组织蛋白酶抑制素

组织蛋白酶抑制素（共7篇）

组织蛋白酶抑制素 篇1

吸烟对人体健康的危害已经众所周知。吸烟被认为是造成男性不育的高危因素之一[1]。香烟中的多种物质吸收后进入血液,致使循环血液中有害物质浓度经过长期积累而逐渐增高,干扰睾丸和附睾的微循环与内环境的物质交换进而发生一系列病理、生理改变,影响精子的发育过程,最终可能导致男性不育[2]。研究表明,被动吸烟可影响大鼠睾丸功能和受精能力的各项指标,随吸烟时间的延长,由于多种激素生长因子及旁分泌因子改变,影响支持细胞和间质细胞功能,继而影响生精内环境,使生精过程受到明显抑制,导致雄性生殖能力下降[3]。我们建立大鼠吸烟模型,旨在观察香烟烟雾对睾丸形态结构、血浆中抑制素B含量影响,并探讨睾丸波形蛋白表达情况,以进一步从支持细胞损伤情况认识香烟对睾丸危害的可能机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

抑制素B试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司),显微镜OLYMPUS CH30(日本OLYMPUS公司),酶标仪,高速冷冻离心机(美国Thermo公司),DK-600型电热恒温培养箱(上海益恒实验仪器有限公司)。

1.2 试验动物分组及处理

清洁级成年雄性SD大鼠160只(由新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心提供,动物许可证号:SCXK(新)2011-0001),体重为180~220 g,适应性喂养1周后随机分为对照组及2、4、6、8、12周实验组,实验组又分为低(10只香烟)、中(20只香烟)、高(30支香烟)剂量组,每组10只。实验组大鼠分别置于自制静式被动吸烟箱中,采用呼吸道静式染毒,香烟烟雾由真空泵抽入,每日1次,每次持续2 h,实验组又分为染毒2、4、6、8、12周组(选用新疆卷烟厂生产的某品牌过滤嘴香烟,每支香烟烟气烟碱量1.2 mg,焦油量12 mg)。对照组大鼠不做任何特殊处理,每日与实验组大鼠同等喂养。

1.3 睾丸脏器系数计算

染毒结束后,各组大鼠用水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,摘取双侧睾丸,剔净睾丸筋膜,滤纸吸干水分后,用电子天平称其湿重.按公式计算脏器系数:脏器系数=[脏器重量(g)/动物体重(g)]×100%。

1.4 血浆抑制素B的测定

用酶联免疫吸附法,按试剂盒的操作步骤,用酶标仪读取450 nm处的A值,根据标准曲线计算血浆中的抑制素B(pg/ml)水平。

1.5 免疫组织化学法检测波形蛋白的分布与表达

每组随机选取5只大鼠样本常规脱水、石蜡包埋后切片,二甲苯和乙醇脱蜡及水处理后,3%H2O室温孵育15 min,以消除内源性过氧化物酶活力,蒸馏水、磷酸盐缓冲液(PBS)各浸洗5 min,枸橼酸抗原修复液微波加热12 min进行抗原修复,水洗后加正常山羊血清封闭30 min,倾去血清,滴加小鼠抗大鼠波形蛋白一抗(1∶100,武汉三鹰),4℃湿盒过夜,PBS冲洗,加入羊抗鼠Ig G(北京中杉公司)37℃,30 min,PBS浸洗后二氨基联苯胺(DAB)显色,常规复染、封片、观察。由于波形蛋白位于胞质内,故以胞质出现棕黄色丝为阳性表达。结果用Cells Sens生物医学图像分析系统对所摄照片的阳性产物进行比例分析。

1.6 光学显微镜(光镜)观察

睾丸一侧用中性甲醛固定,常规制作石蜡切片,HE染色,光镜检测。

1.7 统计学分析

数据以±s表示,应用SPSS 17.0统计软件One-way ANOVA(单因素方差分析)进行资料差异分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脏器系数比较

相同染毒时间大鼠睾丸脏器系数比较,6周高剂量组,8和12周的低、中、高剂量组较空白对照组降低,差异有统计学意义(均P<0.05)。相同染毒剂量大鼠睾丸脏器系数比较,随染毒时间延长,睾丸脏器系数降低。其中,染毒8和12周的中、高剂量组与空白对照组及染毒2、4、6周组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠血浆抑制素B水平的比较

随着染毒周数的增长,大鼠血浆抑制素B呈明显降低趋势。8周高剂量组与空白组的差异有统计学意义,12周低,中,高剂量组与空白组的差异均有统计学意义。见表2。

2.3 波形蛋白表达情况

对照组大鼠睾丸波形蛋白呈强阳性显色,在支持细胞分布的基底膜形成棕黄色的环,并随支持细胞向管腔内延伸。2、4周组的波形蛋白表达下降,其向管腔内延伸的部分变短。随着染毒时间的延长,伸至管腔的波形蛋白微丝表达减少或消失,12周高剂量组大鼠睾丸波形蛋白表达几乎消失,曲细精管管腔中细胞排列紊乱。经Cells Sens图像分析,高剂量组与空白组的差异有统计学意义。随着染毒时间的延长,波形蛋白表达量降低。各组波形蛋白阳性产物表达变化见表3、图1。

注:经单因素方差分析LSD检验,与对照组比较,aP<0.05。每支香烟烟气含烟1.2 mg,焦油12 mg。

注:经单因素方差分析LSD检验,与对照组比较,aP<0.05。每支香烟烟气含烟1.2 mg,焦油12 mg。

2.4 各组大鼠睾丸组织病理变化

见图2。空白对照组睾丸曲细精管形态规则,生精上皮基膜完整,曲细精管管腔位于中央处,管腔内可清楚见到大量初步发育成熟的精细胞,各级生精细胞发育正常,由外到内排列紧密整齐,层次分明清晰,无变性损害;染毒组睾丸生精小管形状不规整,生精上皮层次变薄、界膜部分剥脱,生精细胞层数减少,各级生精细胞排列紊乱、细胞间隙增大,随着染毒时间的延长,部分基膜破裂溶解,生精小管的生精上皮大部分脱落,管壁游离面无精子,管腔内各期生精细胞明显退变。

注:经单因素方差分析LSD检验,与对照组比较,aP<0.05。每支香烟烟气含烟1.2 mg,焦油12 mg。

注:A为空白对照组;B为2周高剂量组;C为4周高剂量组;D为6周高剂量组;E为8周高剂量组;F为12周高剂量组

注:A为空白对照组;B为2周高剂量组;C为4周高剂量组;D为6周高剂量组;E为8周高剂量组;F为12周高剂量组

3 讨论

吸烟是一个严重的社会公共问题,其对男性生殖系统的危害在临床研究中早已得到证实[4],睾丸结构的正常是维持正常生精的基础,其中产生精子的是生精细胞,支持细胞与生精细胞共同构成睾丸的精曲小管,而作为睾丸曲细精管内惟一的体细胞,支持细胞具有营养、激素转化、吞噬、屏障隔离及为生精细胞提供支架的作用,和精子形成有密切关系[5],此外,还具有非常重要的分泌功能,其分泌的生物活性物质具有调节生殖系统功能的作用[6]。

抑制素B是目前公认的评价睾丸生精功能以及评估男性生育能力较好的激素指标之一[7],它的主要作用是通过对下丘脑—垂体—性腺轴的负反馈调节作用,抑制促卵泡激素(FSH)的分泌,间接影响睾丸间质细胞对睾酮的分泌,从而对雄性生殖系统造成损伤。现已经证实精子发生与抑制素B合成都有赖于睾丸支持细胞。抑制素B水平既能反映睾丸生精功能状态,也可以作为睾丸的支持细胞功能评价指标,当睾丸结构受损累及支持细胞时,抑制素B产生水平下降[8]。本实验结果显示,染毒组大鼠血浆中抑制素B水平低于空白对照组,且高剂量组明显低于空白组和低剂量组,并随着染毒时间的延长更加明显。

波形蛋白是支持细胞与间质细胞的细胞骨架成分,与支持细胞、生精细胞间的物质和信息交流,精子释放以及间质细胞功能有紧密联系,参与支持细胞黏着斑的形成及细胞间黏附,对维持支持细胞形态及精子释放起着重要作用[9]。NIEMINEN等[10]认为,如果波形蛋白丢失,将进一步导致或加重相关细胞黏附分子表达的缺失。AUMULLER等[11]研究表明,任何影响波形蛋白表达、分布、结构、降解的因素都将影响支持细胞的功能。本研究结果显示,睾丸组织结构发生改变,睾丸波形蛋白分布变化与表达量减少,提示香烟烟雾中的有害成分影响睾丸组织结构,抑制支持细胞及间质细胞波形蛋白的分泌,破坏支持细胞及间质细胞骨架,从而影响支持细胞的功能,可能是香烟烟雾影响睾丸精子发生及激素分泌的原因之一。推测其可能原因一是,香烟烟雾中主要有害成分尼古丁、镉离子等能干扰细胞内钙稳态,导致细胞内Ca2+浓度持续升高,Ca2+为主要第二信使,其浓度升高将激活Ca2+依赖的蛋白激酶C(PKC),活性PKC可能激活胞内其它酶如蛋白激酶N(PKN)的活性,激活的PKN可通过磷酸化作用催化波形蛋白的降解;二是钙超载可以直接抑制ATP的合成,使能量生成障碍,激活线粒体上磷脂酶,引起线粒体膜损伤,并在线粒体内形成磷酸钙沉淀,改变线粒体膜的通透性,线粒体Ca2+释放,使细胞发生不可逆损伤[12]。然而香烟中有害成分对睾丸细胞损害的具体机制以及戒烟后对雄性生殖系统的损伤能否恢复,是否影响子代遗传物质的改变,仍需深入研究。

作者声明

本文无实际或潜在的利益冲突

参考文献

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[11]AUMULLER G,SCHULZE C,VIEBAHN C.Intemediate filments in Sertoil cells[J].Microsc Res Tech,1992,20(1):50-72.

[12]STOUT AK,RAPHAEL HM,KANTEREWICZ BI,et al.Mitochondrial calcium uptake[J].Nat Neurosci,1998;1(5):366-373.

组织蛋白酶抑制素 篇2

1 材料与方法

1.1 材料

VPA(Sigma公司);阿霉素(浙江海正药业股份有限公司,批号:130707);CUR(Alddin公司,批号:C1213019);四氮唑蓝、胎牛血清及DMSO(Amresco公司);MEM、DMEM、青霉素/链霉素及胰蛋白酶(Gibco公司);人乳腺癌耐药细胞株MCF-7R和人乳腺癌敏感株MCF-7(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

MCF-7R(MCF-7)细胞由含10%胎牛血清、青霉素(100 U/m L),链霉素(100 U/m L)培养基(DMEM)培养,于37℃(5%CO2,95%空气),饱和湿度,待细胞生长至85%左右融合,用0.25%胰蛋白酶液消化后进行传代。MCF-7R耐药细胞除上述条件外,需加入1.0μg/m L的阿霉素,以维持细胞的耐药性,实验前2周停药。CUR由二甲基亚砜(DMSO)稀释为100 mmol/L母液,分装,避光-20℃冰箱保存,2周内有效,使用前以无血清培养基稀释至所需浓度,使DMSO终浓度<0.1%;VPA由PBS液稀释为1 mol/L母液,0.22μm针式滤器过滤除菌,分装,-20℃冰箱保存,使用前以无血清培养基稀释至所需浓度。

1.2.2 细胞增殖检测(MTT)

取对数生长期MCF-7R及MCF-7细胞,1000 r/min离心5 min,弃去上清培养液,用含10%FBS的MEM及DMEM培养液重悬并打匀后,用血细胞计数板计数,将细胞液稀释至5×104个/m L接种于96孔培养板,每孔100μL,37℃、5%CO2过夜贴壁培养24 h后,分别加入不同浓度的ADR溶液,使细胞培养液浓度梯度为100、10、1、0.1、0.01μg/m L,药物作用72 h后,每孔加入20 m L MTT溶液(2.5 mg/m L,现配现用),置于细胞培养箱中孵育4~6 h后,吸弃细胞上清液,每孔加入100 m L DMSO,轻微振荡,待甲瓒完全溶解后用自动酶标仪于490 nm处测定吸光度值(OD值)。取对数生长期MCF-7R细胞按上述方法处理,37℃、5%CO2过夜贴壁培养24 h后,分别加入不同浓度的VPA溶液,使细胞培养液浓度梯度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L,24、48、72 h后得到相应浓度及时间下的增殖抑制率,并根据这个结果选择后续试验VPA浓度;取对数生长期MCF-7R细胞,按上述方法处理,加入不同浓度的CUR溶液,使细胞培养液浓度梯度为320、160、80、40、20、10、5μmol/L,24、48、72 h后得到相应浓度及各时间下的增殖抑制率及各时间段的半数抑制浓度,根据结果选择后续试验浓度,每组实验均设空白对照,分别设3个复孔,实验重复3次。用酶标仪测定OD值,细胞增殖的抑制率(IR%)=(1-OD实验组/OD对照组)×100%。

1.2.3合并用药效果评价

评价联合用药对肿瘤细胞的抑制是否有协同作用,参照金正均Q值法判断:Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb),其中Ea+b为合并用药的抑制率,Ea和Eb分别为A药和B药单独用药的抑制率。Q<0.85为拮抗,0.85≤Q<1.15为相加,Q≥1.15为协同[7]。

1.2.4细胞形态观察

取对数生长期MCF-7R细胞,以5×104/孔接种于96孔板,37℃、5%CO2孵箱培养24 h后,加入终浓度为0.625 mmol/L VPA、10μmol/L CUR、0.625 mmol/L VPA+10μmol/L CUR与联合处理48 h后,在倒置显微镜下观察细胞形态及数量变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,多组比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD-t检验;IC50用Probit回归法计算,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADR对MCF-7R/MCF-7细胞增殖的影响

用100、10、1、0.1、0.01μg/m L ADR处理对数生长期的MCF-7R细胞及MCF-7细胞72 h,根据OD值计算抑制率,用Probit回归法计算IC50。阿霉素对MCF-7R细胞及MCF-7细胞作用的IC50分别是(60.30±20.30)、(5.59±1.87)μg/m L,MCF-7R耐药倍数约为10.8倍。

2.2 VPA对MCF-7R细胞的增殖抑制作用

20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L VPA及空白对照处理对数生长期MCF-7R细胞24、48及72 h,根据OD值计算抑制率,提示各组VPA对MCF-7R细胞抑制作用与浓度和时间相关(P<0.01),见表1。因VPA在临床治疗应用中浓度监测安全范围为50~100μg/m L,尽量减少药物细胞毒性作用对结果的影响,该实验VPA浓度应选为0.625 mmol/L[8]。

2.3 CUR对MCF-7R细胞的增殖抑制作用

320、160、80、40、20、10、5μmol/L CUR及空白对照处理对数生长期的MCF-7R细胞24、48及72 h后,根据OD值计算抑制率。结果,CUR对MCF-7R细胞抑制作用与浓度和时间相关(P<0.01),见表2。Probit回归法计算CUR 24、48及72 h IC50,分别为23.7、49.8和38.6μmol/L,该实验CUR后续浓度为10、20、40μmol/L。

2.4 VPA联合CUR对MCF-7R细胞增殖的影响

0.625 mmol/L VPA分别作用于40、20、10μmol/L CUR处理对数生长期的MCF-7R细胞24、48及72 h后,根据OD值计算抑制率。结果显示,在相同作用时间下,抑制率的高低取决于CUR的浓度,CUR浓度越高,抑制率越大(P<0.01)。见表3。

注:VPA:丙戊酸;CUR:姜黄素

2.5 金正均Q值法判断两药联用效果

采用金正均Q值公式计算Q值,分析VPA联合CUR对MCF-7R细胞增殖抑制率的增强是否具有协同作用。Q<0.85为拮抗,0.85≤Q<1.15为相加,Q≥1.15为协同。结果显示,当CUR为10μmol/L作用48 h时,两药物联合有明确相加作用(P<0.01);而各联合用药组作用24、72 h时及20、40μmol/L CUR联合0.625 mmol/L VPA作用48 h时均表现出拮抗作用。各联合用药组作用48、72 h时Q值比较,差异有高度统计学意义(P<0.01),作用24 h时比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

注:VPA:丙戊酸;CUR:姜黄素

2.6 联合用药对细胞形态及数量的影响

空白组与单独使用0.625 mmol/L VPA组48 h后细胞增殖状态良好,数目形态未见明显变化;单独使用10μmol/L CUR组数目稍有减少,0.625 mmol/L VPA+10μmol/L CUR处理组,数目形态发生较为明显改变,可见少量细胞形态不规则,体积变小,大小不等,培养基中可见少许的细胞碎片及死亡细胞。见图1。

A:空白组;B~C:0.625 mmol/L VPA;C:10μmol/L CUR;D:0.625 mmol/LVPA+10μmol/L CUR;VPA:丙戊酸;CUR:姜黄素

3 讨论

VPA是广谱组蛋白去乙酰化酶抑制剂,可通过诱导细胞周期停滞、细胞凋亡和分化,抑制肿瘤细胞生长增殖等途径达到较强抗肿瘤活性[3,4,5,6]。VPA可增强多种抗肿瘤药物对肿瘤细胞的疗效,例如VPA增强顺铂对小细胞肺癌的作用,其机制是通过线粒体途径诱导细胞凋亡,VPA抑制组蛋白去乙酰化酶3的表达,上调P21,并抑制Bcl-x L的表达,从而增强顺铂的抗肿瘤作用[9]。另外VPA联合RAS抑制剂抑制非小细胞肺癌的增殖,因阻碍Survivin与Aurora A的表达[10]。

CUR具有一定的抗肿瘤作用,能抑制多种肿瘤细胞的生长、促进分化、诱导凋亡等作用[4,11]。CUR可介导细胞内信号,CUR可通过作用不同分子靶点导致肿瘤细胞的凋亡及细胞周期的抑制,例如上调cdk抑制剂、P53,下调Cyclin D1、cdk-1、cdk-2、NF-k B[12],并可增强顺铂或奥沙利铂抗肿瘤作用,并能逆转肿瘤细胞的耐药性[13,14,15],且与下调P-gp蛋白、多药耐药相关蛋白MRP-1等蛋白表达有关[16,17]。CUR的多效活性取决于其复杂的化学组成,故其可作用于多条信号途径,包括NF-k B、Akt、生长因子、依赖于Nrf2细胞保护途径、转移和血管生长途径等[18]。

Fortunati等[19]将适合人体浓度的VPA作用于MCF-7细胞,发现其能诱导P21表达,使细胞周期停滞于G1期,下调Bcl-2及上调Bak表达,从而诱导乳腺癌细胞凋亡。另有文献报道VPA与CUR联合作用于人白血病细胞,通过作用于组蛋白乙酰化酶,导致白血病细胞的凋亡[20],然而目前尚未有文献报道VPA和CUR联合作用于乳腺癌耐药细胞MCF-7R。本研究发现不同浓度的VPA及CUR作用于MCF-7R细胞的增殖抑制作用呈现时间与浓度依赖性,两药联用时0.625 mmol/L VPA+40μmol/L CUR组各时间点抑制率均为最高,但在此浓度下两药并未呈示相加或协同作用。只有0.625 mmol/L VPA+10μmol/L CUR作用48 h时提示存在相加作用(P<0.05),其余各组均呈拮抗作用,但作用24 h各组抑制率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。从对细胞形态及数量的影响发现,联合用药组细胞数量比单药作用减少明显,但不显著。两药在低剂量联用时存在相加作用,高剂量联用时呈拮抗作用,推测两药存在同一作用靶点或通路,尚待进一步深入研究。

摘要：目的 探讨丙戊酸(VPA)联合姜黄素(CUR)对人乳腺癌耐药细胞MCF-7R增殖抑制的影响及其作用机制。方法 分别用100、10、1、0.1、0.01μg/m L阿霉素(ADR)作用于MCF-7R细胞和敏感株细胞MCF-7细胞72 h后,MTT法测定ADR对各组细胞的抑制率,计算半数抑制浓度(IC50),判定MCF-7R细胞的耐药情况;用20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L VPA、空白对照及320、160、80、40、20、10、5μmol/L CUR、空白对照分别作用于MCF-7R细胞24、48及72 h,用MTT法分析细胞增殖抑制率;将VPA 0.625 mmol/L分别与10、20、40μmol/L CUR联合作用于MCF-7R细胞24、48及72 h后,用MTT法分析联合用药细胞增殖抑制率及Q值;将VPA 0.625 mmol/L与10μmol/L CUR联合作用于MCF-7R细胞48 h后,高倍显微镜下观察细胞形态及数量变化。结果 MCF-7R与MCF-7细胞IC50分别为(60.30±20.30)、(5.59±1.87)μg/m L,MCF-7R细胞耐药倍数约为10.8倍。不同浓度VPA或VPA处理对数生长期MCF-7R细胞24、48及72 h后,结果提示对VPA或VPA对MCF-7R细胞的抑制作用与药物浓度和时间相关(P<0.05);联合用药结果显示,在相同作用时间下,CUR浓度越高,抑制率越高(P<0.05)。金正均Q值法判断两药联用结果显示,0.625 mmol/L VPA与10μmol/L CUR联合作用48 h时两药有明确的相加作用(P<0.05),而其他联合用药及作用时间表现出两药拮抗作用,其中各联合用药组作用48、72 h时的Q值比较,差异有高度统计学意义(P<0.01),而作用24 h时Q值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。单用0.625 mmol/L VPA见少量细胞减少;10μmol/L CUR也可导致较多细胞死亡,两药物联用时较单独用药细胞数量减少明显。结论 VPA及CUR在低剂量联用时存在相加作用,高剂量联用时两者呈现拮抗作用。

组织蛋白酶抑制素 篇3

研究发现, 鳄鱼血具有抗菌、抗病毒、抗癌等功能[10,11,12], 而关于鳄鱼血蛋白酶解产物的开发研究却很少有报道。本文运用木瓜蛋白酶将鳄鱼血浆蛋白和血球蛋白进行酶解, 并测定其酶解产物的抗氧化和ACE抑制能力, 为鳄鱼血蛋白酶解产物功能的充分开发和利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料、试剂和仪器

鳄鱼血浆和血球 (广西盟展鳄鱼科技开发有限公司) ;血管紧张素转化酶 (ACE) 、马尿酸、马尿酰-组胺酰-亮氨酸 (HHL) 、DPPH (1, 1-二苯基2-三硝基苯肼) 、啡咯嗪 (Sigma公司) ;木瓜蛋白酶 (广西南宁庞博生物工程有限公司) ;三氯化铁、氯化亚铁、铁氰化钾、硫酸亚铁 (国药集团化学试剂有限公司) ;AY220型电子分析天平 (日本岛津公司) ;LC3000高效液相色谱仪 (北京创新通恒有限公司) ;DSHZ-300多用途恒温振荡器 (江苏太仓市实验设备厂) ;UNICO-2700分光光度计 (美国UNIC公司) ;FE20科特勒-托利多实验室pH计 (梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司) ;TGL-16C高速台式离心机 (上海安亭科技仪器厂) ;恒温水浴锅 (北京市长风仪器仪表有限公司) ;FD-1PF冷冻干燥机 (北京德天佑科技发展有限公司) 。

1.2试验方法

1.2.1原料处理方法

将鳄鱼血浆和血球冷冻干燥, 制成血浆蛋白粉和血球蛋白粉, 之后采用木瓜蛋白酶 (8×105U/g) 进行酶解, 酶与底物比为1:50, 反应温度和时间为37℃、1 h, 之后冷冻干燥备用。

1.2.2亚铁离子螯合能力的测定

根据Kong等[13]的方法并加以改进。将1 mL蛋白酶解液与3.7 mL无水乙醇和0.1 mL 2 mmol/L的氯化亚铁溶液混合, 加入0.2 mL 5 mmol/L的啡咯嗪溶液启动反应, 室温静置10 min后, 在波长562 nm处检测吸光度[13]。

式中:F—亚铁离子螯合率, %;A样品, 562、A对照, 562分别表示样品反应液和对照溶液在562 nm下的吸光度, A。

1.2.3清除ABTS自由基能力的测定

参照Re等[14]的方法并稍作改进。将17 mg过硫酸钾溶于26 mL的双蒸水中, 取上述过硫酸钾溶液2.6 mL, 加入10 mg ABTS, 配制成ABTS母液, 暗处放置12~16 h后, 取上述母液0.8 mL, 用0.2 M磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 稀释至在734 nm下读数为0.70±0.02。取不同浓度的样品溶液0.04 mL与4 mL稀释后的ABTS溶液混合震荡30 s后避光放置6 min, 在734 nm下检测其吸光值, 吸光值越小代表自由基清除能力越强。空白用蒸馏水代替样品。

清除DPPH自由基能力计算公式如下:

式中:I—ABTS自由基的 清除率, %;A样品, 734、A对照, 734分别表示样品反应液和对照溶液在734 nm下的吸光度, A。

1.2.4清除DPPH自由基能力的测定

根据张尊听等[15]的方法, 并加以改进。将1.50 mL酶解产物溶解液与等量的99.5%的乙醇混匀, 加入0.375 mL的DPPH乙醇溶液 (0.02%, w/w) 震荡混匀, 室温下暗室反应60 min后在517 nm处测定其吸光度, 吸光度越小表示自由基清除能力越强[15]。

清除DPPH自由基能力计算公式如下:

式中:J—DPPH自由基清除率, %;A样品, 517、A对照, 517分别表示样品反应液和对照溶液在517 nm下的吸光度, A。

1.2.5还原能力的测定

参照Bougatef等[16]还原能力的测定方法并稍作改动。取1 mL样液, 加入2.5 mL的磷酸缓冲液 (0.22 mol/L, pH 6.6) 和2.5 mL铁氰化钾溶液 (5%, w/w) , 混匀, 在50℃保温20 min后加入2.5 mL三氯乙酸 (10%, w/w) , 混合后, 以3000 r/min离心10 min, 取上清液2.5 mL, 加入0.5 mL三氯化铁 (1%, w/w) , 然后在700 nm波长处测定吸光度A值[16]。A越大, 则样品的还原能力越强。

1.2.6体外ACE抑制率的检测方法

按照表1中实验方法, 将HHL和样品加入试验组离心管, HHL和磷酸盐缓冲液 (pH 8.3, 0.2M) 加入对照组离心管, 两组均在37℃的摇床上预热10 min (加热5 min后, 预热ACE 5 min) , 之后均加入0.05 U/mL的ACE, 在37℃的摇床上温育30 min, 结束后加入125μL 1 M HCL , 在37℃的摇床上再温育30 S, 最后用HPLC在228 nm下进行测定分析。

注:对照组中用10 μ L 磷酸盐缓冲液代替样品反应液。

计算公式为:

K= (M-N) /M×100 (4)

式中:K—ACE抑制率, %;M—对照组中马尿酸的峰面积, (Um A·S) ;N为添加ACE抑制剂组中马尿酸的峰面积, (Um A·S) 。

统计分析

所有数据均采用Microsoft Excel计算标准偏差, SPSS软件对数据进行单因素方差分析, 两两比较采用LSD法, 本试验的数据以Means±SD表示。

2结果与分析

2.1鳄鱼血蛋白酶解产物的抗氧化结果分析

2.1.1亚铁离子螯合率

抗氧化剂主要是通过螯合金属离子、作为供氢体或供电子体清除游离基及促进过氧化物的分解等几种机制完成抗氧化作用[17]。由图1可知, 当浓度<3 mg/mL时, 鳄鱼血浆和血球蛋白酶解产物的亚铁离子的螯合能力随其浓度的提高而显著增加, 当浓度≥3 mg/mL时, 两种蛋白酶解产物对亚铁离子的螯合力变化不明显。鳄鱼血浆蛋白和血球蛋白酶解产物亚铁离子螯合能力的IC50值分别为0.51 mg/mL和0.88 mg/mL。在浓度0~5 mg/mL范围内, 两种蛋白酶解产物的亚铁离子螯合能力的差异性均不显著 (P>0.05) 。两种酶解产物具有较好的亚铁离子螯合能力, 这可能与鳄鱼血蛋白在酶解的过程中, 从蛋白分子的内部暴露出来的羧基及在氨基酸侧链的氨基酸残基有关[18]。

注:相同字母表示不同蛋白酶解产物之间差异性不显著 (P>0.05)

2.1.2清除ABTS自由基的能力

如图2所示, 两种蛋白酶解产物清除ABTS自由基能力随蛋白浓度的升高而增强, 体现了很好的量效关系。在0~5 mg/mL的浓度范围内, 血球蛋白酶解产物清除ABTS自由基的能力均强于血浆蛋白酶解产物, 且在浓度为1 mg/mL时, 血浆和血球蛋白酶解产物清除ABTS自由基能力的差异性极显著 (P<0.01) 。本试验表明了运用木瓜蛋白酶酶解鳄鱼血蛋白粉的酶解产物具有较强抗氧化性, 能有效的清除体外的ABTS自由基。

注:不同字母表示不同蛋白酶解产物之间差异性显著 (P>0.05)

2.1.3清除DPPH自由基的能力

如图3所示, 鳄鱼血浆蛋白酶解产物清除DPPH自由基的能力在0~5 mg/mL的浓度范围内随着蛋白浓度的增加而升高, 当浓度>4 mg/mL时, 其清除能力变化不明显。鳄鱼血球蛋白酶解产物在0~4 mg/mL浓度范围内, 清除能力逐渐升高, 在4 mg/mL处达到最大抑制率后, 其清除能力随浓度升高而降低。运用木瓜蛋白酶酶解的鲢鱼鱼肉蛋白酶解产物对DPPH自由基的清除能力低于20%[19], 鳄鱼血蛋白酶解产物相对鲢鱼鱼肉蛋白酶解产物清除DPPH自由基的能力更强。

注:相同字母表示不同蛋白酶解产物之间差异性不显著 (P>0.05)

2.1.4还原力

鳄鱼血浆和血球蛋白酶解产物的还原力如图4所示。在0~20 mg/mL的浓度范围内均表现出较强的还原力。牟雪娇等[20]通过优化工艺条件制备的鸡血蛋白抗氧化肽的最强还原力为98.4, 低于鳄鱼血浆蛋白和血球蛋白酶解产物的最佳还原力。鳄鱼血浆和血球蛋白酶解产物还原力的IC50值分别为4.512 mg/mL和4.303 mg/mL, 两者差异性不显著 (P>0.05) 。

注:相同字母表示不同蛋白酶解产物之间差异性不显著 (P>0.05)

2.2鳄鱼血酶解产物ACE的抑制结果分析

鳄鱼血浆和血球蛋白的酶解产物的ACE抑制率如图5所示, 两种酶解产物对ACE都存在一定的抑制率。对于血浆蛋白酶解产物, 随着蛋白浓度的提高, ACE的抑制率呈现上升的趋势, 当蛋白浓度达到10 mg/mL时, 其抑制率达到最大, 为75.56%。此后, 随蛋白浓度增大时, 其ACE抑制率随着浓度的增大而减小。血球蛋白酶解产物的ACE抑制率变化趋势与血浆蛋白酶解产物的变化相似。鳄鱼血浆和血球蛋白的酶解产物对ACE抑制率在浓度为2.5 mg/mL、15 mg/mL、20mg/mL时, 两者存在极显著差异 (P<0.01) 。相对于血浆蛋白酶解产物, 血球蛋白酶解产物的ACE抑制率较好, 而且最大抑制率可达到86.42%, 高于猪血红蛋白81.1%[21]的抑制率。研究发现猪血红蛋白水解液经大孔树脂和葡聚糖凝胶初步分离后, 其ACE抑制活性具有明显提高[22]。因此, 可通过进一步的实验提高鳄鱼血蛋白酶解产物的ACE抑制力。

注:**表示不同蛋白酶解产物之间差异性极显著 (P<0.01)

3结论

鳄鱼血经酶解之后既有良好的亚铁离子螯合能力、还原能力及ABTS和DPPH自由清除能力, 又表现出良好的ACE抑制活性。此外, 鳄鱼血球蛋白酶解产物的ACE抑制力优于鳄鱼血浆蛋白酶解产物。以血液蛋白作为原材料制备多肽具有很大的优越性, 其具有分子量小、活性强、易吸收的特点。基于以上的功能和特点, 鳄鱼血将有望开发成天然抗氧化剂和功能性食品。

摘要：研究了鳄鱼血蛋白酶解产物的抗氧化特性和对血管紧张素转化酶 (ACE) 的抑制活性。利用木瓜蛋白酶酶解鳄鱼血浆蛋白和血球蛋白, 用分光光度法测定了酶解产物的抗氧化能力和用高效液相色谱 (HPLC) 测定其ACE的抑制率。结果显示:鳄鱼血浆和血球蛋白酶解产物的亚铁离子螯合能力差异性不显著 (P>0.05) ;在05 mg/mL的浓度范围内, 血球蛋白酶解产物清除ABTS自由基的能力大于血浆蛋白酶解产物, 且在浓度为1 mg/mL时, 两者清除ABTS自由基的能力差异性极显著 (P<0.01) ;血浆蛋白酶解产物清除DPPH自由基的能力在05 mg/mL的浓度范围内随着蛋白浓度的增加而升高, 血球蛋白酶解产物在蛋白浓度为4 mg/mL处达到最大清除率, 之后下降;在020 mg/mL的浓度范围内, 两种酶解产物的还原力随着蛋白浓度的提高显著升高, 但两者还原力的差异性不显著 (P>0.05) ;鳄鱼血浆和血球蛋白酶解产物对ACE具有良好的抑制力, 其最大抑制率可分别达到75.56%和86.42%。研究表明, 鳄鱼血蛋白酶解产物在体外具有抗氧化和抑制ACE的活性。

组织蛋白酶抑制素 篇4

关键词：心室重构,金属蛋白酶抑制因子-1,基质金属蛋白酶

1 金属蛋白酶组织抑制因子

-1 (TIMP-1) 对常见心血管疾病心室重构影响的研究现状

1.1 TIMP-1对心肌梗死后心室重构影响

急性心肌梗死 (acute myocardial infarction, AMI) 后心室重构主要表现为梗死区扩展和变薄, 非梗死区心肌肥厚及拉长, 左室进行性扩张和变形, 收缩功能进行性降低, 最终导致心力衰竭。目前大量研究表明, MMPs的活性和表达增高以及TIMP-1的抑制作用减弱在心肌梗死后细胞外基质重构过程中发挥了重要作用。动物研究发现敲除TIMP-1基因的小鼠心肌梗死模型在心肌梗死后两周, 其左室舒张末容积相比野生型小鼠明显增大, 而应用MMP抑制剂 (MMPi) PD-166793后, 两种鼠的左室舒张末容积均得到明显改善, 但敲除TIMP-1基因小鼠的左室舒张末容积改善更为显著, 并且左室射血分数增加。Carson等在对正常对照组和心肌梗死组进行180d的随访研究中发现, 心肌梗死后第1天心肌梗死组MMP-9, TIMP-1及MMP-9/TIMP-1均表达升高, 其中MMP-9增高明显, 并与左室容积增大及左室扩张呈正相关。而Mukherjee等在转录水平证实心肌梗死区域的TIMP-1启动子活化水平在心肌梗死后第七天达到高峰但明显低于MMP-2, MMP-9。综合以上研究表明, 心肌梗死后梗死区MMPs表达及活性升高, TIMP-1相对不足可能促进了心肌梗死后心室重构发展。由于MMPs表达或活性增高, 促使梗死区细胞外基质大量降解, 破坏了室壁的张力, 导致心室扩张及心脏收缩功能障碍。

1.2 TIMP-1与高血压心室重构

高血压状态由于心脏负荷增加, 血流动力学改变导致室壁应力增加, 刺激心室肥厚造成心室重构。高血压左室重构主要表现为左室肥厚, 其组织结构变化为心肌细胞肥大以及心肌间质纤维化。目前有研究表明TIMP-1升高和心肌纤维化发生有关, 例如Lindsay等研究发现高血压患者血循环中TIMP-1水平升高, 并且与左心室肥大及左室舒张期功能障碍成正相关, 因此, 研究提出TIMP-1可作为高血压患者心肌纤维化的重要标志物。然而, 目前对TIMP-1参与高血压心肌纤维化的具体发生机制尚未研究清楚, 有研究表明氧化应激及炎症反应参与了这一过程。一项研究发现在大鼠体内注入血管紧张素II (AngII) 4周后, 血压明显增高, 同时NADPH氧化酶表达明显上调, TGF-β1、Ⅰ型胶原及TIMP-1mRNA表达增加, 成纤维细胞数量增多, 心肌间质出现明显纤维化。而同时使用抗氧化剂, 则上述情况明显改善。AngII是激活NADPH氧化酶的最主要刺激因子, AngII灌注后会引起体内氧化应激水平增高。

1.3 TIMP-1对心肌病心室重构的影响

扩张型心肌病心室重构主要表现为心肌纤维化, 目前有研究表明这一过程可能与心肌MMPs活性和表达升高, TIMP-1表达相对不足有关。Pircard等对46例扩张性心肌病患者进行心脏活检发现, 同正常对照组相比, 病例组中的MMP-1mRNA水平明显增高;相应的TIMP-1mRNA水平也增高, 由于MMP-1/TIMP-1比例失衡导致MMP-1在扩张性心肌病中过度表达, 促进正常胶原降解, 重构性胶原纤维积聚, 促使心肌发生替代性纤维化。

2 展望

目前大量研究表明TIMP-1通过抑制局部MMPs活性, 参与调控细胞外基质降解和合成间的平衡, 从而在许多心血管疾病心室重构过程中扮演了重要的角色。因此, 在评价TIMP-1对心室重构的影响时[1], 除了关注TIMP-1水平, 同时还应兼顾MMPs的表达变化, 因为二者的共同作用是促使心室重构发生和发展的重要因素。综合考虑心脏和心脏外因素对心室重构的影响可能有利于全面认识心室重构过程。相信随着对TIMP-1对心室重构影响研究的深入, 将使我们更好地揭示左室重构的具体发生机制, 也为临床改善左室重构, 防治心衰提供更多的理论依据。

参考文献

组织蛋白酶抑制素 篇5

有学者发现异位内膜细胞在早期可通过粘附性糖蛋白分子粘附在腹膜表面从而侵入细胞外基质 ( extraceller matrix, ECM) , 且可种植于腹膜, 子宫内膜细胞能否侵袭和种植入腹膜的关键因素是ECM的降解和重建[1]。ECM的破坏和降解需要基质金属蛋白酶 ( matrix metalloproteinases, MMPs) 的作用, ECM的所有成分几乎均可被在p H为中性的MMPs所降解, 且其调节活性决定ECM降解速度[2]。基质金属蛋白酶组织抑制因子 ( tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMPs) 是MMPs的天然特异性组织抑制因子, 它可与MMPs结合形成1: 1 复合体从而抑制其活性和产生, 从而调节ECM的合成与降解。MMPs的活性是由TIMPs调节从而调控ECM的更新, 破坏其平衡引起多种病理改变[3]。

本文应用免疫组化技术检测MMP - 2、TIMP - 1 在子宫内膜组织中的表达, 探讨子宫内膜是如何侵袭腹膜并在腹腔内种植生长, 阐明其发生发展机制, 为开拓新的治疗方法提供理论依据。

1 对象与方法

1. 1 对象实验所用标本来源于我院妇科2011 年12 月至2012 年8 月因子宫内膜异位症而行开腹手术的患者30 例 ( 卵巢巧克力囊肿患者) , 年龄36. 8 ± 5. 0 岁, 且患者在术前3 个月内未用过激素治疗; 22 例在位内膜组织标本取自上述因此病行子宫切除的患者子宫内膜组织;同期因子宫肌瘤而行子宫切除患者的正常子宫内膜20 例 ( 且均为增生期子宫内膜组织) 为对照组, 年龄45. 1± 3. 8 岁。

1. 2 标本采集在开腹手术时取卵巢巧克力囊肿囊壁组织、子宫腺肌病行子宫切除的患者子宫内膜组织、子宫肌瘤患者的子宫内膜组织。在子宫内膜面取新鲜组织, 同法取巧克力囊肿囊壁组织。

1. 3 方法组织经过10 % 的甲酸固定、石蜡包埋和苏木精- 伊红 ( hematoxylin - eosin, HE) 染色。免疫组化染色使用链霉菌抗生物素蛋白- 过氧化物酶 ( streptavidin -perosidase, SP) 法检测试剂盒, 切片脱蜡水化, 冲洗, 修复抗原, 滴加抗体, 充分冲洗; 用二氨基联苯胺 ( diaminobenzidine, DAB) 显色剂显色, 苏木素复染, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片后显微镜下观察。MMP - 2 用已知的阳性乳腺癌标本作阳性对照, TIMP - 1 用已知的肾脏标本作阳性对照, 磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。

1. 4 结果判定阳性染色为内膜细胞膜或浆中出现棕黄色或褐色颗粒, 根据阳性细胞百分率及显色深浅分级: ( 1) 阳性细胞百分率: 无细胞显色为0; < 25 % 细胞显色为1; 25 % ~ 50 % 细胞显色为2; ﹥ 50 % 细胞显色为3; ( 2) 显色深浅: 不显色或显色不清为0; 浅黄色为1; 棕黄色为2; 深褐色为3。二项的乘积: 0 - 1 分为阴性 ( - ) ; 2- 3 分为弱阳性 ( + ) ; 4 - 5 分为中度阳性 ( + + ) ;﹥ 5 分为强阳性 ( + + + ) 。

1. 5 统计学方法采用SPSS 11. 0 软件进行统计分析, 计数资料采用 χ2检验, 以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 异位、在位内膜组织中MMP - 2 的表达MMP - 2 的表达在异位内膜和在位内膜组织的腺上皮与间质中、正常子宫内膜的腺体中。异位内膜以 ( + + ) ~ ( + + + ) 为主, 在位内膜以 ( + ) ~ ( + + ) 为主, 两者比较差异有统计学意义 ( P <0. 05) ; 正常子宫内膜以 ( + ) 为主, 与异位内膜相比差异有统计学意义 ( P <0. 01) ; 正常内膜与在位内膜相比差异有统计学意义 ( P <0. 05) 。

2. 2 异位、在位内膜组织中TIMP - 1 的表达TIMP - 1 的表达在异位和在位内膜组织的上皮与间质中, 在正常子宫内膜的上皮细胞中表达。正常子宫内膜以 ( + + ) ~ ( + + + ) 为主, 在位内膜和异位内膜以 ( + ) 为主, 正常子宫内膜与在位和异位内膜相比差异有统计学意义 ( P < 0. 01) 。在位和异位内膜组织之间TIMP - 1 的表达差异无统计学意义 ( P> 0. 05) 。

3 讨论

子宫内膜异位症是一种良性疾病, 但其侵袭的特性却类似于恶性肿瘤发生侵袭和种植。MMPs属于锌依赖性蛋白酶家族, 是细胞外基质蛋白分解酶, 其促进肿瘤细胞的侵袭和转移是通过对细胞外基质的降解来完成的。已知的MMPs至少有24 种, 按其结构和作用的底物可分为胶原酶、明胶酶、间质溶解素、膜型MMP以及作用未知的多种底物酶[4]。目前已知的且通过鉴定所得出的MMPs具有共同的基本结构及生物化学特性。大多数MMPs都是间质胶原酶的同源分子, 以无活性的酶原形式从细胞分泌至细胞外。蛋白酶或有机汞制剂可使酶原激活后裂解一种或多种细胞外基质成分[5]。正常组织的骨架为ECM, 它是细胞生存的重要内环境。MMPs能降解所有的ECM, 是最重要的降解酶类。EMS的形成与ECM和基底膜的降解密切相关。MMP -2 属明胶酶[4], 能增强细胞的侵袭能力, 是细胞外基质重建的关键酶, 它能调节内膜的崩解与重建, 它可使细胞间的粘附作用降低, 从而利于细胞移动增加种植能力, 利于异位灶的生长。

本实验发现, MMP - 2 表达于正常子宫内膜上皮细胞、异位与在位内膜上皮和间质, 与郭海秀等研究一致。异位内膜组织中的表达明显高于其他两组内膜组织, 差异有统计学意义, 此与邱晓红等、刘维琴等研究结果相同, MMP - 2 的过度表达提示异位内膜细胞的生物学特性与在位内膜和正常子宫内膜细胞之间是有差别的, 说明异位内膜组织侵袭能力更强, 而且随着异位病灶的周期性出血, 使病情不断加重。在位内膜MMP - 2 的表达高于正常子宫内膜组织, 差异有统计学意义, 与他人研究结果相一致。在EMS妇女中, MMP - 2 表达于在位和异位内膜的上皮和间质细胞中, 说明侵袭性高与MMP - 2高表达有关, 这与文献研究结果相同。

TIMPs是体内MMPs的天然特异性组织抑制剂, 目前已知的有4 种, TIMP - 1 是分子量为28. 5 KD的糖蛋白, 能抑制所有已知的MMPs。子宫内膜腺上皮、结缔组织、巨噬细胞既能分泌MMPs, 又能分泌TIMPs。生理状态下, 调节MMP - 2 蛋白水解活性、协调ECM降解与重建的重要因素是MMP - 2 与TIMP - 1 之间的动态平衡。

本实验研究发现, 异位和在位内膜中TIMP - 1 的表达比正常子宫内膜降低, 差异有统计学意义, 异位与在位内膜组织中TIMP - 1 的表达差异无显著性, 此与Szamatowicz等[5]的研究结果相同。

综上所述, MMPs的异常表达可增加子宫内膜异位侵袭种植的能力。正常子宫内膜组织中MMP - 2 在腺体中表达而在在位和异位内膜组织的腺体和间质中均表达, 而间质中的MMP可降解ECM。因此, 说明在位和异位子宫内膜较正常子宫内膜更具有侵袭性; 其表达升高加强了对ECM的降解能力, 更易于正常子宫内膜的侵袭、转移和种植, 从而促进了子宫内膜异位的过程。

异位内膜组织中MMP - 2 的高表达, TIMP - 1 的低表达, 导致异位内膜中MMP - 2 与TIMP - 1 平衡失调, 细胞侵袭降解能力增强从而不断侵蚀腹膜在盆腔内种植、生长, 导致异位症的发生发展。在位内膜组织中MMP -2 的高表达, TIMP - 1 的低表达, 使MMPs / TIMPs比例失衡, 使其水解蛋白活性作用增强, 在位内膜侵袭和种植能力增强, 更具有侵袭性导致异位症的发生发展。通过探讨MMP - 2 及其抑制剂TIMP - 1 与子宫内膜异位症的关系, 为临床人工合成的抑制剂治疗内异症提供了理论依据。

摘要：目的:探讨基质金属蛋白酶-2 (matrix matalloproteinase-2, MMP-2) 及组织抑制因子-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1) 在子宫内膜异位症发生发展中的作用。方法:选择子宫内膜异位症患者异位内膜组织 (卵巢巧克力囊肿的囊壁组织) 30例、在位内膜组织22例和对照组正常子宫内膜组织20例为研究对象。采用免疫组化法检测3组内膜组织中MMP-2、TIMP-1的表达。结果:MMP-2在正常子宫内膜腺上皮细胞、异位和在位内膜的上皮及间质均表达, 在异位内膜组织中的表达高于在位内膜和正常内膜组织, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;在位内膜组织中MMP-2的表达高于正常内膜组织, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。TIMP-1在正常子宫内膜腺上皮细胞、异位和在位内膜的上皮及间质均表达, 其在异位内膜和在位内膜组织中的表达低于正常子宫内膜, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 异位内膜与在位内膜TIMP-1的表达差异无统计学意义 (P>0.05) 。结论:异位和在位内膜组织中MMP-2高表达、TIMP-1的低表达, 导致基质金属蛋白酶/组织抑制因子的比例增高, 使子宫内膜异位症患者的异位内膜侵袭性更强, 在该病的发生、发展中起着极其重要的作用。

关键词：子宫内膜异位症,基质金属蛋白酶,基质金属蛋白酶抑制因子,细胞外基质,异位内膜组织

参考文献

[1]Jobim FC, Schwartsmann G, Xavier NL, et al.Expression of MMP-9 and VEGF in breast cancer:correlation with other prognostic indicators[J].Rev Bras Ginecol 0bstet, 2008, 30 (6) :287-293.

[2]Di Carlo C, Bonifacio M, Tommaselli GA, et al.Metallo proteinases, vascular endothelial growth factor and angiopoietin 1and 2 in eutopic and eutopic endometrium[J].Fertility and Sterility, 2009, 91 (6) :2315-2323.

[3]Shaco-Levy R, Sharabi S, Benharroch D, et al.Matrix metalloproteinases 2 and 9, E-cadherin, and beta-catenin expression in endometriosis, low-grade endometrial carcinoma and non-neoplastic eutopic endometrium[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Bio, 2008, 139 (2) :226-232.

[4]Wang J, Ma X.Effects of estrogen and progestin on expression of MMP-2 and TIMP-2 in a nude mouse model of endometriosis.Clin Exp Obstet Gynecol, 2012, 39 (2) :229-233.

组织蛋白酶抑制素 篇6

1.1 临床资料

收集本院普外科1994年～2011年收治的胃癌患者25例,其中男18例,女7例,年龄在19～81岁,所有病例均经胃镜病理检查确诊为腺癌。胃癌临床TNM分期:I期4例,II期6例,III期12例,IV期3例。病理分级:高、中、低分化分别为:5例,11例,9例。

25例胃癌组织标本均取自根治性胃癌切除术,手术切除的肿瘤标本,取石蜡切片及新鲜组织标本。石蜡切片供常规病理检查及免疫组化之用;新鲜组织标本供mRNA检测。胃癌组和正常组25例分别取肿瘤组织及瘤旁10cm处的正常黏膜组织。

1.2 实验方法

RT-PCR检测XIAP基因mRNA表达Trizol(Invitrogen公司)一步反向法抽提胃癌组织和癌旁正常组织RNA,在UV3000紫外分光光度仪上测定吸光度值,鉴定RNA纯度,A260/A280比值在1.8～2.0之间。PCR引物设计及反应条件如下:XIAP:预期产物片段大小为293bp,退火温度:52℃;Sense:5’-TCAGCAGTTGGAAGACACAG-3’,Antisense:5’-AGTCCAGCACTTGCTAACTC-3’。内参照GAPDH:预期产物片段大小为456 bp,退火温度:52℃;Sense:5’-TTCTCCCCATTCCGTCTTCC-3’,Antisense:5’-GTACATGGT ATTCACCACCC-3’。两步法RT-PCR:(1)逆转录反应:20µL反应体系含:模板11.5µL,随即六合引物1.0µL,5×Reaction Buffer 4.0µL,RNase Inhibitor 1.0µL,Dntp Mix 2.0µL,AMV 1.0µL;反应条件:70℃5 min,37℃5 min,37℃60 min,70℃10 min,4℃保存。(2)聚合酶链反应:50µL反应体系含:cDNA 1μL,10×buffer 5μL,25mmol/L MgCl2 3μL,2.5 mmol/L dNTP 5μL,Tap酶0.5μL,上下游引物各1μL,去离子水补至50μL,GAPDH作内参照。PCR仪扩增条件:94℃变性4min,按94℃30s,52℃(或54℃)40s,72℃45 s,进行35个循环,最后一个循环72℃延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统分析,以XIAP和GAPDH光密度比值相对定量。

1.3 免疫组化染色方法

标本经10%甲醛固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色后进行病理分级和组织分型,免疫组化采用SP法,第一抗体XIAP购自福建迈新生物公司,DAB显色,苏木精复染。以TBS取代第一抗作为阴性对照,以试剂公司提供的阳性片作阳性对照。

1.4 结果判定

根据阳性细胞在全部组织细胞中所占比例以及阳性细胞染色强度判定实验结果:(1)按显色细胞数积分,阳性细胞数<25%为1分,阳性细胞数25%～50%为2分,阳性细胞数>50%为3分。(2)按细胞显色深浅积分,未着色细胞0分,浅黄色1分,棕黄色2分,深棕色3分。积分数=(1)×(2):0分(-),1～2分(+),3～4分(++),6～9分(+++)。至少随即选取5～10个HPF。

1.5 统计方法

实验数据均采用SPSS10.0统计软件进行分析,癌与癌旁组织间采用配对资料t检验,不同组间表达的结果处理用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 胃癌组织及癌旁正常组织XIAP mRNA表达

胃癌组织XIAP的特异性条带为293bp,25例胃癌中XIAP mRNA的阳性表达率为88.0%(22/25)。癌旁组织中XIAP mRNA的阳性表达率为36.0%(9/25),二者差异有显著性(P=0.000)。

2.2 免疫组化结果

XIAP的阳性染色定位于胞浆(图1)。25例胃癌中:21例XIAP阳性表达(84.0%),25例癌旁组织中:6例XIAP阳性表达(24.0%),两者差异有显著性(P=0.000)。XIAP表达强度在不同病理分级间差异有显著性(P=0.002),即肿瘤分化越低,XIAP表达越高。而XIAP在不同临床分期间差异无显著性(P=0.116)。

3 讨论

胃癌发生的其中一个因素就是凋亡过程受到抑制。人类凋亡抑制基因家族共有8个成员:BIRC1-BIRC8,他们编码的蛋白构成凋亡抑制蛋白IAPs(inhibitor of apoptosis proteins)家族[1],X染色体连锁的凋亡抑制基因是凋亡抑制基因家族中重要的成员之一,其编码的蛋白XIAP通过选择性的抑制caspase-3,-7和-9,同时参与肿瘤细胞对化疗药物耐药性的产生。Li等[2]发现在卵巢癌中XIAP表达越高,对化疗的敏感性越差。Tamm等[3]对60个人类癌细胞系的研究表明XIAP在多数癌细胞系中表达,肿瘤细胞系中高水平的XIAP蛋白出乎意料地与一些抗癌药物的药物敏感性相关。本研究结果表明,XIAPmRNA在癌旁组织低表达,而在癌组织中高表达,提示XIAP等抗凋亡因子的异常表达导致凋亡失调,从而促进胃癌的生长和存活,与胃癌的发生和发展有密切的关系。Schimmer等[4]通过对XIAP功能的拮抗,使得肿瘤细胞凋亡增多,并且提高了肿瘤细胞的化疗敏感性。XIAP因子可能作为治疗胃癌的潜在治疗靶点,且与胃癌对化疗药物的敏感性有一定关系。Ramp等[5]发现XIAP表达越高肿瘤的恶性度越高。肿瘤的病理分级和临床分期是判断肿瘤愈后的一个重要指标。本研究显示,胃癌组织分化越低,恶性程度越高,XIAP表达阳性率及表达强度愈高;但XIAP与胃癌的临床分期之间,统计学显示差异无显著性。有研究表明,XIAP在肿瘤组织中表达升高,参与肿瘤新生血管的形成[6]。本实验表明分化差的胃癌生长及转移的速度更快,XIAP可以促进血管的生成,使肿瘤对缺氧有更强的适应力。

注:A:低分化胃腺癌组织中XIAP表达(+++),积分为9分;B:中分化胃腺癌组织中XIAP表达(++),积分为4分

参考文献

[1]Nachmias B,Ashhab Y,Ben-Yehuda D.The inhibitor of apoptosisproteins family(IAPs):an emerging therapeutic target in cancer[J].Semin Cancer Biol,2004,14(4):231-243.

[2]Li J,Feng Q,Kim JM,et al.Human ovarian cancer and cisplatinresistance:possible role of inhibitor of apoptosis proteins[J].Endocrinology,2001,142(1):370-380.

[3]Tamm I,Kornblau SM,Segall H,et al.Expression and prognosticsignificance of IAP-family genes in human cancers and myeloidleukemias[J].Clin Cancer Res,2000,6(5):1796-1803.

[4]SchimmerAD,Welsh K,Pinilla C,et al.Small-molecule antagonistsof apoptosis suppressor XIAP exhibit broad antitumor activity[J].Cancer Cell,2004,5(1):25-35.

[5]Ramp U,Krieg T,Caliskan E,et al.XIAP exp ression is an indep-endent prognostic marker in clear2cell renal carcinomas[J].HumPathol,2004,35(8):1022-1028.

组织蛋白酶抑制素 篇7

1 对象与方法

1.1 对象

选取2007年10月至2008年10月在包头市中心医院产科住院分娩的产妇80例。排除有妊高征、心脏病、肝炎、肿瘤等其他病史及其它因素致胎膜早破的患者。根据妊娠周期、有无胎膜早破, 分为早产早破组、早产临产组、足月早破组、足月临产组4个组, 每组20例。各组孕妇成功分娩后, 取胎膜组织2块 (早破孕妇在其早破周围) , 取材大小约为1 cm×1 cm, 生理盐水冲去组织表面残留, 放于10%甲醛中固定。

1.2 试剂

MMP-2、TIMP-2、TNF-α一抗及二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司。一抗均为兔抗人多克隆抗体。

1.3方法

将所取得组织置于10%甲醛固定, 常规脱水及石蜡包埋组织标本, 连续4μm切片。采用免疫组化方法的链霉亲和素生物素过氧化物酶法, 实验步骤按说明进行。用捷达801图像分析系统分别测定各组羊膜上皮阳性细胞面积积分光密度值, 用阳性积分光密度值表示MMP-2、TIMP-2、TNF-α蛋白表达的相对含量。

1.4 统计学分析

实验结果以均数±标准差表示, 应用SPSS11.5统计学软件分析系统进行t检验分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 羊膜和绒毛膜细胞中MMP-2蛋白表达情况比较

MMP-2蛋白表达主要分布在羊膜和绒毛膜上皮细胞及间质细胞, 其中, 在羊膜上皮细胞中的表达最强。早产早破组MMP-2蛋白表达的相对含量高于早产临产组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。足月早破组MMP-2蛋白表达的相对含量高于足月临产组, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 见表1。

a为与早产临产组比较P<0.01;b为与足月临产组比较P<0.01

2.2 羊膜和绒毛膜细胞中TIMP-2蛋白表达情况比较

TIMP-2蛋白表达主要分布在羊膜和绒毛膜上皮细胞及间质细胞, 其中, 在羊膜上皮细胞中的表达最强。早产早破组TIMP-2蛋白表达的相对含量低于早产临产组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。足月早破组TIMP-2蛋白表达的相对含量低于足月临产组, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 见表2。

a为与早产临产组比较P<0.01;b为与足月临产组比较P<0.01

2.3 羊膜和绒毛膜细胞中TNF-α蛋白表达情况比较

早产早破组TNF-α蛋白表达的相对含量高于早产临产组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。足月早破组TNF-α蛋白表达的相对含量高于足月临产组, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 见表3。

a为与早产临产组比较P<0.01;b为与足月临产组比较P<0.01

3 讨论

PROM是37周后孕妇分娩的常见并发症, 及时有效的护理至关重要。PROM的致病机制尚不清楚, 研究发现可能与生殖道感染、胎位不正、宫颈相关病变等因素相关。研究表明PROM可能由MMP和TIMP之间的失衡引起, 从而导致了胎膜细胞外基质中维持胎膜张力和弹性作用的Ⅰ~Ⅳ型胶原的降解, 降低胶原纤维含量, 以致其它成分排列紊乱, 进而发生PROM。Fortunato[4]在实验中发现在发生PROM时羊水中MMP-2的浓度和活性增加, 同时羊水中的TIMP-2浓度降低, TIMP-2能与MMP-2结合成非共价键化合物, 抑制MMP-2发挥作用。此外, MMP-2能激活MMP-9, MMP-2和MMP-9是Ⅳ型胶原酶, 它们是唯一能降解细胞外基质主要骨架蛋白-Ⅳ型胶原的蛋白水解酶。Riley通过动物实验研究发现, MMP-2在整个孕期均存在, 但中孕水平渐降, MMP-9孕期含量甚微, 但分娩发动前, 羊水中含量急剧上升, 而其抑制物TIMP-2随孕龄增加反而降低。Vadillo等[5]研究发现发生PROM孕妇与足月分娩和早产孕妇相比, 胎膜组织和羊水内的MMP-2和MMP-9含量升高, 而TIMP-2降低, 与Riley的研究结果不同。

MMP可受到内源性抑制物、基质金属蛋白酶抑制剂TIMP家族的抑制。TIMP是MMP的天然活性抑制物, 研究已证实TIMP能抑制MMP的所有活性。已发现的TIMP有4种, 即TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIPM主要在3个方面调节MMP的作用: (1) 酶原活化阶段:TIMP-2与MMP-1前体结合, 形成稳定复合物, 阻碍其自我激活; (2) 活化的MMP阶段:如TIMP-1和TIMP-2可直接与活化的MMP形成紧密的1:1复合体; (3) MMP降解阶段:TIMP对MMP降解有抑制作用。

TNF-α主要由革兰阴性细菌的内毒素刺激单核-巨噬细胞产生, 感染、创伤、缺血或者中毒均可刺激TNF-α表达。在正常的生理状态下, 组织的TNF-α表达很低。但巨噬细胞一旦激活, 组织中就分泌大量的TNF-α。

本研究发现, 胎膜组织中MMP-2表达升高, TIMP-2表达降低是PROM发生的重要原因, MMP-2通过大量降解胎膜中的胶原, 在胎膜早破发生、发展中起重要作用, TNF-α等炎性因子的释放与聚集会促进MMP的活性。

参考文献

[1]乐杰.妇产科学[M].5版.北京:人民卫生出版社, 2002, 163-165.

[2]Maymon E, Roero R, Pacora P, et al.A role for the 72KDa gelatinase (MMP-2) and its inhibitor (TIMP-2) in human parturition, premature rupture of membranes and intraamniotic infection[J].J Perinat Med, 2001, 29 (4) :308-316.

[3]Riley SC, Webb CJ, Leask R, et al.Involvement of matrix metalloproteinase 2 and 9, tissue inhibitor of metalloproteinases and apoptosis in tissue remodeling in the sheep placenta[J].J Reprod Fertil, 2000, 118 (1) :19-27.

[4]Fortunato SJ.Distinct molecular events suggest different pathway for preterm labor and premature rupture of membranes[J].Am J Obstet Gynecol, 2001, 184 (7) :1399-1400.