血氨蛋白酶抑制剂C

血氨蛋白酶抑制剂C（共7篇）

血氨蛋白酶抑制剂C 篇1

弓形虫是一种专营细胞内寄生的机会性致病性原虫,可感染人及多种动物的有核细胞。全球大约有5～10亿人受感染,我国弓形虫感染人群至少也有6千万人,但多数为隐性感染[1]。弓形虫感染人体后可侵犯多种脏器和组织,并可通过母婴垂直传播而造成胎儿畸形,引起流产、早产甚至死胎。弓形虫病显性患者若无有效治疗可因多种脏器和组织损伤、功能衰竭而危及生命;对免疫功能低下及艾滋病患者常是致死的主要病因。目前弓形虫病已成为一个严重的、全球性的公共卫生健康问题。因此研究弓形虫病的防治,筛选有效药物,开拓用药途径,控制弓形虫对人与动物的感染,有着重要的现实意义。

生物化学研究表明,丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等蛋白水解酶,在组织细胞内活性蛋白的加工成熟、多余蛋白的分解中起重要作用。国外研究资料提示,蛋白酶在弓形虫发育和入侵宿主细胞中作用不小[2,3,4]。而蛋白酶的抑制剂能抑制特异性蛋白酶的生物活性,曾有作者提出丝氨酸蛋白酶抑制剂、组蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂均有干扰和影响弓形虫发育、阻止弓形虫速殖子入侵细胞的作用[5,6,7]。本文作者通过建立弓形虫病Balb/c小鼠动物模型,运用不同蛋白酶抑制剂实验治疗,同时观察其疗效,并对观察结果进行了初步分析,提出天冬氨酸蛋白酶抑制剂(Pepstatin)是治疗Balb/c小鼠弓形虫病的有效生物制剂。

1 材料和方法

1.1 建立动物模型

将符合国家实验动物标准的健康Balb/c小鼠40只随机分成4组。即:对照组(生理盐水治疗组)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(Aprotinin)治疗组、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)治疗组、天冬氨酸蛋白酶抑制剂(Pepstatin)治疗组,对各组小鼠进行标记后,分笼同室喂养。取含无菌收取的弓形虫速殖子营养液1ml加入存有5ml 1‰的青霉素和链霉素药液的无菌试管中,然后按照严格无菌操作程序从每只Balb/c小鼠腹膜腔内接种含弓形虫速殖子的药液0.1ml。被弓形虫感染的Balb/c小鼠36h后全部出现发病症状,表现为厌食,呼吸困难,毛色变黄并竖立,腹水、雄鼠阴囊肿胀等。

1.2 实验治疗

Balb/c小鼠出现患病症状开始进行实验治疗。对照组的患鼠每只每次从腹膜腔注入生理盐水0.1ml,2次/d;Aprotinin治疗组,患鼠每只每次注入浓度为10μmol/L的Aprotinin溶液0.1ml,2次/d;Cystatin治疗组患鼠以同样方法每只每次注射10μmol/L的Cystatin溶液0.1mL,2次/d;Pepstatin治疗组患鼠每只每次注射浓度为1μmol/L的Pepstatin溶液0.1ml,2次/d。

2 实验结果

2.1 对照组的患病小鼠48h后,发病症状进一步加重,呼吸重度困难,活动明显减弱,饮水次数增多,腹部膨胀腹水。患鼠陆续死亡,其存活时间见表1。死鼠的腹水涂片检查、弓形虫速殖子发育正常无明显形态变化。如图1。

2.2 蛋白酶抑制剂治疗组的患鼠经2d药物治疗后,呼吸困难减轻,食欲增强,活动增多,但有8只患鼠发病症状无明显改善。经治疗10d,有22只患鼠发病症状完全消失,腹膜腔液涂片检查,未见发育正常的弓形虫。治疗效果不佳的8只患鼠陆续死亡,其死亡率占蛋白酶抑制剂治疗组小鼠的26.7%。腹水涂片检查,有(47±4.5)%的弓形虫发育异常。具体情况见表1及图2、3、4。

3讨论

近几年来,国外有学者发现,蛋白水解酶在弓形虫发育和入侵宿主细胞中起着极其重要作用,弓形虫在入侵宿主细胞前,蛋白水解酶水解并释放细胞粘附分子是弓形虫入侵细胞必需的一步[1]。Carruthers等发现半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶参与弓形虫入侵宿主细胞的粘附蛋白MIC2起加工和修饰作用[3]。Conseil提出丝氨酸蛋白酶抑制剂明显能阻止弓形虫速殖子入侵宿主细胞[5]。也有资料提示,枯草蛋白酶抑制剂、组蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂能强烈破坏弓形虫分泌通道和表膜,抑制弓形虫的入侵和生长[6,7,8,9]。

本研究的动物实验结果可表明,Aprotinin、Cystatin、Pepstatin对弓形虫速殖子的发育有明显的抑制作用,能使弓形虫的形态发生异常改变,从而阻止弓形虫入侵宿主细胞。同时上述酶抑制剂分别能抑制弓形虫体内的丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶的活性,阻止弓形虫入侵宿主细胞。导致弓形虫体某些生物活性的丧失,代谢障碍、发育受阻、形态改变。

有资料报道蛋白酶抑制剂已应用于临床治疗人体疾病。Moyle等报道天冬氨酸蛋白酶抑制剂已用于HIV感染、联合使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂治疗疟疾有协同作用效果。

国内文献报道,采用乙胺嘧啶和磺胺嘧啶治疗人类弓形虫感染性疾病,尚未查及使用蛋白酶抑制剂治疗人类弓形虫病的报道。

作者采用蛋白酶抑制剂治疗Balb/c小鼠弓形虫病,实验结果可说明,丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂对弓形虫的发育有明显干扰和破坏作用,弓形虫发育异常,阻止其入侵宿主细胞,同时使用上述酶抑制剂治疗Balb/c小鼠弓形虫病,治愈率达73%以上,能使严重弓形虫病小鼠的存活时间明显延长200h以上,这项实验结果可提示,上述3种蛋白酶抑制剂有望成为临床防治人类弓形虫病的有效生物制剂。

摘要：目的:实验分析蛋白酶抑制剂对Balb/c小鼠弓形虫病的疗效,筛选有效的酶抑制剂,拓展临床对弓形虫病防治用药途径。方法:建立弓形虫病(Balb/c)小鼠模型,观察其患病过程,随机分组,给弓形虫病患鼠选用不同的蛋白酶抑制剂进行治疗,分析其疗效。结果:未经酶抑制剂治疗的Balb/c患鼠均在患病后90h内死亡,患鼠腹水涂片检查,弓形虫发育无异常形态变化。使用蛋白酶抑制剂治疗的Balb/c患病小鼠有8只在患病后200h以上死亡,死亡率占26.7%,患鼠腹水检查,弓形虫发育有一定比例的形态异常。有22只患病小鼠被酶抑制剂治愈,治愈率占73.3%。结论:蛋白酶抑制剂对弓形虫发育和入侵细胞有明显影响,对Balb/c小鼠弓形虫病有较好疗效,其中Pepstatin疗效最佳。

关键词：Balb/c小鼠,弓形虫病,酶抑制剂

参考文献

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血氨蛋白酶抑制剂C 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院门诊就诊的肌酐, 尿素氮正常者152例作为对照组, 男性82例, 女性70例, 年龄在45~73岁。144例在我院确诊的原发性高血压患者作为病例组, 并根据《中国高血压防治指南》 (2005年修订本) 进行分级, 男性76例, 女性68例, 年龄在44~72岁。

1.2 按患者的尿微量蛋白 (UMP)

尿微量白蛋白 (mAlb) 和和尿β2-微球蛋白 (β2-MG) 的测定结果进行肾功能的分组, 上述指标均正常者为肾功能正常组159例, 上述指标中任意一项异常者为肾功能早期损伤组137例;肾功能正常组患者按血压状况又分为非高血压组81例, 高血压组78例;肾功能早期损伤组按血压状况又分为非高血压组69例, 高血压组68例。所有患者同时进行血清胱抑素C和UMP的测定。

1.3 方法

当天清晨抽取静脉血测定血清胱蛋白酶抑制剂C、血肌酐, 同时留取晨尿测定尿微量白蛋白、尿β2-微球蛋白。血清胱蛋白酶抑制剂C、尿微量白蛋白、β2-微球蛋白由免疫放射比浊法测定, 血肌酐由酶法检测, 血清胱蛋白酶抑制剂C和肌酐在罗氏P800上进行测定, 尿微量白蛋白和尿β2-微球蛋白在A15上测定, 各项目正常参考值范围均参照试剂说明书。血清胱蛋白酶抑制剂C浓度的参考值为0.55~1.25mg/L。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0处理数据, 统计描述表示, 统计分析采用t检验和单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组肾脏功能指标比较

高血压病组各肾脏功能指标均高于正常对照组, 其中Cys-C、mAlb、β2-MG在2级以上高血压均大于正常对照组, 并且其值随血压升高而明显增高。而Cr只有3级高血压才明显大于正常对照组, 见表1。

2.2 在非高血压组

150例患者中, 仅UMP异常23例, 仅血清Cys-C异常47例, 两者均异常43例, UMP与血清Cys-C异常率的比较无显著性差异 (P=0.542) 。高血压组的146例患者中, 仅UMP异常22例, 仅血清Cys-C异常41例, 两者均异常37例, UMP与血清Cys-C异常率的比较差异有显著性意义 (P=0.027) 。高血压组患者中, UMP异常率为39% (57/146) ;血清Cys-C异常率为53.4% (78/146) ;两者联合检测的异常率为68.4% (100/146) 。

注:*与正常对照组比较P<0.01。△与高血压病1级比较P<0.01, ▲与高血压病2级比较P<0.01。

2.3 两组患者的血清胱抑素C和Cr结果比较见表2。

注:与肾功能早期损伤组中的高血压组比较, *P<0.05。

3 讨论

高血压病通过引起良性小动脉肾硬化而导致高血压性肾损害, 发生肾功能损害的较早期, 肾脏一般没有明显的结构和功能改变几乎没有或极少有临床症状和体征[2], 用常规的检测方法测量血清BUN、Cr和常规血液及尿液检查都在不能在早期反映肾功能的损害程度, 在良性小动脉肾硬化出现临床症状以前, 通过应用比较灵敏的检查手段仍能发现一些异常, 这些可视为高血压病的早期肾损害[3]。血清胱蛋白酶抑制剂C (Cys-C) 是一种非糖基碱性蛋白, 分子量13.359KD, 属体内基本微量蛋白之一, 可自由滤过肾小球, 再由近曲小管细胞重吸收并迅速分解代谢, 所有核细胞都能稳定地产生CysC, 且血中浓度不受年龄、性别、肌肉量、炎症以及大多数药物等因素影响[4]。Simonsen等通过一系列研究发现Cys-C是一种特异性高、准确性好, 较肌酐清除率敏感的肾小球滤过率 (GFR) 新指标。

尿微量蛋白是高血压病早期肾脏结构和功能改变的标志[5], 目前研究认为血清Cys-C、尿微量白蛋白、尿β2-微球蛋白均可作为高血压早期肾损害比较敏感的指标[6,7]。从本研究中可以看出高血压组与正常对照组比较, 血清Cys-C、尿微量白蛋白、尿β2-微球蛋白和血肌酐一样, 均大于对照组, 证实血清Cys-C、尿微量白蛋白、尿β2-微球蛋白可作为高血压肾脏损害的指标。

从其高血压亚组分析发现血才Cr只有3级高血压才明显大于正常对照组, 而血清胱Cys-C、尿微量白蛋白、尿β2-微球蛋白其值2级以上高血压均大于正常对照组, 并且血压越高, 其水平同时越高。说明血清Cys-C、尿微量白蛋白、尿β2-微球蛋白可比血肌酐更早期的发现肾脏损害。

本研究以UMP作为肾功能早期损伤的指标, 结合传统的也是肾损害最为可靠的指标Cr分析血清Cys-C在高血压患者肾功能早期损伤临床诊断中的应用价值。结果显示:血清Cys-C在肾功能正常组和肾功能早期损伤组患者中, 当高血压还未引起可检出的肾功能早期损伤时, 血清Cys-C在高血压组患者较非高血压组升高, 但差异无显著性意义。血清Cys-C的升高可能预示着高血压引起肾功能损伤的开始。

UMP水平在同一个患者不同的标本可有很大的变化, 尿路感染、剧烈运动、发热、慢性心力衰竭等情况均可使UMP增加[8]。血清Cys-C所受到的影响因素较少, 但血清Cys-C只能反映肾小球功能的变化, 不能完整地体现高血压对肾小球和肾小管的多种损伤。因而, 为了提高高血压患者肾功能早期损伤检出的敏感性, 应该联合检测血清Cys-C与UMP。本研究的结果也证实这一点, 血清Cys-C与UMP异常率在非高血压组患者中无显著性差异;在高血压组患者中, 差异有显著性意义。这说明, 两者在诊断高血压肾功能早期损伤上可以互相补充, 不能相互替代, 而联合检测血清Cys-C与UMP将明显提高高血压患者肾功能早期损伤检出率。

综上所述, 在高血压患者肾功能早期损伤诊断中, 血清Cys-C具有比血清Cr敏感性高的优势, 而且能与UMP互为补充, 在高血压还未导致可检出的肾功能受损时, 血清Cys-C升高, 提示患者肾功能状况需要更多的关注。血清胱蛋白酶抑制剂C与尿微量蛋白等其他肾功能早期损伤指标联合运用, 能及时发现早期肾功能损伤, 有利于医师对患者及时干预、治疗, 以避免早期肾损害的高血压患者进入终末期肾病。

摘要：目的 评价血清胱蛋白酶抑制剂C (Cys-C) 在高血压肾损伤的早期预测作用。方法 选取我院门诊就诊的肌酐 (Cr) , 尿素氮 (Urea) 正常者152例作为对照组, 在我院确诊的原发性高血压患者作为病例组144例并进行分级, 同时检测血清Cys-C、Cr和尿微量白蛋白 (mAlb) 、尿β2-微球蛋白 (β2-MG) ;按尿微量蛋白 (UMP) 是否正常将所有患者 (296例) 分为肾功能正常组 (159例) 和肾功能早期损伤组 (137例) ;按患者血压状况将肾功能正常组又分为非高血压组 (81例) 和高血压组 (78例) , 肾功能早期损伤组也分为非高血压组 (69例) 和高血压组 (68例) 。进行血清胱抑素C、UMP测定, 并结合其血压进行分析。结果 ①各组肾脏功能指标比较:高血压病组各肾脏功能指标均高于正常对照组, Cys-C、mAlb、β2-MG随血压升高而明显增高;②在非高血压组UMP与血清Cys-C异常率的比较无显著性差异 (P=0.542) ;高血压组UMP与血清Cys-C异常率的比较差异有显著性意义 (P=0.027) 。③肾功能正常组中, 高血压组患者的胱抑素C与非高血压组无显著性差异 (P>0.05) 。肾功能早期损伤组中, 高血压组的胱抑素C值比非高血压组高 (P<0.01) 。结论 血清胱蛋白酶抑制剂C与尿微量蛋白联合分析能有效地判断高血压是否对肾功能产生早期损伤。

关键词：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C,高血压,早期肾损害

参考文献

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血氨蛋白酶抑制剂C 篇3

1 资料与方法

1.1一般资料

我们选择我院于2013 年3 月———2015 年2 月收治的老年痴呆患者60 例为研究对象。患者情况如下:男性患者共计36 例,女性患者共计24 例;患者年龄范围为51 岁~75 岁,患者平均年龄为65.3 岁±1.2 岁;患者病程在1 年~10 年,平均病程为4.3 年±0.6 年。本次入选的患者,全部符合美国精神病学会《精神病诊断与统计手册》中关于老年痴呆的诊断标准。所有患者,均排除具有中枢神经系统、心血管系统、肝肾系统的疾病,完全符合实验要求。

1.2 方法

针对老年痴呆患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C进行检验和分析,了解其与患者认知功能、脑灌注的关系。第一,针对患者的基本指标进行检测,包括患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平、尿素水平、肌酐水平等等。具体的方法是:于清晨对患者进行空腹取血,主要是抽取患者的静脉血,抽取剂量为4m L,利用全自动生化仪进行分析［1］。第二,对患者进行脑萎缩的测定,利用MRI对患者进行头颅平扫处理,观察患者的表现,并搜集相关数据［2］。第三,对患者进行脑灌注的测定。具体的方法是:临床应用磁共振的方法,了解患者脑灌注的情况。第四,对患者进行认知功能的测定。具体的方法:临床通过两位不同的医师,分别对老年痴呆患者,应用简易精神状态检测量表,测试患者的认知功能［3］。

1.3 观察指标

针对60 例老年痴呆症患者,观察男性患者与女性患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平。

1.4 统计学处理

在本次研究中,应用SPSS13.0 统计学软件对相关数据进行处理分析;在计量资料方面,通过均数±标准差来表示;两组间均数比较应用t进行检验,以P<0.05 为差异,具有统计学意义。

2 结果

具体结果如表1 所示。经过临床分析,在60 例的老年痴呆症患者中,男性患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平为0.96±0.21mg/L,女性患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平为1.33±0.42mg/L,两组患者比较差异显著,临床有统计学意义。女性患者血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平,高于男性患者明显,P<0.05。除此之外,在临床检测中发现,老年痴呆症患者,其年龄和血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平,与海马体积、Evans指数、MMSE评分等,均存在显著的关系,P<0.05。针对老年痴呆症患者,通过对患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C进行检验和分析,可进一步了解患者的认知功能情况,了解患者的脑灌注情况,为患者的临床诊治,提供较多帮助。建议在日后的临床工作中,将血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平的分析,推广应用。

3 讨论

近年来,老年痴呆症患者的数量不断增多,对患者的生活及家属的生活,造成了非常严重的影响。相对而言,老年痴呆症患者的身体指标发生了微妙的变化,通过对指标的检测和分析,能够进一步的了解患者的认知功能情况,了解到患者的脑灌注情况,以此来完成临床上的有效干预。

在本次实验研究当中,男性患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平,明显低于女性患者,P<0.05。从临床上来分析,女性患者指标高于男性患者,与女性患者的雌激素水平变化具有一定的关系［4］。女性老年痴呆患者,其雌激素水平的变化,能够在临床上引起一系列分子水平的变化,雌激素也能够对患者的认知功能造成影响［5］。为此,可以得出结论:女性老年痴呆患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平,高于男性患者。

经过上述大量的讨论与分析,可以得出结论:血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平的变化,与老年痴呆症患者的认知功能、脑灌注具有密切的联系。在认知功能方面,血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C与其表现出负相关的关系,在这种关系的作用下,会导致老年痴呆患者的脑组织,处于一种长期的低灌注状态。从目前学术界的观点来看,患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C,能够有效的协助清除Abeta,因此,在检测老年痴呆患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C后,能够对临床诊断,提供较多的帮助。

综上所述,老年痴呆患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C,与认知功能、脑灌注具有密切的关系,很多方面都可以为患者的诊断、治疗提供较多的依据,对患者的积极意义较大。在今后的临床诊治中,可针对老年痴呆患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C进行深入研究,并结合患者的认知功能变化、脑灌注情况变化,在多方面实现有效的治疗及干预,以提高患者的生活质量。

摘要：针对老年痴呆患者,探讨血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C)与认知功能、脑灌注的关系,为日后的临床诊治工作,提供参考与指导,具有重要实际临床应用价值。为进行这一探讨,哈尔滨市第二医院选择2013年3月——2015年2月收治的老年痴呆患者60例为研究对象,进行了临床实验。结果发现,老年痴呆症患者,其年龄和血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平,与海马体积、Evans指数、MMSE评分等,均存在显著的关系,P<0.05。实践证明,通过对患者的血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C进行检验和分析,可进一步了解患者的认知功能情况,了解患者的脑灌注情况,为患者的临床诊治,提供较多帮助。

血氨蛋白酶抑制剂C 篇4

1 材料及方法

1.1 主要试剂及仪器

小鼠抗兔一抗(武汉新启迪生物公司)、山羊抗小鼠二抗(武汉博士德生物工程有限公司)、DAB显色盒; 4%甲醛固定液;15%EDTA脱钙液;石蜡切片机;兔半胱氨酸蛋白酶抑制剂C ELISA试剂盒(蓝基生物公司);细金刚砂车针、正畸测力仪、正畸用镍钛螺旋弹簧、正畸结扎丝。

1.2 动物模型的建立及分组

选用20 只日本大耳兔(山西医科大学动物中心提供), 10 周龄,雌雄不限,体重2.0 kg左右,随机分为1、 3、 5、 7、 14 d组,每组4 只,加力0.8 N,采用自身对照。

本实验采用兔上颌右侧第一磨牙作为实验牙[4,5,6]。戊巴比妥按4 ml/kg的剂量沿耳缘静脉对兔进行麻醉。麻醉后将兔固定,开口,用牙科高速金刚砂车针在右侧上颌切牙及上颌第一磨牙近中颊侧近龈缘处磨出一深约0.5～1 mm的固位沟。用直径0.2 mm不锈钢丝结扎在双侧上颌切牙与上颌第一磨牙之间栓结镍钛螺旋弹簧。结扎丝与弹簧距龈缘保持至少1 mm距离,使第一磨牙向近中移动。动物模型见图 1。

1.3 取龈沟液

在加力0.8 N,加载1、 3、 5、 7、 14 d后,分别取实验侧和对照侧龈沟液。方法[7]:将称好重量的吸潮纸尖插入第一磨牙近中邻间沟的龈袋内,直至遇到阻力为止,停止30 s后取出,再对吸潮纸尖进行称重,-70 ℃保存。有血放弃不用。

1.4 酶联免疫吸附(ELISA)检测方法

取出保存于-70 ℃内待检样本,于室温(20～25 ℃)放置15～30 min;取出酶标板,按照标准品的次序分别加入100 μl的标准品溶液于空白微孔中;空白微孔中加入100 μl的样品,空白对照中加入100 μl蒸馏水;在各孔中加入50 μl酶标记溶液(不含空白对照组);将酶标板用封口胶密封后,37 ℃孵育反应1 h;充分清洗酶标板3～5 次,保持各孔有充足的水压;酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干,各孔中加入显色剂A、B液各50 μl; 20～25 ℃下避光反应10 min;最后加入终止液50 μl; 450 nm处比色,根据标准曲线计算样本浓度。

1.5 标本处理

按实验时间取出龈沟液后处死兔子,取出上颌骨,包括牙体及牙周组织。立刻放入4%甲醛溶液中固定。固定72 h后将组织块放入15%的EDTA溶液中进行脱钙,脱钙4 周后将组织块制作石蜡切片。

1.6 苏木精-伊红(HE)染色

将制成的石蜡切片进行常规苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察实验侧和对照侧下颌第一磨牙近中侧和远中侧固有牙槽骨破坏及形成情况。

1.7 免疫组化SABC方法

将制成的石蜡切片进行免疫组化染色:切片常规脱蜡至水, 30% H2O2、室温10 min以灭活内源性酶,蒸馏水洗3 次;用0.125%的胰蛋白酶进行抗原修复30 min,PBS洗涤3 次×2 min;滴加5% BSA封闭液,室温10 min,甩去多余液体;滴加1∶100的小鼠抗兔一抗,4 ℃过夜;PBS洗3 次×2 min;滴加山羊抗小鼠二抗, 37 ℃ 40 min,PBS洗3 次×2 min;滴加SABC,37 ℃ 20 min,PBS洗4 次×5 min;DAB显色30 min;蒸馏水洗涤;苏木精复染;脱水、透明、封片、镜检。

1.8 图像分析

镜下检测cystatin C的阳性表达率。阳性判定标准: 每例均随机观察10 个高倍视野(×400),有表达即定为阳性,反之定位阴性,并确定被检物质在组织中的位置。

1.9 统计学方法

对ELISA检测结果在不同时间组实验侧上颌第一磨牙近中侧cystatin C的表达采用独立样本的t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

免疫组化结果采用SPSS 17.0统计学软件,采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 组织学观察

未加力组牙周膜结构致密,血管结构完整,未见明显的血管扩张及充血现象,成骨和破骨情况不明显,牙槽骨骨壁平整,如图 2所示。加力1 d时,牙周组织中可见血管扩张,纤维结构疏松,骨吸收陷窝(图 3)。加力5 d时,见骨小梁结构稀疏,细胞排列明显紊乱,牙槽骨骨壁凹凸不平,有很多吸收陷窝,其内有破骨细胞存在(图 4)。

2.2 cystatin C在龈沟液中的ELISA定量结果(表 1)。

注: F=24.172, P<0.05

ELISA结果显示,加力不同时间对cystatin C的表达有统计学意义,即cystatin C的含量与加力时间有相关。

2.3 牙槽骨中cystatin C在不同加力时间的免疫组化结果

对加力1 d和3 d的牙槽骨免疫组化染色显示,cystatin C 的含量较少,1 d组的阳性表达率为27%(10/37), 3 d为30%(12/40),加力5 d时,阳性表达率为52.7%(29/55),加力7 d和14 d组中,cystatin C 的含量增多,阳性表达率为61.5%(32/52)、61.0%(36/59),对照组阳性表达率为37.5%(15/40), 采用χ2检验, t=21.75, P<0.01,差别有显著性(图 5)。

3 讨 论

cystatin C可调节组织蛋白酶K的活性从而调节骨吸收。而组织蛋白酶K属半胱氨酸蛋白酶家族成员,是破骨细胞分泌的主要蛋白酶,具有高蛋白水解活性,可降解有机骨基质。外源性的cystatin C可以促进成骨细胞生成,促进骨质矿化和骨形成[8,9,10]。

免疫组化的结果显示cystatin C主要分布于阳性细胞的胞质中,在细胞外基质、黏膜处也可见微弱表达,而且cystatin C在实验侧牙周组织中的阳性表达率显著高于对照侧牙周组织,对龈沟液中cystatin C含量进行定量检测(ELISA),结果证实cystatin C在不同的加力时间,表达含量不同,并且实验组明显高于对照组。

结合HE染色的结果,发现在正畸牙移动初期,cystatin C含量减少,破骨细胞增多,后期cystatin C含量增多,破骨细胞减少。中村恭子[11]等推测在牙齿移动初期,可能由于机械刺激引发炎症使cystatin C减少,从而也促进了破骨细胞的分化,在牙齿移动到中后期,伴随着成熟破骨细胞的出现、骨改建的进行, cystatin C增加并开始抑制骨吸收。

这些结果表明,cystatin C在生理状况下与牙槽骨的稳定性和生理性的牙齿远中移动有关。

研究结果证实,兔牙正畸力移动过程中,半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)有量的变化,牙周组织中加力侧cystatin C的含量明显高于未加力侧,并且与加力时间有相关性,对于cystatin C变化的机制,有待于进一步的探讨。

摘要：目的:研究兔牙移动过程中半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)在牙周组织中的表达变化,以及加力不同时间的变化特点。方法:选用20只2.0 kg体重的日本大耳兔建立正畸牙移动模型,加力0.8 N,分别在1、3、5、7、14 d后取龈沟液,ELISA检测龈沟液中cystatin C的含量,取龈沟液后,处死动物,HE染色观察牙周组织改建的变化,免疫组化SABC法检测cystatin C的表达随着时间变化的特点。结果:cystatin C在正畸牙移动初期(1～3 d)含量减少,破骨细胞增多,后期(5～14d)cystatin C含量增多,破骨细胞减少。结论:在正畸力的诱导下,cystatin C参与了正畸牙移动骨改建过程中有机基质的降解。

关键词：正畸,牙周组织,半胱氨酸蛋白酶抑制剂C,ELISA,免疫组化

参考文献

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血氨蛋白酶抑制剂C 篇5

1 常用的肾功能损害的指标

临床上常用的测定肾小球滤过功能的指标有血清尿素氮 (BUN) 、血清肌酐 (Scr) 、内生肌酐清除率 (Ccr) 、血β2-微球蛋白 (β2-MG) 、视黄醇结合蛋白 (RBP) 和菊粉等, 这些指标均有一定的局限性。

1.1 BUN

BUN经肾小球滤过, 大部分随尿排出, 小部分由肾小管重吸收入血。由于肾脏代偿功能强, 在肾小球功能轻度受损时可无变化, 只有当肾功能中重度受损时, BUN才高于正常;此外BUN还受蛋白质摄入量、体内蛋白质分解代谢及某些药物的影响, 因此不能作为肾功能早期受损的指标。

1.2 Scr

Scr是肌酸的代谢产物, 可经肾小管分泌, 经肾脏排泄。其水平受肌肉量、肉食的摄入量和体内代谢水平及药物的影响, 其参考范围较宽, 个体差异大, 且肾小球受损早期和轻度损害时Scr浓度可正常, 只有当肾小球滤过功能下降至正常的1/3时Scr才明显升高[2]。因此, Scr也不能作为肾脏损害的早期指标。

1.3 Ccr

Ccr指肾脏在单位时间内, 清除血浆中的内生肌酐量, 是反映肾小球滤过功能的敏感指标, 较BUN和Scr敏感, 当Ccr低于正常的80%时, BUN和Scr仍可正常, 但肾小管分泌少量肌酐, 会使测定结果偏高, 在病理状态下其生成速度也会增快, 使测定结果不准确, 且测定技术操作繁琐, 误差大。因此也不能很好地反映GFR的变化。

1.4 β2-MG、RBP

能反映早期肾功能变化, 但易受病理状态的影响, 且浓度不稳定, 在感染、炎症、恶性肿瘤、肝病时, 其生成速度加快, 影响其真实性。

1.5 菊粉

菊粉清除试验是估量GFR的“金指标”, 但由于操作繁琐, 不适合常规应用[3], 仅在实验研究中应用。

2 Cys-C的生物学特征

Cys-C是一种非糖基化的碱性蛋白质, 由120个氨基酸残基组成, 主要分布于细胞外液中, 精液中浓度最高, 其次, 脑脊液浓度相对高于血中浓度, 唾液、胸水中均有, 由于蛋白质相对分子质量低, 等电点高, 能自由通过肾小球, 在近曲小管上皮细胞内分解代谢, 不被肾小管重吸收和分泌, 且在血清中的浓度只与GFR有关;不受性别、饮食、炎症、感染、血脂、类风湿因子、溶血、血糖、酮体和肝脏疾病等的影响, 且1岁以后基本符合成人的参考范围, 不需要进行身高、体质量、年龄和性别的换算。Cys-C相当稳定, 是评价GFR理想的内源性生化标志物。

3 Cys-C的临床应用

3.1 用于儿科肾功能检测

Cys-C测定既不需小儿不易接受的同位素来测定, 也不受肌肉质量、体表面积、炎症因素等的影响, 也不用留取24h尿, 且≥岁患儿的血Cys-C浓度即达成人水平, 比Ccr更敏感可靠。因此, Cys-C在儿科肾脏疾病诊断中的应用广泛。

3.2 用于肾移植后肾功能的检测

移植肾的GFR检测是判断排斥和免疫抑制剂毒性的最重要的观察指标之一。肾移植后Scr及BUN很快下降至正常, Cys-C下降慢, 有明显的差异。肾脏发生排斥反应时Scr变化缓慢, 不能及时、准确反映移植肾功能, Cys-C对肾移植后肾功能检测具有明显的优势[4]。

3.3 用于糖尿病患者肾功能的检测

1/3糖尿病患者发展为肾衰竭。血Cys-C是一个比较敏感的可靠指标。在糖尿病初期而无肾病证据的患者中, 定期开展血清Cys-C检测, 以观察其与糖尿病血管病变的关系是必要的。

3.4 作为肾小球滤过率的标志物

Cys-C能很好地反映肾功能的变化, 作用明显优于Scr, 特别是轻度肾功能损害患者, Scr仍在正常范围内, 而Cys-C已开始增加。

3.5 其它

Cys-C还用于癌症患者肾功能检测、肾小管功能检测等, 除测定肾功能外, 其在对胸膜疾病的病因、肝纤维化、老年性痴呆等的诊断中有重要的意义。

总之, Cys-C已作为评估GFR的较好指标。临床通过对血Cys-C浓度的测定提高了对肾功能损害的检测水平, 且测定方法简便, 价格便宜, 对于早期发现肾功能损害检测肾功能是非常有意义的。

关键词：血半胱氨酸蛋白酶抑制剂C,肾功能,临床应用

参考文献

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[3]王军, 方一卿, 张迎华, 等.测定血清胱抑素-C对评估肾功能的意义[J].临床肾脏病杂志, 2004, 4 (6) :275-276.

血氨蛋白酶抑制剂C 篇6

1资料与方法

1.1 一般资料

选取2008年2月-2009年2月的住院患者103例,病因包括高血压、冠心病、瓣膜病(包括风湿性和退行性)、先天性心脏病。所有患者均排除急性冠状动脉综合征、左心射血分数(LVEF)<50%、甲状腺疾病、肾脏疾病及肾功能不全(血尿素氮及血肌酐均在正常范围)、肝脏疾病、肺部疾病、中重度贫血、恶性肿瘤、神经系统疾病等。所有患者分为CAF组53例和对照组50例。CAF组为CAF发作超过7d,不能自行终止;对照组为心电图显示窦性心律。CAF组:男29例,女24例;年龄(71.53±13.17)岁;高血压17例、冠心病18例、瓣膜病13例、先天性心脏病5例。对照组:男28例,女22例;年龄(68.15±15.62)岁;高血压18例、冠心病17例、瓣膜病11例、先天性心脏病4例。2组患者性别、年龄及病因构成等方面比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 方法

所有患者均于第2天清晨空腹12h后采集外周静脉血,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,3000r/min离心10min,取血清置于-80℃冰箱保存备用。血清CysC、PRA、AngⅡ、Ald的测定均由同位素室专人。采用放射免疫法一次性完成检测。

1.3 统计学方法

计量资料以$\overline{x}\pm s$表示,组间比较采用t检验;采用直线回归分析两变量之间的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 血清CysC、PRA、AngⅡ、Ald水平

与对照组比较,CAF组血清CysC、PRA、AngⅡ、Ald水平均明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

注:与对照组比较,*P<0.01

2.2 相关性分析

CAF组血清CysC水平与PRA、AngⅡ、Ald水平呈显著正相关(r分别为0.515、0.489、0.449)。

3讨论

CysC是一个由120个氨基酸组成的低相对分子质量的碱性非糖基化的分泌性蛋白,由有核细胞分泌,广泛存在于各种体液中,其血清浓度与GFR密切相关,可作为肾小球滤过功能的评价指标[1]。研究证明CysC与心血管疾病的发生发展有关[2,3]。Michael等[4]研究证明CysC对所有心血管疾病的发病率和病死率有显著的独立预测作用,发现高水平CysC与新诊断的心肌梗死和脑卒中有独立相关性,而肌酐值范围与心血管疾病的死亡风险、心肌梗死或脑卒中发生无独立相关性,而CysC水平更有效地预测了老年人群中心血管事件和死亡的风险。过去的研究证明了肾功能不全可以预测各种临床背景下不利的心血管疾病的演变和死亡。但是肌酐和GFR值检测肾功能不全的不敏感性限制了它们作为预测因子的价值。

本结果发现,CAF患者血清CysC水平明显升高,并与PRA、Ang Ⅱ、Ald密切相关。CAF患者心悸、胸闷等不适症状引起交感神经兴奋性增加,末梢释放大量儿茶酚胺递质,促进PRA的分泌和AngⅡ的生成;肾上腺素能兴奋神经,血液循环中儿茶酚胺均增加,PRA、Ang Ⅱ等引起肾血管收缩、肾血流减少、肾脏血液灌注不足、GFR下降、滤过分数上升、Ald降解作用减弱、抗利尿激素释放增加,引起水钠潴留,这些均由心房颤动时RAAS激活所继发。而肾脏有强大的贮备能力,只有当GFR下降到正常的50%以下时,血中尿素及肌酐浓度才出现增高,因此不能反映早期的肾功能损害。而CysC可被肾小球自由滤过,又被肾小管吸收、降解而不再重返血流中,因此血清中的CysC浓度由GFR决定,在肾功能早期受到损害时,血清CysC浓度即可有明显升高。但CysC是否可作为一个评价CAF预后的客观指标,还有待进一步的研究。

参考文献

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血氨蛋白酶抑制剂C 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择临床上确诊的糖尿病住院患者103例, 其中男63例, 女40例;年龄40～62岁;其中已伴发肾病的患者有21例, 男15例, 女6例;年龄40～60岁。对照组103名均为健康体检者, 其中男63例, 女40例;年龄35～55岁。

1.2 检测方法

血清β2-MG、Cys C, 采用免疫增强比浊法。试剂由浙江康特生物技术有限公司提供, BUN采用酶学速率法, Cr采用酶法, 试剂由北京九强生物技术股份有限公司提供, 仪器均选用日立7170A全自动生化分析仪。清晨空腹采血, 排除溶血和黄疸, 离心分离血清检测。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0软件分析数据, 计量资料以$(\overline{x}\pm \text{s})$表示, 计量资料采用t检验, 以P<0.05表为差异有统计学意义。

2 结果

糖尿病组血清β2-MG、Cys-C结果明显高于正常对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 而BUN和Cr与正常对照组比较, 仅已伴发肾病的患者明显高于正常对照组, 其余差异均无统计学意义 (P>0.05, 见表1) 。

3 讨论

目前, 临床上多采用BUN、Cr作为评价GFR的指标。但是, BUN受肾前因素 (如高蛋白饮食、胃肠出血等) 影响较大, 并且在肾小管重吸收和排泌。Cr相对恒定, 不被肾小管重吸收, 排泄量较少。但是, Cr水平也受到一些因素 (如年龄、肌肉量) 的影响, 并且不够灵敏。只有当GFR下降一半以上时, 其值才开始升高。而且Cr升高已预示肾功能进入了不可逆转的损伤期。随着年龄的增加, 肌肉产生的内生性肌酐绝对值不足, 虽然肾功能下降很多, 但血肌酐的测定值还处于正常范围内。即在老年患者, 特别是女性患者中存在着普遍的隐匿性肾功能不全。临床医生一般习惯于单纯的根据BUN、SCr判断肾功能, 这样会忽视隐匿性肾功能不全患者的诊断和治疗。所以, 传统的肾功能标志物BUN、Cr二者的敏感性和特异性都不是理想的参考项目。

β2-MG是相对分子质量为11800的蛋白质, 存在于除红细胞和胎盘滋养层以外的所有有核细胞, 尤其单核细胞和淋巴细胞含量丰富。β2-MG主要由淋巴细胞分泌, 肾近曲小管是β2-MG在体内处理的惟一场所。由于分子量小, 可自由通过肾小球滤过。正常情况下几乎全部由肾小管重吸收, 血液中含量很低。GFR下降时, 血液中β2-MG升高, β2-MG与GFR呈显著地负相关。但是有些疾病 (如炎症及肿瘤) 产生β2-MG过多, 也会使血中β2-MG增加。此时血清β2-MG升高不是肾功能改变引起, 在评价检验结果时必须注意。

Cys-C是一种非糖基化的碱性低分子量蛋白质, 由有核细胞分泌, 广泛存在各种体液中, 生成速率恒定, 可自由通过肾小球虑过膜, 在近曲小管几乎全部重吸收, 被肾小管上皮细胞完全代谢降解成小分子的肽或氨基酸。无肾小管分泌, 肾脏是惟一排泄器官。血中浓度不受饮食、体重、肌肉量、代谢、年龄、性别、肝功能变化及炎症等因素的影响。其血中浓度与GFR密切相关。在反映肾小球功能上, 它比血清β2-MG优越。Cys-C现已替代血清Cr作为评价GFR的指标。

综上所述, 糖尿病患者尿蛋白阴性以及血清BUN, Cr检测结果在正常参考值范围, 也不能排除早期肾功能损害的存在。血β2-MG的测定可作为糖尿病早期肾损伤诊断的敏感指标。因此初诊糖尿病患者在作肝、肾功能、血脂、血尿常规等检查外, 有必要进行血β2-MG、Cys-C的检测, 这对于及早发现早期肾损害, 阻止糖尿病肾病的发生发展具有重要意义。

参考文献

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