艾美尔球虫（共7篇）
艾美尔球虫 篇1
鸡球虫病中柔嫩艾美耳球虫是致病性最强, 危害最为严重的一个种。目前对该病的防治仍以化学合成药及抗生素为主, 但随着化药在禽产品中人残留对日益受到关注, 人们开始寻找新的防治鸡球虫病的途径。中草药作为抗寄生虫药物历史悠久, 且效果显著。许多中药对鸡球虫病都有防治效果, 加上其毒副作用小、不易产生耐药性和药物残留等优点, 在人们关注“绿色”食品的今天, 中药防治球虫病会有更广阔的前景。
为了避免因化药残留对人体造成的危害, 减少球虫病给养鸡业造成的经济损失。我们在总结国内外有关中药防治球虫病研究资料的基础上, 根据鸡球虫病的特点, 用中药对球虫卵囊进行孢子化抑制试验, 从而选出对球虫卵囊孢子化抑制效果较好的药物作为主药, 根据中兽医辨证论治原则组成三个方剂, 用于研究人工感染柔嫩艾美耳球虫试验。
1 试验材料
1日龄健康的罗曼蛋用雏鸡300只 (由北京正大蛋业有限公司提供) , 分笼饲养, 按NRC (1994) 禽的营养标准, 自配无抗球虫药的饲料, 让鸡只自由采食、饮水。
青蒿、白头翁、黄柏、甘草、仙鹤草、黄芩、常山、柴胡、黄连、肉桂等中药 (购于河北安国市药材市场) , 各味中药为药厂代加工, 粉碎过40目筛按组方混合均匀。
重铬酸钾 (南京化学试剂有限公司, 批号:140201) , 离心机 (北京雷勃尔离心机有限公司) , 生物显微镜 (XS-213型, 江南光学仪器厂) , 恒温振荡器, 电热恒温培养箱 (DH-250, 北京科伟永兴仪器有限公司) ;全球 (0.5%的地克珠利, 购于河北北方牧业科技有限公司, 批号:20131226) ;柔嫩艾美尔球虫卵囊 (由中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所提供) , 试验前人工感染无球虫鸡继代1次, 获得试验用卵囊, 29℃孢子化, 4℃保存备用。
2 试验方法
2.1 药物分组
依据中药的有效成分和精简高效的原则选用了10味中药, 组成三个中药方剂, 通过观察治疗球虫病的临床效果, 进行抗球虫方剂的筛选试验。见表1。
2.2 动物处理及分组
在雏鸡13日龄时, 选取体重相近 (体重差别不超过±5g) 并经前期临床观察确认为健康的雏鸡240只, 随机分为12组 (Ⅰ一Ⅻ) , 每组20只。Ⅰ一Ⅸ组为中药组 (三个方剂的三个浓度:1.5%、2%、3%) , Ⅹ组为地克珠利 (全球) 对照组 (1%添加量) , Ⅺ组为感染不给药对照组, Ⅻ组为不感染不给药对照组。分组当天在对应组饲料中添加药物, 并于15日龄时对I-Ⅻ组雏鸡经口感染柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊4.0×105个/只, 感染后第8天将鸡全部捕杀剖检。
2.3 临床观察
接种球虫后观察和记录各组鸡的发病情况, 临床症状。感染后第4天开始每天检查粪便, 记录血粪情况, 直至扑杀。第4~8天进行克粪卵囊计数, 并对所有死亡鸡剖检, 重点检查盲肠病变。统计成活率、增重率、病变值、卵囊值等, 计算抗球虫指数。
2.4 疗效考核指标
相对增重率 (%) =感染投药组的平均增重/不感染不投药组的平均增重×100%。
存活率 (%) =[ (组内总鸡数一每组因感染球虫死亡的鸡数) /组内总鸡数]×100%。
血便记分。接种卵囊后第4、5、6、7、8天, 参照Morehouse和Baron的标准记分。0分:100%粪便不带血;1分:1%~25%粪便带血;2分:26%~50%粪便带血;3分:51%~75%粪便带斑;4分:76%~100%粪便带血。
病变记分。参照Johnson和Reid的标准, 根据剖检后肠道病变的严重程度记分。0分:无肉眼病变;1分:盲肠壁有很少散在的瘀点, 肠壁不增厚, 内容物正常;2分:病变数量较多, 盲肠内容物明显带血, 盲肠壁稍增厚, 内容物正常;3分:盲肠内有多量血液和肠芯, 血凝块可见灰白色干酪样的香蕉型块状物, 盲肠壁明显增厚盲肠中粪便含量少;4分:盲肠中充满大量的血液和肠芯, 盲肠肿大, 肠芯中含有粪渣或不舍;因球虫感染死亡鸡也记为4分。病变值=每组平均病变记分×10。
在球虫感染后第4天至第8天收集粪便, 按照Mc Master’S法计算克粪便卵囊数。方法:将收集的粪便搅匀后, 称取2g, 加适量饱和食盐水搅匀, 用60目网筛充分过滤。将滤液稀释至60ml, 然后用麦氏计数板记数, 最后求其平均值。如果卵囊的数量太多, 则按照梯度稀释, 然后计数, 再乘以稀释倍数 (抗球虫指数 (ACI) 采用默克公司的标准计算抗球虫指数) 。
抗球虫指数 (ACI) = (相对增重率+存活率) 一 (病变值+卵囊值)
药效判定标准为:ACI小于120, 判疗效差;ACI为120~160, 判疗效中等;ACI为160~180, 判疗效良好;ACI大于180, 判疗效优秀。
3 试验结果
接种球虫后第4天, 球虫感染组鸡只均不同程度出现临床症状, 如精神状况差、沉郁、嗜睡、采食量减少等。感染后第5、6天, 感染不给药鸡排出大最的血便, 中药组和地克珠利组血便记分均低于感染不给药组, 第7天血便减少, 其中, 中药组与化学药物对照组的血便记分最低 (见表2) 。
在接种后的第4天晚上, 第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ组分别有1只鸡死亡, 第5~8天试验组均有鸡只死亡, 其中6、7天死亡最严重, 中药组和地克珠利组的鸡只死亡率均低于感染不给药组, 其中中药Ⅲ组的死亡率最低, 比阳性对照组低25个百分点 (见表3) 。
在球虫感染后第8天, 剖杀试验鸡, 取出盲肠内容物, 按照Mc Master’s法计数克粪便卵囊数 (OPG) 。根据盲肠内容物的OPG值, 即每1g粪便中的卵囊数 (柔嫩×106) , 按角田清方法换算卵囊值。当OPG值为0~0.1时, 卵囊值为0;当OPG值为0.11~1.时, 卵囊值为1;当OPG值为1.1~1.9时, 卵囊值为10;当OPG值为2.0~5.9时, 卵囊值为20;当OPG值为6.0~10.9时, 卵囊值为20;当OPG值≥11.0时, 卵囊值为40。通过盲肠内容物中卵囊数量的检查发现, 不感染不给药组未见有卵囊, 所有球虫感染给药组盲肠内容物中的卵囊数量均低于感染不给药组, 其中以中药Ⅲ组卵囊数量最低, 仅为0.315×106个/g粪便。
试验表明, 三个方剂都有一定的抗球虫效果, 而以方剂一和方剂二高浓度 (3%添加量) 的抗球虫效果为良好;其他浓度的抗球虫效果均为中等;方剂一3%添加量的抗球虫指数为170.8, 较地克珠利组高出34.5个百分点, 比感染不给组高出102.9个百分点。详细结果见表4。
4 讨论与小结
试验表明, 3个中药方剂都有一定的抗球虫作用。接种球虫给中药能够降低球虫感染鸡的死亡率, 减少粪便中球虫卵囊的排出量, 提高鸡只的增重率。在抗球虫指数方面, 三个方剂中, 方剂一和方剂二高浓度的抗球虫效果为良好, 方剂三高浓度的抗球虫效果为中等, 其他浓度抗球虫效果均为中等, 其中以方剂一3%添加量的抗球虫指数为170.8, 方剂三低浓度 (1.5%添加量) 的抗球虫效果虽然较差, 但也有一定的抗球虫作用。
方剂二和三中只有一种抗球虫病的草药, 并以消炎止泻为主, 抗球虫效果不是很明显。由于中药药物繁多, 要筛选抗球虫作用良好的中药方剂还需要在不断总结经验的基础上进行更广泛试验研究。
本试验中感染不给药组的存活率为65%, 相对增重率为50.2%, 卵囊值为10, 病变值达21, ACI仅为84.2。说明本试验所用的球虫卵囊有较强的侵袭能力和致病力。
地克珠利的抗球虫指数偏低, 可能因为此类药用的较多, 已经出现耐药性, 再加之加工工艺的差异等方面的原因。
参考文献
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艾美尔球虫 篇2
1 材料与方法
1.1 试验材料
柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊由本实验室培育, 于2.5%重铬酸钾溶液4℃环境中保存。柔嫩艾美尔球虫SAG2基因重组卡介苗p MV361-SAG2为本实验室构建并保存。预防所用卡介苗 (BCG) 购自长春生物制品研究所。160只1日龄海兰白公雏鸡购自长春市农科院种鸡场, 所用饲料经80℃烘烤2 h且未添加任何抗球虫药物及抗生素。
1.2 主要试剂
PE标记的CD4+和FITC标记的CD8+鼠抗鸡单抗均购于Southen Biotech Associates, Inc。HRP标记的兔抗鸡Ig G购于北京鼎国生物技术有限公司。鸡抗柔嫩艾美尔球虫阳性和阴性血清均由本实验室制备。其他试剂均为国产或进口分析纯产品。
1.3 试验方法
1.3.1 柔嫩艾美尔球虫重组卡介苗p MV361-SAG2的制备
将本实验室成功构建并保存的含有SAG2基因的重组卡介苗p MV361-SAG2接种于新配置的MB液体培养基中, 于37℃条件下培养20 d至对数生长期, 4 000 rpm离心10 min后, 以灭菌生理盐水按相同方式反复洗涤目标菌液2次, 并最终重悬于生理盐水中以备动物试验使用。
1.3.2 免疫程序的设计
将购进的1日龄160只雏鸡饲养于干净清洁的环境中自由采食。7日龄时确认无感染球虫情况下随机分成8组, 每组20只, 如表1所示定期定量进行免疫[5], 免疫后第35天口服攻虫。
1.3.3 免疫效果评价
1.3.3. 1 检测体液免疫水平
在雏鸡7、14、28日龄免疫前, 以及雏鸡35日龄攻虫前, 每组随机抽取5只鸡分别进行心脏采血, 以3 000 rpm离心10 min并于-20℃保存血清, 以备日后分析。
本试验采用间接ELISA法对血清中Ig G水平进行动态监测。以包被液将纯化超声破碎好的柔嫩艾美尔球虫稀释至10μg/m L包被反应板, 采用方阵滴定法确定最佳的包被浓度和阳性血清的最佳稀释度, 用PBS将HRP标记的兔抗鸡作1:1 000稀释以检测抗体, 通过酶联免疫检测仪测于490 nm波长处的OD值, 检测结果中P/N值大于2.0的血清均判定为阳性。
1.3.3. 2 检测细胞免疫水平
按照免疫程序的设计, 三次免疫后 (攻虫前) , 随机从各组抽选出5只35日龄鸡, 放血处死后无菌取脾, 通过研磨获取106/m L单细胞悬液, 将PE标记的CD4+和FITC标记的CD8+抗体分别加入100μL所制的细胞悬液中, 避光作用1 h, 经清洗液清洗2次后, 通过流式细胞仪分别检测T细胞亚群情况, 获取并记录CD4+、CD8+T淋巴细胞数量, 而后以Graph Pad Prism5.0对数据进行统计分析。
1.3.3. 3 检测卵囊数
每天检查攻虫后各组鸡粪便情况, 将剖杀后各组鸡盲肠内容物分别混合均匀, 依据内容物重量及鸡的数量计算出各组平均的克盲肠排出卵囊数 (OPG) , 从而计算保护率与卵囊值。
保护率=[ (D组卵囊数-试验组卵囊数) /D组卵囊数]×100%
1.3.3. 4 检测盲肠病变记分
攻虫7 d后各组随机抽取5只鸡进行剖杀, 依据Johnson和Reid所设计的标准对各组鸡盲肠病变进行评定记分[6], 病变分五个等级:无病变记0分;内容物正常, 肠壁不增厚但存在少量瘀点记1分;内容物带血, 肠壁增厚且病变处较多记2分;内容物量少且存在较多血液、血块或灰白干酪样块状物, 肠壁明显增厚记3分;肠道仅有粪渣或充满大量血液, 肠壁增厚肿大严重, 甚至死亡记4分。两侧盲肠以病变较重侧为准。而后进一步计算各组相对病变记分, 公式如下:相对病变= (试验组病变记分/D组病变记分) ×100%
1.3.3. 5 观察增重效果及计算抗球虫指数 (ACI)
每组随机选取1 0只鸡进行编号, 攻虫前及攻虫后12 d分别观察并记录体重变化情况, 计算相应的平均增重及相对增重, 再根据其他多项参数, 计算出抗球虫指数 (ACI) [7], 当ACI数值大于180时表示保护效果显著, 数值介于160~179范围内表示保护效果一般, 小于160表示无保护效果, 相应计算公式如下:
2 结果
2.1 体液免疫水平
间接ELISA法检测结果如图1所示, 免疫前 (7 d) 及一免后 (14 d) 各组鸡抗体效价差异不明显 (p>0.05) 。二免后 (28 d) p MV361-SAG2滴鼻和口服免疫组相比空白对照组均表现出一定水平的抗体效价, 差异显著 (p<0.05) 。三免后 (35 d) 滴鼻、口服和颈部皮下注射p MV361-SAG2试验组与H组相比差异极显著 (p<0.01) , 而在所有试验组中p MV361-SAG2滴鼻免疫组OD490nm吸光度最高。
2.2 细胞免疫水平
流式细胞仪检测各组T淋巴细胞亚群的数量显示, 各试验组与E对照组相比, CD4+和CD8+数值变化极显著 (p<0.01) , 且相比其他组别, p MV361-SAG2免疫组T淋巴细胞亚群水平相对较高。
2.3 盲肠病变记分、卵囊数及增重效果
攻虫后第5天, D组鸡表现出精神不振, 食量下降, 羽毛松立, 血便, 腹泻等症状, 而其它免疫组相比精神状态较好, 个别存在便血症状。依据盲肠病变记分结果显示, 免疫组均可不同程度的使病变减弱, 且与对照组相比差异显著 (p<0.05) 。而从所检卵囊数结果显示p MV361-SAG2滴鼻组与BCG滴鼻组效果最佳。根据攻虫前后体重变化情况, 可知免疫p MV361-SAG2的三组和BCG滴鼻组体重增长与D对照组相比差异极显著 (p<0.01) , 且p MV361-SAG2滴鼻组效果最佳。具体情况见表3。
2.4 抗球虫指数 (ACI)
依据多项数据计算得出抗球虫指数 (ACI) 结果如表4所示, 可以看出, p MV361-SAG2滴鼻组ACI大于180, 说明保护效果良好, p MV361-SAG2口服及颈部皮下注射组、BCG滴鼻组ACI介于179~160之间, 说明保护效果一般。
3 讨论
卡介苗作为一种减毒苗是表达外源基因的理想活菌载体, 可视为一种非特异性免疫增强剂和佐剂, 能够诱导体液及细胞免疫应答[8]。重组卡介苗的研制对预防鸡球虫病展开了新的探索与尝试, 也为禽类其他疾病的防治提供一种新思路[9]。
本研究利用已成功构建出的r BCG (p MV361-SAG2) 疫苗免疫雏鸡, 按照试验设计, 将重组卡介苗和卡介苗分别以滴鼻、口服及颈部皮下注射这三种方式进行免疫, 而后通过间接ELISA法对各组免疫后血清中Ig G进行检测, 同时采用流式细胞术对各组鸡脾脏中CD4+和CD8+T淋巴细胞进行检测, 结果显示相比卡介苗免疫组及对照组, 所构建的重组卡介苗免疫组能够显著提升机体体液及细胞免疫水平。攻虫试验后, 主要采用四项参数对免疫保护效果进行评价, 分别为存活率、相对增重、病变值以及卵囊值, 经计算以代数关系ACI进行表示, 其中r BCG (p MV361-SAG2) 滴鼻免疫组表现最优, 保护效果明显, 而r BCG口服和颈部皮下注射免疫组, BCG滴鼻免疫组显示出的保护效果一般, 其余组别无保护效果。
综上, 本试验证明了所构建的r BCG (p MV361-SAG2) 疫苗在实验室条件下具有增强鸡抵抗柔嫩艾美尔球虫的免疫保护功效, 且当以滴鼻的方式进行免疫时效果最佳。但客观而言, 气候条件、饲养方式以及洁净程度等方面的不同, 导致实际的生产活动与实验室环境存在不可忽略的差距, 加之实际养殖中还要为预防各种流行性传染病而进行多种免疫, 这些不定的内外因素是否会影响重组卡介苗在应用过程中的免疫保护效果, 且影响程度如何, 还有待于日后进一步的研究。
参考文献
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巨型艾美耳球虫研究之回顾 篇3
1 生物学特性方面
1.1 形态学研究
《禽病学》第九版列出卵囊大小为 (21.5~42.5) μm× (16.5~29.8) μm, 平均30.5μm×20.7μm;《球虫生物学》中指出卵囊大小为 (21~42) μm× (16~30) μm;《鸡球虫病学》中所列卵囊大小为 (21.5~42.5) μm× (16.5~29.5) μm, 孢子囊为 (15~19) μm× (8~9) μm。E.maxima卵囊和孢子囊大小及形状指数在国内外其它文献报道中也不尽一致。
1.2 生活史研究
1.2.1 最短孢子化时间和最短潜在期
关于孢子发育的最早时间, 文献记录多为28~32h, 个别的2d。Tacla (1967) 认为最短孢子化时间为30h;Norton等 (1983) 报道最短孢子化时间为28.5h;徐卫东等 (1994) 认为最短孢子化时间为28h;黄兵等 (1995) 认为最短孢子化时间为30h。
文献对E.maxima潜在期的记录多为120~134h, 个别的6d。Bhatia和Pande (1968) 认为最短潜在期为121h;徐卫东等 (1994) 认为最短潜在期126±0.15h;黄兵等 (1995) 认为最短潜在期为142h。
1.2.2 内生性发育史
1.2.2. 1 关于E.maxima裂殖生殖
关于E.maxima在鸡体内的发育有不同的报道, 主要的差异是裂殖生殖代数及产生的裂殖子数量。Tyzzer、Long (1959) 、Bhatia和Pande (1968) 认为只有1代裂殖生殖, 裂殖体仅含8~16个裂殖子。而Johnson (1938) 、Edgar (1955) 、Scholtyseck (1959, 1963) 、Davis (1963) 、Challey和Johnson (1868) 等认为有两代裂殖生殖, 大部分裂殖子出现在感染后4~5d。其中Scholtyseck观察到两代裂殖体的大小相近, 为10μm×8μm, 内含8~16个裂殖子, 而Challey等观察到感染后48h出现第1代裂殖体, 内含约25~50个裂殖子, 感染后72h出现第2代裂殖体, 内含约8~12个裂殖子。Millard (1972) 、Le Vine (1985) 、查红波 (1998) 、的报道认为有3代裂殖生殖, 其中Millard等 (1972) 观察到感染后24~48 h进行第1代裂殖生殖, 裂殖体大小为 (13~21) μm× (7~13) μm, 平均16μm×10μm, 内含25个长为5μm~8μm的第1代裂殖子, 感染后48~72h进行第2代裂殖生殖, 裂殖体大小为12μm×12μm, 内含8~12个裂殖子, 感染后72~96h进行第3代裂殖生殖, 裂殖体大小与第2代的相近。Mc Donald (1986) 等认为至少有4代裂殖生殖, 但对各代未做详述。
1.2.2. 2 关于E.maxima配子生殖和卵囊壁的形成
Ball等 (1981) 观察了E.maxima小配子体的结构和形成过程, 起始, 染色质核仁消失, 小配子体表面凹陷, 随后染色质凝聚分布在核仁的周围, 与此同时鞭毛形成并从突起长入带虫空泡和内部凹陷中, 最后核仁变的更加浓密, 从小配子体的边缘突起。成熟小配子体的表面由大量的相距很近的鞭毛覆盖。球虫小配子发育具有相同的模式, 可分为两个阶段: (1) 生长阶段, 在此阶段配子体的体积增大, 发生与裂殖生殖相似的核分裂, (2) 小配子的实际形成和分化阶段。
在裂殖子转变为椭圆形或圆形之后, 年轻的大配子体可以同小配子体相区别, 因为大配子体拥有1个增大的细胞核和明显的嗜锇酸的核仁。Speer和Hammond第一次证明了大配子体是能够运动的, 他们观察到E.maxima的大配子体以阿米巴方式运动而通过细胞浆, 他们还发现大配子体在细胞浆中离开清晰的通路, 间或穿过细胞, 进入邻近的细胞。Mehlhorn等报道E.maxima的配子体在0.2μm的面积上有5个微孔。在其随后的研究中, 其又指出在E.maxima大配子体发育的早期, 裂殖子表膜的外2层膜仍保留。Pittilo等 (1980) 的研究也证实了这一点。但他进一步指出E.maxima配子体表面被覆的2层表膜, 其在配子体整个发育过程始终存在。
大配子体在带虫空泡中发育, 带虫空泡中存在大量的泡内小管, 其围绕大配子体周围延伸一端距离, 有时还可看到泡内小管和虫体胞膜直接连接。在发育过程中, 电子透明小泡被从大配子体的外面被掐断。大配子体最典型的特征是存在成壁体, 包括成壁体Ⅰ和成壁体Ⅱ, 成壁体Ⅰ其电子致密, 在发育中似乎有两种形式的成壁体Ⅰ, 一种嗜锇酸性比另一种弱, 成壁体Ⅱ围绕在粗面内质网周围, 其出现比成壁体Ⅰ要早。
随着进一步的发育, 大配子体的体积增大, 当它成熟时就发育成大配子。大配子通常含有一个核, 然而Speer发现E.maxima大配子是多核的。大小配子受精导致合子的出现, 成熟大配子和年轻的合子是不能区分的, 但合子很快会发生细胞质的变化, 其标志是卵囊壁形成的开始。卵囊壁外层由位于卵囊表面的成壁体Ⅰ释放的内容物形成, 外层电子致密, 起始是在外表上是一样的, 但后来发展成两个区域, 一个外层无定形区和一个内层嗜锇酸区。随后分散在卵囊外壁和限制膜之间的成壁体II出现形成电子透明的内层。其卵囊壁的形成表现为膜形成体、成壁体Ⅰ和成壁体Ⅱ内容物连续释放的过程, 其过程可能被粗面内质网或高尔基体所控制。
1.2.2. 3 子孢子的发育
Pittilo等 (1985) 指出E.maxima孢子生殖开始于被一层膜限制的细胞质团块收缩时, 在29℃到9h时, 被多糖颗粒围绕的密体被用于合子的限制膜, 到12h时, 核已经发生分裂, 到15h时, 可以观察到成孢子细胞, 子孢子形成发生于21~30h。
1.3 致病性研究
1.3.1 E.maxima感染对宿主的病理生理学影响
球虫感染可以引起鸡体内发生一系列病理生理学变化, 包括组织、器官生理常数及血液成分的改变, 某些物质及元素代谢的异常和内分泌系统功能的变化等。
1.3.1. 1 对肠道生理常数的影响
E.maxima的寄生可降低小肠的收缩力, 使鸡肠道渗透性增加, 这可能与MMC释放胺类物质有关。查红波等 (1997) 研究了感染E.maxima后空肠组织组织胺含量的变化, 指出HA与E.maxima的致病作用可能有关。
1.3.1. 2 对肠道pH值和吸收能力的影响
E.maxima感染期间肠道的pH值下降, pH下降最多的是在肠道感染最严重区域, 相反却能影响肠道对维生素的吸收能力, 使血液中胡萝卜素的水平降低。与感染E.necatrix的鸡的鸡相比较, 感染E.maxima对葡萄糖的吸收抑制较少。感染E.maxima后7d的鸡与对照鸡相比整个小肠对葡萄糖和L-甲硫氨酸的吸收显著降低。
1.3.1. 3 对鸡体内能量物质的影响
E.maxima感染鸡的胰脏重量减轻, 胰脏和表面黏膜中的淀粉酶活性全面下降。在E.maxima急性感染期, 肝糖原和血浆蛋白浓度下降, 而血浆葡萄糖、游离脂肪酸、尿酸和胸肌、心肌糖原变化不大。
1.3.1. 4 对鸡血液成分和浓度的影响
雏鸡E.maxima感染后, 白细胞数升高, 红细胞数、血红蛋白含量、血清白蛋白总量及血浆蛋白总量 (主要是白蛋白和α1-球蛋白) 明显降低, 而α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白都没有变化。鸡感染E.maxima后第6天血清碱性磷酸酶活性明显低于对照组, 且感染量越大, 病变记分越严重, 酶活力降低越明显。第3、5、7、9、11天时血清谷丙转氨酶活性升高, 碱性磷酸酶活性则明显降低。但E.maxima感染对血脂的影响不一, 有人认为血脂水平降低, 也有人认为对血脂水平没有影响。
1.3.1. 5 对激素的影响
E.maxima感染后可使血浆中甲状腺素 (T4) 和三碘甲腺原氨酸 (T3) 浓度降低, 促乳素浓度增加, 但对生长素和皮质酮浓度没影响。
1.3.2 E.maxima感染宿主的临诊表现和病变
球虫对宿主的致病性取决于球虫内生性发育的部位, 致病作用主要是机械破坏。众多研究证明E.maxima致病力属轻度至中度。E.maxima感染时, 直至感染后第4天完全见不到变化, 第5天见轻度下痢, 从第6天起出现与堆型艾美耳球虫 (Eimeria acervulina) 感染相同的症状, 但是第6天后, E.maxima感染出现排泄带黏液粪便的症状较多, 有时出现轻微血便。其病变表现为与肠壁增厚相关的严重出血性肠炎, 可能呈现某种程度的气胀, 肠内容物呈褐色。橘黄色, 粉色或红褐色, 而且包括粘性非常大的黏液分泌物。
1.3.3 E.maxima的毒力
E.maxima毒力的强弱取决于虫株, 但宿主环境和外界环境对卵囊的毒力有很大影响, 常可导致毒力的改变, 继而导致其致病力的巨大变化。如通过早熟选育和理化处理, 可显著降低E.maxima毒株的毒力, 但其仍然保持良好的免疫原性, 可用来研制球虫弱毒苗。
2 免疫学特性方面
2.1 E.maxima的免疫原性
在各种鸡球虫中, E.maxima的免疫原性最强, 接种E.maxima 1个卵囊, 甚至是1个孢子囊, 机体便可产生明显抗攻毒感染的抵抗力。一次适宜接种, 便可使鸡体产生抗同源E.maxima虫株再感染的几乎完全保护力 (>99.99) 。E.maxima其不同发育阶段的免疫原性强弱也不一样, 其早期内生发育 (尤其是第2代裂殖生殖阶段) 引起宿主很强的兔疫, 而其他阶段则很弱, 但是配子生殖阶段受保护性免疫影响最明显。
2.2 与其他种的交叉免疫反应
一般认为不同种的艾美耳球虫的免疫反应是特异的, 无虫种间的交叉免疫。但近年来, 不断有文章报道E.maxima和某些虫种之间有血清学的交叉反应和交叉保护反应。
2.3 E.maxima的抗原变异
有证据表明, 在各种鸡球虫中, E.maxima的抗原变异最显著, 攻虫与产生卵囊数量间的相关程度有时仅为10%, 在田间可因E.maxima免疫变异株的出现导致疫苗免疫失败。E.maxima不同的群, 包括野外分离株, 呈现连续的抗原多样性。而且这种变异似乎是稳定的, 不随时间推移而改变, 这与其他发生抗原变异的原虫明显不同。
2.4 E.maxima的保护性免疫机制
2.4.1 细胞免疫研究
众多学者一致认为T细胞免疫反应在球虫免疫应答中处于核心地位。如Talebi (1995) 在鸡感染E.maxima后用全血T淋巴细胞转化试验检测鸡外周血中T淋巴细胞活性变化, 发现感染后一周T淋巴细胞活性明显增强, 第2周时急剧上升到顶峰, 第3周时开始下降。查红波等 (1998) 通过给予鸡地塞松抑制T细胞活性, 表明地塞米松处理可损伤鸡抗E.maxima再感染的免疫力。这提示了CD8+T细胞、γ-IFN及IL-2等在抗E.maxima再感染中的作用。
E.maxima主要寄生部位在小肠中部, 因此有必要研究鸡肠道的淋巴细胞在抗鸡球虫中的作用。鸡肠道广泛分布有肠上皮间淋巴细胞和固有层淋巴细胞 (LPL) , i IELs是由B细胞、T细胞和NK细胞组成的细胞群, 但其中主要为CD8+T细胞, LPL中细胞主要为CD4+T细胞。Rothwell等 (1995) 用免疫组化ABC法检测鸡感染E.maxima后肠道中肥IELs与LPLs中CD3+、CD4+、CD8+、TCR1+、TCR2+细胞数量的变化, 发现初次感染后LPLs中CD4+淋巴细胞迅速反应, 而在再次感染中反应不大, CD4+T淋巳细胞主要存在于LPLs中。CD8+T淋巴细胞初次感染后反应速度略慢于CD4+T淋巴细胞的反应, 但是增殖的数量多, 反应剧烈, 在LPLs中的反应比IELs中的迅速;在再次感染中在IELs中的反应明显。整个反应过程中产生的CD8+T淋巴细胞比CD4+T淋巴细胞数量多。程金科等 (1995) 在观察到雏鸡初次感染E.maxima卵囊后, 盲肠扁桃体中T淋巴细胞数量显著增加, 肠上皮间淋巴细胞在初次感染后于球虫内生性发育未期阶段显著增多, 而再次感染时IEL即刻显著反应。该结果表明, 无论T细胞还是IEL, 在肠道淋巴细胞抗球虫的免疫应答中, 都可能起着十分重要的作用。
CD4+T细胞、CD8+T细胞等可通过释放细胞因子在鸡球虫保护性免疫中起作用。细胞因子多数在体内或体外有抑杀球虫的作用, 有的则可能加剧球虫感染的病理损伤程度, 有的可能兼具病理损伤和兔疫生理的双重作用。Byrnes等 (1993) 分离自E.tenella或E.maxima感染鸡的肝脏巨噬细胞与大肠杆茵内毒素脂多糖一起培养, 产生的α-TNF量要高于未感染鸡。Yun CH等在E.maxima感染后8d和10d, 通过ELISA检测到鸡血清中INF-γ含量极显著升高, 而且, 血清中的INF-γ水平与粪便中卵囊产量呈明显的正相关 (γ2=0.97) 。可见, 球虫在内生性发育过程中兔疫细胞不断受到球虫抗原刺激而使INF-γ的产生逐渐增多。
2.4.2 体液免疫研究
虽然抗E.maxima免疫以细胞介导免疫为主, 但在球虫感染期间出现血清抗体及Ig A, 提示不能排除抗体在抗球虫免疫中起到辅助作用。最近有学者通过母源抗体对后代的保护作用进一步证实抗体在E.maxima保护性免疫机制中的作用。
3 结语
兔艾美耳球虫病防治概述 篇4
E.stiedai, 即肝球虫, 是唯一寄生于兔肝胆管上皮细胞内, 公认的致病性强、危害较大的一种兔球虫。E.stiedai属于顶复门、孢子纲、真球虫目、艾美耳球虫科、艾美耳球虫属的原虫。其卵囊呈椭圆型, 大小为28~40μm×16μm, 平均36.8μm×19.9μm。卵囊壁光滑, 淡黄橙色或橙红色。卵膜孔明显, 卵囊壁厚, 且均厚, 无外残体, 或个别卵囊仅有小颗粒外残体, 孢子囊为长卵圆形, 有斯氏体, 内残体大而明显, 但不规则, 孢子化时间在室温下为3 d[1]。
1 艾美耳球虫的发育
1.1 无性繁殖阶段 (裂殖生殖阶段, 即复分裂阶段)
又叫复分裂阶段, 也即裂殖生殖阶段。兔子食用到有侵袭力的卵囊时, 其十二指肠会受到胰液和肠液的刺激, 加上肠蠕动作用, 卵囊内的子孢子就会从中逸出, 并进入胆管或肠壁的上皮细胞, 存裂殖体就从其中的卵囊发育。在上皮细胞内, 裂殖体会分裂为相当多的裂殖子。这些裂殖子从已致死的上皮细胞中溢出, 以继续侵袭新的上皮细胞, 这样可多次重复无性繁殖[2]。无性繁殖代数会不断增加, 由于上皮细胞的破坏, 其相应的器官也会遭到破坏, 毒素分泌量也随之增加, 无性繁殖越旺盛, 致病力越强, 而死亡率也就越高。此阶段是球虫发育过程中对宿主破坏力最强的阶段, 但这也是球虫发育中抵抗力最弱的阶段[3]。所以, 球虫病的治疗在此阶段是最有效的。故球虫病的防治, 要早用药、早预防。
1.2 有性繁殖阶段 (配子生殖阶段)
也叫配子生殖阶段。就过多次无性繁殖, 裂殖子会分裂发育成雄性小配子和雌性大配子。当两性的大小配子细胞成熟后, 小配子进入大配子, 两者结合为合子。合子外面会迅速包上一层被膜, 成为卵囊。而后, 卵囊从被破坏死亡的上皮细胞中, 落入宿主肠道内并随粪便排往外界, 所以粪便中常可见到卵囊[4]。卵囊对外界环境的抵抗力较强, 在水中可生活2个月以上, 在湿土中甚至可存活一年多。其对温度很敏感, 在60℃水中20 min死亡;80℃水中10 min死亡;开水中5 min就死亡。在-15℃以下卵囊就会冻死, 但一般的化学消毒剂对其杀灭作用很微弱。
在有性繁殖阶段, 配子大量进入生殖阶段, 而无性繁殖明显减少, 其繁殖周期也会加长, 则无性繁殖受到限制。几天后, 成熟且被排出的卵囊的孵化率最高。此时虽然病兔的病症渐渐减少, 外表上也显示出健康迹象, 但其排出的卵囊有少数分布在环境中, 成为隐性球虫病带虫者, 对兔的养殖影响仍很严重。但到目前为止, 仍没有药物可有效治疗或抑制有性繁殖阶段的球虫[5]。
1.3 孢子繁殖阶段 (孵化阶段)
也称为孵化阶段。在外界适宜湿度、温度等条件下, 卵囊会发育成为4个孢子卵, 每个孢子卵含有2个孢子, 成为有较强侵袭力的卵囊。可以严重污染水源、饲料、兔笼、褥草、人、工具、母兔乳头等, 健康兔子因接触或采食而被感染[6]。
2 艾美耳球虫的致病性
在仔兔30~40日龄时, 将球虫以6×104个/只的剂量进行人工感染, 在感染7 d后开始出现死亡现象, 当18~21 d时, 死亡达到高峰, 死亡率达到23.1%。在感染进行到第4 d时, 对感染仔兔进行剖检, 发现在肝脏表面分布有少数白色、针尖形点状病灶, 随着时间的推移, 病灶逐渐增大并融合。在感染球虫10 d之内, 肝脏病理变化主要以白细胞浸润及肝细胞弥漫变性为主;在感染球虫10 d之后, 肝脏以纤维组织及胆管增生为主[7]。从感染球虫第4~5 d后, ALP (碱性磷酸酶) 出现异常, 在第8~9 d含量达到高峰;第6 d之后, SDH (琥珀酸脱氢酶) 出现明显变化;第7 d之后, ACP (酸性磷酸酶) 反应增强;第8 d开始, 肝糖元逐渐减少, 且在13 d之后几乎耗尽。第12 d之后, 上述酶的变化表现出缓和趋势[8]。当感染20 d时, 肝脏肿大至正常时的2~3倍, 肝脏表面布满米粒大、黄豆大或相互融合的黄白色和暗绿色结节性病灶, 且肝脏变硬, 切面出现明显白色纤维组织增生, 胆囊及肝外胆管极度扩张, 充满黄白色或暗绿色胆汁, 涂片可见, 视野内显现有大量卵囊和裂殖体。有学者研究发现, 肝球虫感染后, 血清中AST、ALT、γ-GT、ALP及TBIL均有所增加, 对于兔球虫感染, 还会出现血红蛋白减少、低血糖及蛋白血症等症状。
肝球虫会引起肝细胞损伤, 甚至坏死, 肝功能也会随之降低, 使整个肝脏的合成、分解、排泄功能及生物转化发生障碍, 从而致发生一系列的病理变化, 最终导致病兔死亡。所以说, 肝细胞的损伤及坏死是造成病兔死亡的重要早期原因。球虫感染中后期, 肝脏细胞组织的病变主要以增生为主, 其中以纤维组织和胆管系统弥漫性增生为主, 造成兔肝球虫病的最终结果是肝脏的纤维化[9]。由于以上所述, 使肝细胞被极度挤压, 肝细胞的总数会明显减少, 肝脏功能会因体容量的减少而大为降低, 造成机体的代谢紊乱, 这是感染后期发生动物死亡的主要病因。
3 兔艾美尔球虫病的诊断措施
3.1 临床症状
根据球虫的寄生部位可分为肠型、肝型和混合型3种。发病初期, 病兔食欲明显减退, 精神萎靡, 嗜卧不动, 生长缓慢或停滞。体温升高, 眼睛和鼻子的分泌物增多, 腹部会胀大, 排粪频繁, 肛门黏污。发病后期, 常常会出现神经症状, 四肢痉挛、麻痹, 因极度衰竭而死亡。肠型死亡快, 肝型较慢。
3.2 病理变化
肠型球虫病见十二指肠壁厚, 内腔扩张, 黏膜炎症。急性死亡, 可见肠壁血管出血、充血, 十二指肠发炎、肿胀、充血, 小肠充气, 内积红色黏液, 肠黏膜充血并有出血点。肝球虫病则肝肿大, 表面有数量不等和大小不一的白色或淡黄色结节, 呈圆形, 如粟粒, 大至豌豆, 沿小胆管分布。胆囊黏膜发炎充满浓稠色淡的胆汁, 腹腔积液等。病程时间较长, 其内容物变为粉粒样钙化物。剖检所见多数为肠球虫和肝球虫混合感染。
3.3 实验室诊断
镜检卵囊可采取肠黏膜的白色小结节、肝脏的白色结节压片检查, 或取粪便直接涂片检查, 必要时采取粪便用饱和盐水漂浮法检查卵囊。
4 兔艾美尔球虫病的防治措施
4.1 饲养管理措施
加强对兔场的管理, 建立科学的饲养管理措施。仔兔和成年兔要分开饲养, 此外, 还应该把病兔与健兔进行分群饲养[11]。要及时清除兔舍内及活动场所的粪便;夏季应做到每日清扫, 定期用消毒剂对兔舍、兔笼等设备进行彻底消毒, 在多雨季节要加强消毒, 每隔3 d进行1次, 消灭鼠类、苍蝇等, 这样可以阻断球虫卵囊的机械性传播。要经常更换饲料, 如有污染的和发霉变质的草料坚决不喂;秋季应加强营养, 多喂青绿饲料, 适当增喂蛋白质含量较高的精饲料[12]。此外, 对于怀孕25 d和分娩后第6 d的母兔, 每日应口服碘溶液或兔健宝, 以提高家兔自身免疫力[13]。
4.2 采用治疗措施
对兔球虫病治疗效果较好的药物有以下几种:氯苯胍、磺胺二甲嘧啶、兔球灵、磺胺喹口恶啉、复方新诺明、地克珠利、妥曲珠利、复方敌菌净、球佳、盐霉素和马杜拉霉素等。这些药物多数是进行口服的, 在饲喂家兔时应该严格按照药物说明书进行用药;其中磺胺喹口恶啉和复方新诺明可以将其拌到饲料中进行饲喂。但是应该注意的是, 在发病期间应少喂精料, 适当的增加青绿饲料;此外, 球佳对肝球虫有很好的治疗作用, 且比较安全, 无明显毒性;0.007%的盐霉素对肝球虫治疗效果最佳[14,15]。养殖户应根据发病情况及时给予药物治疗。
目前, 人们在防治兔球虫病的工作中遇到的最大问题是耐药性[16]。一些学者也在不断的对球虫病的耐药性进行试验研究, 但是随着对该病防治措施的不断加强, 其耐药性处于上升趋势已经不可避免, 因此, 为减少和防止球虫产生耐药性, 在科学研究药物的基础上, 在实际的临床用药中, 应在短时间内有计划地交替, 轮换使用不同种类的抗球虫药[17]。
4.3 采用免疫预防
艾美尔球虫 篇5
1 球虫的分离
1.1 病料选择
斯氏艾美耳球虫可见于病兔的肝脏和消化道中, 因众多兔球虫中仅斯氏艾美耳球虫能寄生于肝脏, 且消化道内往往混有其他球虫, 所以采集病兔的肝脏是获取纯斯氏艾美耳球虫最理想的来源。在采集肝脏病料时, 应选取肿大、表面分布有粟粒状大小的白色或灰白色结节的肝脏组织。搅碎前, 剪开任一白色结节, 用玻棒蘸取少许内容物于载玻片上, 加一滴水, 盖上盖玻片于显微镜下观察, 若见大量椭圆形球虫, 即可进行球虫的分离与收集。分离肝脏的过程中, 要注意避免肠道污染。
1.2 球虫收集
球虫的分离和收集主要采取漂浮法进行, 常用的有饱和食盐水漂浮法、饱和硫酸镁溶液漂浮法、尿素溶液漂浮法、蔗糖溶液漂浮法等。
1.2.1 饱和食盐水漂浮法。
饱和食盐水的配制:查找室温条件下食盐的溶解度, 根据溶解度加入适量食盐和蒸馏水于三角烧瓶中, 用磁力搅拌器溶解食盐, 制成饱和食盐水。
卵囊的分离:用搅拌机将肝脏搅碎后加入蒸馏水混匀, 分别用80目、200目滤网过滤, 或80目滤网反复过滤, 收集滤液于50 m L离心管中, 3 500 r/min离心10 mim;弃去上清, 于沉淀中加入饱和食盐水, 摇匀溶解, 2 000 r/min离心10 min;收集上清液到一干净烧杯中, 加入4倍于上清的蒸馏水稀释, 再转移至50m L离心管, 3 500 r/min离心10 min;弃上清, 加蒸馏水洗涤沉淀, 3 500 r/min离心10 min, 重复1次, 所得沉淀即为分离和收集的球虫卵囊。
1.2.2 饱和硫酸镁漂浮法。
硫酸镁溶液的配制:根据溶解度称取相应量的硫酸镁试剂, 与蒸馏水充分溶解即可。卵囊分离方法与饱和食盐水漂浮法相同, 只是在加入漂浮液进行离心时, 离心速度可以提高至3500r/min。
1.2.3 尿素溶液漂浮法。
尿素的配制:1 000 m L蒸馏水中加入944.4g市售尿素CO (NH2) 2, 充分混匀即可。卵囊分离方法同饱和食盐水漂浮法相同, 漂浮静置时间控制在5~10 min后进行离心。
1.2.4 蔗糖溶液漂浮法。
蔗糖溶液配制:称取500 g纯蔗糖和6.5 g石碳酸 (或6.7 m L石碳酸溶液) 溶于320 m L蒸馏水中即得。该溶液又被称为Sheather (西泽尔) 氏糖溶液。
卵囊分离:肝脏搅碎后, 加入适量蒸馏水, 分别用80目、200目滤网过滤, 滤液与等量Sheather氏糖溶液混合, 以1 500×g (约4 000 r/min) 离心3 min;吸取上层漂浮的卵囊液置于另一离心管中, 加入10倍量的水稀释, 以4 000 r/min离心10 min, 重复离心洗涤2次, 所得沉淀物即为分离的球虫卵囊。
2 孢子化卵囊的培养
斯氏艾美耳球虫只有经过孢子化后才具有感染力, 才能进行短期保存和开展相关研究。实验室中常用2.5%重铬酸钾或1%氯胺T进行培养, 2.5%重铬酸钾溶液在各种球虫的孵化中均有应用, 是最常用的球虫孵化试剂;而1%氯胺T多应用于鸡球虫的孵化, 在培养商业化球虫疫苗方面具有较好的效果。
培养方法:用2.5%重铬酸钾溶液溶解上述球虫沉淀, 然后倒入玻璃平皿中, 保持混合液深度不高于5 mm, 放入30℃温箱中, 每天搅拌不少于6次, 一旦发现液面下降就用吸管滴入1~3滴蒸馏水, 维持重铬酸钾浓度。本试验笔者分别用2、5 mm和10 mm深度的培养液在直径为12 cm的平皿中, 30℃条件下培养斯氏艾美耳球虫, 结果发现培养液深度越浅, 孵化时间就越短且孵化率越高。具体结果详见表1。
斯氏艾美耳球虫大小为 (26~40) × (16~25) μm, 80目滤网孔径约150μm, 200目滤网孔径大小约63μm, 因此, 先后分别用80目、200目滤网过滤混合液能有效地将肝脏残碎组织与卵囊分离开。4种漂浮液中, 饱和硫酸镁和蔗糖溶液的比重较饱和食盐水与尿素的比重高, 在用这两种溶液进行漂浮离心时, 离心速度可以调高些;而饱和食盐水与尿素的离心速度控制在2 000 r/min即可。据报道, 隐孢子虫的卵囊在饱和食盐水中极易破裂, 对球虫的提取有一定影响, 因此, 用饱和食盐水提取斯氏艾美耳球虫时, 应减少饱和食盐水与卵囊的接触时间, 做到用饱和食盐水溶解卵囊沉淀后, 尽快离心, 离心后立即向食盐水中加入蒸馏水稀释, 保证后期卵囊的孵化不受影响。
卵囊的孢子化需要充足的氧气、适宜的温度和湿度。为此, 要获取足够量的孢子化卵囊, 在选择平皿培养时, 应选择直径较大的平皿以提供足够大的水平面。试验发现, 重铬酸钾和球虫的混合溶液深度越浅, 孵化效果越佳。由于斯氏艾美耳球虫的孵化适宜温度在25~32℃之间, 且重铬酸钾溶液的最适培养浓度为2.5%, 故在温箱中培养时, 为防止液体挥发而影响重铬酸钾浓度及保持接触足够多的氧气, 每天需搅拌培养液并适度添加少许蒸馏水以补偿挥发丢失的水分。
3 孢子化卵囊的保存
孢子化的斯氏艾美耳球虫卵囊, 一般可溶于2.5%重铬酸钾或1%氯胺T溶液在4℃环境中保存, 随着保存时间的延长其毒力会逐渐减弱, 使用前, 只需进行一次繁殖恢复毒力即可。有报道称, 柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫在冰箱4℃下保存6个月后, 继代繁殖1次, 其毒力会有所降低。为了寻求更长久的保存方法, 有学者尝试用液氮低温保存, 如韦 (上接第28页) 量) 组的效果最佳。具体结果详见表1。
3 分析
3.1 淋巴细胞转化率的高低可以反映机体免疫机能的状态, 是测定机体免疫功能的指标之一。
细胞免疫缺陷者, 其淋巴细胞转化率低于正常值, 淋巴细胞转化率升高, 则说明其免疫力增强。
赵金香 (2005) 研究表明, 在日粮中添加酵母铁 (150 mg/kg) 可显著提高仔猪T淋巴细胞转化率, 增强仔猪的免疫力。李秀霞等 (2005) 发现, 缺铜能降低小鼠组织器官中的铜浓度和细胞免疫功能, 而在基础日粮的基础上添加4.5 m L/kg蛋氨酸铜和硫酸铜均能显著提高T淋巴细胞转化率, 促进脾脏发育。徐迪雄等 (1995) 研究发现, 适量补充锌可促进胸腺、脾脏生长, 增强T淋巴细胞活性, 提高免疫力。张庆东等 (2006) 研究表明, 饲粮中添加2.0 mg/kg铬可显著提高鸡胸腺重量和T淋巴细胞转化率 (P<0.01) 。本试验在注射复方微量元素制剂后, T淋巴细胞转化率显著升高, 这是由于复方微量元素制剂中多种微量元素协同作用的结果。
3.2 本试验在注射复方微量元素制剂后第30 d, 淋巴细胞增殖率达到最高值, 第30 d后缓慢降低, 但仍显著高于对照组 (P<0.05) 。
这可能是由于微量元素在体内代谢过程中被逐渐消耗掉, 而饲粮中的微量元素仍然处于缺乏状态所造成的。
4 结论
本试验结果表明, 中剂量组的淋巴细胞转化率显著高于低剂量组和高剂量组 (P<0.05) , 极显著高于对照组 (P<0.01) , 而低、高剂量组之间差异不显著 (P>0.05) 。故临床上应选择中剂量注射为宜。
摘要：斯氏艾美耳球虫的分离与孵化是进一步研究其生物特性、免疫原性的前提。本文就病料的处理、分离方法、孵化试剂选择及孵化过程中的注意事项与保存方法等进行阐述, 以期为相关研究提供参考。
关键词：斯氏艾美耳球虫,卵囊,分离,孵化,保存
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一起兔斯氏艾美耳球虫病理学诊断 篇6
1 材料与仪器
1.1 动物及来源
患病家兔8只来自四川农业大学实验动物中心。
1.2 主要仪器
切片机，泰维公司;生物显微镜，Nikon公司。
2 方法
2.1 临床检查
患病家兔食欲减退或废绝，消瘦，皮肤变薄，被毛粗乱，可视黏膜苍白。精神沉郁，行动迟缓，虚弱。有的家兔在眼鼻处有白色分泌物，口腔周围被毛潮湿。病兔尿频或常做排尿姿势。有的家兔出现四肢抽搐、头向后仰、尖叫等神经症状。
2.2 眼观病理剖解变化
肝脏明显肿大，质地坚实，切面白色纤维组织增生区明显，胆囊及肝外胆管极度扩张，充满黄白色或暗绿色胆汁。肝脏表面和内部有黄白色粟粒大至豌豆大的结节性病灶，沿胆小管分布。心脏、肾脏、脾脏、肺脏等出现不同程度萎缩。
2.3 组织切片制备和观察
取病变肝脏，10%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，H.E.染色，镜检。镜下可观察到裂殖生殖时期和配子生殖时期的虫体，见图1A、B，其中以配子生殖时期的虫体最为明显。末代裂殖生殖产生的裂殖子大部分侵入到新的胆管上皮细胞中发育为含有大量原生质的大配子，大配子为一圆形四周有红染颗粒环绕的原生质团，该球虫的配子形态具有诊断意义，见图1C。小部分裂殖子仍然侵入到新的胆管上皮细胞，发育为含少量原生质的小配子，见图1D。成熟的小配子离开宿主细胞，钻入含有大配子的宿主细胞，使大配子受精成为合子，见图1E。合子再发育为卵囊，被二层被膜围绕，外层为保护性膜，弹性较大，可变形，内层是由大配子在发育过程中形成的类脂质红染小颗粒构成，见图1F。
A.粟粒大白色结节切面, 周围被结缔组织包裹, 内层为胆管上皮细胞。B.可见兔肝球虫发育各个时期的形态, 以大配子为主。C.大配子为一圆形四周有红染颗粒环绕的原生质团。D.含少量原生质的小配子存在于上皮细胞内, 发育成熟后, 破溃上皮细胞与大配子结合。E.合子中含有一圆形的、呈颗粒的、有核原生质团。F.未孢子化卵囊, 内含合子, 为双层结构。
3 讨论
球虫属于单细胞原虫，寄生于兔的有14种。球虫在兔体内寄生、繁殖，卵囊随粪便排出，污染饲料、饮水、食具、垫草和兔笼，在适宜的温度、湿度条件下变为侵袭性卵囊，易感兔吞食有侵袭力的卵囊后而致感染。卵囊对外界环境的抵抗力较强，在水中可生活2个月，在湿土中可存活1年多。它对温度很敏感，在60℃水中20 min死亡;80℃水中10 min死亡;开水中5 min就死亡。在-15℃以下卵囊就会冻死，但一般的化学消毒剂对其杀灭作用很微弱。依球虫寄生的部位，可将它分为两类：寄生于肝脏、胆管上皮细胞内的称为肝球虫;寄生于肠道上皮细胞内的叫肠球虫，其中肝球虫也就是斯氏艾美耳球虫，对养兔业危害最大。
对兔球虫的预防应采取综合措施。保持兔笼、兔舍的干燥、通风、充足的光照与清洁卫生，经常清除粪便，定期对笼舍及兔场进行消毒，特别应保持饲料及饮水的清洁卫生。饲喂全价饲料，保证充足的营养供给，以提高兔抗病力。新引进兔应注意隔离检疫，发病兔应及时隔离治疗。幼兔与成年兔应分笼饲养，断乳至3月龄内的兔应添加抗球虫药物进行预防。消灭兔场内的鼠类、蝇类及其他昆虫，减少球虫卵囊的散播。
艾美尔球虫 篇7
1.1 试验动物
从四川省内江市种鸡场购回1日龄罗曼公雏280只, 分笼饲喂于经严格消毒的笼舍中, 饮水经煮沸消毒, 饲喂自配无抗球虫药的饲料。
1.2 试验药物
中药:由马鞭草、黄柏、郁金、栀子等中药组成, 由广东省天宝生物制药有限公司提供。300目微粉制剂由四川夸克 (超微) 科技有限公司粉碎。
化学药物:氯羟吡啶为新希望集团江苏天成保健有限公司生产, 批号为061024;盐酸氨丙啉由广东农丰动物药业有限公司生产, 批号为051212;地克珠利由沈阳华康动物药品厂生产, 批号为070601。
1.3 球虫卵囊
球虫卵囊由南京农业大学寄生虫病教研室赠送。试验前人工感染无球虫鸡继代1次, 获得试验用卵囊, 29℃孢子化, 4℃保存备用。
1.4 试验分组及处理
选取135只13日龄健康雏鸡, 随机分为9组, 每组15只。其中Ⅰ组为1%中药组;Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别为氯羟吡啶、盐酸氨丙啉和地克珠利拌料给药组;Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组分别为1%中药与氯羟吡啶、盐酸氨丙啉和地克珠利混合给药组;Ⅷ组为阳性对照组;Ⅻ组为阴性对照组。各用药组分别于分组当天在饲料中添加对应的药物, 每天定时饲喂至试验结束。15日龄时, 除阴性对照组外, 每只鸡经口接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5.0×104个。
1.5 疗效检测指标
每天观察鸡的饮食情况、粪便情况。第8天称重, 按组逐只剖检捕杀。观察盲肠病变并记分, 计数盲肠内容物克粪便卵囊数量 (OPG值) 、计算存活率、平均增重、相对增重率、血便记分、病变记分及病变值、卵囊值和抗球虫指数。
2 试验结果
2.1 发病情况及症状
接种后第5天, 除Ⅷ组出现血便外, 其他试验组未见有明显血便。此外, Ⅷ组在第5天死亡1只雏鸡, 第6天时又死亡3只, 病死鸡剖解, 见盲肠明显肿大, 剖开肠管, 里面有大量出血。除阴性对照组外, 其他试验组雏鸡仅在接种球虫后第4, 5, 6天出现采食量下降, 精神沉郁, 饮水增加, 第7, 8天逐渐恢复。
2.2 药物疗效
单独使用药物时, 仅地克珠利组抗球虫指数为160.6, 达到良好水平, 1%中药组、氯羟吡啶组和盐酸氨丙啉抗球虫效果中等, 抗球虫指数分别为143.9, 145.7和156.9。中西药联合用药组抗球虫效果均比单独用药好, 其中, 中药与氯羟吡啶联合用药组疗效中等 (ACI=150.5) , 中药与氨丙啉及中药与地克珠利联合用药抗球虫效果良好, 抗球虫指数分别为164.3和169.8。
3 分析与讨论
3.1 三种化学药物单独使用抗球虫效果
氨丙啉是20世纪80年代中期, 在国内生产上市的化学合成抗球虫药。该药毒性小, 安全范围大, 对球虫第1代裂殖体特别有效, 因而对控制球虫病的发生有良好的效果。到90年代初, 上海、广西等10多个省区的球虫对氨丙啉已产生了抗药性。从本试验结果来看, 该药对柔嫩艾美耳球虫疗效中等, 建议和其他药物联合使用。
氯羟吡啶属吡啶类抗球虫药。该药初期使用时对球虫有较好的效果, 但能明显地抑制机体对球虫产生免疫力, 而且球虫对该药极易产生抗药性, 通常连续使用2～3年, 其ACI就明显下降, 甚至于无效。本次试验结果可见, 该药尚具有中等抗球虫效果, 但不及氨丙啉和地克珠利, 抗球虫指数最低, 建议慎用该药。
地克珠利对球虫的无性生殖阶段和有性生殖阶段都起作用, 曾被认为能控制球虫感染, 不产生卵囊, 但国内外已有地克珠利抗药株出现的报道。试验结果表明, 在3种化学药物中, 地克珠利对鸡柔嫩艾美耳球虫的防治效果最好, 单独使用, 其抗球虫指数为160.6, 抗球虫效果达到良好水平。
3.2 中药与化学药物联合抗球虫效果