蛋白组织化（精选11篇）
蛋白组织化 篇1
牙本质基质蛋白1 (DMP1) 矿化组织特异性蛋白之一, 不同物种DMP1的分布不同。该蛋白含有一些磷酸化位点, 可能与牙本质的发生与矿化有关。本文就牙本质基质蛋白1得结构和功能作一综述。
1 DMP1的分子生物学特征
不同的物种中DMP1基因结构基本类似。牛DMP1基因包括[1]:5'端92bp的非编码区;1530bp构成的开放读框, 共编码510个氨基酸;3'端非编码区长1379bp, 包括一个多聚腺苷酸化信号和Poly (A+) 尾;等电点3.95;分子量56KD。1997年, MacDougall等成功克隆了人[2]和小鼠[3]DMP1基因。人DMP1基因包括:5'端99bp的非编码区;1539bp组成的开放读框编码513个氨基酸残基的强酸性蛋白, 主要为丝氨酸 (21.4%) 、谷氨酸 (15.6%) 和天门冬氨酸 (12.1%) ;3'端有1041 bp非编码区, 包括一个多聚腺苷酸化信号。小鼠DMP1长2820 bp, 其中1509 bp构成的开放读框编码503个氨基酸, 包括一个多聚腺苷酸化信号。小鼠和大鼠均有一15个氨基酸的插入片段, 经基因组DNA分析为DMP1的外显子, 是DMP1的替换剪切版本。人、牛、小鼠、大鼠DMP1基因具有高度同源性, 并有一些高度保守区, 如疏水的16氨基酸残基信号肽, 与细胞粘附有关的RGD序列, 数个可能是酪蛋白激酶Ⅰ、Ⅱ磷酸化位点的丝氨基酸残基。由于DMP1的谷氨酸含量很高, 与OPN和BSP相似, 故DMP1的生物学特性可能介于牙本质磷蛋白之间。
2 DMP1理化性质
DMP1蛋白是一种富含丝氨酸的亲水性蛋白。DMP1的氨基酸组成中, 有1/3为天门冬氨酸和谷氨酸。由于绝大多数丝氨酸以磷酸化的形式存在, 使得DMP1成为等电点3.68的强酸性蛋白。由此推测DMP1是牙本质矿化过程中的一种重要蛋白质。由大鼠DMP1 c DNA推测的分子量为53KD, 翻译后的磷酸化和糖基化可使其分子量增为60-66KD。George等[4]通过E.Coli表达出的大鼠重组DMP1分子量为90-95KD, 这种差异可能是蛋白质在表达过程中发生折叠造成的。DMP1还含有一个共有序列 (Asn-Thr-Ser) 作为N-糖基化位点, 数个Ser-Thr-Glu序列作为O-糖基化位点, 以及一个与细胞粘附功能有关的RGD (Arg-Gly-Asp) 序列。DMP1的氨基酸序列与骨酸性糖蛋白-75 (BAG-75) 高度同源, 与骨桥蛋白 (OPN) 部分同源。DMP1中的许多肽段含有4个以上连续的天门冬氨酸或谷氨酸残基, 这些残基中通常含有丝氨酸。这些区域与转录后的酪蛋白激酶磷酸化所需的序列一致。DMP1中, 总共有107个丝氨基酸残基, 55个位于与酪蛋白激酶Ⅰ、Ⅱ磷酸化有关的序列中。从组织中提取的DMP1为磷酸化蛋白。在生理过程中, 磷酸化的氨基酸末端可以与多价的阳离子如Ca2+结合, 调节硬组织的形成。Qin[5]等比较了四种从大鼠骨中和牙本质提取的富含涎酸的蛋白OPN、BSP、BAG-75、DMP1, 认为DMP1特性应介于OPN与BAG-75之间。对不同组织中提取的DMP1进行染色发现:牙本质提取物显色清晰, 骨组织则未显色, 表明牙本质DMP1的量明显高于骨组织, 这种量的区别可能与骨和牙本质的矿化程度不同有关。牙本质矿化程度较高, 在其矿化过程中需要大量强酸性蛋白, 促进矿物离子的沉积。由此推测DMP1与牙本质的矿化有关。
3 DMP1的分布
George等[2]用Northern印记法发现大鼠DMP1只在牙齿中表达, 而在皮肤、脑、肝脏、颅盖骨、胫骨中未见表达;原位杂交显示DMP1的m RNA仅在成熟分泌的成牙本质细胞中表达, 而在前成牙本质细胞和牙髓细胞中未见表达。D'Souza等[6]用RT-PCR研究发现DMPlmRNA出现在牙胚发育的蕾状后期, 在整个牙本质发生过程中均有表达, 在矿化期的早期牙本质细胞中也有表达, 但在矿化后的分泌性成牙本质细胞中表达量降低。原位杂交显示DMP1仅见于矿化前的年轻成牙本质细胞, 出现矿化后表达量显著降低。DMP1在成釉细胞分化成熟过程中也有表达。Hirst等[5]用Northern印记法发现牛DMP1在成牙本质细胞、脑和骨中均有表达, 而牙槽骨、肝脏、皮肤和成釉细胞中未见表达。MacDougall等[7]通过原位杂交发现DMP1在小鼠成牙本质细胞、成釉细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞中均有表达。Septier[7]等对体外培养的小鼠牙胚进行研究, 发现DMP1在成牙本质细胞和分泌性成釉细胞有表达, 在成牙本质细胞突、牙髓、前期牙本质、牙本质、前期和早期成釉细胞未见表达而培养基中加入6硫化肌醇 (一种酪蛋白激酶抑制剂) 的牙胚, 则仅在牙尖区成牙本质细胞有表达。
4 DMP1的功能
到目前为止, 尽管没有直接的实验证实DMP1的确切功能, 但基于其理化性质、生物合成等方面的特征, 推测DMP1可能参与牙本质矿化的启动和调节。同时, 也可能充当信号转导分子。
DMP1中有与细胞粘附有关的RGD序列。Kulkrni等[8]采用将RGD序列基因进行定点诱变, 使RGD序列 (Arg-Gly-Asp) 转变为RGE (Arg-Glu-Glu) 序列;将RGD序列从DMP1中删除这两种方法研究大鼠DMP1 RGD序列的功能, 发现含RGD序列的DMP1可以迅速与细胞小鼠胚胎颅骨细胞 (MC3T3-E1) 和牙髓细胞 (RPC-C2A) 结合, 并促进细胞之间的粘附, 而诱变后的两种新蛋白则与细胞结合速率较慢、促粘附功能较低。三种蛋白均与中国仓鼠卵细胞不结合。他们用含有RGD序列的肽段封闭细胞表面整合素受体后, 发现DMP1与细胞结合速率下降、细胞间粘附降低。由此提示DMP1可能介导细胞之间以及细胞与胞外非胶原性基质之间的细胞信号转导。
Narayanan[9]等通过建立对表达DMP1基因的稳定传染细胞系和腺病毒传染细胞系来研究DMP1的生物学功能。当C3H10T1/2、MC3T3-E1和RPC-C2A等具备多分化潜能、中胚层来源的细胞表达DMP1基因时, 均可向成牙本质样细胞分化, 并形成功能性成牙本质样细胞。在这些细胞分化过程中, 碱磷酸、骨桥素、骨钙素和骨粘结素等细胞外基质形成早期的标志物, 以及DMP2和DSP等成牙本质细胞分化末期的标志物均可被检测到。而且随着DMP1表达量的增加, DMP2和DSP的表达量也增加。而用酪蛋白激酶Ⅱ的抑制剂阻断DMP1的磷酸化, DMP2、DSP、OCN等的表达未见明显变化。体外过表达DMP1基因的细胞分化并形成功能性成牙本质样细胞后, 细胞体内可形成矿化结节并增大, 最终形成矿化基质。由此可推测, 体内DMP1在未分化间充质细胞向成牙本质细胞分化过程中起着非常重要的作用。
上述研究表面, 对于DMP1在牙齿或组织中的时空表达有相互矛盾之处, 它的确切功能仍不清楚。虽然DMP1基因能够促进未分化间充质细胞向成牙本质细胞样细胞分化, 并促成成牙本质样细胞内矿化结节的形成和增长, 但是DMP1如何调节成牙本质细胞的分化, 在此过程中有哪些转录因子发挥作用, 其信号途径是什么, 仍有待进一步研究。它是否利用RGD序列介导细胞信号转导;是否参与细胞移动、细胞与细胞外基质的粘附过程;是否能够干扰胚胎发育中器官特别是牙胚的发生;如何参与牙本质和骨的矿化过程等仍不清楚, 均有待我们进行更深入的研究。
参考文献
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[6]D'Souza RN, Cavender A, MacDougall M, et al.Gene expression pattems ofmurine dentinmatrix protein 1 (Dmpl) and dentin sialophosphoprotein (DSPP) suggestdistinct developmental functions in vivo.J Bone Miner Res 1997Dec:12 (12) :2040~9.
[7]Septier D, Torres-Quintana M A, Menashi S, et al.Inositol hexasulphate, a caseinkinaseinhibitor, alters the distdbution of dentin matrix protin 1 in culturedembryonic mouse tooth grms-Eur J Oral Sci2001;109:198~293.
[8]Kulkami GV, Chen B, George A, et al.Promotion of selective cell attachment bythe RGD sequence in dentine matrix protein 1.Arch Oral Biol 2000Jun, 45 (6) :475~484.
[9]Narayanan K, Srinivas R, Ramachandran A, George A.Differentiation ofembryonic mesenchymal calls to odontoblast-like calls by overexpression ofdentin matrix protein 1 Proc.Natl.Acad-Sci.USA, Vol.98, Issue8, 4516-4521, April10, 200.
蛋白组织化 篇2
10% Triton X-100
Triton X-100 蒸馏水
10ml 90ml
混合后37℃-40℃水浴中2-3hr，使其充分混匀
10% 去氧胆酸纳
去氧胆酸纳 蒸馏水 避光保存
200mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氯)
PMSF
174.2mg 5ml
1g 10ml
异丙醇
分装，-20℃保存
100mmol/L EDTA
EDTA
372.24mg 10ml
蒸馏水
1mg/mL亮抑酶肽(Leupeptin)
亮抑酶肽 蒸馏水
2mg 2ml
分装，-20℃保存
1mg/mL 抑蛋白酶肽(Aprotinin)
抑蛋白酶肽 蒸馏水
2mg 2ml
分装，-20℃保存
1mg/mL 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)
胃蛋白酶抑制剂 甲醇
2mg 2ml
分装，-20℃保存
2. 工作液
Tris-base (50mmol/L，pH 7.4)：
Tris-base NaCl
605mg 900mg 75ml
蒸馏水
用HCl调整pH值为7.4
10% Triton X-100 10% 去氧胆酸纳 100mmol/L EDTA 用前加入：
1mg/mL亮抑酶肽 1mg/mL 抑蛋白酶肽
100?l 100?l 100?l 500?l
10mL 2.5mL 1mL
1mg/mL 胃蛋白酶抑制剂 200mmol/L PMSF
各成分的终浓度
Tris-base
50mmol/L，pH 7.4 1% 0.25% 150mmol/L 1 mmol/L 1?g/mL 1?g/mL 1?g/mL 1mmol/L
Triton X-100 去氧胆酸纳 NaCl EDTA
亮抑酶肽
抑蛋白酶肽
蛋白组织化 篇3
关键词：生物组织；糖类；脂肪；蛋白质；显色反应；检测
G633.91
生物课程的教材改革越来越注重内容的创新，同时也要做好关键知识点的有效教学，对于生物组织中有机化合物的反应原理而言，更要分析三大有机化合物的显色反应过程，尽可能的确定糖类、脂肪和蛋白质检测中的不同显色反应机理，总结注意事项，综合提升生物知识储备能力。对于生物组织中糖类、脂肪和蛋白质检测鉴定的显色反应机理究竟如何始终是生物老师教学高度重视的一个问题+[1]。因此论文对生物组织中糖类、脂肪和蛋白质阿金侧鉴定的显色反应机理进行研究有一定的现实意义。
一、生物组织中糖类、脂肪和蛋白质检测鉴定的显色反应
糖类、脂肪和蛋白质作为生物组织中的三大有机化合物，糖类中的淀粉一旦遇到碘，将会呈现出蓝色，就可溶性还原糖而言，一旦和斐林试剂发生反应，有砖红色沉淀，同时脂肪和苏丹III反应，出现橘黄色的反应，和苏丹IV反应，出现红色。蛋白质一旦和双缩脲试剂发生反应，将会出现紫色反应，这种显色反应作用下，生物质中糖类可以进行有效的判定，同时也可以鉴定蛋白质和脂肪。
关于显色反应原理的探究，始终是生物界高度重视的一个焦点，在有机化合物的处理过程，结合多种有机化合物的反应原理，借助于多种试剂实现有效的显色反应处理，实现化合物的鉴定。关于染色剂的吸附显色过程，主要是做好还原性糖和蛋白质的有效鉴定过程，分析和试剂发生的作用，并结合显色现象，进而做好鉴定[2]。
基于可溶性还原糖鉴定的过程，确定类似反应原理，确定可溶性还原糖的结构，主要是可溶性还原糖存在醛基糖结构，同时也存在碱性果糖溶液和麦芽糖，葡萄糖和果糖作为同分异构体，而葡萄糖中一般有醛基，但是果糖具有酮基并没有醛基，溶液稀释的过程，出现了互变异构。
稀碱溶液用果糖稀释的过程，出现了还原性的反应，同时还原性糖常伴有醛基反应，在和斐林试剂反应的时候，氢氧化铜和可溶性还原糖出现了氧化还原反应，而蓝色氢氧化铜也伴有砖红色氧化亚铜，这一反应的进行，还原糖存在。
脂肪鉴定的过程，苏丹III一旦融入脂肪，溶解度比较大，脂肪生物组织得到有效的处理，同时对于酒精中的苏丹III而言，和脂肪发生反应，脂肪呈现出橘黄色。关于蛋白质的鉴定过程，主要是确定双缩脲的试剂成分，确定氢氧化钠溶液以及质量浓度，进而实现硫酸铜溶液的分析，在碱性溶液作用下，往往和铜离子发生反应，并伴有紫红色络合物沉淀。
关于蛋白质鉴定的一种反应原理而言，主要是结合蛋白质鉴定的试剂，并借助于双缩脲实际确定蛋白质显色反应，双缩脲分子一旦发生缩合反应，将会失去一分子氨，分子中和蛋白质一样存在肽键，同时碱性溶液作用下，出现了大量的化学反应，并出现了紫色铜离子罗何物，基于肽键和物质反应过程，常伴有紫色铜离子络合物，这一反应过程中需要分析生物组织蛋白质的存在。
二、 生物组织中糖类、脂肪和蛋白质检测鉴定可能存在的负反应
基于生物组织中糖类、脂肪和蛋白质检测鉴定中的问题分析，就要做好苹果组织样液的加热过程，一旦加入斐林试剂之后，将会出现受热现象，黑色沉淀逐步产生，斐林试剂也伴有黑色沉淀，主要是氢氧化铜逐步的分解了氧化铜，在砖红色沉淀之后，也出现了变黑的现象，也即是氧化了氧化亚铜，进而出现了氧化铜[3]。鉴定蛋白质的时候，需要做好蛋清液的稀释工作，逐步的滴加硫酸铜，乳白色沉淀逐步产生，在重金属盐出现变性之后，变小了实际的溶解度，同时实验也伴有蛋白质的变性，这种蛋白质变性不仅仅和温度有关，同时也和碱性强度有着直接的关联，一旦过强受热和过强碱性，都会导致蛋白质变性[4]。鉴定蛋白质的时候，需要控制硫酸铜的滴加速度，一旦有过量和过快的滴加速度，蓝色沉淀产生，硫酸铜和氢氧化钠出现了蓝色氢氧化铜沉淀。
三、生物组织中糖类、脂肪和蛋白质检测鉴定的相关注意事项
还原糖和蛋白质鉴定阶段，就要避免出现负反应，保证有着规范化的操作。关于斐林试剂的使用，需要本着现配现用的基本原则，在斐林试剂以及苹果组织样液混合之后，实现充分的加热处理。
蛋清液的稀释之后，可以使用蒸馏水，避免蛋清液的加热，同时鉴定的过程，避免滴加硫酸铜，需要充分均匀氢氧化钠溶液，在硫酸铜滴加之后，避免有过快的滴加速度，进行边滴加边振荡的过程。而硫酸铜溶液一旦为0.05g/mL时，就要滴加2滴左右，硫酸铜溶液的浓度为0.05g/mL事，就要滴加4滴左右。关于氢氧化钠浓度而言，避免浓度的过大，确定氢氧化钠的低浓度添加。
总而言之，生物组织中糖类、脂肪和蛋白质检测鉴定时，就要分析三大有机物的反应过程，做好糖类、脂肪和蛋白质检测鉴定的显色原理分析，合理使用滴加夜，并结合不同化合物的基本反应要求，避免出现负反应。鉴定蛋白质的时候，需要做好蛋清液的稀释工作，逐步的滴加硫酸铜，乳白色沉淀逐步产生。蛋白质的鉴定过程，主要是确定双缩脲的试剂成分，确定氢氧化钠溶液以及质量浓度，进而实现硫酸铜溶液的分析。对于斐林试剂的使用，需要本着现配现用的基本原则，在斐林试剂以及苹果组织样液混合之后，实现充分的加热处理。
参考文献：
[1]郑琦琦，吴坚.基于NO2-显色反应的抗湿性喷雾雾滴密度和大小的检测体系[J].农业工程学报，2015，04（3）：107-112.
[2]潘斌.高中生物学实验中的显色反应释疑[J].生物学教学，2015，40（11）：42-43.
[3]王子武，孙海荣.生物组织中几种有机化合物的定量检测[J].生物学教学，2016，41（5）：65-65，66.
蛋白组织化 篇4
1 中低水分组织化产品评价方法
1.1 感官评价
感官评价是一种主观评价方法, 该方法在评定组织蛋白产品质量时具有非常重要的作用, 常用的感官评价指标主要包括产品外观、风味和质地。有学者提出在评价组织蛋白质量过程中质地指标最为重要, 其次是外观和风味, 因为组织化产品常与真正的肉混合食用, 往往很难分清组织蛋白和肉, 而且肉制品风味的不断改进也能弥补大豆蛋白的不良气味[2]。
Maurice等人提出组织化大豆蛋白产品的组织化分析应包括咀嚼次数 (即咀嚼一定量的样品使之达到与对照样品类似吞咽程度所需的咀嚼次数) 以及采用拉伸或剪切方式判断产品的状态[3]。也有学者提出在感官评定产品质量时应包括产品密度和吸水率[4]。
除了感官评价外很多学者也采用仪器测试的方法评价组织化产品的质地如剪切、拉伸和压缩测试。其中Breene提出组织蛋白多用于模拟肉, 因此应采用评价商品肉制品质地的方式评价组织蛋白的质地, 同时提出嫩度 (tenderness) 和含汁度 (juiciness) 是评价产品质地过程中的两个重要参数。Breene采用ottawa质构测试仪对组织化产品进行测试获得一个客观的质地曲线。分析结果表明嫩度与感官评价具有很好的相关性, 但含汁度相关性较差[5]。
1.2 持水性
挤压参数中温度、水分以及螺杆构型三者通过控制蛋白质的变性程度影响产品的组织化程度, 进一步影响产品的持水性[6]。由于持水性影响产品的功能性和经济性, 已经成为挤压产品重要的品质指标。张波等认为持水性可部分反映产品的组织化程度, 并根据测定时是否破坏样品组织结构, 将持水性分为持水率 (Water Holding Capability) 和吸水率 (Water Absorption Capability) 。通过分析结果提出影响产品持水率程度的大小顺序为物料含水率、螺杆构型;影响产品吸水率程度的大小顺序为螺杆构型、挤压温度、物料含水率[7]。
Dhal等人以酸和碱变性的大豆蛋白为原料进行挤压加工时也采用持水性作为组织化产品的评价方法, 认为弱碱性组织化大豆蛋白持水性较高, 但是质地较差。而强碱性组织蛋白硬度较大但复水时易破碎[8]。
目前国内的一些大豆组织蛋白生产企业也常采用持水性这一指标来评价干燥后的中低水分组织化产品, 即将组织化蛋白混合均匀, 称取20 g置于250 mL烧杯中, 用60℃蒸馏水浸泡30 min后轻轻攥干称重, 计算样品持水性。
2 高水分组织化产品评价方法
2.1 感官评价
很多研究学者使用感官分析来评价中低水分蛋白组织化产品, 相似方法也用于评价高水分蛋白组织化产品, 如lins等以硬度、湿度、分层性、弹性、咀嚼性和粘结性等感官评价指标来描述高水分蛋白组织化产品[9,10]。张汆等以产品色泽、表观状态、组织化度、口感 (硬度、润滑感、黏弹性) 和风味等对组织化花生蛋白进行评价[11]。
但是Mercier C等采用染色的方法对高水分组织化蛋白的纤维形成情况进行观察, 即将样品切成薄片并通过一个对蛋白质敏感的考马斯亮蓝或对于碳水化合物敏感的过碘酸希夫试剂 (Periodic Acid Schiff Reagent) 染色后进行观察。通过该种方法得到的结果与拉伸强度的测定结果具有较好的相关性[12]。
类似中低水分组织蛋白产品质量评价一样, lin和赵多勇等人以干燥后的高水分蛋白组织化产品为样品测定其持水性[10,13]。
2.2 质地分析
质构仪因其具有的灵敏、客观可模拟人咀嚼动作等特点被广泛应用于食品质地分析, 常采用的分析指标为硬度、粘着性、弹性、聚结性和咀嚼度等。如Lin、魏益民、赵多勇等人采用质构仪在TPA模式下, 将样品 (切成边长为15 mm的正方形, 厚度为3.0 mm) 置于质构仪测试台上, 用P/35探头 (直径为35 mm, 高35 mm) 以1 mm·s-1的速度压缩样品厚度的50%, 用以测定高水分组织化产品的质地[10,13,14]。
王洪武等采用纤维强度测试方法评定高水分组织化产品的质量:即挤压样品烘干后, 用RHEOMETER流变仪测试样品的纵向拉伸力和横向拉伸力, 计算纵横向拉伸力的比值[15]。Akinori Noguchi等人采用法国Clextral BC-45双螺杆挤压机, 在原料pH=7, 螺旋转速60 r·min-1, 水分含量60%, 进料速率15 kg·h-1的条件下以纵向拉伸强度FL和横向拉伸强度Fv为指标, 研究温度对高水分挤压蛋白拉伸强度的影响。结果表明组织蛋白的纵向强度FL始终大于横向强度Fv。180℃时Fv达最大值, 超过这个温度时FL保持在最大值附近, 在任何机筒温度下FL始终大于Fv, 认为FL/Fv应始终为一个大于1的值[12]。
组织化度 (Texturization Degree) 是评价高水分组织化产品特性的另一项重要指标。研究学者常参照李里特方肉制品组织化度的测定方法, 以横向剪切力与纵向剪切力的比值表示产品的组织化度。如魏益民等以组织化度的方法, 并结合电镜观察产品的微观结构, 对高水分组织化大豆蛋白的纤维形成程度进行描述[14]。康立宁和张汆等人也采用前人方法, 测定高水分产品的质构、组织化度、色泽等指标, 并通过因子分析法综合评价产品特性[16,17]。
2.3 微观结构分析
lin等人采用光学显微镜对高水分蛋白组织化产品的纤维结构进行观察。将解冻后的样品切成小块 (约为7 mm×7 mm×7mm) 并切面向上, 使挤压方向与x轴平行, 使用蔡司显微镜, 立体相机对试验样品进行拍照, 曝光时间为1 s。将照片放大30倍后观察发现, 该方法可以明显区别不同水分含量下 (60%～70%) 蛋白质纤维结构的差异[10]。
扫描电子显微镜因其具有良好的反映样品表面结构的能力, 很多学者都采用该方法评价高水分组织化蛋白纤维结构的形成程度。但是不同学者之间采用样品处理方法稍有不同如lin等人采用-60℃冻干的方式进行样品处理, 而王洪武、张汆、魏益民等人则采用乙醇逐级脱水和超临界干燥联合作用的方式进行处理[10,18,19,20]。
虽然上述方法在一定程度上能够反映组织蛋白终产品的质地和状态, 但是质地分析方法易受样品水分含量影响而且与纤维形成相关性差, 不能确切描述组织化蛋白的质构特性和纤维化形成程度。微观结构检验可以提供备检小块样品的微观结构, 但是它不能准确反映纤维形成的全部细节而且在操作过程中经常要对样品进行切割, 容易造成产品结构改变。除此之外感官观察具有主观性, 不能对产品之间的差异提供量化数据, 因此越来越多的研究致力于开发精确检测组织蛋白纤维形成的仪器检验方法。
Yao G等人以大豆分离蛋白、小麦谷朊粉和非改性小麦淀粉以6∶4∶0.5的比例混合为原料, 在水分为60%、66%和72%的条件下进行高水分蛋白组织化。同时采用质地分析、微观结构分析和荧光偏振光谱分析对产出物品质进行评价, 结果表明质地分析方法不能准确地描述纤维形成的程度, 而基于荧光偏振光谱理论的荧光偏振程度和各向异性指标则能较好地反映挤压过程中纤维的形成, 而且各向异性指标与感官检验确切的纤维形成具有显著的相关性, 与荧光偏振程度相比各向异性指标能够补偿样品不均一对结果造成的影响[21]。
Ranasinghesagara J等根据霍夫变换和回归统计分析开发了一种图像处理技术, 可以使用数字图像直接计算样品的纤维系数。样品经切割后使其纤维结构完全曝露, 在高瓦数白炽灯下, 距离样品25 cm, 采用数码相机将1.9 cm×1.4 cm样品放大0.34倍拍摄照片。照片经平衡背景、霍夫变换和感兴趣区分析后, 计算所有单元的标准偏差。设定样品的纤维系数为标准偏差的倒数, 即当纤维分布均匀时标准偏差较小, 纤维系数较大。试验结果表明, 这种通过数码照片直接计算纤维系数的方法可以区别不同纤维状态, 与Yao G等人开发的荧光偏振光检测方法相关系数达到95%[22]。同时Ranasinghesagara J等发明的光子迁移方法 (Photon Migration Method) 作为一种标准方法进行无损、瞬时检测高水分挤压植物蛋白产品的纤维化度[23]。
3 存在问题及未来展望
中低水分组织化植物蛋白产品特性的评价方法目前已经较为成熟, 而高水分组织化植物蛋白产品特性的评价方法研究则刚刚起步, 新开发的评价方法虽然可以比较客观地反应组织化产品纤维形成状态, 但是还存在一些问题如Yao G等人开发的荧光偏振光谱分析法, 当光源激发产生荧光时, 其波长在可见光范围内, 而且强度较弱因此结果易受外界光线影响, 因此不适用于在线检测纤维的形成状态。而Ranasinghesagara J等人2004年开发的图像处理技术中, 样品需经过处理, 容易破坏样品原有的纤维状态等。而且在进行高水分组织化植物蛋白产品评价时, 不同的研究学者选取的指标和评价方法不同, 致使实验结果可比性差, 减慢了高水分组织化技术的发展速度, 成为工业化生产的制约因素, 因此制定组织化植物蛋白的评价体系和标准, 是高水分组织化产品商业化生产的必然要求。
摘要：随着挤压技术的发展和消费者健康意识的增强, 组织化植物蛋白产品广泛应用于食品加工业中。根据国内外研究论文和报告, 从感官评价、质地分析和微观结构分析等角度, 介绍了中低水分组织化植物蛋白和高水分组织化植物蛋白产品评价方法的研究进展。
半胱氨酸组织蛋白酶与免疫调节 篇5
半胱氨酸组织蛋白酶(CC)属于蛋白酶clan CA中的木瓜蛋白酶家族(C1),由组织蛋白酶B、L、H、S、K、F、V、X、W、O和C等组成.这些蛋白酶参与了各种生理和病理过程.
作 者：谢德鄂 孙兵 陈季武 XIE De-E SUN Bing CHEN Ji-Wu 作者单位：谢德鄂,XIE De-E(华东师范大学生命科学学院,上海,62;中国科学院上海生命科学研究院生化与细胞生物学研究所,上海,200031)
孙兵,SUN Bing(中国科学院上海生命科学研究院生化与细胞生物学研究所,上海,200031)
陈季武,CHEN Ji-Wu(华东师范大学生命科学学院,上海,200062)
蛋白组织化 篇6
【摘要】目的：研究狗肝菜多糖对二甲基亚硝胺（DMN）诱导的肝纤维化大鼠肝组织中瘦素（Leptin）及血管内皮因子蛋白表达的影响。方法：用DMN诱导大鼠肝纤维化模型，不同浓度狗肝菜多糖干预后，肝脏常规取材、制片，免疫组织化学方法检测各组大鼠肝组织Leptin及血管内皮因子蛋白表达的情况。结果：模型组大鼠肝组织Leptin及血管内皮因子蛋白染色强度和范围明显高于正常组，具有显著性差异（P<0.05）；与模型组比较，狗肝菜多糖高剂量组、狗肝菜多糖中剂量组大鼠肝组织Leptin及血管内皮因子蛋白表达明显降低，具有显著性差异（P<0.05）。结论：狗肝菜多糖抗肝纤维化的作用机制可能通过降低Leptin及血管内皮因子蛋白的表达而调控细胞外基质的代谢有关。
【关键词】狗肝菜多糖；肝纤维化；免疫组织化学；瘦素；血管内皮因子
瘦素（Leptin）及血管内皮因子在代谢、炎症、肿瘤中均发挥着重要作用，明显加重肝纤维化的发展程度，可能是一个关键促纤维化因子。狗肝菜多糖是是爵床科华九头狮子草属，在抗炎抑菌、抗氧化、抗病毒中发挥重要作用。近年来通过其化学成分、药理作用的研究，其药用价值得到了进一步的肯定，尤其是在保肝护肝方面。因此，作者等通过免疫组化方法，观察狗肝菜多糖干预的肝纤维化大鼠肝组织中Leptin及血管内皮因子蛋白表达情况，探讨狗肝菜多糖抗肝纤维化机制是否与降低Leptin及血管内皮因子蛋白表达有关。
1材料与方法
1.1 SPF级SD大鼠72只，体重180-220g，雄性，适应性喂养2d，每组12只，随机分为正常对照组、模型组、秋水仙碱组、狗肝菜多糖高剂量组、狗肝菜多糖中剂量组、狗肝菜多糖低剂量组。除正常对照组外，余60只造模。模型复制：每只动物按2ml.kg-1剂量，腹腔注射0.5% DMN，连续注射三天，停药四天，造模时间为四周，共注射12次。第一周用2/3剂量，以后用全量。药物处理：秋水仙碱组剂量为0.1mg.kg-1，狗肝菜多糖高、中、低剂量组分别为300mg.kg-1、200mg.kg-1、100mg.kg-1，除正常对照组和模型组给予等體积生理盐水灌胃外，各组均灌胃给药，1次/d，连续4周。4周末，实验结束时，取大鼠肝组织常规脱水、制片，苏木素-伊红染色（HE）染色，观察各组大鼠肝组织形态改变；免疫组织化学方法检测各组大鼠肝脏Leptin、血管内皮因子表达情况。
免疫组化结果判定： 以胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。先按染色强度打分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；再按阳性细胞所占百分比打分：0分为阴性，1分为<10%，2分为11%-50%，3分为51%-75%，4分为>75%。总分0-1分（-），2-3分（+），4-5分（++），6-7分（+++）。
1.2 用SPSS17.0 统计软件，进行Ridit分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Leptin表达情况
与正常组比较，模型组表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，狗肝菜多糖高、中剂量组、秋水仙碱组瘦素蛋白表达明显降低（P<0.05），狗肝菜多糖低剂量组瘦素蛋白表达无统计学意义（P>0.05）；狗肝菜多糖高、中剂量组与秋水仙碱组比较，无统计学意义（P>0.05）。
3讨论
新近发现，瘦素（leptin）与转化生长因子β1，血小板源性生长因子，肿瘤坏死因子，r干扰素、 缺氧诱导因子-1α等构成相互促进或抑制的调解网络，在肝纤维化形成中具有重要作用。作用机制为促进肝内转化生长因子β1、血小板衍生生长因子等细胞因子的表达，增加胶原的表达，上调基质金属蛋白酶抑制剂-1的表达，减少基质金属蛋白酶-1的形成，减少细胞外基质的降解，并能上调促炎因子和促血管生成因子，从而促进纤维化发展[1]。在人肝星状细胞细胞系（LX - 2） 、鼠肝星状细胞细胞系（HSC - T6）和从正常鼠肝内分离培养活化的肝星状细胞内均发现有Leptin受体的表达，Leptin能刺激基质金属蛋白酶抑制剂启动子活性，激活络氨酸激酶和信号转导与转录激活因子3，5酶活性，进而促进基质金属蛋白酶抑制剂-1的产生。Crepo J检测135名慢性肝炎患者和75名正常对照者Leptin水平，并评价Leptin水平与肝纤维化程度的相关性，结果表明Leptin水平与肝纤维化程度正相关，随着纤维化程度增加而升高。王曙强[2]认为，在非酒精性肝硬化中，Leptin水平与转化生长因子β1水平呈正相关，Leptin在非酒精性肝硬化中是独立的致病因素，Leptin可能通过转化生长因子β1系统导致肝纤维化。
狗肝菜多糖作为一种民间药物，有清热解毒、消肿利湿的功效，常用来治疗水肿、感冒发热、蛇虫咬伤等。近年来通过其化学成分、药理作用的研究，其药用价值得到了进一步的肯定。此次研究发现，模型组大鼠肝组织Leptin及血管内皮因子表达明显高于正常组，证实Leptin及血管内皮因子在肝纤维化中发挥了重要作用。狗肝菜多糖防治大鼠肝纤维化可能与其降低Leptin及血管内皮因子表达，抑制肝星状细胞增殖和降低肝内转化诱导因子β1等细胞因子表达，减轻肝脏炎性坏死程度，减少血管生成，从而抑制肝纤维化的启动密切有关。同时，中医药与西医治疗比较，具有成本低廉、副作用小、多靶点、提取简单等优势。我国又是传统中医药大国，中药资源丰富，因此，狗肝菜多糖防治肝纤维化研究具有广阔的推广前景。
参考文献
[1]刘弋云，朱萱.瘦素在肝纤维化形成中的作用与地位[J].国际消化病杂志，2009，29（6）：384-386.
蛋白组织化 篇7
1 材料与方法
1.1 标本来源
选取新鲜或采用液氮储存的非小细胞肺癌组织标本72例及其对应的癌旁正常组织, 其中男39例, 女33例, 年龄范围为33~74岁, 平均年龄为 (57.2±12.7) 岁, ≤60岁者34例, >60岁者38例;腺癌44例, 鳞癌28例;高分化17例, 中分化31例, 低分化2 4例;Ⅰ期28例, Ⅱ期17例, Ⅲ期27例;无区域性淋巴结转移43例, 有区域性淋巴结转移29例;22例有吸烟史, 50例无吸烟史。
1.2 方法
将非小细胞肺癌组织及其对应正常癌旁组织 (距离癌组织5 cm) 置于冰上, 加入预冷的蛋白裂解液, 充分匀浆后, 12 0 0 0 r/min离心5 min, 收集上清液, 采用卡马斯亮蓝法进行蛋白定量, 充分混合等体积的上清液与上样缓冲液, 经SDS-PAGE电泳后, 采用半干转法进行转膜, 5%的脱脂奶粉封闭1 h, 分别以p27 (1∶50 0) 和CRT (1∶2 0 0) 的鼠抗人一抗孵育 (4℃过夜) , 采用T B S T充分洗膜3次 (5 m in/次) , 加入兔抗鼠二抗 (1∶5 0 0 0) , 室温1 h, 行ECL法曝光及胶片显影, 内参为GAPDH, 采用image pro plus 6.0软件分析光密度。最终结果表示为与GA PDH条带的光密度比值。
1.3 评价指标
分析非小细胞肺癌组织及对应癌旁正常组织的p2 7和CRT蛋白水平, 非小细胞肺癌组织中两者的相关性及与不同临床病理特征 (性别、年龄、吸烟、病理类型、TNM分期和淋巴结) 的关系。
1.4 统计方法
采用SPSS 16.0软件进行统计学分析, 蛋白水平以“平均数±标准差”的表示并行t检验, 采用Person相关检验分析两者的相关性, 检验水准a=0.05。
2 结果
2.1 两组的p27和CRT的水平比较
非小细胞肺癌组织中的p27低于癌旁正常组织, 而CRT水平却高于癌旁正常组织, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1、图1。
注:与癌旁正常组织比较:aP<0.05。
A:癌旁正常组织;B:癌组织
2.2 非小细胞肺癌组织中两蛋白水平与临床病理参数的关系
两蛋白在不同T NM分期及淋巴结转移情况上的分布差异有统计学意义 (P<0.05) , 且ⅢA (TNM分期) 和有淋巴结转移的p27水平较低, 而CRT水平较高。
2.3 两蛋白水平的相关性
非小细胞肺癌组织中p27和CRT蛋白水平呈负相关 (r=-0.663, P<0.05) 。
注:与对应项比较:aP<0.05。
3 讨论
p27是一种蛋白激酶抑制因子, 具有负性调节细胞周期的作用, 可抑制细胞的增殖, 在肿瘤的发生发展中起作用[3]。p27可与调节细胞周期的Cyclin E结合, 抑制Cyclin E/CDK2复合体的活性, 阻止细胞由G1期进入S期, 进一步达到抑制细胞生长的效果[5]。CRT是细胞内常见的Ca2+结合蛋白, 主要存在于内质网和肌浆网中, 该蛋白的主要生理作用为调节肿瘤抗原的呈递, 通过增强肿瘤细胞对放射的敏感性, 抑制肿瘤细胞的生长[6]。以上两蛋白在肿瘤细胞的发生发展中起重要作用, 因此研究非小细胞肺癌组织中两蛋白的水平具有重要意义。
该研究发现:非小细胞肺癌组织中p 2 7的水平较低, C R T水平较高, 与癌旁正常组织相比差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示非小细胞肺癌组织中两指标异常表达, 可能在非小细胞肺癌的发生发展中意义重大。主要原因为p27为抑癌基因, 可抑制肿瘤的发展及生物学行为的发挥, 因此肿瘤组织中其水平为低表达, 减弱其对肿瘤生长的限制。CRT本身具有抑制血管生成, 干扰肿瘤生长的效果, 但非小细胞肺癌组织中其表达水平却较高, 可能为机体的代偿反应, 进一步通过促进免疫来达到杀伤肿瘤细胞的效果。进一步分析得出两者在不同TNM分期及淋巴结转移情况上的分布有差异, 提示两者的分布与肺癌的临床病理学特征有关, 因此提示两者可用于病情评估。
综上所述, 非小细胞肺癌中p2 7水平较低, CRT水平较高, 且与TNM分期及淋巴结转移有关, 有可能成为非小细胞肺癌诊断、治疗及预后预测的重要指标。
参考文献
[1]程颖, 李鑫, 刘文超, 等.现行晚期非小细胞肺癌治疗策略[J].现代肿瘤医学, 2011, 19 (5) :1014-1019.
[2]时广利, 胡秀玲, 岳思东, 等.血清肿瘤标志物在肺癌辅助诊断中的应用[J].中华肿瘤杂志, 2005, 27 (5) :299-301.
[3]吴益峰, 孙德光, 王静文, 等.磷酸化蛋白p27在肝细胞肝癌中表达及其意义[J].中华实验外科杂志, 2010, 27 (12) :1835-1837.
[4]王国勇, 李程辉, 张林, 等.肺腺癌组织中TTF-1、CRT表达变化及意义[J].山东医药, 2013, 53 (8) :39-40.
[5]孙秀梅, 高峰, 李贵新, 等.新辅助化疗后大肠癌患者癌组织中CD44v6、p27的表达及意义[J].山东医药, 2010, 50 (11) :75-77.
蛋白组织化 篇8
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2012—2013年于苏州大学附属太仓第一人民医院进行手术切除的肠癌患者(存档蜡块)62例,均经病理学检查确诊,术前均未化疗或放疗。其中男39例,女23例;中位年龄66岁;以男性血红蛋白(Hb)<120.0 g/L,女性Hb<110.0g/L作为贫血的诊断标准,其中贫血21例,无贫血者41例;TNM分期符合全国肠癌协作组病理组规定的标准,TNM分期T1、T2期16例,T3、T4期46例;有淋巴结转移31例,无淋巴结转移31例;有远处转移7例,无远处转移55例。另选15例肠癌患者的癌旁正常肠黏膜组织作为对照。
1.2 方法
试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。采用SABC免疫组织化学染色法,石蜡标本均进行5μm切片,连续切5张,置于600℃烤箱内烤30min;二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脱蜡各10min;无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→95%乙醇→80%乙醇→75%乙醇→65%乙醇各5min,自来水洗2min水化,自来水冲洗数分钟,PBS(p H=7.4)冲洗3次,5min/次。一张切片进行HE染色复核病理诊断、其余4张SABC染色,按试剂盒的操作规程进行。以PBS代替一抗做阴性对照。
1.3 结果判定
以细胞质和细胞质被染成棕黄色或黄褐色为阳性。高倍镜下随机选取5个视野,按照瘤细胞着色的深度计分,染色强度浅黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分。按照阳性细胞数记分,阳性细胞数≤10%0分;11%~25%1分;26%~50%2分;51%~75%3分;75%以上4分。两个分值相乘,0分为阴性,记为(-);1~4分为弱阳性,记为(+);5~8分为中度阳性(++);>8分为强阳性(+++)。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理,计数资料采用χ2检验,组间比较采用SNK法;采用Spearman进行等级相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肠癌组织中Hepcidin表达情况
Hepcidin在正常肠黏膜组织中阳性表达率为20.0%(3/15),肠癌组织中Hepcidin阳性表达率为66.1%(41/62),两者比较,差异有统计学意义(P<0.01)。T3、T4期Hepcidin阳性表达率高于T1、T2期,差异有统计学意义(P<0.05)。有无淋巴结转移和有无远处转移Hepcidin阳性表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。详见图1和表1。
2.2 肠癌组织中BMP6表达情况
BMP6在正常肠黏膜组织中阳性表达率为53.3%(8/15),肠癌组织中BMP6阳性表达率为38.7%(24/62),两者比较,差异无统计学意义(P>0.05)。T1、T2期BMP6阳性表达率高于T3、T4期,差异有统计学意义(P<0.01)。有无淋巴结转移和有无远处转移BMP6阳性表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2和表1。
2.3 肠癌组织中HJV表达情况
HJV在正常肠黏膜组织中阳性表达率为93.3%(14/15),肠癌组织中HJV阳性表达率为87.1%(54/62),两者比较,差异无统计学意义(P>0.05)。T分期、有无淋巴结转移和有无远处转移HJV阳性表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。详见图3和表1。
2.4 贫血与Hepcidin、BMP6、HJV表达的相关性
有无贫血之间Hepcidin、BMP6和HJV的表达比较,差异无统计学意义(χ2H=0.40,χ2B=1.38,χ2H=0.32,P>0.05,见表2)。经Spearman等级相关检验,贫血与Hepcidin、BMP6和HJV表达均无相关性(r=0.08、-0.15、0.07,P>0.05)。
2.5 Hepcidin与BMP6、HJV表达的相关性
Hepcidin的表达与BMP6和HJV表达比较,差异无统计学意义(χ2BMP6=1.06,χ2HJV=0.32,P>0.05,见表3)。经Spearman等级相关检验,Hepcidin与BMP6、HJV表达均无相关性(r=-0.13、-0.07,P>0.05)。
3 讨论
研究表明,铁代谢紊乱在肠道肿瘤的发生、发展中起到了重要作用,铁代谢紊乱可能通过刺激Wnt信号途径促进肿瘤的发生、发展[4]。Hepcidin通过减少小肠对铁的吸收和网状内皮系统对铁的释放负性调节铁代谢平衡,可能在铁代谢中起到核心调节作用。炎症和肿瘤都可提升Hepcidin水平[5]。BMP6在骨肉瘤、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌细胞中高表达[6,7,8,9],促进Hepcidin的表达,并通过多种方式介导肿瘤的发生发展[10]。HJV也对Hepcidin的表达起调节作用。
本研究结果表明,Hepcidin、BMP6及HJV与患者的年龄、性别、淋巴结转移及远处转移等临床特征均无相关性,但Hepcidin、BMP6两者与患者的T分期有关。说明在肠癌组织中Hepcidin的表达与肿瘤的局部侵袭性有关,起到了促进肿瘤侵袭的作用,这与Ward等[11]的研究结果是一致的。而在低T分期患者(T1、T2)中发现BMP6的表达阳性率明显高于高T分期患者(T3、T4),提示在肠癌组织中BMP6的表达对肿瘤的侵袭有抑制作用。Beck等[12]报道BMP6通过调节RAS/ERK、改善p21WAF1的稳定性诱导结肠癌细胞生长抑制。Du等[13]研究报道BMP6可以抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞株的增殖。虽然BMP6在肿瘤中的作用机制还没有完全被阐明,但BMP6与肿瘤发生及发展的密切关系已引起关注,BMP6有可能成为临床肿瘤非细胞毒治疗的新靶点。而HJV与上述指标均无相关性,提示HJV在肠癌发生发展中可能无明显作用,有待于以后增加病例进行深入研究。
另外研究发现BMP6和Hepcidin两者在肠癌发生发展中的作用并不一致,而Hepcidin与BMP6及HJV表达之间无相关性,提示肿瘤组织中Hepcidin的调节可能在生理情况下有差异,或者在肠癌的发生、发展中BMP6、HJV可能并不是调节Hepcidin的主要因素。
以往研究表明,术后放化疗及晚期肿瘤伴贫血患者中,血清中Hepcidin水平明显升高,是肿瘤相关性贫血的主要因素[14]。本研究结果表明肠癌肿瘤组织中的Hepcidin、BMP6及HJV的表达在有无贫血患者之间均无区别,进一步研究发现该三者与血红蛋白(Hb)水平均无相关关系,说明肠癌肿瘤组织中的Hepcidin、BMP6及HJV的表达不是引起贫血的原因,并且也不能代表患者的血清中Hepcidin水平,即与血清中Hepcidin的表达是不相关的。这与相关研究结果相一致[15]。
总之,肠癌患者中Hepcidin高表达、BMP6低表达,并且与肿瘤的T分期有关,检测Hepcidin、BMP6可作为反映肠癌患者生物学行为的客观指标。
摘要：目的 研究与铁代谢相关的铁调素(Hepcidin)、骨形成蛋白(BMP6)、铁调素调节蛋白(HJV)在肠癌组织中的表达及其临床意义。方法 选取2012—2013年于苏州大学附属太仓第一人民医院进行手术切除的肠癌患者(存档蜡块)62例,另选15例肠癌患者的癌旁正常肠黏膜组织作为对照。应用免疫组化技术对肠癌组织中Hepcidin、BMP6、HJV的表达进行检测和分析。结果 肠癌组织中Hepcidin阳性表达率高于正常肠黏膜组织,T3、T4期Hepcidin阳性表达率高于T1、T2期,差异有统计学意义(P<0.05)。有无淋巴结转移和有无远处转移Hepcidin阳性表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。BMP6阳性表达率在正常肠黏膜组织中与肠癌组织比较,差异无统计学意义(P>0.05)。T1、T2期BMP6阳性表达率高于T3、T4期,差异有统计学意义(P<0.01)。有无淋巴结转移和有无远处转移BMP6阳性表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。HJV阳性表达率在正常肠黏膜组织中与肠癌组织比较,差异无统计学意义(P>0.05)。T分期、有无淋巴结转移和有无远处转移HJV阳性表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。贫血与Hepcidin、BMP6和HJV表达均无相关性(r=0.08、-0.15、0.07,P>0.05)。Hepcidin与BMP6、HJV表达均无相关性(r=-0.13、-0.07,P>0.05)。结论 肠癌组织中Hepcidin、BMP6的表达与患者的T分期有关。肠癌患者术前贫血与肿瘤组织中Hepcidin、BMP6、HJV的表达无关。Hepcidin与BMP6、HJV均无相关性。
蛋白组织化 篇9
关于实验原理的改进, 在实验原理的说明中, 教材上的统一说法为“某些化学试剂能够使生物组织中有关有机化合物产生特定颜色反应……”, 实际上在这些实验中, 原理并不完全相同, 还原糖与蛋白质的鉴定属于显色反应, 是产生了特殊颜色的物质, 而脂肪鉴定是染色, 由于脂肪对苏丹Ⅲ (Ⅳ) 染液亲和力较大而被染色, 经洗涤后留有染液颜色, 故应把原理区分为两部分, 为将来染色体染色与观察, DNA、RNA在细胞中的分布, DNA粗提取与鉴定等实验打好基础。
在实验目的中, 仅要求学生尝试用化学试剂检测、鉴定生物组织中的化合物, 学生兴趣不高, 应补充对照实验, 取三种已知还原糖、蛋白质、脂肪材料作为样本, 同时每组还要增加空白对照, 既可使学生信服, 又能增加实验设计的科学性与严谨性;同时又符合生物学实验的一般原理。
在材料与用具的选择中, 由于需设立对照, 故追加材料有:鸡蛋清溶液 (稀释) 、葡萄糖溶液、动物脂肪、淀粉溶液、班氏试剂。
一、还原糖鉴定实验的改进
1.取三支洁净的试管, 编号甲、乙、丙;
2.向甲试管内注入2 m L待测样品, 乙试管内注入葡萄糖溶液2 m L, 丙试管内注入等量清水;
3.向试管中注入1 m L斐林试剂 (甲、乙液混合后再注入) , 也可加班氏试剂;
4.将试管放入50℃~65℃温水中加热约2 min。
特别指出的是, 原来笔者还做过利用市售砂糖 (主要为蔗糖) 做非还原糖的对照实验, 本来不应使斐林试剂变色, 但每次都失败, 后经研究, 笔者认为原因在于市售的各种砂糖由于生产工艺问题均不同程度混有还原糖。后来笔者发现有一种较纯净的蔗糖, 即冰糖, 洗净表面后溶解效果很好。
二、脂肪鉴定实验的改进
方法一和方法二均有部分缺憾, 方法一很多学生认为混合液中颜色本来就是苏丹Ⅲ (Ⅳ) 与脂肪无关。
而方法二操作方法复杂, 制作花生子叶切片需要很长时间, 特别是对高一学生而言, 要求所有的学生都能熟练应用徒手切片技术, 难度很大, 并且学生操作刀片有一定的危险性, 且操作时间长, 降低实验的效率。笔者改进方法为:
1.取两片洁净载玻片, 编号为甲、乙两组;
2.甲组:将一粒浸泡过的花生种子, 去掉种皮, 用刀片轻轻刮下花生粉末, 置于载玻片上, 滴一滴清水, 放在酒精灯上轻微烘烤, 至水分蒸发即可, 滴2~3滴苏丹Ⅲ染液染色3分钟 (如果用苏丹Ⅳ染液, 染色1分钟) , 再滴加1~2滴体积分数为50%的酒精溶液, 洗去浮色, 用吸水纸吸去花生子叶周围的酒精, 滴一滴蒸馏水, 盖上盖玻片, 制成临时装片, 显微镜下观察即可;
3.乙组:刮取动物脂肪组织少许, 其余操作同上;
4.低倍镜下找到染色细胞, 在高倍镜下观察比较染色情况。
三、蛋白质检测实验的改进
在教材原来基础上追加两个对照组, 编号乙、丙, 步骤为:
1.甲试管内注入待测样品2 m L, 乙组试管内注入2m L蛋清稀释液, 丙组中滴入2 m L清水;
2.向试管中注入双缩脲试剂A 1m L, 摇匀;
3.向试管内注入双缩脲试剂B液4滴, 摇匀, 观察试管中出现的颜色变化。
四、淀粉检测和观察的改进
1.取三支洁净的试管, 编号甲、乙、丙;
2.甲组试管中注入2 m L马铃薯匀浆, 乙组中注入2m L淀粉溶液, 丙组中注入2 m L蒸馏水;
3.向试管内滴加2 m L碘液, 观察颜色变化。
综上所述, 经改进后的实验, 可鼓励学生积极开阔思维, 大胆尝试从不同的角度设计相关的探究性实验。以上为笔者的一点粗浅认识, 不当之处, 敬请广大同行批评指正。
参考文献
[1]王士朝.可溶性还原糖的几种鉴定方法[J].生物学教学, 2005 (1) :39-40.
[2]李五顺.还原糖的鉴定实验现象演变的化学分析[J].生物学教学, 2005 (9) :42.
蛋白组织化 篇10
如下主要通过实验来探讨织物组织对大豆蛋白织物透气性、透湿性、耐磨性的影响。
1 实验
1.1 织物准备
纱线材料：纯大豆蛋白股线;
纱线规格：14.58tex×2;
组织结构：平纹，2/2斜纹，5枚2飞经面缎纹;
织物密度：经密255根/10cm，纬密203根/10cm;
织造设备：ASL2000-20-24型剑杆小样织机。
1.2 透气性实验
实验仪器：YG (B) 461D—Ⅱ型数字式织物透气量仪;
实验方法：在保持织物两侧压力差为一定的条件下，测定单位时间内通过织物的空气流量，就可以推求出织物的透气性。透气性表示织物在一定压力梯度下，气体通过织物的气孔和间隙向外扩散的能力，用透气量来表示。透气量越大，织物的透气性能越好。织物的透气率常以Bp来表示。
式中：V———T秒内通过织物的空气量(ml);
A———织物的面积(cm2)。
1.3 透湿性实验
实验仪器：YG501型透湿试验箱;
实验方法：透湿量是指在织物两面分别在恒定蒸汽压的条件下，在规定时间内通过单位织物的水蒸汽质量。本试验主要采用透湿杯法测试织物单位面积透过的水蒸汽质量。把盛有吸湿剂(硅胶干燥剂)并封以织物试样的透湿杯置于规定温度和湿度的密封环境中(这里采用温度40±0.5℃，湿度38.5%±2%)，根据一定时间内透湿杯(包括试样和吸湿剂)质量m的变化，以及下面公式来计算出透湿量。
其中wvt为每平方米每天的透湿量[g/(m2·d)];
s为试样面积(m2);t为透湿时间(h);
算出3个试样的透湿量平均值，修正为10g/m2·d。
1.4 织物耐磨性实验
实验仪器：YG (B) 401D型全自动织物平磨仪，AB104-N电子天平。
实验方法：将织物试样在一定条件下与磨料(全毛华达呢磨料)接触并做相对运动(本实验采用李莎茹曲线的运动轨迹进行相互摩擦)，使试样受到多方向的磨损，通过对比织物磨损前后的变化来评价其耐磨性。
2 实验结果分析讨论
试样的透气性、透湿性测试结果见表1。
2.1 透气性
织物透气性决定于织物中经纬纱线间以及纤维间空隙的数量与大小，亦即与经纬密度、经纬纱线特数、纱线捻度等因素有关。此外还与纤维性能、纱线结构、织物厚度和体积重量等因素有关。本实验中，在其他条件都相同的情况下，不同组织对织物的透气性的影响很大。观察表1数据，可以很清楚地看出：当纤维原料相同时，织物组织不同，织物的透气性有很大的区别，特别表现为缎纹的透气率明显的大于平纹和斜纹。这是由于织物组织本身存在着差别，使得试样的交织点密度规律为：平纹>斜纹>缎纹，那么形成的织物的浮长线长度就会表现为：缎纹>斜纹>平纹，浮长线越长，织物内纱线间的紧度就越小，所以空气越容易通过织物，织物的透气性也就越好。
2.2 透湿性
作为服装用料的织物，透湿能力的好坏至关重要，透湿性好的织物穿着起来使人体感觉舒服，相反则闷热、不透气。由表1可知，不同组织相同原材料的织物的透湿能力相差不大，可以得出大豆蛋白纤维机织物的透湿性能的好坏与织物的组织关系很小。
2.3 耐磨性
不同组织对大豆蛋白织物的磨损性影响情况可以从图1看出来。
此外，分别取一组磨了10000次的三块织物的试样图象进行比较。见图2。
通过对比不同组织结构大豆蛋白织物的磨损情况和磨了10000次的不同组织试样外观特征，得出以下几点结论：
2.3.1 平纹织物耐磨性能好，而且不易起毛起球：但是织物的光泽比较暗淡，手感较硬。
2.3.2 斜纹织物耐磨性能最差，易起毛起球，但是织物纹路美观，光泽柔和，手感较好。
2.3.3 缎纹织物耐磨性能一般，特别容易起毛，纹路易于变形;但是织物的组织美观，光泽华丽，手感最好。
究其原因还是和三原组织的特点相关。
平纹组织交织点多，浮长较短，织物的断裂强度较大，受到的作用力较小。平纹织物一般处于零结构相或第五结构相，通常经纬纱都在同一个平面上，织物两面都比较平坦，经纬向的力学性能差异较小。
斜纹组织交织点比较少，浮长较平纹长，但是斜纹织物强力和挺括程度不如平纹织物。受到的作用力比较大，重量损失较多。
缎纹组织交织点较少，经浮长较长，受力大于平纹小于斜纹。在磨损过程中，大量的经浮长线使缎纹的重量损失比平纹大，比斜纹小。耐磨性较好的原因是由于纱线和纤维能退让缓冲，纹路较易滑移，从而减缓了纱线的外力作用。
3 结语
通过实验证明，在细度相同的情况下，大豆蛋白纤维织物组织不同，织物的性能存在很大的差异：从透气性能来看，突出表现为缎纹的透气性明显的大于平纹和斜纹;在耐磨性能上，平纹织物耐磨性能好，而且不易起毛起球，斜纹织物耐磨性能最差，易起毛起球，缎纹织物耐磨性能一般，特别容易起毛，纹路易于变形。因此，在设计或选择大豆蛋白织物时，应综合考虑不同组织对大豆织物的服用性的影响，并结合具体用途合理选择。
参考文献
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蛋白组织化 篇11
注:χ2=48.889, P=0.000。
资料与方法
2011年8月-2014年2月收集蜡块标本, 所有组织均经病理学检查证实, 宫颈鳞癌组织60例, 其中13例伴淋巴结转移。组织学分级 (WHO) :G1~G2:39例, G3:21例;按照FIGO (2000) 临床分期:Ⅰ期27例, Ⅱ期24例, Ⅲ/Ⅳ期9例;患者年龄25~65岁, 中位年龄45岁。CIN (宫颈上皮内瘤变) Ⅰ:20例, CINⅡ~Ⅲ:20例。正常宫颈组织:选取15例在相同时期由于子宫肌瘤而进行子宫全切术所切取的正常宫颈上皮组织作为整个试验的对照。
样本入组标准:本次试验所入组的患者在接受手术之前均没有进行任何治疗, 均有完整的术后病理资料, 宫颈鳞状细胞癌诊断准确。对照组宫颈外观表面光滑, 术前TCT检查示宫颈无异常。其中鳞癌Ⅲ/Ⅳ期的患者由于其实施手术的时间较为延后, 试验中所使用的标本均为宫颈活检组织。
试剂与方法:采用美国Santu Cruz公司生产的兔抗人APC多克隆抗体, 稀释浓度1:100;ABC免疫组化试剂盒及DAB底物试剂盒均购自美国Vector Laboratories公司;采用卵白素-生物素-辣根过氧化氢酶复合物法, 具体步骤按说明书进行。
结果判定:染色判定标准应用半定量分析法。按阳性细胞百分率: (1) 0%~5%:0分; (2) 6%~25%:1分; (3) 26%~50%:2分; (4) 51%~75%:3分; (5) 76%~100%:4分。
按细胞染色深浅: (1) 无染色0分; (2) 浅黄色1分; (3) 棕黄色2分; (4) 黄褐色3分。
最终的实验结果取2项评分的乘积, >4分则为阳性, <4分则为阴性。
统计学方法:用SPSS 17.0统计学软件处理数据, 计量资料采取t检验, 计数资料采取χ2检验。当P<0.05时, 认为差异具有统计学意义。
结果
APC蛋白在不同宫颈组织中的表达:正常宫颈, CINⅠ、CINⅡ~Ⅲ及宫颈鳞癌组织中APC蛋白阳性表达率分别为93.33%, 75.00%, 50.00%, 11.67%, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
讨论
APC蛋白异常表达在很多肿瘤组织当中较为常见, 如肝癌、乳腺癌等组织中都检测到APC蛋白表达减弱[2~4]。此次试验结果发现, 从正常宫颈组织到宫颈上皮内瘤变组织到宫颈鳞癌组织, APC蛋白阳性表达的概率逐渐下降, 这表明APC蛋白表达程度可能与宫颈病变的发生发展相关, APC蛋白可能参与了宫颈上皮细胞的恶性转化过程。随着宫颈癌变的不断继续往下发展, 组织中APC蛋白阴性表达的程度也逐渐增加, 这表明APC蛋白在宫颈鳞癌的整个病变发生过程中起着一定的作用。
APC蛋白属于亲水蛋白的一种[5]。APC蛋白主要存在于细胞质中, 具有多个功能区域, 如C端可降解β-catenin、β-catenin结合位点及结合细胞骨架微管的部位[6]。这些功能区域参与构成细胞骨架, 在细胞生长调控中发挥重要作用。由Wnt基因介导的信号转导通路又称为Wnt信号通路, 该通路的异常激活与多种肿瘤的发生有关。作用机制:存在于细胞外的Wnts蛋白与跨膜受体卷曲蛋白结合后, 可以抑制糖原合成APC、酶激酶-3β (GSK-3β) , 阻碍β-catenin的磷酸化, 这样就会导致该物质在胞质中不能正常进行代谢, 当其在细胞质内的含量上升到一个界限以后, 它就可以从细胞质直接进入胞核, 进而与TGF/LEFS进行结合, 这样就导致细胞的增值、生长以及周期等正常的调控机制被打乱[7~10]。
总之, 根据APC蛋白在不同宫颈组织中的表达情况, 提示其在宫颈病变的发生发展及宫颈鳞癌的浸润转移过程中可能发挥了重要的作用, 进一步研究将有助于了解宫颈癌变的根本机制, 为宫颈癌的早期诊断及生物防治提供理论依据。
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