角蛋白酶（精选7篇）
角蛋白酶 篇1
引言
组织切片技术可直观地观察皮革的组织结构变化,藉以认识和了解脱毛的机理[1,2,3]。S. Sivasubramanian等更是通过不同的染色方法的组织学观察和组织免疫学观察对一种碱性蛋白酶的脱毛机理进行了阐述[4]。
角蛋白酶(Keratinase)是一种可以特异性降解角蛋白的酶类,由细菌、放线菌和真菌等多种微生物产生。角蛋白酶来源不同,其结构、理化性质、活性和底物也不同[5]。尽管一些具有代表性角蛋白酶的基因Ker已被完全解析出来,但还存在如表达形式为包涵体,对宿主细胞有毒性等很多问题,且角蛋白酶作用于制革工业脱毛的机理尚未完全阐明,已成为其发展的障碍之一。Ekta Tiwary等[6]对Bacillus licheniformis ER-15的脱毛条件进行了优化,并表明了角蛋白酶在脱毛过程中对于毛具有特异性降解的作用。J. Friedrich等[7]观察到脱毛工序中表皮层和真皮层区域的分离,从而推测只有角质层的上层暴露给角蛋白酶,而进入表皮层中其他非角质化的区域则非常困难。
本文就已筛选Bacillus cereus SZ-4的发酵粗酶液,以羊皮为对象,通过对其脱毛条件的优化及其酶脱毛过程中组织结构变化特点的研究,以揭示其脱毛的机理。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
1.1.1 主要试剂
苦味酸饱和水溶液(质量分数约1.22%),自制。苏木素,成都天泰生命科技公司。其他试剂均为分析纯。
1.1.2 主要仪器
高速冷冻离心机:TGL16M(湘南离心机,长沙);超净工作台:SW-CJ-2FD型(苏州净化设备有限公司,苏州);电热恒温培养箱:DHP-9162(上海一恒实验仪器有限公司,上海);恒温振动培养器:QYC-2112型(上海福玛实验设备有限公司,上海);光学显微镜:CX31RTSF(Olympas 日本)。冷冻切片机(Leica,德国);转鼓:GI热泵自动式转鼓(德润轻工机械厂,无锡);发酵罐:BIOSTATB plus(Sartorius,德国);板框压滤机:BASO.1/20-FB型板框式0.1平米暗流不锈钢式压滤机(荣成压滤机设备厂,成都)。
1.2 培养基
种子培养基:葡萄糖、天冬氨酸培养基[8];发酵培养基:添加0.2%脱脂羊毛粉的改良高氏培养基[9],即以脱脂羊毛粉取代培养基中作为有机氮源;保藏培养基: 营养培养基[8];LB培养基[9]。
1.3 实验方法
1.3.1 粗酶液的制备
本实验室分离蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus SZ-4的发酵液经压滤的滤清液为粗酶液。
1.3.2 角蛋白酶活力测定
据参考文献[10]所述的方法测定发酵离心上清液的角蛋白酶活力。其活力定义为1 mL酶液在所述的条件下,30 min释放蛋白质相当于1μg BSA的量为一个酶活力单位(U)。
1.3.3 角蛋白粗酶液脱毛条件的优化
浸水脱脂后的山羊皮依背脊线被切割为相同大小(10 cm×20cm),放入装有适当不同稀释倍数粗酶液(适当不同初始pH及适当不同温度条件下)的有机转鼓中,转动30 min后停鼓,其后每隔50 min转动10 min,观察其脱毛状况、脱毛速度及作用特点[11],确定其脱毛的最佳酶活力、pH和温度。脱毛效果采用6分评估法。
脱毛液角蛋白酶活力分别为64、96、128、160、192、224、256、288 U/mL,其初始pH分别是7、8、8.5、9、10、11,温度分别是25、30、32、35 ℃。
确定脱毛酶液的初始pH、温度和活力后,羊皮处理24 h后取样,观察其时间对组织结构的影响。
脱毛后,进行浸灰和复灰[11,12],观察其白皮的粒面和柔软状况。
1.3.9 组织学观察
酶处理前后,分别在相应的位置取样(5 cm×10 cm),10%中性甲醛固定24 h,冰冻切片法纵向(顺毛生长方向垂直于粒面)切片,切片厚度15 μm:,采用Van Gieson氏染色法[13]染胶原纤维、表皮和毛囊,通过光学显微镜观察该角蛋白酶粗酶液处理样品脱毛程度3及脱毛程度6的胶原纤维、表皮和毛囊之间的区别。
2 结果与讨论
2.1 脱毛条件的影响
如表1所示,30 ℃,初始pH 10的脱毛液中,不同活力的脱毛液处理山羊皮大约6 h,其毛基本脱光,但活力为160 U/mL的脱毛液,在其初始阶段脱毛效率较其它活力的脱毛液。研究结果表明,在其脱毛接近50%的阶段,主要是降解表皮角蛋白的过程,且该活力降解表皮角蛋白效率最高,而在其后期则主要常规蛋白酶起主导作用,所以脱毛时间无显著差异,该酶的主要特点则是在无硫脱毛。
观察不同活力脱毛液的脱毛结果表明,活力增高,对其毛孔大小影响不显著,但对其花纹和洁白度有影响,活力增高,花纹变得模糊且泛黄,坯革松面而且弹性差。
在30 ℃下,脱毛液酶活力160 U/mL,不同初始pH脱毛效率的研究结果表明:初始pH的对山羊皮脱毛率50%和100% 所需要时间影响较大,当pH为9和10时,其脱毛时间最短。初始pH增加或减少,其时间均匀延长,但脱毛效果无显著差异。
活力160 U/mL,初始pH为9脱毛液研究温度影响的结果表明,温度对脱毛时间及脱毛效果的影响显著,脱毛液的温度为25 ℃时,其作用相当缓慢,温度升高,脱毛时间缩短,作用温度达到30 ℃后,在30～35 ℃的范围,提高作用温度,脱毛率达到50%所需时间保持稳定,其脱毛皮坯洁白度、粒面清晰度等变差。
2.2 角蛋白酶粗酶液脱毛组织学观察结果
A-脱毛开始时羊皮组织学观察图。B-脱毛完成时羊皮组织学观察图。C、D-脱毛程度为3时的羊皮组织学观察图。E-脱毛酶活力单位为288 U/mL,pH9,30 ℃下脱毛完成时的羊皮组织学观察图。F-脱毛酶活力单位为160 U/mL,pH9,30 ℃下作用24 h的羊皮组织学观察图。
图1B是活力160 U/mL,初始pH为9,作用温度30 ℃脱毛率100%时组织切片观察结果。与脱毛初始态比较(图1A ),其毛囊部位呈现空洞,表皮角质被除去,边缘规则,纤维分散适度且均匀,脱毛率50%的组织切片结果比较(图1C和图1D),后者已其表皮角质层的已被除去且毛囊角质层的也被降解,羊毛及毛根等硬角质仍部分残留于毛囊中。活力过高或作用时间过长亦会导致胶原纤维断裂(图1E和图1F)。在一定范围内,温度稍高或初始pH接近该酶的最适pH(以脱脂羊毛为底物测)则纤维分散均匀,坯革质量也有所提高。该角蛋白酶的作用特点是不仅水解角蛋白,同时也作用基底膜,破坏粘性蛋,使基底膜使毛根与毛囊脱离[4]。Bacillus cereus SZ-4的粗酶液系时间和pH依赖型,与J. Friedrich等研究Doratomyces microsporus角蛋白酶在制革脱毛中应用结果是一致的[6]。
3 结论
基于粗酶活力、作用温度和初始pH脱毛效率和感官指标结果的研究表明,Bacillus cereus SZ-4角蛋白酶粗酶液应用山羊皮脱毛的最适酶活力、初始pH和温度分别为160 U/mL、pH9和30 ℃,系时间和pH依赖型。
对其脱毛作用特点的组织切片的观察结果表明,Bacillus cereus SZ-4的粗酶液不仅水解角蛋白,同时也作用于基底膜,破坏粘性蛋,使基底膜使毛根与毛囊脱离[4],从而达到均匀分散胶原纤维的作用,较Doratomyces microsporus角蛋白酶有更强的渗透性,是多种蛋白酶的协同作用,更适合制革生物脱毛。
细胞角蛋白19片段的临床应用 篇2
关键词：细胞角蛋白19片段,肿瘤标志物,临床应用,文献综述
近年来,肿瘤越来越受到大家的重视。肿瘤是指机体在多种导致肿瘤发生的因素的协作下,部分组织的某些细胞在基因水平上的生长和分化发生调控失常,致使其克隆性异常增生而形成的新生物。随着肿瘤的产生,各种肿瘤标志物也随之应用于临床。肿瘤标志物是肿瘤组织分解代谢和分泌产生的分子产物,代表细胞或体液的生理及化学特性[1]。肿瘤标志物同时还具有非侵入、简单经济、快速有效的特点。细胞角蛋白19片段(cytokerantin-19-fragment,CYFRA21-1)即是一种新型的肿瘤标志物,在多个系统的肿瘤中可进行检测及临床评估。现将近几年来对CYFRA21-1的临床应用作一简要的综述。
1 CYFRA21-1的结构
CYFRA21-1是细胞角蛋白家族中的一个类型,相对分子质量为40 000,等电点5.2,是存在于上皮细胞中的细胞结构蛋白,其可溶性片段上的2个抗原决定簇可特异性地与2个单克隆抗体BM19-21、KS19-1相结合。
2 CYFRA21-1的表达
一般来讲,CYFRA21-1含量非常低,常以寡聚物形式存在。伴随着上皮细胞发生癌变,激活的蛋白酶促进细胞角蛋白的降解,很多CYFRA21-1释放出来,导致其在尿液、血液等体液中的水平上升[2]。CYFRA21-1分布于鳞状上皮、复层上皮以及单层上皮细胞如结肠、乳腺导管、汗腺、气管、腺泡、子宫内膜和肝细胞等,其分布的部位非常广泛[3]。
3 CYFRA21-1在各种肿瘤诊治中的临床应用
由于CYFRA21-1分布广泛,可用于乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、上皮性卵巢癌、肺癌、胃癌、胆道肿瘤、宫颈癌等的预后、病情监测及疗效评价等。
3.1 乳腺癌
20世纪以来乳腺癌的发病率在世界各地均有上升的趋势。乳腺癌的诊断也越来越受到重视。白树祥[4]通过采用电化学发光免疫法检测62例乳腺癌患者、57例乳腺良性疾病患者及50例健康对照组的血CYFRA21-1、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和糖类抗原153(carbohydrate antigen-153,CA153)水平,得出结果:CYFRA21-1在乳腺癌患者中明显高于乳腺良性肿瘤和健康对照组(P<0.01);血清CYFRA21-1在3个肿瘤标志物中特异性最高,为89.7%,其敏感性为45.2%,但是CYFRA21-1作为单一的肿瘤标志物具有一定的局限性,与CEA、CA153联合检测可提高敏感性和准确性,弥补单一检测的不足,同时可用于术后随访和监测疾病复发。
3.2 胰腺癌
胰腺癌是一种恶性程度和病死率都很高的肿瘤,早期症状不明显,一经发现多为晚期。饮食结构不合理、生活缺少规律,可诱发胰腺癌[5]。CYFRA21-1已经作为生物标志物在一些上皮的恶性肿瘤中应用。然而,其在胰腺癌的作用还需进一步研究。
Boeck等[6]将72例胰腺癌患者纳入研究,其中45例接受治疗。在前瞻性临床试验中分别测定治疗前和每周CYFRA21-1、糖类抗原199(carbohydrateantigen-199,CA199)、CEA的水平,这些每周测定值由姑息一线化疗中得到。该试验通过生物标志物的数据,利用单向和多变量分析疾病进展时间(time to progression,TTP)和总生存期(overall survival,OS)。试验结果:TTP中位数为3.9个月,OS中位值7.7个月;治疗前CYFRA21-1水平与体能状态(P=0.039 9)和疾病的阶段(P=0.000 1)均显著相关联。化疗之前标志物水平和2个月的3种标志物分段标记值被认为是对治疗效果的重要预测。在多变量分析中,只有CYFRA21-1和体能状态为胰腺癌的独立预测因子。结论:CYFRA21-1可以用作晚期胰腺癌监测治疗反应和评估预后的宝贵工具。
3.3 鼻咽癌
鼻咽癌是一种头颈部恶性肿瘤,因临床表现不一且复杂、前期症状不明显、起病隐匿,不容易确诊。鼻咽癌患者主要依靠影像学检查监测复发、远处转移及治疗效果,但不能动态反映疗效及监测复发[7]。CYFRA21-1的研究有利于改变鼻咽癌的现状。
国内一项研究[8]通过测定332例鼻咽癌患者治疗之前血清CYFRA21-1水平,研究其与OS、无瘤生存期(tumor-free survival,TFS)、局部复发时间(time to local recurrence,TLR)和远处复发时间(time to distant recurrence,TDR)的关联。结果:多因素分析表明,治疗前血清CYFRA21-1水平和肿瘤分级高是OS缩短和TDR的独立预测因子。高水平的治疗前CYFRA21-1是更短的TFS和TLR的独立预测因子。结论:治疗前血清CYFRA21-1的水平将是一个可靠的生物标志物,用以评估患者的未分化鼻咽癌的长期预后。
3.4 上皮性卵巢癌
卵巢癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤,具有发现晚、治疗效果差、转移早等临床特点,病死率居妇科恶性肿瘤首位[9]。
Wu等[10]回顾性分析42例未经治疗的上皮性卵巢癌患者的血清的CYFRA21-1浓度,采用单变量和多变量分析该疾病的不同预后,同时测定血清标志物糖类抗原125(carbohydrate antigen-125,CA125)浓度,并分析比较。此试验得出结果:CYFRA21-1和CA125的血清水平与腹膜后阳性淋巴结和铂电阻有关;与比较低的水平CYFRA21-1相比,较高水平的CYFRA21-1(3.0 ng·ml-1为截点)与更短的无病存活率(16个月vs 28个月P=0.001)和总生存期(29个月vs 41个月,P=0.007)相关。进一步的单变量分析显示,CYFRA21-1和腹膜后淋巴结转移均与铂电阻和死亡率有关。多变量分析显示腹膜后淋巴结转移和血清CYFRA21-1水平可作为TFS和OS的独立危险因素。结论:未经治疗的上皮性卵巢癌血清CYFRA21-1水平有显著的预后意义,当它超过3.0 ng·ml-1时预后差。
测定血清CYFRA21-l的水平对卵巢癌的预后进行评估,随时监测病情变化,具有重要意义。
3.5 肺癌
肺癌是造成肿瘤患者死亡的重要因素,其发病率高,而且不易早期诊断,不仅病死率高,治疗后效果也不佳。
国内一项研究[11]通过电化学发光法测定血清CEA和CYFRA21-1的水平,这些血样采自102例肺癌患者,45例良性肺疾病患者和36例健康对照者。结果:在肺癌患者中,血清CYFRA21-1水平和阳性率[(14.08±8.34)ng·ml-1,62.7%]显著高于良性肺部疾病患者[(3.27±2.87)ng·ml-1,7.7%;P<0.05]和健康对照组患者[(2.69±2.02)ng·ml-1,3.8%;P<0.05]。肺癌患者处于不同TNM阶段,其CYFRA21-1水平都不同程度地增加:Ⅱ期(10.05±6.76)ng·ml-1,Ⅲ期(15.93±6.66)ng·ml-1,Ⅳ期(22.78±4.12)ng·ml-1。结论:CYFRA21-1单独采用对肺癌的诊断有帮助。
在肺癌的诊断中以组织病理检查和细胞学为诊断依据,特异性高,但敏感性不强,所以肿瘤标志物成为了理想的指标[12]。CYFRA21-1的出现,对肺癌诊断提供了便利条件。同时,CYFRA21-1便于确定病理类型,若联合检测可以提高肺癌诊断的敏感性,大大提高肺癌的检出率[13]。
3.6 膀胱癌
膀胱癌为泌尿系统中常见的恶性肿瘤。膀胱癌复发率很高,约一半的患者可能复发,一小部分复发患者可进展为浸润性肿瘤[14]。
Washino等[15]通过研究血清CEA、CA19-9和CYFRA21-1水平来分析它们对膀胱癌的诊断和监测的有效性,血样来自85例膀胱癌患者。在不同的肿瘤临床分期和病理分级中,比较每个肿瘤标志物的绝对水平和阳性率。标志物的变化用来评估患者有无疾病进展,同时评估生存与这些肿瘤标志物之间的关系。结果表明:较高的CYFRA21-1血清水平与较高的肿瘤分期关系密切(P<0.01),同时与较高的病理分级(P<0.05)相关。CYFRA21-1的水平随着疾病的进展显著升高[从(7.33±13.3)增至(55.9±127)ng·ml-1,P<0.01]。CYFRA21-1阳性的患者疾病特异生存率更差,(P<0.000 1,时序检验)。结论:血清CYFRA21-1在膀胱移行细胞癌的诊断上似乎是一个先进的标志物,CYFRA21-1可以有效地监测膀胱癌的进展及评估其预后。
3.7 胃癌
近些年,各种肿瘤标志物已被应用在胃癌的管理中,只有少数报道描述CYFRA21-1。
Gwak等[16]通过试验评估CEA、CA19-9、糖类抗原72-4(carbohydrate antigen 72-4,CA72-4)、CYFRA21-1和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)在胃癌患者中的潜在诊断性能。结果表明:在胃癌的初期阶段,根据两个不同的临界值(推荐的和调整的),CYFRA21-1(≥2.0和1.2 ng·ml-1)有各自的敏感性,分别为50%和78.1%;CEA(≥7.0和3.9 ng·ml-1)的敏感性分别为8.3%和18.8%;CA19-9(≥37和26.7 ng·ml-1)的敏感性分别为15.6%和18.8%;CA72-4(≥4.0和13 ng·ml-1)的敏感性分别为28.1%和9.6%;NSE(≥14.7和15.0 ng·ml-1)的敏感性分别为7.3%和7.3%。CYFRA21-1在ROC曲线下的面积(AUC)0.978(95%置信区间,0.964~0.991)是相对最高。结论:CYFRA21-1是最敏感的肿瘤标志物,并显示出在5个胃癌管理肿瘤标志物中最强大的诊断性能。
3.8 胆道肿瘤
胆道肿瘤包括肝内、肝门部、远端胆管和胆囊癌。血清CYFRA21-1水平升高在胆道肿瘤中有少量报道。
Huang等[17]通过研究探讨血清CYFRA21-1在胆道癌亚型中的临床意义。该实验随访134例恶性和52例良性病变患者,测定其血清CYFRA21-1、CA199和CEA术前、术后的值,分析了生物标志物的受试者特征曲线。CYFRA21-1水平与患者临床病理特征及随访数据相关。结果:CYFRA21-1在胆道恶性肿瘤中显著上调,而且在不同的亚型中有表达差异。在确诊胆囊癌和肝内胆管癌方面,CYFRA21-1比其他肿瘤标志物具有更好的诊断性能;在手术切除肿瘤后下降,在肿瘤复发时升高,它与肿瘤的侵袭性和TNM分期相关。这是一个多因素分析中1年无复发生存率和总生存率的独立预测因子。结论:血清CYFRA21-1在应用于诊断胆囊癌和胆管癌上,是一种可靠的生物标志物。
3.9 宫颈癌
宫颈癌是一种恶性的妇科肿瘤,其预后评估受到极大的重视,具有重要的临床意义。Piao等[18]通过回顾性分析506例宫颈癌患者根治性子宫切除术或次同步放化疗治疗的数据。治疗前测定患者血清鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCCAg)和血清CYFRA21-1水平,采用Cox比例风险模型进行多因素分析,探讨治疗前变量的预后意义。结果:治疗前CYFRA21-1(P=0.010)血清水平独立影响总生存率。同样,在非鳞状细胞癌患者中,治疗前CYFRA21-1的血清水平是影响无病生存期和总体生存率的独立预后因素(P<0.001,P=0.006)。结论:参考血清SCCAg,治疗前CYFRA21-1水平可作为宫颈癌的一个有效预后指标。
3.1 0 其他肿瘤
CYFRA21-1不仅在乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、上皮性卵巢癌、肺癌等疾病中检测出,同时在其他肿瘤中也被检测出,如食管鳞状细胞癌。丁文秀等[19]采用电化学发光法分别检测健康对照组(45例)和初次诊断食管鳞状细胞癌患者(90例)血清中CYFRA21-1和CEA浓度,并对出现淋巴结转移和(或)远处转移者再次检测血清中CYFRA21-1和CEA的浓度。该实验结果表明:CYFRA21-1对食管鳞状细胞癌的诊断及预后有重要价值,而且优于CEA。
4 CYFRA21-1在慢性炎症性疾病中的临床应用
华红等[20]通过研究表明:CYFRA21-1不仅在肿瘤疾病中有所表达,同时在结核性胸膜炎等慢性炎症疾病中有所表达,但CYFRA21-1在结核性胸膜炎中的水平不及肿瘤高。
5 结语
人工角蛋白膜的成分及致密性表征 篇3
关键词：角蛋白膜,羊毛,光谱分析,形态
角蛋白膜是人工产品,自然界中的角蛋白物质众多,主要为毛皮、羊毛、头发、羽毛、皮肤,以及动物的外部附属物爪、喙、角、指甲、翎毛等。人们已能将这些物质溶解,再生制得液体[1]、膜[2]、粉末[3]、纤维[4]和骨材[5]等。这类人工角蛋白膜的应用最为普遍,其中膜的组成最为人们所关注。膜结构的组成对其使用性能至关重要,其组成将影响使用的安全性,即是否含有其它物质或有害物质[6];膜的多孔和致密性结构将影响膜材料的力学性质[7]和传递性质[8]。本研究针对自制的角蛋白溶液和角蛋白膜进行了成分和致密性分析,以期为该类材料的生物医用性能提供基本数据。
1 实验
1.1 试剂和仪器
溶解对象为普通羊毛。溶解用化学试剂:尿素,分析纯,分子式为(NH2)2CO,分子量为60.06;巯基乙醇,分析纯,分子式为C2 H6OS,分子量为78.14;十二烷基硫酸钠SDS,分析纯,分子式为CH3(CH2)10CH2OSO3Na,分子量为288.38;蒸馏水、甘油等。
实验用具:恒温水浴锅、平板、刮刀、烘箱等。
检测仪器:日本SHIMADZU公司的UV-2500紫外-可见光分光光度计;美国Nicolet公司的Avtar360型红外光谱分析仪;法国HPRIBA JOBIN YVON公司的LabRAM HR800 UV激光共聚焦显微拉曼光谱仪;日本日立公司的X-450型电子显微镜。
1.2 实验准备
1.2.1 羊毛角蛋白溶液的制备
采用巯基乙醇还原法制备羊毛角蛋白溶液,其步骤为:选择原料,预处理原料,溶解羊毛,固液分离以及提纯和浓缩溶液。
1.2.2 羊毛角蛋白膜的制备
称取一定质量的蛋白溶液,加入0.2%的甘油,将铸膜液倾倒在玻璃板上(一般为经过严格选择的平整玻璃板);用特制的刮刀使之铺展成具有一定厚度的均匀薄层,然后移植到烘箱中使溶剂完全挥发,烘干温度控制在100℃以下。
1.3 测量
采用紫外-可见光谱仪、红外光谱仪、拉曼光谱仪和扫描电镜测量分析羊毛角蛋白膜。
2 结果与分析
2.1 紫外光谱测试分析
试样1和试样2分别为80℃和20℃条件下烘干的羊毛角蛋白膜。图1为羊毛角蛋白溶液和羊毛角蛋白膜的紫外光谱对此。由图1可以看出,羊毛角蛋白膜的紫外光谱在紫外区有强的吸收,但是形峰不是很明显,说明羊毛角蛋白膜具有很强的紫外吸收能力。
2.2 红外光谱测试分析
蛋白质红外光谱图中最典型的特征峰是酰胺基团的吸收峰,蛋白质中的酰胺属仲酰胺,分为酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带、酰胺Ⅳ带、酰胺Ⅴ带、酰胺Ⅵ带、酰胺Ⅶ带,其谱带的位置指定如表1所示。酰胺Ⅰ带由酰胺的羰基C=O伸缩振动产生;酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带由N-H弯曲振动和C-N伸缩振动产生,其中,酰胺Ⅱ带偏重N-H弯曲振动而酰胺Ⅲ带偏重C-N伸缩振动[9];酰胺Ⅳ带为O=C-N弯曲振动,同时混有其它振动方式;酰胺V带归属于N-H弯曲振动[10]。此外还出现了N-H的伸缩振动吸收峰,而且异构结构可能形成双峰。
注:str为伸缩振动;def为变形振动;Tor为扭摆
图2是不同成膜温度下羊毛角蛋白膜的红外吸收光谱(其中(a)是全吸收峰,(b)是1000～1250倍的放大图,(c)是1500～1750倍的放大图)。从图2中可以看出,羊毛角蛋白膜的红外光谱具有十分明显的酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带及酰胺A带,表现为典型的蛋白质物质。红外光谱中1200～1000cm-1是S-O振动区,而3000～2800cm-1是C-N振动区[11]。
图2(b)和图2(c)为特征波段放大后的图谱,S=O振动谱带在1101cm-1、1078cm-1、1043cm-1、995cm-1处出现了多重吸收,均为胱氨酸氧化物特征吸收峰,都是羊毛角蛋白膜异于羊毛本身的红外吸收,它的出现表明二硫键已经发生断裂,有新的产物生成。
酰胺Ⅰ带的谱峰指认目前较成熟的是:1700～1660cm-1处为β-转角;1658～1650cm-1处为α-螺旋;1650～1640cm-1处为无规则卷曲;1640～1610cm-1处为β-折叠[12]。羊毛角蛋白膜的酰胺Ⅰ带均出现在1649cm-1处,且试样1在1642cm-1和1631cm-1处还有2个小峰,而1650～1657cm-1处出峰并不明显,只有1个平台,见图2(c),说明羊毛角蛋白膜主要的二级结构是无规则卷曲和β-折叠,表明羊毛溶解后破坏了羊毛大分子间的有序排列,增加了羊毛大分子的无序结构。
2.3 拉曼光谱分析
红外光谱和拉曼光谱都属于分子振动光谱,分别对振动基团的偶极矩和极化率的变化敏感。红外光谱为极性基团的鉴定提供有效的信息,而拉曼光谱对研究物质的骨架特征特别有效,故蛋白质的拉曼光谱对蛋白质的结构认定十分敏感,不仅能得到其氨基酸组成信息,还能得到二级结构信息;不仅能得到主链构象(特别是酰胺Ⅰ、Ⅲ带,C-C、C-N伸缩振动),还可得知其侧链的构象。
主要通过肽键和骨架C-C和C-N来分析蛋白质主链的构象。蛋白质的拉曼光谱中,由酰胺键引起的各类振动与红外光谱基本相似,其中酰胺Ⅰ、Ⅲ带对构象十分敏感,表2说明了酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ谱带的位置。
属于骨架的C-C伸缩振动的谱线是构象灵敏的,其中α-螺旋区域在890～945cm-1,无规则卷曲在945～960cm-1[13];C-N伸缩振动在1070～1130cm-1也是构象灵敏的由羊毛角蛋白膜的拉曼光谱图(见图3)可以看出,C-C伸缩振动的谱线在933cm-1和934cm-1处,蛋白质的主链构象在α-螺旋区域,而C-N伸缩振动谱线在1060cm-1处,比较靠近低频,这与红外光谱的酰胺Ⅰ带指定有差异。
进一步分析侧链的拉曼光谱:
(1)酪氨酸(Tyr)对羟苯基环的呼吸振动和环平面外弯曲振动的倍频间费米共振引起的830cm-1和850cm-1双峰是构象灵敏的谱线,当强度比I850/830>1时,该酪氨酸是“暴露”的,强度比I850/830<1时,该酪氨酸是“埋藏的”,理论上可以计算出2种残基的摩尔分数。属于酪氨酸的谱线还有648cm-1、1180cm-1、1210cm-1、1607cm-1和1621cm-1。羊毛角蛋白膜中I850/830>1。
(2)色氨酸(Trp)吲哚环引起的谱线分别在544cm-1、577cm-1、761cm-1、879cm-1、1014cm-1、1338cm-1、1363cm-1、1553cm-1、1582cm-1和1620cm-1附近,它的吲哚环N-H弯曲振动谱线则在1432cm-1处,共11条,其中1363cm-1处的谱线对环境和聚集状态的改变敏感。当色氨酸残基为“埋藏”的时,该谱线呈尖锐的峰形。
(3)苯丙氨酸(Phe)单基取代苯基环在1002cm-1处有强峰(见图3),但其构象不灵敏。属于苯丙氨酸的谱线还有5条,分别是624cm-1、1032cm-1、1203cm-1、1607cm-1和1620cm-1。
(4)二硫键S-S有3种构象,在(510±5)cm-1处的谱线属于扭曲-扭曲-扭曲构象;(525±5)cm-1处的谱线属于扭曲-扭曲-反式构象;(540±5)cm-1处的谱线属于反式-扭曲-反式构象。碳硫键有2种构象:630～670cm-1处的谱线属于扭曲构象,700～745cm-1处的谱线属于反式构象。羊毛角蛋白膜中的二硫键谱线位置在509cm-1处,碳硫键位置在644cm-1和642cm-1处,与文献[16]中羊毛的二硫键和碳硫键的位置一致,说明羊毛被分解后重新构建的角蛋白膜中形成的新的二硫键也是分子间形成的,这也是羊毛角蛋白膜为什么同样具有优良力学性能的原因。
关于酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ带的比较,参考表2得到羊毛角蛋白膜中角蛋白的主要二级结构是无规则卷曲和β-折叠结构,α-角蛋白的比例减少。此结果与红外光谱的信息基本一致。根据Lucia E.等和Huson M.等的研究,无序肽链酰胺Ⅲ的谱带强度I1248/I1450反映了角朊纤维大分子聚集态结构的无序程度,该比值越大,角朊纤维聚集态结构越无序;I1653/I1450反映了有序α-螺旋链的含量,该比值越大,角朊纤维中有序α-螺旋链的含量越高。试样1的I1248/I1450为0.67,试样2的I1248/I1450为0.56,说明高温下羊毛角蛋白膜迅速形成交联,有序化程度高。而试样1的I1653/I1450为0.474,试样2的I1653/I1450为0.543,说明试样2中α-螺旋的有序结构含量更高。
2.4 膜的致密性观察
采用扫描电子显微镜观察角蛋白膜的表面和内部结构。图4为2种成膜条件下羊毛角蛋白膜的SEM照片(×1000倍)。图4(a)、(b)是在80℃条件下烘干的膜的截面和表面照片(膜1),图4(c)、(d)是在室温下(20℃)烘干制成的膜的截面和表面照片(膜2)。图4中角蛋白膜都有比较平整的表面,没有明显的孔洞。透气性测量发现几乎很少透气,表明该膜致密性良好。当然也可以调节成膜条件,使之产生微孔。
3 结论
角蛋白酶 篇4
羊毛主要组成物质是角朊蛋白质, 由近20种α-氨基酸以—CO—NH—肽键构成多肽长链。大分子间除依靠范德华力、氢键结合外, 还通过盐式键、二硫键、酯键相结合而使其大分子具有网状结构。尤其二硫键的存在, 致使羊毛不溶于水并具有较强的耐酸能力, 打开二硫键并保持羊毛大分子主链的完整是溶解羊毛的关键[1,2]。目前将废弃毛溶解制取角蛋白溶液, 在缓释肥料[3]、再生蛋白纤维[4,5]、薄膜[6,7]以及组织工程支架[8,9]等材料领域, 已取得较大进展。大分子角蛋白作为一类天然高分子材料, 具有良好的生物亲和性及可降解性等优良特性[10,11], 具有类似羊毛纤维的结构, 但纯羊毛角蛋白膜在干燥条件下脆、硬、易折裂的特点, 极大地限制其使用。同时我国羊毛资源丰富, 每年废弃的毛数量巨大, 造成环境污染及资源浪费[12]。为实现废旧羊毛的再生利用, 扩展角蛋白资源的应用领域, 对其改性制备优良使用性能的膜材料及其功能材料势在必行。
聚合物共混是改善角蛋白性能的主要手段之一, 通过共混可使不同聚合物之间产生强烈的相互作用, 利用能够与蛋白质分子形成氢键和静电作用力的聚合物与其共混, 即可提高纯角蛋白膜的使用性能[13,14]。张华林[15]等利用高浓度、高黏度、高制成率的羊毛角蛋白与羧甲基壳聚糖 (NOCC) 及增塑剂甘油, 通过机械共混法制膜, 结果表明, NOCC的加入明显改善了纯角蛋白膜材料的物理机械性能, 添加甘油使共混膜具有良好的弹性和韧性。王辉[16]等研究了羧甲基纤维素钠共混改性丝素蛋白膜的结构与性能, 结果表明:加入羧甲基纤维素钠的共混膜, 丝素蛋白含量大于70%时, 拉伸强度适中, 伸长率最大, 适合作医用创面材料。但共混改性存在高分子材料相容性较差的缺点, 并且增塑剂多与高分子材料形成氢键次级键作用, 在膜的耐水性能方面有待改善, 所以交联改性方法值得借鉴。马春辉等[17]研究了交联改性制备胶原蛋白膜, 配制胶原蛋白溶液, 依次加入淀粉、戊二醛、增塑剂增稠, 真空脱气后涂布于光滑玻璃板上, 干燥后揭膜, 戊二醛起到交联改性作用。冯治平等[18]利用交联作用改善大豆分离蛋白膜的保藏特性, 提高其阻湿性和抗拉强度。结果表明:经0.04%二醛或0.2%环氧氯丙烷交联后, 大豆分离蛋白膜的阻湿性分别下降5.7%和5.1%。抗拉强度提高35%和33%。经二醛交联过的大豆分离蛋白膜用于葡萄的保藏试验, 能明显防止葡萄的褐变, 延缓营养成分损失, 有效延长保藏时间。由于丝素蛋白、胶原蛋白、大豆蛋白与羊毛角蛋白在结构上类似, 以上方法可以借鉴。
本研究的前期工作是利用实验室自行提取的羊毛角蛋白溶液, 与羟甲基纤维素钠溶液共混, 并添加山梨醇做增塑剂, 制取共混膜, 但膜材的耐水性能较差。故本研究改用添加交联剂戊二醛, 对原料高分子进行交联改性。戊二醛分子式为C5H8O2, 是典型的双功能团试剂, 2个醛基 (—CHO) 可与羊毛角蛋白氨基 (—NH2) 发生醛化缩合反应, 共价结合, 与伯氨基作用形成环状吡啶结构, 基本原理如图1 (a) 所示, 在一定条件下交联剂能将单体、线型高分子转变成复杂三维网状结构, 交联度亦能达到很高程度, 醛化反应使肽链链段排列更加紧密。此外戊二醛与蛋白质的交联反应比较复杂, 也可能发生类似以下的结合, 3个戊二醛分子与一个氨基酸侧链反应可以生成图1 (b) , 醛基与氨基缩合生成希夫碱结构后, 再进一步反应, 多个 (b) 缩合连接构成图1 (c) , 形成共轭结构与环状结构的稳定结合[19]。添加戊二醛可以优化复合膜的机械性能、耐水性能、弹性与柔韧性, 本研究将深入探讨交联剂对复合膜各方面性能的影响。
1 试验部分
1.1 原料与仪器
废旧羊毛, 山东棉纺厂;
羟甲基纤维素钠 (CMCNa) , 食品级, 其重均分子质量5.0×105g/mol (黏度为300~800m Pa·s, 替代度中级D.S 0.75~0.9) , 天津市标准科技有限公司;
亚硫酸氢钠、溴化锂、十二烷基磺酸钠 (SDS) 、氢氧化钠、戊二醛, 均为分析纯, 上海嘉辰化工有限公司。
所有仪器由天津工业大学分析测试中心提供。
1.2 羊毛角蛋白的制备
称取一定质量羊毛, 加入还原剂Na HSO3/金属盐Li Br/表面活性剂SDS溶解体系, 调节适宜p H值和温度, 通入纯氮气隔绝空气反应若干时间后, 得到浅黄色、透明的羊毛角蛋白溶液, 经截留分子质量 (8 000~14 000) 透析袋流动水透析48h, 再用去离子水透析24h, 去除残余试剂和小分子多肽蛋白, 便得到了大分子羊毛角蛋白原液[20]。
1.3 复合膜的制备
配制一定质量浓度的羊毛角蛋白溶液, 同时将羟甲基纤维素钠粉末在50℃水浴下搅拌溶解于去离子水中, 配制成一定浓度的CMCNa溶液, 通过溶液共混方法将二者以一定配比混合, 并加入适量的交联剂戊二醛, 在一定温度、时间下搅拌均匀后得到制膜液, 静止稳定后倾倒于制膜容器中, 37℃下烘干1h, 室温下自然干燥成膜。根据之前制备羊毛角蛋白/羟甲基纤维素钠共混膜正交试验的研究[21], 羟甲基纤维素钠对膜的性能影响最大, 反应温度和时间影响较小, 故本研究在反应温度37℃, 反应时间1h, 羊毛角蛋白/CMCNa质量比5∶5条件下, 进行复合膜的制备。
1.4 力学性能测试
参照国标GB1039-79和GB1040-79, 采用织物拉力仪测试复合膜的拉伸强度和断裂伸长率。将膜材在真空干燥箱里烘24h, 用千分尺在样品上选取3点测厚度, 计算得平均厚度。取制备好的厚度相近的膜 (0.175±0.005mm) , 用裁样刀裁成长条型试样, 样品宽度为15mm, 夹持长度为30mm, 测试温度为室温, 湿度为 (65+5) %, 样品最终取值均由5次独立的测试结果求平均值得到, 织物拉力仪定速拉伸速度为100mm/min。拉伸强度和断裂伸长率的计算如下式所示:
1.5 含水率测试
膜在20℃、RH=65%条件下达吸湿平衡24h后, 取膜Wa (g) 放于烘箱中干燥48h, 烘至恒重, 称重Wb (g) 。计算其中所含水分质量占膜原质量的百分比, 每种样品均做5个平行试验, 取平均值。利用下面公式计算复合膜含水率:
1.6 溶失率测试
将膜精确称重Wa (g) 后, 置于盛有蒸馏水的锥形瓶中, 于37℃下放置30min后, 取出烘干至恒重, 再称重Wb (g) 。利用下面公式计算膜的溶失率:
1.7 透气率测试
按照国家标准GB/T12704-1991织物透湿性测定方法—透湿杯法进行:杯内装入10m L蒸馏水, 膜封装在杯口, 测试试样组装体于38℃环境中, 每隔1h测定1次, 重复5次。利用下面公式计算膜的透气率Qv:
式中:Gi为每次称量的透湿杯重量, g;
n为称量的次数;
t为称量的相隔时间, h;
A为膜的有效面积, m2。
1.8 扫描电镜测试
取力学性能良好的复合膜样品, 经干燥、喷金处理, 利用H-7650型扫描电镜测试并获得电子照片。
1.9 红外光谱测试
将膜样品剪成粒径小于40mm的粉末, KBr压片制样, 采用德国BRUK-ER公司TENSOR37型红外光谱仪测定膜样品的红外光谱。
1.10 X-射线测试
利用X-射线在晶体上产生的衍射现象, 可以从分子水平上分析物质的内部结晶状态以及晶体晶面在材料内部的取向。本试验利用X-多晶粉末射线衍射仪观测复合膜的晶体结构。
2 结果与讨论
2.1 实物膜对比
由图2 (a) 可以看出:纯羊毛角蛋白膜呈现小碎块状态, 无法形成整片膜, 羊毛角蛋白溶液干燥成膜后硬且脆, 轻触即碎裂, 力学性能较差, 需改性以提高应用性能。由图2 (b) 可知:纯羟甲基纤维素钠具有成膜性, 能够形成整膜, 但膜偏硬, 柔韧性和弹性欠缺, 无拉伸性, 以上二者均不能满足力学性能测试要求。图2 (c) 为力学性能较好的复合膜实物图, 表面光滑、半透明、均匀有一定柔韧性和弹性, 并且膜材具有一定厚度。
2.2 复合膜的表观形态
由图3 (a) SEM照片可以看出复合膜成膜效果比较理想, 表面无明显孔隙和较大裂缝, 复合膜内各组分相容性良好。图3 (b) SEM照片显示复合膜断面比较致密均匀, 各组分已达到分子结合水平。膜的表面出现的细小纹路可能是由于测试过程中温度偏高以及膜具有一定的含水率未进行脱气处理所致。
2.3 交联剂用量对膜力学性能的影响
由图4可以看出:复合膜的拉伸强度和断裂伸长率均随戊二醛浓度的增加而增加, 当戊二醛浓度为0.15%时, 复合膜具有最大断裂伸长率26.3%, 同时拉伸强度为40.1MPa。因为戊二醛与角蛋白分子的侧链集团形成密集的交联网状结构, 在戊二醛浓度较小的区域范围即可对羊毛角蛋白分子进行较大程度的改性, 促使原料分子内部结晶区域改变, 相应力学性能发生变化, 改善膜的柔韧性及弹性。当戊二醛浓度在0.15%~0.25%区间, 膜的断裂伸长率急剧下降至5%左右, 几乎难以拉伸伸长, 同时浓度在0.2%~0.25%区间, 膜的拉伸强度也大幅下降。当戊二醛浓度过大, 交联程度增加, 复合膜材料趋向硬化, 柔韧性急剧下降, 脆裂程度增大。在试验中观察, 随戊二醛浓度增加, 制膜液颜色由透明逐渐变至白色, 气泡也渐增多, 当戊二醛在浓度范围0.1%~0.2%之间, 复合膜的强度和拉伸性能较好, 戊二醛浓度超过0.2%, 膜材表现出硬且易裂的状态, 成膜性差。综合以上分析, 戊二醛最佳用量在0.15%, 兼具较好的拉伸强度和断裂伸长率, 并且膜材透明均匀, 弹性好易揭取。
2.4 交联剂用量对膜含水率的影响
膜材的含水率主要与各组分的亲水基团数目相关, 羊毛角蛋白和CMC-Na分子自身都含有一定数目的亲水基团, 故复合膜具有一定的含水率。由图5可知膜的含水率随戊二醛浓度的增加而逐渐减小, 从起始的9.25%至3.48%, 下降趋势明显。首先角蛋白与CMCNa分子间形成氢键缔合, 使膜内部的亲水基团减少, 另外主要因为戊二醛结构中含2个醛基, 与角蛋白分子氨基发生醛化缩合反应, 形成不可逆的共价结合, 使角蛋白分子间氢键作用明显减弱, 交联改性作用突出, 分子间形成紧密而复杂的交联网络结构, 促使原料分子中的亲水基团不断减少, 导致含水率明显下降。在戊二醛浓度为0.15%时, 复合膜具有最佳力学性能, 其含水率为7.05%。
2.5 交联剂用量对膜溶失率的影响
溶失率是膜材料的重要指标, 反应膜的耐水性能, 对膜材料的应用领域起到至关重要的作用。由图6可以看出随戊二醛浓度的增加, 膜的溶失率呈显著下降趋势。因为戊二醛与原料分子形成交联网状紧密结构, 浓度越高, 形成的交联程度越大, 膜越致密, 硬度强度越大, 溶失率下降幅度也较大, 与膜的力学性能相对应。当添加戊二醛浓度范围在0.1%~0.2%区间, 复合膜的力学性能良好, 其溶失率也较小在10%~20%之间, 耐水性较好。尤其在戊二醛浓度为0.25%时, 溶失率最小可达6.80%, 但此时的复合膜偏硬化趋势, 拉伸性与弹性均不理想。由此可说明添加戊二醛的复合膜的耐水性能较好, 形成的膜材在厚度、强度、韧性和耐水性方面, 均强于添加山梨醇做增塑剂的共混膜材料。
2.6 交联剂用量对膜透气率的影响
由图7可以看出:在戊二醛浓度范围0.05%~0.1%时, 膜的透气率逐渐增加, 因为角蛋白与CMCNa分子间形成氢键次级键作用, 另外戊二醛起交联作用, 与原料分子间构成不可逆的键合作用及大量交联网状结构, 打破原有分子间的结晶结构, 各分子间空隙增加, 膜的透气性能增强。当戊二醛浓度0.1%时, 透气率达到最高点74.5g/m2·h, 同时0.1%浓度亦形成分界, 即透气率下降的拐点, 随着戊二醛浓度的增大, 在0.1%~0.25%范围区间, 交联程度显著增大, 分子间密集的交联结构增加, 复合膜内部结晶区域增大, 膜材料更加致密, 厚度硬度极大增加, 透气性明显下降, 当戊二醛浓度为0.25%时, 透气性下降至30g/m2·h以下。
2.7 红外光谱分析
由图8a可知:纯羊毛角蛋白膜经红外光谱测试, 在1 650.0、1 537.5cm-1分别为α-螺旋型构象的酰胺Ⅰ和Ⅱ带的强特征吸收处出现强吸收峰, 表明是以α-螺旋型构象为主的羊毛角蛋白。另外在3 434.1、1 457.5cm-1处均有特征吸收峰, 属于酰胺键 (—CONH) 伸缩振动范围, 证明羊毛角蛋白膜中含有大量酰胺键的多肽分子结构, 并以α-螺旋型构象为主。羟甲基纤维素钠膜的红外光谱如图8b所示, 1 582.1cm-1处为羟甲基基团的特征吸收峰, 3 597.3cm-1处的吸收峰, 表明是羟甲基纤维素钠中—OH的振动峰, 此处振动峰的吸收强度比较大, 是由于羟甲基纤维素钠中的—OH基团比较多。由复合膜的红外光谱图8c对比图8a和图8b可以看出:羊毛角蛋白膜的1 650.0、1 537.5cm-1酰胺Ⅰ和Ⅱ带的强吸收峰明显向低波数偏移至1 643.8、1 414.2cm-1, 且吸收峰趋向平缓, 同时3 434.1cm-1酰胺键 (—CONH) 伸缩振动特征吸收峰也向低波数偏移至3 291.1cm-1。图8b中1 582.1cm-1和3 597.3cm-1处的特征吸收峰消失, 这是由于羊毛角蛋白分子与羟甲基纤维素钠分子之间形成氢键缔合, 纯角蛋白和羟甲基纤维素钠分子结构均发生改变, 同时证明了复合膜组分分子间存在分子水平的强烈相互作用, 在交联剂戊二醛作用下, 复合膜内部实现良好的分子间结合, 纯角蛋白膜得到充分改性, 复合膜材的各性能得以改善。
2.8 X-射线分析
由文献[22]可知羊毛角蛋白在2θ为6°和18°有2个较平缓的特征衍射峰, 内部存在结晶结构, 羟甲基纤维素钠膜在2θ=21°有强衍射峰, 在2θ=15.5°有弱衍射峰, 说明其有2种结晶结构的存在。若复合膜中各组分没有相互作用, 则在膜中会有各自的结晶区, 衍射图谱会相应表现为各组分按混合比例简单的叠加。由图9a可以看出:角蛋白/CMCNa/戊二醛复合膜衍射图谱中在2θ为4.6°和7°出现2个明显尖锐的特征衍射峰, 结晶度较为集中突出。相比纯角蛋白和CMCNa发生了较大变化, 原有组分衍射峰消失。如果角蛋白、CMC-Na与戊二醛没有相互作用或作用较弱, 复合膜中将会出现各自组分的结晶区域, XRD图谱将会出现各自的衍射峰。添加戊二醛的复合膜体系, 因戊二醛的交联改性作用, 改变原有组分的结晶状态, 分子间形成强烈的相互作用, 导致膜的内部结构存在新的结晶区域, 且结晶度较大, 以此说明戊二醛交联改性的成功。由图9b可以看出:角蛋白/CMCNa/山梨醇共混膜的XRD图谱, 由于山梨醇的增塑效果, 与角蛋白和CMCNa形成强烈的氢键作用, 破坏了原有组分的晶体结构, 角蛋白与CMCNa原有的衍射峰消失, XRD曲线比较平缓, 没有特别突出的衍射峰, 结晶度不大。以上分析证明复合膜各组分之间具有很好的相容性, 存在强烈的分子水平相互作用。由剪纸称重法得出结晶度:角蛋白/CMCNa/戊二醛复合膜>角蛋白/CM-CNa/山梨醇共混膜。
a.羊毛角蛋白膜的FTIR曲线;b.CMCNa的FTIR曲线;c.角蛋白/CMCNa/戊二醛复合膜的FTIR曲线
3 结论
角蛋白酶 篇5
众所周知,除裘皮和毛革(双面革)加工外,皮革的生产均需脱毛处理。据介绍,每加工1盐湿皮仅制造出不足300 kg的成品革,却要产生600 kg以上的副废物,且其中所产生的废弃毛就高达100 kg左右[1]。纵然,目前已有一些生产加工技术能够利用动物毛加工制造生活用品,例如,绵羊毛和山羊毛、牦牛毛中的细绒毛是制造毛纺织品的优质原料;猪鬃一直是我国农副产品出口中的大宗产品,主要用于制造各类毛刷。然而,还是很难使废弃毛发得以完全利用。不同原料皮所产生的毛副废物的数量及性质虽各有不同,但它们都是由角蛋白组成的。角蛋白中氨基酸含量高,种类达17~18种,利用范围广。因此,充分回收毛并从中提取角蛋白,不仅可大幅度减轻制革业的污染治理负担,同时可为角蛋白的生产提供优质价廉的原料,提高制革的综合经济效益,绝对称得上是一件利国、利民、利己的大好事。随着“资源循环、高效利用”的观念深入人心,秉承“节能,清洁再循环”的思想,绿色皮革制品的研发也逐步受到重视。因而,皮革行业废弃毛的清洁化利用,也成为皮革行业中亟待解决的一大问题,绿色皮革化学,废弃毛回收再利用也成为皮化行业研究的热点之一[2]。
随着科学技术、化学分析技术的进步,众多科研工作者已对动物毛的组织结构以及角蛋白的结构化学进行了研究分析,逐步了解了角蛋白的分子结构以及物理、化学性质。通过物理或化学降解方法,成功提取了角蛋白。同时,对提取得到的角蛋白经过化学改性等处理,制备得到了各项物理化学性能更加优良的改性角蛋白产品,且其已逐步应用于医药、化妆品、涂料、皮革等行业。
2 角蛋白概况
2.1 角蛋白的来源
角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白,广泛存在于生物体的组织结构中。在同一个体的不同组织细胞中,不同个体,以及不同物种之间角蛋白的含量存在着较大差异。一般说来,高等动物的表皮毛发中角蛋白的含量较高,而植物、微生物中角蛋白的含量较低[3]。角蛋白可分为软角蛋白和硬角蛋白两大类。软角蛋白和硬角蛋白在元素含量及空间结构上有很大的不同,软角蛋白存在于皮肤和其它一些细胞组织中,如脑灰质,脊髓和视网膜神经的蛋白质。而硬角蛋白,多存在于一些硬化了的角质细胞中,如:发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、喙、丝及其他动物表皮结构中,无营养作用。动物体中的角蛋白是生皮纤维的第二大组成部分[4]。
在动物体中,如猪、牛、羊等牲畜的屠宰下脚料、蹄、角、毛以及禽类羽毛中,角蛋白含量极高。禽类羽毛中的角蛋白含量高达80%,羊毛的角蛋白含量更是高达93%。许多皮革厂、屠宰场及其毛纺加工厂,在生产过程中产生的废弃毛料具有很大的回收利用价值,是角蛋白丰富的来源[5]。
毛作为角蛋白的一大来源,有其独特的结构。成熟的毛由内到外依次分为髓质层、皮质层和鳞片层。髓质层存在于毛中空的部分,由充满空气的薄壁细胞组成,决定毛的保暖性,含有色素颗粒。皮质层是毛的主要组成部分,由皮质细胞胶合而成,决定毛的柔软度,强度,卷曲度,含有色素,从而决定毛的颜色。鳞片层,又称表皮层,约占毛重的10%,决定毛的摩擦性能,粘缩性,吸湿性,以及光泽和手感。
2.2 角蛋白的结构
(1)角蛋白分子的一级结构
角蛋白属于纤维状蛋白质,分子链由20种α-氨基酸构成,在不同物种、同一物种的不同个体之间、乃至同一个体的不同组织之间,角蛋白分子的分子结构及其分子中的氨基酸序列和含量有较大差异。即,角蛋白的来源不同,氨基酸的组成存在差异。Parry等发现,动物毛发纤维的氨基酸重复单元中主要有两种基本的五肽环模式的重复单元,即:重复单元A(半胱氨酸-半胱氨酸-X-脯氨酸-X)和B(半胱氨酸-半胱氨酸-X-丝氨酸/苏氨酸-丝氨酸/苏氨酸),其中,X代表除半胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸之外的构成蛋白质的任何一种氨基酸[6]。分子中含有较多的半胱氨酸,约占11%,没有羟脯氨酸,羟赖氨酸也很少,或没有。角蛋白中氨基酸的通式可以表示为:
H2N-CHR-COOH
其中R是具有不同性质的侧链或基团。角蛋白的一级结构,是由各种α-氨基酸通过肽键缩聚而形成的多肽链的结构,具体结构示意图如图1所示[7]。
(2)角蛋白分子的二级结构
X衍射法研究发现,经X射线照射后,角蛋白存在两种结构,如图2所示,分别为角蛋白的α-螺旋结构和β-折叠结构。角蛋白的一级结构是由α-氨基酸通过肽键构成多肽长链,因为氨基酸中除α-氨基和α-羧基以外还有其他侧基,肽长链又通过侧基间的相互作用(如:二硫键、氢键、离子键、酯键、范德华力等)横向联系形成角蛋白的空间构型。在提取角蛋白时,对毛羽的溶解应该是打开毛角蛋白大分子间的侧基间的作用,并保持大分子肽链的完整性而不受破坏,否则角蛋白的实用价值就会受到影响[8]。其中二硫键、氢键、酯键等保持角蛋白的空间构型,使其相互交联形成稳定的三维结构,也正是因为二硫键和氢键的存在使得α-角蛋白具有很好的曲挠性。角蛋白在自然条件下很难降解,主要原因是其结构中有大量的二硫键相连,具有强的耐酸能力,但是当-S-S-被破坏后,便能在稀碱液中很快膨胀而溶解[9]。
(3)角蛋白的三级结构
毛是典型的α-角蛋白,其基本结构是右手α-螺旋,两个α-螺旋可卷绕形成二聚体。在二聚体中,两个α-螺旋分子链相互缠绕,拧成绳状,呈左手螺旋结构。角蛋白的单股左手螺旋二聚体间,由于肽链侧基,如双硫键等作用,使多个二聚体相互作用形成微纤维,数十根微纤维相互作用又形成原纤维。即,α螺旋→微原纤维→原纤维→纤维束→细胞。角蛋白三级结构示意图如图3与图4所示。
2.3 角蛋白分子内及分子间的作用力
角蛋白中,α-氨基酸形成的肽长链之间,由于侧基R的相互作用,即,范德华力,双硫键,酯键,离子键等的相互作用,形成稳定的空间结构。其中,双硫键是由两个半胱氨酸的巯基被氧化形成的共价键,可表示为-S-S-。双硫键键能很大,大约126~420 k J/mol,但几乎不能自由转动,所以角蛋白单个肽长链间,通过二硫键作用,对角蛋白空间结构的稳定性有重要作用。由于角蛋白长肽链上有很多肽键,肽链侧基如-COOH,-NH2,-OH等基团,这些基团之间可能形成大量的氢键,氢键也是影响角蛋白分子结构稳定性的重要因素之一。除此之外,角蛋白分子侧链上的带负电基团和带正电基团之间会相互作用,形成离子键;分子之间,基团之间,还可能存在范德华力以及某些疏水基团的作用,亦对角蛋白的空间结构有着重要影响,赋予了角蛋白稳定的结构和化学性质。如表1所示,为角蛋白分子间所存在的作用力及其对结构的影响作用结果[7,8,9,10]。
2.4 毛和角蛋白的物理性质
动物毛中,角蛋白成分占80%以上,角蛋白的空间结构及元素组成,决定了毛的物理性质。动物毛吸湿性好,回潮率一般在15%~16%,吸水率可达60%。截面吸湿膨胀率在17.5%~18%之间。由于毛纤维的分子结构特征,使其在一般情况下具有较好的弹性[6]。
在湿热条件下,经机械外力反复作用,纤维集合体逐渐收缩紧密、交编毡化。角蛋白的耐热性较差,在100~105℃时,毛纤维很快失水、干燥而变得脆弱、泛黄、强度降低。如图5所示,为毛的应力-应变曲线图[11]。
3 角蛋白的提取方法
从目前的总体情况来看,角蛋白的提取方法众多,然而,通过我们的分析发现,主要的提取方法为机械法和化学法两类。
3.1 机械法
角蛋白中的双硫键在高温高压下会被破坏,使角蛋白水解成多肽链混合物,相对分子质量下降且溶解性增加,这种提取角蛋白的方法称为“高温高压水解法”。基本原理是在加温加压条件下(一般温度100~200℃、压力0.3~1 MPa),角蛋白的空间结构发生变化,肽链伸展,单分子肽链间的作用力(如双硫键、氢键等)遭到破坏,溶解性提高,同时角蛋白的空间结构变得疏松,分子间空隙增大,从而增大了角蛋白与溶剂的接触面积。
机械法提取角蛋白,多用于角蛋白饲料的生产,动物毛羽、蹄等经过加热,高压,使其膨化溶于水呈凝胶状,然后,烘干,粉碎。该方法蛋白产率高(高达85%),然而,其对设备的要求高,耗能大,且条件不易控制[12]。如表2所示,即为现阶段提取角蛋白的主要机械方法[13]。
3.2 化学法
3.2.1 酸水解法
由于酸不易使双硫键遭到破坏,所以角蛋白对酸的耐受性较强,角蛋白用40 g/L的H2SO4常温处理羊毛8 h,羊毛的强度保持不变。在制裘中,毛适合在弱酸条件下湿加工,40℃条件下浸酸,毛几乎无损伤。但高浓度强酸长时间作用,角蛋白会由于肽链的水解而遭到破坏,此法使角蛋白分子降解成小分子肽及氨基酸。一般说来,酸的浓度越高,酸性越强,反应温度越高,反应时间越长,则角蛋白越易水解。
3.2.2 碱水解法
角蛋白中肽链间的双硫键键能极大,几乎不能自由转动,非常稳定,但对碱非常敏感,经碱处理极易发生断裂,与此同时,碱还会破坏角蛋白中的盐键,影响肽链本身的结构。但碱对角蛋白的溶解作用,主要是破坏双硫键。角蛋白的破坏程度与时间、温度、碱的浓度及碱的性质有关[14]。
碱催化的双硫键水解反应属于双分子β-消除反应,在强碱介质中,OH-首先攻击肽链中的半胱氨酸α-碳原子上的氢原子,并夺取之。失去质子的α-碳原子将多余的电子向侧链转移,导致C-S键的断裂并生成脱氢丙酰胺。后者进一步分解,转化为半胱氨酸盐,同时释放出一个硫原子。
由于碱破坏角蛋白中双硫键的同时,也破坏了蛋白分子中的盐键、肽键等,碱浓度越高,碱性越强,则提取的角蛋白相对分子质量越低,所以在这种方法中必须解决角蛋白的产率和相对分子质量之间的矛盾,通常需要和还原剂配合使用。如表3所示,为现阶段研究的主要酸碱处理法及其比较结果[13]。
3.2.3 还原法
还原剂与角蛋白的反应主要发生在双硫键上,所用还原剂一般为巯基化合物,如巯基乙酸钠、巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇[13],它们与双硫键的反应属于双硫键的交换反应,包括两个连续的亲核取代反应,中间产物为不对称双硫化物[14]。还原法所使用的试剂比较温和,对肽链的破坏程度较小,获得的角蛋白产品相对分子质量较高,产率也较高,通常是众多科研工作者首选的化学提取方法[5]。
(1)还原A法[17]
由于-S-S-容易被还原,还原剂亦可用于角蛋白提取,其反应表达式为:
-S-S-+[H]→-SH
这种反应的特点是,断开交联后至少要生成一份巯基(-SH),但是巯基极不稳定,如果将制得的溶液长时间放置,巯基会发生氧化又重新生成-S-S-,使角蛋白沉淀。具体反应过程如下式所示。
-HN-CO-CH2-S-S-CH2-CHR-CO-NH-+2HSCH2COOH→HS-CH2-CHR-CO-NH-+HS-CH2-CO-NH-+HOOCCH2-S-S-CH2COOH
(2)还原B法和还原C法
还原B法和还原C法是在还原A法中为阻止半胱氨酸残基的氧化再交联而产生的。还原B法采用了封闭-SH的手段,使用亚硫酸盐或Na2S作为还原剂时,与二硫键反应生成-S-SO3Na基团和-S-Na基团,封闭了-SH基团,生成物水溶性增加。但生成物中仍有P-S-残基,角蛋白溶液仍不稳定。
P-S-S-P1+2Na2S→P1-SNa+P-SNa+Na2S2
与还原B法相比,还原C法利用表面活性剂胶束的保护作用阻止-SH氧化现象和沉淀发生,可以获得稳定的角蛋白溶液。采用此法提取角蛋白,可提取得到相对分子质量较高的角蛋白,且得率较高。
如表4所示,为采用还原法提取角蛋白的具体实施方法[13]。
3.2.4 氧化法
过氧化氢、亚氯酸钠、高锰酸钾、过甲酸、过乙酸等都可以氧化角蛋白。氧化法的主要依据是-S-S-+[O]→SO3H,生成含有水溶性基团的角蛋白质[4]。以水作为溶剂,则可获得一定浓度的水溶液。其反应历程如下式所示[14]:
P-S-S-P1+HOH→P-SH+P1-S-OH
P-SH+P1-S-OH+RCO3H→P1-SO3H+RCO2H
在氧化法制取角蛋白溶液的过程中,除了双硫键和巯基,甲硫氨酸的甲硫基、酪氨酸的酚羟基等也可被氧化,因此,不可避免的会造成肽链被氧化降解。因此,氧化法制取的角蛋白,相对分子质量较低,大多数角蛋白分子在3000 k Da以下。
3.3 生物法(酶处理法)
天然角蛋白由于双硫键的存在,对酶有很强的抵抗能力,只有角蛋白酶,即,双硫键还原酶,可以使角蛋白的双硫键还原,从而破坏-S-S-,将难溶性角蛋白分解为可溶性角蛋白,提高角蛋白的溶解性[18],这也是毛类产品的虫蛀原理。但角蛋白酶的价格一般较昂贵,不适合工业生产。且产物较多为分子量较低的多肽。
4 角蛋白在制革工业中的应用
4.l在表面活性剂方面的研究
近年来,随着对生物高分子的研究,对蛋白质的性能及改性应用的研究分析也有了突破性的研究进展,基于蛋白质本身保护、润湿等作用以及其易降解的特性,经改性得到的蛋白质表面活性剂应运而生。如,雷米邦A就是一种由皮胶原和油酰氯缩合而成的典型的阴离子表面活性剂。基于此研究,强西怀等人利用废弃羊毛,将羊毛水解,再同油酰氯缩合,纯化制备得到阴离子角蛋白型表面活性剂[19]。王全杰等人通过将废弃牛毛水解,再和油酰氯缩合制备表面活性剂,并检测其表面张力,乳化力,发泡力。结果表明,牛毛水解液制备的表面活性剂具有较强的降低溶液表面张力的能力、优异的起泡能力以及良好的乳化能力[20]。
4.2 在蛋白填料、复鞣剂方面的研究
早在上世纪70~80年代,印度人就开始了对羽毛角蛋白填料的研究。随着资源高效循环、高效利用观念的深入人心,对角蛋白复鞣填充剂的研究也逐渐成为制革工业中的一个热门研究课题。辛中印等人通过对角蛋白复鞣剂各项性能的研究分析发现,角蛋白具有一定数量的活性基团、一定的相对分子质量分布,对角蛋白用过硫酸钾引发,用丙烯酸进行了改性,制备得到的蛋白复鞣填充材料能明显降低革的部位差,且对铬革后续的染色工序无影响[20]。魏鹏勃等人用过硫酸钾、亚硫酸氢钠引发,在很大程度上增加了短支链,从而提高了角蛋白的助鞣填充性能,使革的柔软度,丰满度,厚度和伸长率都有所改善,且不影响坯革的抗张强度,撕裂强度[21]。李闻欣等也对角蛋白的助鞣作用进行了研究。综上所述,人们对毛角蛋白结构和性能的认识在逐步提高,角蛋白改性产品也可以代替部分鞣剂得以使用。有理由相信,只要通过适当的混合,接枝,共聚等处理,必将研制出性能更加卓越的角蛋白复合改性复鞣填充剂[22,23,24,25,26]。
4.3 在吸附剂方面的研究
角蛋白复合材料中含有大量(如酰胺键,二硫键,氨基,羧基,羟基等)可与金属离子发生配位络合作用的基团,因此,对金属离子具有吸附性。在制革行业中产生的废弃毛料,是角蛋白最好的来源之一。一方面,废弃毛料的处理再利用是实现能源高效循环利用所必须的,另一方面,废弃毛料作为吸附剂的价格远远低于其它高分子合成吸附剂。
在制革行业中,铬的污染是不可避免的。如何处理污水中的Cr3+,是制革过程中必须解决的一大问题。近年来,对角蛋白改性制取角蛋白吸附剂,应用于铬鞣废液中Cr3+的处理,已经逐步得到实践。李闻欣等人利用脱脂溶胀处理后的羊毛,处理铬鞣废液,验证了羊毛角蛋白的吸附性,证明了羊毛角蛋白表面暴露官能团越多,吸附性越好[27]。李闻欣等人还采用了与甲基丙烯酸甲酯接枝改性共聚的改性羽毛角蛋白对铬鞣废水进行处理,改善了羽毛角蛋白的吸附性能,提高了废弃角蛋白的利用率[28]。改性角蛋白具有微孔,质轻,较大比表面积等特性,同时,还具有较强的吸附能力。邵坚等利用此性质,用Na2SO3还原改性后,大大改善了其对污水中Cr2O72-的吸附能力[29,30,31],该结果不仅表明了改性角蛋白具有较强的吸附能力,其也间接证实了改性角蛋白能够用于废水中的六价铬的处理,拓宽了改性角蛋白在其它工业废水中的可应用性。
4.3 在皮革涂饰中的应用
皮革涂饰剂是由成膜剂、着色剂、溶剂和助剂等多种材料混合而成的。蛋白涂饰剂能使皮革具有优越的卫生性能[31],然而,从目前的研究现状来看,制革上使用最广的是酪素。随着对角蛋白的研究改性,角蛋白涂饰剂也将逐渐被使用。众所周知,天然蛋白具有自身硬、脆等特点,因此采用未经改性处理的天然蛋白进行涂饰必将对坯革的各项性能产生一定的负面影响。辛中印等人通过使用乙烯基单体对角蛋白进行改性,不仅保留了毛蛋白涂饰的特点,同时改善了角蛋白涂层不耐干湿擦性能,使涂饰剂的性能得到了提高[32]。张扬等人采用甲基丙烯酸丁酯和丙烯酸乙酯和丙烯腈与羽毛蛋白进行接枝共聚反应,改善了涂饰剂的耐湿擦性、耐折裂和耐熨烫等性能,同时大大提高了涂层的粘着力[25]。
4.5 其它方面的应用
目前,角蛋白的应用十分广泛,已涉足于农副产品,医药产品,生物高分子产品等多个行业,可作为化妆品添加剂、农药、肥料添加剂[33]等得以使用。对于医药行业而言,可将从中提取得到的半胱氨酸作为医药品使用。此外,角蛋白还可作为诱导底物,定向选育高效脱毛角蛋白酶等。综上所述,角蛋白不仅来源广泛,而且具有十分广阔的应用前景,对其进行研究分析必将具有十分显著的现实意义。
5 结语
角蛋白酶 篇6
关键词：废弃羊毛,角蛋白,资源化利用
1 前言
羊毛角蛋白质纤维作为人类利用的第一种纤维材料,在人类文明史的发展长河中扮演了重要的角色,它是纺织工业的重要原料[1]。在制革工业生产中,脱毛是一道必不可少的工序。我国是制革大国,因此也是废弃羊毛纤维资源的大国。羊毛作为皮革工业的副产品在毛纺工业中极具利用价值,但羊毛经提绒后会残留大量的废弃粗羊毛,回收利用率低,据有关部门统计表明,我国每年平均生产9万吨左右的粗长毛,它们质量低下、加工难度大又不易降解,很难得到充分利用,还会带来严重的COD、BOD废水污染[2]。传统回收利用方法主要是物理机械手段的加工,但羊毛中含有大量角蛋白,如果将其溶解后再利用,产品的附加值就可大大提高。近年来随着化学及生物技术的发展,羊毛角蛋白在提取及资源化利用方面研究发展迅速。
2 羊毛角蛋白主要提取方法
人类对天然角蛋白的加工利用已经有很长的历史了,其中最早的塑料制品就是以角蛋白为原料制成的[3]。可生物降解塑料及生物医学材料越来越受到重视,其中研究的热点之一就是从毛发、禽羽毛等中提取角蛋白。羊毛角蛋白的加工和提取方法主要有两大类:机械法和化学法。
2.1 机械法提取角蛋白
机械法[4]制备角蛋白一般都是用加热(100～200℃)和加压(0.3～1.0 MPa)的方法破坏角蛋白内部的二硫键和肽链,使它变为可溶的、易消化的多肽混合物,多应用于饲料行业。
2.1.1 挤出法
挤出法是在高温、高压下于挤出装置中,将已粉碎的原料分散于介质(水)和还原性附加剂(主要为Na2S)所形成的液相中加热熔化后挤出成型。此法主要用于制备热塑性材料,优点是可将原料加工成为任意需要形状的饲料食品。
2.1.2 挤压法
挤压法是在高温、高压、强剪切的环境下使角蛋白中的二硫键发生断裂,它的粗产物呈膨松状,只要轻压就可以得到角蛋白粉。挤压的作用使角蛋白在化学结构上和物理形态上均发生变化。角蛋白二硫键经挤压作用后发生降解,降解幅度达50%～60%。挤压法具备简便易行、易于连续化操作和投资少等优点,在食品工业、饲料行业等得到了广泛应用。
2.1.3 水解法
水解法是采用高温高压法对毛持续进行蒸煮,使胱氨酸中的二硫键被破坏。此工艺破坏了毛角蛋白的稳定空间结构,水解产物蛋白质含量不低于75%,为可被畜禽消化吸收的可溶性蛋白。
2.2 化学法制备角蛋白
较为成熟的毛发水解方法[5]主要包括酸碱法、还原法、氧化法、铜氨溶液法、金属盐法、微生物法和酶解法等。不同的水解方法,毛发角蛋白水解片断大小分布有所不同。
2.2.1 酸碱法
酸碱法是比较传统的提取角蛋白的方法。一般是先用酸预处理溶胀纤维,后在特定的温度下用碱溶解,过滤后收集滤液,再用等电点法提纯角蛋白。但是酸碱法会产生大量的碱性废水和废酸的蒸汽,污染环境。
2.2.2 还原法
用还原剂的碱性溶液将角蛋白中的二硫键(-S-S-)还原成巯基(-SH),制得可溶性角蛋白溶液。一般常用还原剂是巯基乙醇,它可以打开二硫键而不会使肽链断裂。
2.2.3 氧化法
Timmons等[6]选用氧化剂(如过氧乙酸、卤素、双氧水等)将角蛋白中的二硫键部分氧化成磺酸基团,使产物的亲水性增加。被部分氧化后的毛发经过干燥、研磨成粉,然后直接用浓硫酸或甲酸酸化至pH小于1,制得角蛋白溶液,进而制成膜。根据报道,这种角蛋白膜可用作包装材料、药物缓释膜等。
2.2.4 电化学还原法
此法溶解蛋白质较为新颖,通过使用电解槽氧化还原而有效地拆开角蛋白分子中的二硫键。阴极槽一般采用还原反应体系,含有巯基化合物,阳极槽是电解质溶液和稀硫酸,隔栅选用离子交换树脂膜材料。再经反渗透、甲酸溶液透析,就可获得角蛋白溶液。但是,这种方法过程繁琐,电解产物成分也复杂。
2.2.5 铜氨溶液法
铜氨溶液、铜乙二胺溶液等对分子间的氢键有很好的分解能力,但若要提高羊毛角蛋白的溶解,需添加一定浓度的还原剂,这样获得的角蛋白溶液浓度才不至于太低,角蛋白相对分子质量才会相对来说较高[7,8],且获得的角蛋白相对分子质量较高。另外,铜氨溶液也可作为纤维素很好的溶剂,将棉短绒等天然纤维素原料溶解在氢氧化铜或碱性铜盐的浓氨溶液中,配成纺丝溶液,经过一定的处理可使铜氨纤维素分子化合物发生分解而再生出纤维素,可用于毛发与纤维混纺材料的资源化再生利用。但是这种方法对蛋白质肽链的破坏程度很大,角蛋白相对分子质量不高。
2.2.6 金属盐法
选用氯化锌、溴化锌、氯化锂等具有拆开氢键能力的金属盐,这种方法一般用于再溶解毛发角蛋白质粉末或接枝共聚物。
3 羊毛角蛋白的应用
天然角蛋白的来源广,应用价值高。从毛发、动物的蹄壳中提取角蛋白不但可以回收角蛋白,而且可以减少角蛋白对环境的污染,在取得经济效益的同时也保护了环境。目前羊毛角蛋白溶液的应用主要有以下几种方式:碱法制得的角蛋白质溶液[9]蛋白多肽相对分子质量相对较低,制取纤维时还需要接枝其他的高聚物,这种方式可以制得蛋白含量低于40%的羊毛再生纤维;铜氨溶液法[10]主要用于毛/粘、毛/麻、毛/棉等混纺(合)品资源的再生利用,也可以获得蛋白含量不超过40%的蛋白/纤维素共混纤维;若采用金属盐法,则制得的蛋白相对分子质量非常高而且溶液黏度高,可以与其他的高聚物共混纺丝得到蛋白含量超过50%的共混纤维;若采用还原法则可以生产出蛋白含量不超过50%的蛋白共混纤维。当蛋白含量达到45%时,共混纤维的强度将是羊毛强度的2倍[11]。
提纯后的硬角蛋白质可以用作动物饲料的添加剂、毛定形整理剂、皮革功能性添加剂、纺织品亲水性和舒适性整理剂、羊皮革饰面剂[12]、重金属离子捕捉剂等。一般由于应用领域的不同会选择不同的方法来制备溶液。
3.1 在纺织领域的应用
如同丝素整理剂一样,提纯后的羊毛角蛋白也能作为亲水性整理剂用于合成纤维加工;使用还原方法制得的具有还原性的羊毛角蛋白质溶液,可以用于高卷曲羊毛、形状记忆羊毛纱、形状记忆羊毛织物等羊毛制品定形整理的加工;另外,角蛋白溶液还可以用于羊毛再生纤维的生产。羊毛角蛋白溶液的成纤维性极差,通常采用混合溶液的方式纺丝。Kazunori Katoh[13]等将制得的角蛋白与PVA通过湿法纺丝来制得角蛋白-PVA复合纤维。这种复合纤维不仅可以吸附有毒的甲醛气体和Ag+,而且还具备了合成纤维的力学性能[14]。湖北省纺织工业科学研究所用碱法来溶解羊毛,采用甲醛等做交联剂。但此方法制得的角蛋白质溶液存在一些缺点,浓度较低、蛋白质易变性、产业化成本高[11]。鄂尔多斯公司采用了与Kazunori Katoh的方法类似的再生角蛋白功能纤维的加工技术,并且将功能性分散液添加到纺丝溶液中使纺出的丝具有抗菌防静电等功能[15]。据有关报道称:2005年中国科学院工程研究所、四川宜宾五粮液集团有限公司关于“纳米抗菌生物蛋白纤维”的制备,将银系纳米抗菌粉均匀分散于角蛋白溶液和纤维素纺丝液的共混液中,采用粘接纺丝工艺制造出了抗菌功能性蛋白纤维[16]。
3.2 作为医用生物材料的研究
羊毛角蛋白由于其来源于动物体,因此具有较好的组织相容性,在医学领域中具有潜在的应用价值。有研究指出利用羊毛角蛋白作为伤口缝合线[17],与壳聚糖的复合材料相比具有更好的生物相容性。早在20世纪90年代,国外就有人在降解后的羊毛角蛋白溶液中加入葡萄糖氧化酶等生物活性物质,应用到纤维集合体的表面来制备生物传感器等生物材料,并获得了相关专利[18]。另外,将羊毛采用巯基乙醇还原法制得角蛋白高分子溶液,然后经过滤或透析,采用平板成膜法成膜,用于组织工程结构材料的研究[19]。还有研究将提纯后的角蛋白复合聚乳酸棒来作为承重骨内的固定材料,结果表明此材料具较高初始力学强度和早期降解速度缓慢等的优点[20]。超声波处理角蛋白溶液与甲苯的混合液,形成水包油型乳化体系,采用凝聚法制得以角蛋白为囊壁材料的微胶囊。此胶囊颗粒强度好,在沸水、二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中性质稳定,可以把油脂和染料等不溶于水的液体包裹其中[21],有作为药物缓释控系统中药用胶囊的可能性。
3.3 用作膜和包装材料的研究
制备角蛋白膜[22],一般是将毛发采用一定的化学方法水解成角蛋白溶液,然后平铺在塑料或玻璃板上,在一定条件下溶剂析出或水分蒸发后即可。但是用此种方法制得的膜弹性差,易断裂,不透气,不适合直接应用。通常会加入交联剂(如甲醛)或增塑剂(如甘油),来改善应用性能。
2004年,Tanabe[23]等在羊毛角蛋白溶液中加入壳聚糖制得复合膜,不仅提高了角蛋白膜的强度和柔韧性,还保留了良好的生物相容性,但不足的是壳聚糖在酸性和中性溶液中易膨胀。后来改换戊二醛作为交联剂,大大降低了复合膜在酸性和中性溶液中的膨胀性,而且在碱性溶液中其膨胀率也小很多。该角蛋白复合膜仍可进行细胞培养,但细胞吸附率低于角蛋白膜和壳聚糖角蛋白复合膜[24]。还可采用压铸方法成膜,即将角蛋白溶液或粉末直接放在热的压板上,高温高压下压制成角蛋白膜,与平板蒸发制成的膜相比,这种膜的强度、弹性和模量要好很多[25]。1997年Ingen[26]发明了一种利用角蛋白来制备热塑性材料的方法,主要方法是:先将角蛋白溶解,然后利用高温、高压的条件使角蛋白塑化,这种材料可被压制加工成各种形状,具有良好的抗水性和力学性能。
4 结语
动物蹄角蛋白分解菌的筛选与鉴定 篇7
1 材料与方法
1.1 土壤样品的采集
于沈阳市于洪区杨士屠宰场长期堆积猪蹄角的地方采集土样。
1.2 蹄角粉制备
去除蹄角上脂肪部分,取动物蹄角硬蛋白部分,用水洗净后用剪刀剪成小块状再将其磨成粉末,过60目筛。
1.3 培养基
1.3.1 富集培养基[4]
(1)细菌培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。(2)放线菌培养基:高氏一号培养基。(3)真菌培养基:马铃薯蔗糖琼脂培养基。CaC12·2H2O 0.2 g,NaCl 0.2 g,ZnSO4·7H2O 0.002 g,蹄角粉20 g,H2O 1 L。(3)NH4Cl 0.5 g,NaCl 0.5 g,K2HPO40.3 g,KH2PO40.4 g,MgCl2·6H2O 0.1 g,yeast extract 0.1 g,蹄角粉20 g/L,H2O 1 L。
1.3.2 发酵培养基[5]
(1)K2HPO41.5 g,MgSO4·7H2O0.025 g,CaC120.025g,FeSO4·7H2O 0.015 g,ZnS04·7H2O 0.005 g,蹄角粉20 g,H2O 1 L。(2)K2HPO41.0 g,KH2PO41.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,
pH约7～8,固体培养基是在(1)、(2)、(3)中加2%琼脂粉。
1.4 发酵培养
分装100 ml富集培养基于250 ml三角瓶中,接菌种一环,于30℃,转速180 r/min培养24 h。然后,分装100 ml分离培养基于250 ml三角瓶中,接1%富集培养液,30℃,转速180 r/min培养48 h[6]。
1.5 蹄角蛋白分解菌的富集、分离
1.5.1 富集
将取来的土壤放入培养皿中,加入块状蹄角,置于恒温箱中(30℃)培养,直至蹄角明显毁解(眼观察,约20～30 d)。把毁解的蹄角分别转移至3种发酵培养液中,分别加入新的蹄角,再将其放置于恒温(30℃)摇床中培养,直至新的蹄角明显毁解(肉眼观察)。如此重复3～4次,可以获得3种不同的角蛋白分解菌富集培养物。
1.5.2 分离
将3种不同的分解菌富集培养物各取0.5 ml,分别加到固体分离培养基中并用玻璃棒涂平,每种做3个重复。待长出菌后,分别挑取单菌落并采用平板划线法进行分离纯化,最后将分离出的菌种分别进行斜面保存并加以命名[7]。
1.6 筛选
1.6.1 干物质测定法
将分离出的各个菌株按“1.4”进行发酵培养。培养前的蹄角粉经105℃数小时烘干至衡重后称其质量,培养后菌液经过滤后将不溶物质105℃数小时烘干至衡重后称其质量。计算出蹄角蛋白分解率后比较,分解率高的菌种为优势菌。蹄角角蛋白分解率=(培养前蹄角粉干重-培养后蹄角粉干重)/培养前蹄角粉干重
1.6.2 产物(可溶性蛋白)测定法
将分离出的各个菌株分别在各自的发酵培养液中按“1.4”进行培养(3个重复),每天分别取菌液1 ml,加蒸馏水19 ml,混匀,以光程为1 cm的石英比色杯,在260 nm、280 nm处测定紫外吸收光密度OD260nm、OD280nm,并利用公式计算出待测溶液的蛋白质浓度。绘制出蛋白浓度随天数变化的曲线后比较,蛋白浓度明显升高的为优势菌株。
蹄角蛋白分解率=(最终菌液蛋白质浓度-最初菌液蛋白浓度)×菌液体积/蹄角蛋白质量;
蛋白质浓度(mg/ml)=20×(1.45 OD280nm-0.74OD260nm)[8]
式中:OD280 nm──蛋白质溶液在280 nm下测得的光密度值;
OD260 nm──蛋白质溶液在260 nm下测得的光密度值;
20──菌液被稀释了20倍。
1.7 角蛋白分解菌菌株的鉴定
1.7.1 拮抗细菌菌株的生物学鉴定
按参考文献[4,9]进行细菌培养、形态学观察、革兰氏染色、芽孢染色。
1.7.2 拮抗细菌菌株的分子生物学鉴定
将纯化后的菌种委托大连宝生物技术有限公司进行分子生物学测定,并将该菌的16S rDNA序列与Gene Bank数据库进行比对。
2 结果与讨论
2.1 角蛋白分解菌的富集、分离与筛选
经过富集、分离之后,共得到细菌4株、放线菌1株、真菌3株。分别命名为1A、2A、3A、4A、1B、1C、2C、3C。求出各菌液蛋白浓度平均数后绘制曲线,如图1。
从图1中可以看出2A菌株的培养液中蛋白浓度明显高于其他菌液,说明2A菌可以有效分解蹄角角蛋白。第6天时,菌液中蛋白浓度高达14.7 mg/ml,通过计算得出分解率为68.7%。
将2A菌液剩余部分过滤后烘干,称量干物质质量为0.667 2 g。通过计算得出分解率为66.7%,与紫外分光光度计法测蛋白浓度结果基本相符。
2.2 菌种鉴定
2.2.1 生物学鉴定
此菌在牛肉膏培养基上生长良好,菌落生长前期边缘整齐,有粘性荚膜;后期出现褶皱,白色至淡黄色。革兰氏染色呈阳性,直杆状,两端稍圆,含中生圆或椭圆形芽孢。
2.2.2 16Sr DNA分子水平鉴定
序列测定为1 463bp,见图2。在NCBI上进行序列比对,扩增序列与Bacillus subtilis的16SrDNA的同源性为99%。
注:M,DL2 000 DNA Mar ker;1,CTC200-CY-PCR产物;+,阳性对照;-:隐性对照。
3 结论与讨论
本试验综合运用了多种成型的筛菌方法并进行比较和改进,成功地从土壤中筛选出动物蹄角蛋白的优势分解菌。此菌的培养条件温和,营养简单,分解蹄角蛋白效率高,又是自然界广泛存在的非致病菌,对人畜无害,不污染环境,因此很适合用于工业降解蹄角蛋白。利用形态学观察、生理生化鉴定和16SrDNA分子水平鉴定此菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
有关菌株在分解动物蹄角蛋白时的条件优化,以及利用此菌种产生相关酶化合物都需做进一步的研究。
摘要：本试验采用产物测定法,在特定土壤中分离得到一株能够有效分解动物蹄角蛋白的菌株,该菌株在30℃条件下培养3d,对蹄角蛋白的分解率可以达到45.35%。通过形态学观察、生理生化特征及16SrDNA序列分析,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
关键词：蹄角蛋白,蹄角蛋白降解菌,枯草芽孢杆菌
参考文献
[1]梁建东,韩燕峰,梁宗琦,等.蛋白酶耐热金孢菌的初筛研究[J].菌物研究,2007,4:210-213.
[2]谭盈盈,冯继勤,郑平.拟青霉菌株Z-1降解羽毛角蛋白特性的研究[J].浙江大学学报,2005,31(1):82-87.
[3]Bernal Cairo,Coello Oliver.Purification and characteri-zation of a novel exocellular keratinase from Kocuria rosea[J].Enzyme Microbial Technol,2006,38:49-54.
[4]周德庆.微生物学实验教程[M].北京:高等教育出版社,2006,45-60.
[5]谭盈盈.角蛋白废物微生物水解技术的研究[D].浙江大学,2003,82-87.
[6]Grazziotin Mel,Pimentel Jong,E V,et al.Nutritional im-provement of feather protein by treatment with microbial keratinase[J].Animal Feal Science Technol,2006,126:135-144.
[7]蔡成岗.角蛋白酶生产菌株选育、发酵与分离纯化研究[D].浙江大学,2007,17-19.
[8]吕淑霞.基础生物化学实验指导[M].北京:中国农业出版社,2003,58-61.