断与恢复加工的方法

（二）参数设置能够依据零件特点设置相关参数进行加工数控系统参数设置方法四、零件加工（一）平面铣削能够编制数控加工程序铣削平面、垂直面、斜面、阶梯面等，并达到如下要求：

（1）尺寸公差等级达IT7（2）形位公差等级达IT8 级（3）表面粗糙度达Ra3.2μm 1．平面铣削精度控制方法 2．刀具端刃几何形状的选择方法

（二）轮廓加工能够编制数控加工程序铣削较复杂的（如凸轮等）平面轮廓，并达到如下要求：

（1）尺寸公差等级达IT8（2）形位公差等级达IT8 级（3）表面粗糙度达Ra3.2μm 1．平面轮廓铣削的精度控制方法 2．刀具侧刃几何形状的选择方法

（三）曲面加工能够编制数控加工程序铣削二次曲面，并达到如下要求：

（1）尺寸公差等级达IT8（2）形位公差等级达IT8 级（3）表面粗糙度达Ra3.2μm 1．二次曲面的计算方法 2．刀具影响曲面加工精度的因素以及控制方法

（四）孔系加工能够编制数控加工程序对孔系进行切削加工，并达到如下要求：

（1）尺寸公差等级达IT7（2）形位公差等级达IT8 级（3）表面粗糙度达Ra3.2μm 麻花钻、扩孔钻、丝锥、镗刀及铰刀的加工方法

（五）深槽加工能够编制数控加工程序进行深槽、三维槽的加工，并达到如下要求：

（1）尺寸公差等级达IT8（2）形位公差等级达IT8 级（3）表面粗糙度达Ra3.2μm 深槽、三维槽的加工方法（六）配合件加工能够编制数控加工程序进行配合件加工，尺寸配合公差等级达IT8 1.配合件的加工方法 2.尺寸链换算的方法（七）精度检验 1.能够利用数控系统的功能使用百（千）分表测量零件的精度 2.能对复杂、异形零件进行精度检验 3.能够根据测量结果分析产生误差的原因 4.能够通过修正刀具补偿值和修正程序来减少加工误差 1.复杂、异形零件的精度检验方法 2.产生加工误差的主要原因及其消除方法

五、维护与故障诊断（一）日常维护能完成数控铣床的定期维护数控铣床定期维护手册（二）故障诊断能排除数控铣床的常见机械故障机床的常见机械故障诊断方法（三）机床精度检验能协助检验机床的各种出厂精度机床精度的基本知识

3．3 技师

职业功能工作内容技能要求相关知识一、加工准备（一）读图与绘图 1.能绘制工装装配图 2.能读懂常用数控铣床的机械原理图及装配图 1.工装装配图的画法 2.常用数控铣床的机械原理图及装配图的画法（二）制定加工工艺 1.能编制高难度、精密、薄壁零件的数控加工工艺规程 2.能对零件的多工种数控加工工艺进行合理性分析，并提出改进建议 3.能够确定高速加工的工艺文件 1.精密零件的工艺分析方法 2.数控加工多工种工艺方案合理性的分析方法及改进措施 3.高速加工的原理（三）零件定位与装夹 1.能设计与制作高精度箱体类，叶片、螺旋桨等复杂零件的专用夹具 2.能对现有的数控铣床夹具进行误差分析并提出改进建议 1.专用夹具的设计与制造方法 2.数控铣床夹具的误差分析及消减方法

（四）刀具准备 1.能够依据切削条件和刀具条件估算刀具的使用寿命，并设置相关参数 2.能根据难加工材料合理选择刀具材料和切削参数 3.能推广使用新知识、新技术、新工艺、新材料、新型刀具 4.能进行刀具刀柄的优化使用，提高生产效率，降低成本 5.能选择和使用适合高速切削的工具系统 1.切削刀具的选用原则 2.延长刀具寿命的方法 3.刀具新材料、新技术知识 4.刀具使用寿命的参数设定方法 5.难切削材料的加工方法 6.高速加工的工具系统知识二、数控编程（一）手工编程能够根据零件与加工要求编制具有指导性的变量编程程序变量编程的概念及其编制方法（二）计算机辅助编程 1.能够利用计算机高级语言编制特殊曲线轮廓的铣削程序 2.能够利用计算机CAD/CAM 软件对复杂零件进行实体或曲线曲面造型 3.能够编制复杂零件的三轴联动铣削程序 1.计算机高级语言知识 2.CAD/CAM 软件的使用方法 3.三轴联动的加工方法（三）数控加工仿真能够利用数控加工仿真软件分析和优化数控加工工艺数控加工工艺的优化方法

三、数控铣床操作（一）程序调试与运行能够操作立式、卧式以及高速铣床立式、卧式以及高速铣床的操作方法（二）参数设置能够针对机床现状调整数控系统相关参数数控系统参数的调整方法四、零件加工（一）特殊材料加工能够进行特殊材料零件的铣削加工，并达到如下要求：

（1）尺寸公差等级达IT8（2）形位公差等级达IT8 级（3）表面粗糙度达Ra3.2μm 特殊材料的材料学知识特殊材料零件的铣削加工方法（二）薄壁加工能够进行带有薄壁的零件加工，并达到如下要求：

（1）尺寸公差等级达IT8（2）形位公差等级达IT8 级（3）表面粗糙度达Ra3.2μm 薄壁零件的铣削方法

（三）曲面加工 1．能进行三轴联动曲面的加工，并达到如下要求：

（1）尺寸公差等级达IT8（2）形位公差等级达IT8 级（3）表面粗糙度达Ra3.2μm 2．能够使用四轴以上铣床与加工中心进行对叶片、螺旋桨等复杂零件进行多轴铣削加工，并达到如下要求：

（1）尺寸公差等级达IT8（2）形位公差等级达IT8 级（3）表面粗糙度达Ra3.2μm 三轴联动曲面的加工方法四轴以上铣床/加工中心的使用方法（四）易变形件加工能进行易变形零件的加工，并达到如下要求：

（1）尺寸公差等级达IT8（2）形位公差等级达IT8 级（3）表面粗糙度达Ra3.2μm 易变形零件的加工方法（五）精度检验能够进行大型、精密零件的精度检验精密量具的使用方法精密零件的精度检验方法

五、维护与故障诊断（一）机床日常维护能借助字典阅读数控设备的主要外文信息数控铣床专业外文知识（二）机床故障诊断能够分析和排除液压和机械故障数控铣床常见故障诊断及排除方法（三）机床精度检验能够进行机床定位精度、重复定位精度的检验机床定位精度检验、重复定位精度检验的内容及方法六、培训与管理（一）操作指导能指导本职业中级、高级进行实际操作操作指导书的编制方法（二）理论培训能对本职业中级、高级进行理论培训培训教材的编写方法（三）质量管理能在本职工作中认真贯彻各项质量标准相关质量标准（四）生产管理能协助部门领导进行生产计划、调度及人员的管理生产管理基本知识（五）技术改造与创新能够进行加工工艺、夹具、刀具的改进数控加工工艺综合知识

3．4 高级技师

职业功能工作内容技能要求相关知识一、工艺分析与设计（一）读图与绘图 1.能绘制复杂工装装配图 2.能读懂常用数控铣床的电气、液压原理图 3.能够组织中级、高级、技师进行工装协同设计 1.复杂工装设计方法 2.常用数控铣床电气、液压原理图的画法 3.协同设计知识（二）制定加工工艺 1.能对高难度、高精密零件的数控加工工艺方案进行合理性分析，提出改进意见并参与实施 2.能够确定高速加工的工艺方案。

3.能够确定细微加工的工艺方案 1.复杂、精密零件机械加工工艺的系统知识 2.高速加工机床的知识 3.高速加工的工艺知识 4.细微加工的工艺知识（三）工艺装备 1.能独立设计复杂夹具 2.能在四轴和五轴数控加工中对由夹具精度引起的零件加工误差进行分析，提出改进方案，并组织实施 1.复杂夹具的设计及使用知识 2.复杂夹具的误差分析及消减方法 3.多轴数控加工的方法

（四）刀具准备 1.能根据零件要求设计专用刀具，并提出制造方法 2.能系统地讲授各种切削刀具的特点和使用方法 1.专用刀具的设计与制造知识 2.切削刀具的特点和使用方法二、零件加工（一）异形零件加工能解决高难度、异形零件加工的技术问题，并制定工艺措施高难度零件的加工方法（二）精度检验能够设计专用检具，检验高难度、异形零件检具设计知识三、机床维护与精度检验（一）数控铣床维护 1.能借助字典看懂数控设备的主要外文技术资料 2.能够针对机床运行现状合理调整数控系统相关参数数控铣床专业外文知识（二）机床精度检验能够进行机床定位精度、重复定位精度的检验机床定位精度、重复定位精度的检验和补偿方法（三）数控设备网络化能够借助网络设备和软件系统实现数控设备的网络化管理数控设备网络接口及相关技术四、培训与管理（一）操作指导能指导本职业中级、高级和技师进行实际操作操作理论教学指导书的编写方法（二）理论培训 1.能对本职业中级、高级和技师进行理论培训 2.能系统地讲授各种切削刀具的特点和使用方法 1.教学计划与大纲的编制方法 2.切削刀具的特点和使用方法

（三）质量管理能应用全面质量管理知识，实现操作过程的质量分析与控制质量分析与控制方法（四）技术改造与创新能够组织实施技术改造和创新，并撰写相应的论文。

科技论文的撰写方法

4.比重表 4．1 理论知识项

目中级（%）

高级（%）

技师（%）

高级技师（%）

基本要求职业道德 5 5 5 5 基础知识 20 20 15 15 相关知识加工准备 15 15 25 －数控编程 20 20 10 －数控铣床操作 5 5 5 －零件加工 30 30 20 15 数控铣床维护与精度检验 5 5 10 10 培训与管理－－ 10 15 工艺分析与设计－－－ 40 合计 1

4．2 技能操作项

目中级高级技师高级技师

（%）

技能要求

培养鉴定篇6

关键词血鹦鹉；益生菌；坚强芽孢杆菌；16S rRNA ；培养条件

分类号 S942.42

Isolation and Identification of Potential Probiotic from Intestine of

Cichlasoma citrinellum × C. synspilum and Optimization of Culture Conditions

YANG Ning1） JIANG Fangyan2） HUANG Hai1）

（1 Sanya Sci-Tech Academy of Hainan National Breeding and Multiplication， Sanya， 572000， China

2 School of Biological Science and Technology， Qiongzhou University， Sanya， 572022， China）

Abstract 7 kind of bacteria were isolated from intestine of Cichlasoma citrinellum×C.synspilum， 1 kind of bacteria named 0129B was potential probiotics by purification culture and infection experiments. Morphological characters， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence were analyzed， gram positive， rod-shaped， 5 indicators were positive including glucose， mannitol， gelatin， nitrate （reduction） and mannose， 15 indicators were negative including maltose， arabinose， xylose， etc. 1541 bp fragment were amplified by 16S rRNA method， 0129B was identified as Bacillus firmus. The effection of salinity， temperature and pH on the growth of 0129B were studied， suitable culture conditions were identified， salinity 10， temperature 40℃， pH 8.

Keywords Cichlasoma citrinellum×C. Synspilum ； probiotic ； Bacillus firmus ； 16S rRNA ； culture conditions

血鹦鹉鱼（Cichlasoma citrinellum×C. synspilum）俗称红财神，为雄性红魔鬼（C. citrinellum）和雌性紫红火口（C. synspilum）的杂交种，成鱼体色主要呈红色，经人工处理还可呈黄色、绿色、橙色等多种颜色，形态有心形、元宝形、独角形等，是一种深受欢迎的淡水观赏鱼类。海南是我国最大的血鹦鹉鱼输出省份，但在其工厂化养殖过程中病害时有发生，严重影响该产业的发展。在提倡生态养殖、健康养殖的今天，益生菌在水产养殖应用中显示出了重要作用，国内外有大量关于益生菌在鱼类、虾蟹类和贝类养殖中应用的报道，如：曾东[1]从鲤鱼（Cyprinus carpio）肠道内分离的3种益生菌具有提高鲤鱼免疫机能和消化酶活性，改善其肠道菌群多样性等作用；Macey等[2]研究表明，益生菌对中间鲍（Haliotis midae）具有促进生长和提高抗病力作用；Iehata等[3]研究表明，益生菌可提高日本大鲍（Haliotis gigantea）的肠道内环境，进而影响肠道菌群分布；刘君等[4]从凡纳滨对虾肠道分离出2种益生菌，拌料投喂可提高虾体免疫酶活性和抗病毒能力。本研究通过从血鹦鹉鱼肠道内分离出细菌，经注射感染试验找到潜在益生菌，并研究其合适的培养条件，以期为益生菌的筛选和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用鱼

血鹦鹉鱼来源于三亚市南繁科学技术研究院观赏鱼重点实验室，选取无发病史的健康个体，体长（11.72±1.17）cm，体宽（6.10±0.84）cm，体重（32.25±1.50）g。于水族箱内暂养一周后用于试验。

1.1.2 培养基

益生菌分离和培养所用的培养基配方如下（g/L）：牛肉膏3.0、酵母提取物 1.0 g、胰蛋白胨 5.0、NaCl 5.0、琼脂15.0。

1.2 方法

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1.2.1 肠道细菌的分离

先用75%酒精将血鹦鹉鱼体表消毒，剖开腹部及肠道，在无菌条件下，用接种环接种肠道内溶物于固体培养基上，30℃培养24 h，挑取菌落形态特征不同的菌落，纯化2次，获得菌种用15%甘油-80℃冰箱保藏备用。

1.2.2 注射感染试验

纯化后的细菌经扩大培养后配成菌浓度为1×108 CFU/mL，腹腔注射健康血鹦鹉鱼，0.2 mL/尾，对照组注射同剂量的生理盐水，每组20尾，每组设一平行。观察记录一周内的成活情况。

1.2.3 潜在益生菌的形态观察

对上述注射感染试验中未出现血鹦鹉死亡的细菌进行革兰氏染色和显微观察，记录该菌的形态特征。

1.2.4 潜在益生菌的生理生化鉴定

生理生化鉴定指标有：葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、半乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、山梨醇、鼠李糖、西蒙氏枸椽酸盐、纤维二塘、VP、苯丙氨酸、明胶、硝酸盐（还原）、蜜二糖、甘露糖、棉子糖、水杨素、尿素共20项。

1.2.5 潜在益生菌的16S rRNA分子生物学鉴定

菌株16S rRNA分析参照文献[5]的方法。通过常规PCR后，采用2%的琼脂糖电泳，切胶回收，将目的片段送深圳华大基因有限公司测序。测序结果提交GenBank，获取登录号。并与已发表的16S rRNA序列进行比对，采用Mega 5.0软件构建系统发育树，确定菌株的分子分类地位。

1.2.6 潜在益生菌的合适培养条件研究

试验共设盐度、温度、pH值等3个因子，温度分别为20、25、30、35和40℃，盐度分别为0、5、10、15和20，pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。考察温度影响时，盐度和pH分别是5和7；考察盐度影响时，温度和pH分别是30℃和7；考察pH影响时，温度和盐度分别是30℃和5，200 r/min振荡培养24 h后，以平板涂布计数法计算出原菌液浓度，比较不同培养条件对细菌生长的影响。

1.2.7 数据统计与处理

试验数据采用（平均值±标准差）表示，用SPSS 19进行数据分析，进行单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 细菌分离和注射感染试验结果

从肠道分离得到7种细菌，菌落形态特征、所占比例和注射感染的致死率见表1。通过注射感染试验，只有0129B一种细菌对血鹦鹉的致死率为0%，认为是潜在益生菌，命名为0129B。

2.2 菌株0129B的鉴定

菌株0129B革兰氏染色结果为阳性，短杆状，大小为1.2 μm×0.6 μm，常多个菌株链状排列。

生理生化特征分析结果表明（表2），该菌株的葡萄糖、硝酸盐（还原）、明胶、甘露醇、甘露糖、蔗糖6项指标均为阳性，其余检测指标呈阴性。根据《伯杰氏手册》[6]和《常见细菌系统鉴定手册》[7]等资料，初步鉴定菌株0129B为坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）。

以菌株0129B基因组DNA为模板，采用16S rRNA的通用引物进行PCR扩增，目的片段经测序分析，确定得到的目的片段长为1 451 bp（图1）。

通过BLAST，将与菌株0129B的16S rRNA同源性较高的同一属3种细菌和亲缘关系较远的16种细菌选出，用MEGA 5.0软件对这20种序列进行同源性比对，Neighbor-joining法构建系统发育树，自举分析（Bootstrap）1 000次，0129B与坚强芽孢杆菌相似性100%（图2）。

综合菌株的形态特征、生理生化特征和16S rRNA分析，确定所分离的潜在益生菌菌株0129B为坚强芽孢杆菌（GenBank登录号：KC916741）。

2.3 盐度对菌株0129B生长的影响

研究结果表明（图3），4种不同盐度对菌株0129B生长具有显著影响（P<0.05），其中盐度为10时，细菌的培养浓度最高，当盐度降低到5时，菌数大量减少，当盐度增加到15时，菌数稍有降低，当盐度增加到20时，菌数大量减少，表明该菌株的合适培养盐度为10。

2.4 不同温度下细菌的生长状况

研究结果表明（图4），4种不同温度对菌株0129B生长具有显著影响（P<0.05），细菌浓度随温度的升高而增加，25℃时浓度最低，40℃时达到最高，表明该菌株的合适培养温度为40℃。

2.5 不同pH值下细菌的生长状况

培养基的酸碱度对微生物的生长代谢和产酶有很大的影响，pH可以改变细胞膜的通透性、营养物质的溶解性，影响微生物对营养物质的吸收。培养基分别设置5、6、7、8、9五个不同pH值条件进行，各组差异显著。从图5可以看出，pH值由5～8细菌数量呈增加趋势，pH值为8的菌落数量增加最为明显，当pH值为9时又突然下降。

3 讨论与结论

3.1 潜在益生菌的分离和鉴定

本试验成功从血鹦鹉鱼肠道内分离到潜在益生菌菌株，通过细菌形态特征观察、生理生化和16S rRNA的测定，最终鉴定菌株0129B为坚强芽孢杆菌。有关坚强芽孢杆菌的研究较多，大部分集中在该菌对养殖对象和养殖水体影响。李桂英等[8]研究表明，饲料中添加坚强芽孢杆菌可显著提高凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的非特异性免疫水平和抵抗对虾白斑综合症病毒的能力。孙艳[9]研究表明，坚强芽孢杆菌活菌和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）活菌结合使用，可显著搞高凡纳滨对虾抗对虾白斑综合症病毒感染的能力。柴鹏程等[10]研究表明，用拌有坚强芽孢杆菌的饲料投喂凡纳滨对虾，能显著提高对虾的生长率和淋巴器官中STAT基因的表达。郭静[11]等通过富集培养，从养殖水体中分离到坚强芽孢杆菌，该菌对氨氮和亚硝态氮的降解率分别达80%和90%以上。不过，有关鱼源性坚强芽孢杆菌的研究较少，本文从血鹦鹉肠道中分离得到的1株坚强芽孢杆菌，该菌对血鹦鹉无致病性，为下一步开展该菌的活性研究奠定了基础。

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3.2 潜在益生菌株0129B的培养条件优化

本文研究了盐度、温度和pH值对菌株0129B生长的影响，确定了该菌的合适培养条件为盐度10、温度40℃、pH 8。其中，菌株0129B的合适培养盐度与李坤等[12]对益生细菌沼泽红假单胞菌（Rhodopseudanonas palustris）的研究结果相似；其合适培养温度与赵先锋[13]所分离的坚强芽孢杆菌的最适生长温度（30～40℃）相似，但与钟硕良等[14]对益生菌哈维氏弧菌（Vibro harveyi）的温度影响研究结果不同；其合适pH值与沈锦玉[15]对光合细菌类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）试验结果相似，但与赵先锋[12]所分离的坚强芽孢杆菌最适pH 5.4～7.2不同。

通过感染试验，初步验证了本试验分离的坚强芽孢杆菌对水产养殖对象无致病性，并通过对其生长环境条件的研究，初步掌握了该益生菌体外培养中生长变化规律，为大量培养提供了理论依据。本试验中的菌种仅是潜在益生菌，实际应用中该菌的益生作用，如对宿主的生长、非特异性免疫和水环境的影响还有待进一步研究。

参考文献

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[2] Macey B M， Coyne V E. Improved growth rate and disease resistance in farmed Haliotis midae through probiotic treatment[J]. Aquaculture， 2005， 245： 249-261.

[3] Iehata S， Inagaki T， Okunishi S， et al. Improved gut environment of abalone Haliotis gigantea through Pediococcus sp. Ab1 treatment[J]. Aquaculture， 2010， 305： 59-65.

[4] 刘君，宋晓玲，刘莉，等. 2株消化道优势菌对凡纳滨对虾免疫酶活性和抗白斑综合征病毒感染力的影响[J]. 水产学报，2012，36（3）：444-450.

[5] 杨宁，黄海，张希，等. 尼罗罗非鱼嗜水单胞菌的病原分离鉴定和药敏试验[J]. 水产科学，2014，33（5）：306-310.

[6] 布坎南. 伯杰细菌鉴定手册（第九版）[M]. 中国科学院微生物研究所译. 北京：科学出版社，1994：745-746.

[7] 东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：162-171.

[8] 李桂英，宁晓玲，孙艳，等. 几株肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异性免疫力和抗病力的影响[J]. 中国水产科学，2011，18（6）：1 358-1 367.

[9] 孙艳. 对虾抗病微生物的筛选及其作用机制的研究[D]. 青岛：中国海洋大学， 2012.

[10] 柴鹏程，宋晓玲. 饲料中添加芽孢杆菌PC465对凡纳滨对虾生长和STAT基因表达的影响[J]. 渔业科学进展， 2013，34（3）：97-103.

[11] 郭静，熊焰，李华. 养殖水体中水质净化菌的筛选和鉴定[J]. 水利渔业，2008， 28（4）：105-106.

[12] 李坤，王福强，张辉. 环境条件对光合细菌生长的影响[J]. 大连大学学报，2011，32（3）：79-82.

[13] 赵先锋. 利用农业副产品发酵坚强芽孢杆菌及其用于加强生物絮团培养的研究[D]. 青岛：中国海洋大学，2011.

[14] 钟硕良，陈良忠，周宸. 环境因子对发光细菌的生长及日本对虾仔虾感染死亡率的影响[J]. 中国水产科学，2001，8（1）：41-45.

[15] 沈锦玉，刘向，尹文林，等. 光合细菌HZPSB菌株的分离鉴定及其生长特性的测定[J]. 科技通报，2005，21（1）： 69-73.

培养鉴定篇7

1材料与方法

1.1 材料

清洁级昆明种成年雌性小白鼠(烟台市绿叶制药有限公司动物中心提供)20只,8～10周龄,体重25～30g。雌雄按2∶1比例合笼,次晨检查阴栓,发现阴栓者记做妊娠第1天。

1.2 设备和试剂

(1)主要设备:二氧化碳培养箱(Thermo Forma3131)、Olympus倒置显微镜(日本)、 200目筛网、离心机(Eppendorf5702)、超净工作台(青岛Haier集团公司)。(2)试剂:DMEM/F12高糖培养液(Hyclone公司)、胎牛血清(FCS,Gibco公司)、胶原酶Ⅰ(Gibco公司)、双抗(Hyclone公司)、兔抗鼠角蛋白抗体、兔抗鼠波形蛋白抗体、链霉素生物素-过氧化物酶(SP)标记的羊抗兔免疫组化试剂盒(均为北京中山金桥生物公司)。

1.3 方法

1.3.1 妊娠第4天雌鼠断颈处死,迅速无菌取出子宫,置于含双抗的DMEM/F12(4℃预冷)的3.5cm培养皿中,去除脂肪后,再次用含双抗的DMEM/F12培养液冲洗子宫两遍,取弯折成90°的20ml注射器针头用挤压法挤出小鼠子宫内膜组织。将子宫内膜剪成细颗粒状组织块。用2g/ml的胶原酶Ⅰ按3∶1混合,37℃培养箱消化150min。以含血清的 DMEM/F12培养液终止消化 ,反复吹打后收集培养液,200目滤网过滤将组织弃去。1 000r/min离心10min收集内膜细胞沉淀。吸去上清液,加少许含10%FCS的培养液轻轻吹打细胞制成细胞悬液。调整细胞密度,以 1×105/ml的密度接种于6孔培养板(培养板孔内放有多聚赖氨酸包被的盖玻片),置入37℃、5%CO2培养箱培养,定期用倒置显微镜观察细胞生长情况 ,隔日更换细胞培养液。

1.3.2 细胞的免疫化学染色:待细胞生长成单层后取出玻片,预冷的 PBS漂洗,4%多聚甲醛室温下固定20min,PBS冲洗;3%的 H2O2室温下孵育15min,PBS冲洗;10%的正常羊血清37℃封闭 30min;加一抗(波形蛋白抗体、角蛋白抗体)稀释浓度为1∶200,4℃过夜孵育;二抗(SP标记的羊抗兔IgG)即用型工作液,37℃孵育30min;PBS冲洗,DAB显色;苏木精复染;盐酸酒精分色;中性树胶封片。阴性对照采用PBS代替一抗,其他步骤相同。高倍镜下计数100个细胞,计算细胞阳性率。

2结果

2.1 形态学特征

倒置显微镜下观察基质细胞平铺生长呈单个分散细胞,在接种30min贴壁。细胞呈多角形或者梭形。多角形细胞胞浆薄而透明,有多个短小突起。消化后的腺上皮细胞呈管状或葡萄状,在接种24h 后已贴壁。成团生长,培养2d后腺上皮细胞长成铺路石样的单层细胞集落排列紧密,细胞核大而圆,位于细胞中央。

2.2 细胞鉴定及纯度检测

采用对上皮细胞特异的细胞角蛋白18抗体和对基质细胞特异的波形蛋白抗体进行免疫细胞化学染色。子宫内膜腺上皮细胞角蛋白染色阳性,胞质被染成棕色, 核呈蓝色, 阳性率约 96%(见图1,腺上皮细胞角蛋白-18染色阳性)。基质细胞波形蛋白染色胞质也呈棕色,阳性率达93%(见图2,基质细胞波形蛋白染色阳性)。

3讨论

本研究结果表明,运用挤压法和酶消化法相结合,可以成功地培养出围着床期小鼠子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。用挤压法[1]可以完整分离出围着床期小鼠子宫内膜。胶原酶Ⅰ消化作用温和缓慢,消化后获得的细胞比胰蛋白酶消化后获得的细胞活力高。本研究采用二者结合培养小鼠子宫内膜细胞,不但使子宫内膜细胞纯度提高,而且增加了细胞的活力。子宫内膜细胞由单层柱状腺上皮细胞和固有层基质细胞组成,两者相互作用,相互影响,腺上皮和基质细胞均受卵巢激素的影响产生周期性的变化,基质细胞具有旁分泌功能,其产生的酶类、功能蛋白和细胞因子调节子宫内膜腺体细胞的分化、增殖。Kleinman[2]研究表明基质是子宫腺上皮细胞生长、分化的必要条件,Arnold[3]提出基质细胞可能参与雌激素对上皮细胞的调节作用。所以将腺上皮细胞和基质细胞共同培养,以发挥两者的协同作用。对进一步研究小鼠子宫内膜细胞的生物活性和各种因素的调节作用以及建立与胚胎的共培养体系等具有重大意义。

摘要：目的:建立小鼠围着床期子宫内膜细胞的原代培养,并对其进行形态学鉴定。方法:通过挤压法获取小鼠子宫内膜组织,胶原酶Ⅰ消化,过滤法,进行单层培养。通过倒置显微镜观察其大体形态,免疫细胞化学染色法对间质细胞(ESC)及上皮细胞(EEC)进行鉴定。结果:EEC和ESC经角蛋白抗体和波形蛋白抗体染色,胞质被染成棕黄色的细胞为阳性细胞。结论:成功培养了原代小鼠子宫内膜细胞,方法简便有效,获得细胞成活率高,生长稳定。成功建立子宫内膜细胞原代体外培养体系,为从细胞和分子水平方面研究子宫内膜的各种功能及干预调节奠定基础。

关键词：小鼠子宫内膜细胞,细胞培养,免疫细胞化学

参考文献

[1]谭毅,顾美礼,王智彪,等.完整分离围着床期小鼠子宫内膜方法的建立(J).中国实验动物学报,2001,9(1):40-44.

[2]Kleinman HK,McGarvey ML,Hassell JR,et al.Basementmembrane complexes with biological activity(J).Biochemis-try,1986,25:312.

大鼠胚鼠皮层神经元培养与鉴定篇8

1 材料与方法

1.1 实验动物

由重庆医科大学实验动物中心提供, 由川北医学院实验动物中心代购, 实验动物饲养于我校动物实验中心。选取孕15~18d胎龄SD大鼠, 清洁级, 自由摄食和饮水, 室内温度在25℃左右, 相对湿度为60%~70%。

1.2 主要试剂

高糖DMEM/F12培养液 (美国Gibco公司) 、胎牛血清 (FBS) (美国HyClone公司) 、B27添加剂 (美国Invitrogen公司) 、Neurobasal-A培养液 (美国Gibco公司) 、多聚赖氨酸 (7万~15万) (美国Sigma公司) 、胰蛋白酶 (美国Sigma公司) 、SABC (链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物) 试剂盒 (武汉博士德生物工程公司) 、DAB显色试剂盒 (武汉博士德生物工程公司) 、多聚甲醛 (美国Sigma公司) 、兔抗NeuN (神经元核特异蛋白) (Millipor公司) 、0.2%TritonX-100 (中国天根生化科技有限公司) 、0.01M PBS液 (中杉公司) 。

1.3 细胞爬片的制备

将盖玻片放于玻璃培养皿中, 泡酸过夜后取出, 自来水下洗净酸, 再用去离子水洗净, 放入玻璃培养皿, 将装有盖玻片的玻璃培养皿一起放入消毒饭盒中高压锅消毒灭菌备用。

1.4 多聚赖氨酸包被培养板、盖玻片

6孔细胞培养板中每孔加入配制好的多聚赖氨酸 (0.1mg/ml) , 以能盖住孔底为限。拟行免疫细胞化学技术检测的标本, 需在培养板中预先置入1cm×1cm的玻璃盖片, 然后再涂多聚赖氨酸, 超净台放置20min后, 吸净培养板中的多聚赖氨酸, 加入适量10%FBS的DMEM/F12 (高糖) 培养液, 置于37℃、5%CO2细胞培养箱中备用, 临用前吸弃原培养液, PBS液清洗2次, 新鲜细胞培养基 (含10%FBS的高糖DMEM/F12培养液) 清洗1次即可使用。

1.5 神经元培养

取孕15~18dSD大鼠孕鼠, 颈椎脱臼处死, 碘伏消毒腹部皮肤, 75%酒精脱碘后, 剪刀腹部皮肤向两侧拉开, 用另一把剪刀打开腹壁暴露子宫, 取出含有胎鼠的子宫, 置于无菌消毒饭盒中。在超净台内小心剖开子宫, 打开羊膜囊取出胎鼠, 剪下胎鼠头部, 移入盛有冰PBS液的培养皿中。眼科镊剥离头颅皮肤、颅骨, 暴露出大小脑, 小心将全脑取出放入另一盛有冰PBS液的培养皿中, 漂洗。解剖显微镜下剥离脑膜, 直至剥离干净, 见不到含有血管的脑膜为主, 剥离出大脑皮质。将胎鼠皮层移入无菌小培养皿中, 用眼科剪剪成约为1mm3大小的小组织块。加入0.125%胰蛋白酶在37℃、含5%CO2细胞培养箱消化约30min后, 加入同等量含10%FBS的高糖DMEM/F12培养液 (完全培养基) 立即终止消化, 无菌玻璃吸管轻轻吹打分散后, 用200目钢网过滤。将过滤后所得单细胞悬液, 吸入无菌离心管中, 以800rpm的速度离心5min, 弃上清, 完全培养基重悬细胞, 玻璃吸管轻柔吹打。以密度为1×106个/ml混匀后接种于铺有多聚赖氨酸处理的盖玻片的6孔培养板中。置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内进行培养。于培养24h后, 全部细胞贴壁良好, 部分细胞周围开始出现突起, 培养液换为含2%B27的Neurobasal-A培养液, 抑制非神经元细胞的增殖。以后每3d换液1次, 每次更换一半新鲜培养液 (含2%B27的Neurobasal-A培养液) 。定时在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况。6d用于实验研究, 在培养过程中4h及1d、2d、4d、6d用倒置相差显微镜观察细胞的生长情况。

1.6 皮质神经元NeuN (神经元核特异蛋白) 免疫细胞化学鉴定

将铺有盖玻片6孔培养板中的培养液弃去, 每孔加入1ml4%多聚甲醛室温固定20min, 吸弃多聚甲醛, 每孔加入0.01M PBS液清洗细胞3次, 5min/次;0.2%TritonX-100室温下作用10min, 吸弃, 0.01M PBS液清洗细胞3次, 5min/次;3%过氧化氢浸泡10min;0.01M PBS液清洗细胞3次, 5min/次;5%BSA溶液封闭30min (37℃) ;吸去封闭液 (不洗) , 直接滴加一抗 (兔抗NeuN1∶100) 4℃孵育过夜, 阴性对照直接加PBS;0.01M PBS清洗细胞3次, 5min/次;滴加相应生物素化二抗37℃ (SABC试剂盒内, 为即用型) , 30min;0.01M PBS细胞3次, 5min/次;滴加辣根过氧化物酶标记抗生物素试剂 (SABC) 30min;0.01M PBS清洗细胞3次, 5min/次;取出各孔内盖玻片, DAB显色, 显微镜下控制, 显色效果满意后终止, 自来水冲洗5min;苏木素染色2min, 冲洗后, 盐酸酒精分化1s;70%乙醇, 30s×2次、80%乙醇30s×2次、95%乙醇30s×2次、无水乙醇分别脱水30s×2次;晾干中性树脂封片, 镜下观察并照相。胞浆、胞核出现棕色颗粒为阳性为神经元细胞。

2 结果

2.1 大鼠皮层神经细胞原代体外培养形态学观察

神经细胞刚分离时呈圆形, 细胞边缘光滑, 折光性强, 体积较小胞体透亮;种植4h后大部分神经细胞贴壁, 胞体圆而透明, 分布较均匀 (图1) ;细胞培养24h, 细胞全部均匀贴壁, 部分细胞变形呈多角形、伸出短小的突起, 大部分呈圆形, 胞体周围光晕明显;第2天细胞体积增大, 开始出现多极神经元, 周围突起增多、增粗并伸长, 但细胞间突起连接较少 (图2) ;第4天有部分细胞呈梭形、多角形, 细胞周围突起进一步增长、增粗, 出现相互连接, 形成较稀疏的神经网络 (图3) ;第6天细胞胞体饱满清晰, 边界清楚有明显的光晕, 有很强的折光性及立体感, 突起进一步增多、增长, 并有突起连接在一起, 相互间交错成网, 未见明显的胶质细胞 (图4) 。

2.2 大鼠皮层神经细胞免疫细胞化学鉴定

神经元特异核蛋白 (NeuN) 是神经元的特异性标志蛋白。将培养第6天的大鼠皮层神经细胞进行抗NeuN细胞免疫细胞化学检测, 显示胞核深染为强阳性、胞浆淡染为弱阳性 (图5) , 10×40倍视野下随机取10个视野, 计数阳性细胞的百分率, 鉴定神经元纯度为 (93.7±5.5) %。

3 讨论

原代培养的神经元由于在体外可以从事各种试验, 避免体内因素的影响, 现已广泛的用于神经系统的研究。目前关于神经元培养方法多种多样, 说法各不相同。要获得纯度高、生长状态良好的神经元取决于许多不同的影响因素, 包括适龄动物、组织分离的方法、培养基的选择及细胞接种的数量等因素[1]。本研究在以往各种方法的基础上对培养的各环节加以改进, 已获得高纯度、高质量的神经元, 结果显示:正常原代细胞接种后很快贴壁, 约30min开始贴壁, 4h时大部分细胞已贴壁, 24h时细胞贴壁良好, 部分细胞突起形成开始增长、增粗, 长至第6天时细胞胞体增大, 部分胞体为星形、梭形, 突起形成神经网络, 神经元特异核蛋白免疫细胞化学鉴定其纯度达90%以上。由于皮质神经元在体外生存能力较弱, 在其分离、培养的过程中, 需注意其中的关键环节: (1) 鼠龄是影响分离效果重要因素, 适龄胎鼠, 神经元的形态学分化和化学分化程度较低, 可以轻松的剥离脑膜及血管, 节约取材时间, 增加细胞体外存活能力[2], 因此本研究采用孕15~18d的胎鼠来分离皮质神经元; (2) 酶消化有利于分离组织间细胞, 本实验采用0.125%胰蛋白酶消化20~30min, 此浓度消化酶不易损伤细胞, 显微镜下观察, 易把握消化时间; (3) 吸管轻柔吹打分离细胞, 用力过猛将导致大量细胞膜破裂, 影响细胞的存活; (4) 刚接种时用含10%FBS的高糖DMEM/F12培养, 血清主要是促进神经元的贴壁生长; (5) 血清培养至2~3d时胶质细胞开始长出, 既往研究常规使用一定浓度的阿糖胞苷抑制非神经元细胞的生长, 但阿糖胞苷同时对神经元有毒性作用, 因此本实验于培养至24h全量换液, 换为含2%B27的Neurobasa-A培养液[3,4,5], 可抑制非神经细胞的生长[6,7], 从而提高神经元的纯度。结果显示:含2%B27的Neurobasal-A培养基抑制非神经细胞的生长, 从培养效果可以观察到, 细胞折光性好, 培养到24h换液后细胞仍生长良好, 紧密贴壁, 无悬浮细胞, 细胞周围开始伸出较长突起, 并相互连接形成神经网络, 胶质细胞数量较少, 通过免疫细胞化学方法鉴定获得纯度90%以上的神经元; (6) 神经元培养细胞接种密度也至关重要, 密度太低使神经元缺乏相互间的支持和营养也能导致培养的失败, 一般接种密度应在5×105~5×106个/ml[8]之间, 本实验采用1×106个/ml, 细胞密度适中, 生长状态良好。近年来, 离体培养的原代神经细胞越来越广泛应用于包括细胞功能及形态、神经发育、中枢退行性疾病、脑缺血等在内的多领域、多层次的研究[9,10,11,12], 所以本研究总结改进以往[13,14]皮层神经元原代培养方法为上述实验研究的顺利进行打下基础。

培养鉴定篇9

不同细胞类型转基因供核体细胞的克隆动物相继产生,充分表明不同分化类型的体细胞在卵母细胞胞质的作用下均有完全重建而重新发育成新个体的潜能。但如何简便、快速、高效地制备丰富的转基因核供体细胞是成功获得转基因动物的关键技术之一[3]。目前,由于胎儿成纤维细胞具有取材方便、生长快、分化程度相对较低、体外传代次数相对较高、转基因效率高等特点成为用于生产转基因克隆动物的首选体细胞系。由胎儿成纤维细胞提供核供体相继产生了转基因克隆绵羊[4]、山羊[5]、牛[6]以及基因定点修饰的绵羊[7]和猪[8]。

研究通过组织块贴壁培养的方法分离培养草原红牛胎儿成纤维细胞,并设计性别特异性引物对其进行体外培养,以获得用于转基因克隆牛制作的核供体转基因细胞,为高效率、低成本制作转基因克隆牛奠定基础。

1 材料与方法

1.1 胎儿组织的获取与处理

草原红牛胎儿来自吉林省农业科学院畜牧科学分院草原红牛保种场。具体胎儿获取方法:将妊娠40 d母牛电击屠宰,迅速剖腹摘取怀孕子宫,为防止污染,将胎儿与子宫一同置于装有37 ℃生理盐水的保温瓶中带回实验室。用手术剪在PBS液中剥除胎膜,将分离的牛胎儿用含500 IU/mL 青霉素、500 mg/mL 链霉素的PBS 液冲洗3 遍后,移入无菌操作台处理。

1.2 组织块的贴壁培养

胎儿成纤维细胞的分离培养参照李扬的组织块贴壁法进行,并稍作改动。简要方法:首先用手术剪去除胎儿头、四肢、内脏,保留躯干,将胎儿躯干部用手术刀切成1～3 mm3的小块,用含10%胎牛血清的DMEM完全培养液冲洗2遍,分别接种于含完全培养液的直径为35 mm细胞培养皿中,然后将培养液吸干,放入培养箱中培养5 h,使组织块充分贴壁,待贴壁完全后,小心加入完全培养液,置于38.5 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.3 成纤维细胞的纯化及传代培养

待细胞铺满培养瓶底后,采用胶原酶消化法将上皮细胞和成纤维细胞分开,具体做法:吸出瓶内的培养液,用无菌PBS液清洗2遍后加入0.5 mg/mL的胶原酶,使消化液浸没细胞,将培养瓶放在倒置显微镜下观察,发现成纤维细胞变圆、部分脱落时,立即加入2 mL含血清的培养基终止消化;用弯头吸管轻轻吹打成纤维细胞生长区域,再用少量培养基漂洗1次;然后将消化液吸出,转移至新的培养瓶中加入适量培养基继续培养,于38.5 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.4 细胞生长曲线的测定

将传至第3代的牛胎儿成纤维细胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化,调整细胞浓度为5×104个/mL,接种于24孔细胞培养板中,每孔接种0.5 mL,置38.5 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养,每隔24 h消化收集细胞,用血细胞计数板计数3个孔的细胞数,每孔计数2次,取平均值,最后绘制生长曲线。在细胞接种及计数过程中用台盼蓝染色法去除死细胞干扰。

1.5 血液和细胞基因组的提取

选取雌雄各5头成年草原红牛,颈静脉采集血液样品,加ACD抗凝。草原红牛胚胎成纤维细胞及血液基因组的提取采用酚氯仿法提取(方法详见《分子克隆》第3版),用0.8%琼脂糖电泳检测基因完整性及纯度,-20 ℃冷冻保存。

1.6 牛性别特异性引物的设计与合成

选取牛性别特异性基因SRY(登录号为EU581861)及内参基因GAPDH(登录号为NC_007303),采用引物设计软件Oligo 6.0设计基因特异性引物。SRY基因引物序列为SRY U 5′-AAGTTTGCCTTATGGATT-3′,SRY D 5′-GAAGTAATATGCGGTGTA-3′;GAPDH基因引物序列为GAPDH U 5′-ATTCTGGCAAAGTGGACATCG-3′,GAPDH D 5′-ACATACTCAGCACCAGCATCAC-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.7 性别鉴定引物的特异性检验

以已知性别成年草原红牛外周血基因组为模板,采用基因组PCR方法对试验中设计的性别鉴定引物进行特异性检验。PCR 反应体系(25 μL):10×PCR Buffer 1.5 μL,上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL,Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)1 μL,DNA 模板(50～100 ng/L)1 μL,dNTP(10 mmol/L)1 μL,加ddH2O 至25 μL。反应条件:95 ℃预变性4 min;95 ℃变性40 s,62 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,共35个循环;72 ℃延伸10 min ;4 ℃保存。取产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测性别鉴定引物的特异性。试验中设置水空白对照以排除体系污染。

1.8 草原红牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定

在完成性别鉴定引物特异性的前提下,对本研究中分离培养的草原红牛胚胎成纤维细胞进行基因组PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测以确定其性别。具体基因组PCR反应程序参见1.7。

2 结果

2.1 草原红牛胎儿成纤维细胞的分离培养及生长特征

胎儿组织块经贴壁培养48 h后可见单细胞游离出来,呈辐射状向外贴壁生长。培养1周后贴壁细胞逐渐增多,多数围绕组织块周围生长。随着培养时间的推移,组织块周围可见大量成纤维细胞包绕,其间有上皮样细胞共生(见图1A)。9～10 d后成纤维细胞生长旺盛,成纤维细胞呈梭形或不规则三角形、放射状或漩涡状走行(见图1B)。培养2周左右,组织块移出的单层细胞汇合,细胞铺满瓶底,可进行消化传代。

2.2 草原红牛胎儿成纤维细胞的生长规律

胎儿成纤维细胞传至第3代时,以5.0×104个/mL的浓度接种24孔细胞培养板,细胞于7～8 d长满。于不同时间点测定细胞数并绘制生长曲线,见图2。

从图2可以看出,胎儿成纤维细胞生长曲线基本呈现S型,分别代表潜伏期、指数增生期和停滞期,0～4 d为潜伏期,5～9 d为指数增生期,培养至第10天进入生长停滞期。

2.3 性别鉴定引物的特异性检验结果

提取已知性别草原红牛血液基因组(雌雄各5头),利用所设计的牛性别鉴定SRY基因引物,以GAPDH基因特异性引物为对照,采用基因组PCR方法对性别鉴定SRY引物进行特异性检验,结果(见图3)发现:在完全没有进行PCR条件摸索的情况下,性别特异性SRY引物能够特异性地扩增出雄性草原红牛SRY基因片段(见图3 第1～5泳道),而以雌性草原红牛为模板则完全不能扩增出任何片段(见图3 第6～10泳道);内参基因GAPDH引物无论在雌性还是雄性草原红牛中均能很好地扩增出特异性片段。说明基因组质量良好,不影响引物的扩增。同时以水作为空白对照不存在任何扩增产物,说明扩增体系不存在污染现象。

1～5.雄性草原红牛血液基因组扩增产物; 6～10.雌性草原红牛血液基因组扩增产物;11.水空白对照组。

2.4 草原红牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定结果

本研究在验证SRY性别鉴定引物特异性的基础上,对已分离的草原红牛胚胎成纤维细胞利用SRY引物采用基因组PCR方法进行性别鉴定,结果见图4。表明已分离培养的胚胎成纤维细胞为雄性。

3 讨论

1.100 bp DNA Ladder;2.草原红牛胚胎成纤维细胞SRY基因PCR结果;3.雌性草原红牛SRY 基因PCR对照; 4.雄性草原红牛SRY基因PCR对照。

动物成纤维细胞分离培养主要采用两种方法,一种是组织块贴壁培养法;另一种是胰酶消化分离单细胞接种培养法。通常情况下,组织块贴壁培养法长出细胞比分离单细胞培养法需要较长的时间,但操作相对简单方便,目前多用此法培养动物成纤维细胞[9,10]。本研究同样采用此方法成功分离出草原红牛胚胎成纤维细胞。

在转基因克隆动物的研究过程中,成纤维细胞活力及纯度严重影响转基因细胞的制备及体细胞核移植操作,与转基因克隆动物的获得息息相关。尽管胚胎早期细胞的分化程度不高,但早期分离培养的胚胎成纤维细胞依然多为上皮细胞和成纤维细胞的混合物。上皮细胞由表皮生发层细胞分裂、增殖而来,是源于外胚层的细胞;成纤维样细胞是由真皮层细胞分裂、增殖而来,源于中胚层。两者具有完全不同的细胞特征及生长特性。在体外培养过程中,可以利用这些生长特性进行成纤维细胞的分离、纯化,常规方法是利用上皮细胞与成纤维细胞的贴壁能力及对胰酶消化反应时间差不同进行初步分离纯化[11],也可以针对上皮细胞及成纤维细胞的不同生长区域进行人为刮除。本研究采用细胞时间差酶消化法分离纯化胚胎成纤维细胞,经过反复几轮的分离纯化达到比较理想的效果。

培养鉴定篇10

关键词：副猪嗜血杆菌,分离,鉴定,血清型

副猪嗜血杆菌病的病原菌为副猪嗜血杆菌 (Haemophilus parasuis, HPS) 。HPS可影响2～4月龄的青年猪, 主要感染4～8周龄的猪, 发病率一般为10%～15%, 病死率可高达50%。感染猪主要表现为浆液性-纤维蛋白性多发性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎[1,2]。研究从疑似副猪嗜血杆菌病病猪中分离到14株革兰阴性细小杆菌, 同时进行了血清型鉴定, 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 病料

病猪的心脏、肺脏、心包液、关节液, 采自重庆市荣昌、永川、垫江和四川省宜宾、隆昌等地区10个猪场的疑似患有副猪嗜血杆菌病而死亡的猪。

1.2 菌种、主要培养基及试剂

金黄色葡萄球菌, 购自中国兽医药品监督所。普通营养琼脂培养基、纯化琼脂、伊红美蓝培养基、生化微量鉴定管, 购自杭州微生物试剂有限公司;营养肉汤、胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA) , 购自北京奥博星生物技术有限公司;麦康凯琼脂培养基, 购自上海市医学化验所试剂厂;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) , 购自AMRESCO公司;琼脂粉, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 细菌的分离培养、纯化、染色及镜检

无菌取疑似副猪嗜血杆菌病猪的心血、肺脏、心包液、关节液接种于含0.025%NAD的鲜血平板, 在37 ℃条件下培养24～48 h, 观察菌落形态。挑取针尖大小、无色、透明、露珠样菌落继续分离培养, 取疑似副猪嗜血杆菌进行革兰染色, 在显微镜下观察菌体大小、形态特征及染色结果。

1.4 细菌的培养特性观察

挑取纯培养后的疑似菌株分别接种于普通营养琼脂平板、巧克力琼脂平板、鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板中, 37 ℃培养24～48 h, 观察细菌生长情况。

1.5 卫星试验及V因子依赖性试验

将纯培养疑似菌株接种普通营养琼脂平板, 垂直划线接种金黄色葡萄球菌, 同时以不接种金黄色葡萄球菌的平板作为对照, 37 ℃培养24～48 h后观察细菌生长情况。将纯培养疑似菌株分别接种于含0.025% NAD 的鲜血平板和不含NAD的鲜血平板, 置于37 ℃培养24～48 h, 观察细菌生长情况。

1.6 分离菌分型抗原的制备及血清型鉴定

用PBS (pH值为7.2) 洗下在TSA平皿中培养24 h的菌苔, 再用PBS洗涤2次, 7 000 r/min 离心2 min;弃上清液, 调整OD600值约等于1, 121 ℃高压蒸气处理2 h;10 000 r/min离心5 min;取上清液作为用于琼脂扩散试验的分型血清 (又称热稳定抗原) , 备用。

参考P.Keilstein和V.J.Rapp-Gabrielson[3]建立的方法, 用华中农业大学动物科学院惠赠的15种标准分型血清对分离到的菌株进行血清型鉴定:用含8.5% NaCl的PBS (pH值为7.2) 配制1%琼脂培养基, 加0.1%NaN3, 厚度为3～5 mm;用打孔器打孔, 孔径为3 mm、孔间距为4 mm, 热熔封底;中间孔加各菌株热稳定抗原, 周边孔加各分型血清, 加满为止;同时设健康兔血为阴性对照;放湿盒中置于37 ℃作用24 h后观察结果, 连续观察3 d。抗原抗体之间出现清晰白色沉淀线为阳性反应, 反之为阴性反应。

2 结果

2.1 菌落及镜检形态

分离菌接种含NAD的鲜血平板36 h后, 可观察到露珠状、无色、透明小菌落, 菌落直径为0.5～1 mm。经革兰染色后, 疑似菌株为革兰阴性短小杆菌, 偶见球杆状和长丝状, 呈散在分布。

2.2 培养特性观察结果

疑似菌株在普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板上均不生长, 在巧克力琼脂平板和鲜血琼脂平板上生长的菌落呈针尖大小、露珠状、无色透明、不溶血的细小菌落, 在含NAD鲜血平板上生长较好。

2.3 卫星试验及V因子依赖试验结果

越靠近金黄色葡萄球菌的菌落生长越好, 菌落大、数量多, 离得越远的菌落越小且数量少, 直至不生长。在含NAD的鲜血平板上疑似副猪嗜血杆菌生长良好, 而不含NAD的鲜血平板无菌落出现, 表明该疑似菌株生长依赖NAD。

2.4 生化鉴定结果

分离到的14株疑似菌株均能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖;蛋白胨、吲哚、山梨醇、氧化酶、尿素酶、甘露醇反应均为阴性;对乳糖、棉籽糖、硝酸盐、触酶、H2S生化反应表现不稳定。

2.5 血清型鉴定结果

结果表明:血清4型5株, 占35.71%;血清5型3株, 占21.43%;血清12型2株, 占14.28%;血清13型4株, 占28.57%。

3 讨论

试验从重庆市荣昌、永川、垫江和四川省宜宾、隆昌地区10个猪场分离到了14株革兰阴性小杆菌, 经鉴定均为副猪嗜血杆菌, 表明副猪嗜血杆菌在采样的10个猪场呈一定的流行性。副猪嗜血杆菌血清型复杂多样, 基于热稳定性可溶性抗原琼脂扩散血清分型方法 (Kieletein-Rapp-Gabriedson, KRG) 至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型[3], 但仍有15%～41%的分离株无法确定血清型[4]。通过对从野外病例中分离到的流行株的血清型鉴定, 发现在日本、美国、西班牙、德国、丹麦和澳大利亚以4, 5, 13型最为常见, 在中国流行的菌株血清型同为4, 5, 13型[5]。本研究对分离到的副猪嗜血杆菌进行了血清型鉴定, 结果显示14株分离菌中血清4型5株, 血清5型3株, 血清12型2株, 血清13型4株, 与国内外的流行规律相似。

参考文献

[1]AMANO H, SHIBATA, KAJIO N, et al.Pathologic observations ofpigs intranasally inoculated with serovar 4 and 5 of Haemophilus pa-rasuis using immmunoperoxidase method[J].J Vet Med Sci, 1994, 56 (4) :639-644.

[2] WIEGAND M, KIELSTIN P, POHIE D, et al.Examinationof primary SPF swine after experimental infeetion with Haemophilus parameters and in the paraeters of cerebrospinal fluid[J].Tierarztl Prax, 1997, 25 (3) :226-232.

[3]KEILSTEIN P, RAPP-GABRIELSON V J.Designation of 15 sero-vars of Haemophilus parasuis on the basisi of immunodiffusion usingheat-stable antigen extracts[J].J Clin Microbiol, 1992, 30 (4) :862-865.

[4]OLIVEIRA S, PIJOAN C.Haemophilus parasuis:new trends on diag-nosis, epidemiology and control[J].Vet Microbiol, 2004, 99:1-12.

培养鉴定篇11

一、高职学院技能鉴定存在的问题

1、高职技能鉴定考试现场影响因素诸多

通过对学校几个专业技能鉴定考场的了解,发现不同考场的考评员的水平风格各异,参差不齐。有的考评员注重学生案例分析的整体思路,有的考评员会更多地注重细节,学生从考场出来后,则有不同的反应,这种差异表面上看是由于考评员自身的特点和性格的不同,但其实是对考核观念的不统一。

2、“鉴定”与“专业集成”相错位

“专业集成”有的高职学院也称为“综合实训”,目的是改善高职毕业生的质量,提升办学的质量、内涵,对改变办学条件起到了积极的作用。但一般“专业集成”被安排在第五个学期的后几周,时间大约1～2个月,实训结束后开始技能鉴定,目前在高职学校,受一些客观因素和人为因素的影响,二者在时间的前后安排上比较随意。

如果将鉴定安排在实训之前,鉴定已经结束,学生无论是否通过,都会失去实训的意义,在鉴定这个任务的驱动下,综合实训则显得“劳而无功”了。加之在综合实训过程中,学生还要面对实习单位的选择,因此在实训过程中就必然出现懈怠情绪,“集成”多少会有点流于形式,成为学生专业学习过程中最后一个不得不完成的环节。

3、技能鉴定题目的难易程度有差异

高职院校职业技能鉴定中,有笔试和操作两个部分组成,在操作的过程中,题目的难易程度是不同的,在很多复习的范围中,随即抽取进行考核,很多学生都“膜拜”,希望能抽到简单的试题,当然,抽到难的试题的同学,也只能自认自己运气不佳。在技能鉴定中,操作部分应该采取统一模式,可以杜绝运气分,使学生能更全面的掌握技能鉴定所要求的内容。

二、目前职业学校中开展职业技能鉴定的状况

从近年我们在职业学校中实施职业技能鉴定的情况中我们可以看到,职业教育本身还存在诸多问题。职业技能鉴定与学校教学存在着脱节,且各成体系,造成了教育资源的浪费。这主要表现在以下几方面:

1、专业教学大纲内容与职业技能鉴定相应职业规定内容不相符

职业学校各专业执行其教学计划、大纲,而相应各职业(工种)职业技能鉴定却有其自己的鉴定标准、规范。职业学校各专业的教学大纲内容与职业技能鉴定相应工种鉴定规范的内容不相符。

2、教学活动组织与职业技能鉴定规定要求不同

教学活动组织与职业技能鉴定规范对学生应掌握的理论知识与实践知识的分配比率不同。很多学校教学活动的组织,还是按照理论与实习教学的比率(6:4)编配,主要侧重于理论知识的学习。职业技能鉴定规范,则要求被鉴定者不但要掌握本工种所应掌握的理论知识(包括基本知识、专业知识、相关知识),而且还要掌握本工种的技能知识(包括操作技能,工具、设备的使用与维护,安全知识及其他),理论知识与技能知识各占一半,主要侧重于技能知识的掌握。

3、教学内容与职业鉴定规范脱节

近年,学校虽然也进行教学改革,加大技能训练的力度,提倡应用型人才的培养。但这些教学改革是在原有基础之上的改革,没有结合和渗透职业技能鉴定标准、规范的内容。

学校在实施职业技能鉴定时,因其所授内容不能全面涵盖鉴定的内容,在技能鉴定时不得不对有关的知识再进行系统的培训,这样就造成了教育的重复和浪费,同时学生通过鉴定获职业资格证书率比较低。

4、职业教育的师资质量数量不足

从职业教育的师资力量来看,职业教育师资不足。缺少熟练操作技能和实践经验教师。而现在的老师还不能从单纯的文化和专业知识教育中脱离出来,造成现在的职业教育与单纯的学历教育没什么区别。同时,职业教育体系还不完善,对职业技能人员没有科学的测评方式。此外,职业技能人员的待遇也没有得到很好落实。

三、提高高职技能鉴定质量的想法

1、提高思想上的认识

技能鉴定的“职业性”、“技能性”导向基于“职业技能水平”的考核活动,属于标准参照型考试。他是由考试考核机构对“劳动者”从事某种“职业”所应掌握的技术理论知识和实际操作能力做出客观的测量和评价。从职业技能鉴定的定义来看,应该是以技能为主,知识为辅的。

2、内练素质、外造形象

技能鉴定是以企业的工作作为参照,难免有一些局限性,事实上,专业技能鉴定的内容要比专业技能课程的范围狭窄的多。而高职教育要培养的事“高素质、技能型”的人才,学生除了要具备良好的岗位专业技能,还应具备一定的综合素质。所以技能鉴定虽然侧重考核实际操作,但也应该根据工种有所区分。

3、组织上的周到有序

时间安排要有序。专业集成和鉴定复习、鉴定三个环境的时间安排上,要本着有利于提高学生技能为根本,有利于提高专业人才培养为契机的原则进行的,尽量排除一些因节假日或者考评员抽调不及时而造成的时间错位,导致时间安排不合理,影响了正常的考试质量。