内毒素类

内毒素类（共7篇）

内毒素类 篇1

1 沙蚕毒素类仿生农药发展概况

1.1 我国农药产业政策现状

农药是重要的农业生产资料和救灾物资, 对防治农业有害生物, 保障农业丰收, 提高农产品质量, 确保粮食安全, 以及控制卫生、工业等相关领域的有害生物起着不可或缺的作用。经过半个多世纪的发展, 我国农药的产量和出口量已跃居世界第一, 不仅能够满足国内农业和相关领域的需求, 而且已成为全球重要的农药生产和出口国。

纵观农药的发展历程, 化学农药发展到20世纪60年代, “农药公害”问题日趋严重, 在国际上引起了震动, 使农药发展发生了转折, 人们开始关注生物农药。1972年, 我国规定了新农药的发展方向:发展低毒高效的化学农药, 逐步发展生物农药。70~80年代, 我国生物农药的发展呈现出蓬勃发展的景象。但是, 由于化学农药高效快速, 人们仍寄希望于化学农药防治病虫害, 对生物农药的研制和应用曾一度漠视忽略。进入20世纪90年代, 随着科学技术不断发展进步, 减少使用化学农药, 保护人类生存环境的呼声日益高涨, 研究开发高效、低毒、低残留的农药成为国内外植物保护科学工作者的重要研究课题之一。

为了推动我国农药的发展, 国家先后出台了多项政策。2003年, 《高毒农药削减方案》限制甲胺磷等高毒农药的使用;2005年, 《产业结构调整指导目录》鼓励开发生产高效、低毒、安全的新品种农药;2006年, 《全国农业和农村发展第十一个五年规划》把“农产品质量安全进一步提高”作为重点发展目标;同年国务院颁布了《生物产业发展“十一五”规划》, 规划中强调要围绕保障粮食安全和促进农产品结构调整, 加速生物农业技术的研发及推广应用, 提升农业生产效益;2007年, 《关于积极发展现代农业, 扎实推进社会主义新农村建设的若干意见》中指出要积极发展低毒高效农药, 推进农药产品更新换代;2011年, 《“十二五”农药工业发展专项规划》出台, 规划指出要重点发展高效、安全、环保的农药品种, 鼓励发展生物农药, 促使行业兼并重组提速。

在一系列国家政策的积极引导下, 国内农药企业迎来了千载难逢的发展机遇, 发展高效、低毒、环境友好的农药成为了农药生产企业的发展方向。

1.2 沙蚕毒素类仿生农药技术发展趋势

农药作为人类文明进步的必然产物, 为加强社会稳定、解决人类温饱、促进人类健康作出了不可磨灭的贡献。尤其是20世纪50年代, 有机合成农药的成功发现, 为控制害虫的危害提供了有效的工作。随着社会的发展和农业现代化的要求, 对农药的需求不断增加, 在今后相当长的时间内, 农药在提高单位面积产量中的作用仍是不能代替的。

我国农林牧业的杀虫主要依靠化学杀虫剂, 然而大量的事实表明, 化学杀虫剂的广泛使用也成为造成环境污染的重要因素之一。杀虫剂所产生的环境问题和对人类健康的危害日益暴露出来, 人们开始认识到问题的严重性。我国每年都生产和使用大量的农药, 农药的生产和使用, 可通过多种途径进入大气、河流和海洋, 通过食物链造成多种生物危害, 从而直接或间接地造成对人类的危害, 因此寻找低毒、低残留的农药已经势在必行。

随着对杀虫剂的认识越来越深刻, 对杀虫剂的概念, 已经发生了深刻的变化, 对杀虫剂的研究的着手点已经从“杀死”转变为“调节”。公众心目中理想的杀虫剂应是“生物合理杀虫剂”, 即对害虫高效, 对环境、对非靶标生物安全的杀虫剂。

生物杀虫剂对自然生态环境安全、无污染, 符合人们对杀虫剂的要求, 但生物杀虫剂的自身属性复杂, 生物农药制剂要考虑的因素多, 并且生物农药一般表现为质量不纯、性质不稳定、活性较低, 因此人们开始研究仿生杀虫剂, 用以克服生物杀虫剂的缺点, 使产品得到升级。从天然物质中寻找新农药的先导物, 然后进行“仿生”合成, 这种仿生农药的研究方法已经成为当前新型杀虫剂开发的热点。由于仿生农药源于安全的天然产物, 具有低毒、低残留、与环境相容性好、广谱、高效等特点, 因此仿生农药的市场不断扩大, 将成为未来杀虫剂市场的主体产品。仿生杀虫剂将对我国乃至世界农药创制起着积极的推动作用。

沙蚕毒素类仿生农药是仿生杀虫剂的典型代表, 是20世纪60年代开发兴起的一种新型有机合成仿生杀虫剂, 是一类以天然产物为模型开发成功的现代合成杀虫剂。

沙蚕毒素是1934年日本学者Nitta首先从海生环节足动物异足索沙蚕体内分离出一种有效成分, 具有杀虫作用。1960年Hashimoto和Okaichi重新研究提出了的分子式并确定了其结构。1965年, Hagiwara人工合成了沙蚕毒素及其衍生物, 经过广泛筛选, 日本武田药品工业株式会社成功开发了第一个沙蚕毒素类仿生农药———巴丹 (杀螟丹) , 是人类历史上第一次成功利用动物毒素进行仿生合成的动物源杀虫剂, 随后掀起了对该类化合物研究的热潮。1974年我国贵州省化工研究所首次发现了沙蚕毒素衍生物-杀虫双对水稻螟虫的防治效果, 并成功将其开发成为商品。1975年瑞士山德士公司开发出杀虫环。随后, 通过对该类化合物官能团的变换和构效关系研究, 相继开发了一系列高效沙蚕毒素类仿生农药, 如杀虫单、多噻烷、杀虫磺及苯硫丹等, 目前已实现产业化并大规模应用于农业生产的沙蚕毒素仿生农药有杀螟丹、杀虫环、杀虫单、杀虫双, 这些杀虫剂至今仍在农业害虫的防治上发挥着重要作用。

沙蚕毒素类仿生农药杀虫谱广, 可用于防治水稻、蔬菜、甘蔗、果树、茶树等多种作物上的多种食叶类、钻蛀类害虫, 有些品种对蚜虫、螨类、叶蝉、飞虱、蓟马等害虫也有效;杀虫作用多样, 具有很强的触杀、胃毒和一定的内吸、熏蒸作用, 有的还有拒食、杀卵作用;具有低毒、低残留以及施药适期长、速效、持效期长、防效稳定等多种优点。此外, 有的品种 (如杀螟丹等) 还具有一定的杀菌活性及抑制媒介昆虫传播病毒的作用。因此, 这类杀虫剂在20世纪60年代用于农业防治后, 就迅速得到了推广作用。沙蚕毒素类仿生农药使用数周后可自然分解殆尽, 在农作物上无残毒保留, 这是目前许多合成农药所难以达到的。

沙蚕毒素类仿生农药与有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等杀虫剂虽同属神经毒剂, 但作用机制不同。其作用部位是胆碱能突触, 阻遏神经正常传递而使害虫的神经对外来刺激不产生反应, 当害虫接触或取食药剂后, 虫体很快呆滞不动、瘫痪, 直至死亡。但虫体中毒后没有痉挛或过度兴奋的症状。由于作用靶标的不同, 与有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等杀虫剂无交互抗性问题, 在防治害虫中, 也未产生交互抗性的现象, 因此对上述3类杀虫剂产生抗药性的害虫, 采用沙蚕毒素杀虫剂防治仍然有很好的效果。

2 沙蚕毒素类仿生农药专利态势分析

2.1 沙蚕毒素类仿生农药专利申请趋势分析

2.1.1 国外沙蚕毒素类仿生农药专利申请趋势

国外沙蚕毒素类仿生农药专利申请趋势如图1所示。

通过对国外沙蚕毒素类仿生农药专利进行检索, 并合并同族专利后发现, 国外沙蚕毒素类仿生农药专利量较少, 一方面国外对绿色农业的要求较高, 因此对杀虫剂的使用控制较严格;另一方面, 目前杀虫剂的种类繁多, 其他类型杀虫剂的快速发展势必会分散沙蚕毒素类仿生农药的研发力度;此外, 国外沙蚕毒素类仿生农药专利多涉及生产工艺等较核心技术, 而组合杀虫剂的应用型专利相对国内少。日本是沙蚕毒素类仿生农药专利申请大国, 日本武田药品工业株式会社是最早从事沙蚕毒素类仿生农药研发的企业, 后被日本住友株式会社收购, 日本住友株式会社在该领域也有较多专利申请。

2.1.2 国内沙蚕毒素类仿生农药专利申请趋势

国内沙蚕毒素类仿生农药专利申请趋势如图2所示。

我国是农业大国, 也是最早使用杀虫剂防治植物害虫的国家之一。1972年, 我国规定了新农药的发展方向:发展低毒高效的化学农药, 逐步发展生物农药。但化学农药随之带来的环境和农药残留的问题, 不断推进了生物农药的研究和运用。沙蚕毒素类仿生农药作为生物农药中仿生农药的代表, 以其杀虫谱广、毒性低、环境危害小等优点逐渐受到人们的关注。我国沙蚕毒素类仿生农药的专利申请始于1985年, 1974年我国贵州省化工研究所首次发现了杀虫双对水稻螟虫的防治效果, 1985年我国专利法实施以来, 贵州省化工研究随即于1985年4月1日申请了两件相关专利, 成为我国沙蚕毒素类仿生农药最早的专利, 该申请人在此领域申请相关专利在5件左右, 但由于申请年限较早, 目前都已失效。石原产业株式会社是最早在中国进行沙蚕毒素类仿生农药专利申请的国外企业, 随后巴斯夫欧洲公司、拜尔农作物科学股份公司、杜邦公司等都开始在中国进行专利申请, 在中国进行沙蚕毒素类仿生农药的技术布局, 占领技术市场。1985-2006年, 沙蚕毒素类仿生农药专利申请量相对平稳, 2006年后国家进入“十一五”时期, 国务院颁布了《生物产业发展“十一五”规划》, 规划中强调要围绕保障粮食安全和促进农产品结构调整, 加速生物农业技术的研发及广泛应用, 提升农业生产效益, 开发并推广应用生物农药、生物肥料、植物生长调节剂、生物饲料添加剂等重要农用生物制品, 大幅度提高我国绿色农业生物制品自主创新能力和国际竞争力, 有效缓解农业污染。随后《“十二五”农药工业发展专项规划》出台, 规划指出要重点发展高效、安全、环保的农药品种, 鼓励发展生物农药。在众多政策扶持下, 自2006年后, 沙蚕毒素类仿生农药专利技术进入了迅速发展阶段, 由于专利公开滞后性的影响, 届时还会有相关专利公开。2004年起, 一些国外公司的专利开始通过PCT申请进入中国, PCT申请同时可以进入多个国家和地区, 往往是申请企业的核心专利或重要技术, 因此国内企业需要重点关注, 一方面对先进的技术进行借鉴, 一方面防止侵权风险。该领域主要是发明专利, 这与专业类型息息相关。

任何产品都有自己的生命周期。新产品研制成功后, 从投入市场开始直到被淘汰为止的整个延续时间, 被称为产品生命周期, 它一般表现为4个阶段: (1) 引入期 (也称为初生期) :产品开发之初, 结构和工艺尚未成熟, 厂家少, 批量小, 成本高, 因而获利很低, 甚至亏本。 (2) 成长期 (也称发展期) :产品经试销与改进, 工艺趋于成熟, 质量趋于稳定, 产量大增, 成本降低, 利润迅速增长, 市场竞争激烈, 专利数目迅速增加。 (3) 成熟期:市场趋于饱和, 利润相对下降, 产品销售量虽然有所增加, 但增长极其缓慢, 专利年申请量趋于平稳。 (4) 衰退期:市场出现新的替代产品, 老产品最终因无销路而退出市场, 专利申请量下降。

从图1、图2综合中可以看出沙蚕毒素类仿生农药在20世纪50年代中期至70年代末期进入初生期, 80年代以来, 专利数量不断增长, 表明已进入“成长期”。

综合比较我国沙蚕毒素类仿生农药和国外沙蚕毒素类仿生农药的发展趋势可见, 我国沙蚕毒素类仿生农药的研究起步较晚, 但专利数量增长快, 国家不断在农药新产品创制方面给予政策扶持, 推动生物农药的发展, 因此沙蚕毒素类仿生农药今后还会有较大的发展空间。

2.2 沙蚕毒素类仿生农药专利地区分布

(1) 国外沙蚕毒素类仿生农药专利区域分布如图3所示。国外企业专利申请除在所在国申请以外, 还会通过世界知识产权组织 (WIPO) 以及欧洲专利局 (EPO) 进入其他国家, 在其他国家和地区进行专利布局。根据国别分布进行统计可以发现, 申请国涉及的国家和地区有20个, 其中申请数量最多的国家为日本, 共有71件, 占据国外沙蚕毒素类仿生农药相关专利申请总量的43.6%, 占有绝对优势, 这与日本是最早进行沙蚕毒素类仿生农药研究的国家, 技术相对成熟密切相关, 同时也与日本的国家专利战略有关, 广撒网, 设置外围专利墙等等;WIPO和欧洲专利局的专利数量分别占18.4%项和6.7%, 该部分专利一般会进入多个国家并获得授权, 属于这一技术领域的核心专利, 需要加以关注。

除国外申请人进行PCT申请外, 中国也有2件专利作为优先权在国外组织进行了专利申请, 申请人为四川国光农化股份有限公司和湖南化工研究院, 权利人以此为优先权在世界知识产权组织、日本等地进行了专利申请, 该专利申请可能是该公司的核心专利。以中国为优先权的专利申请详细列表如表1所示。

(2) 国内沙蚕毒素类仿生农药专利区域分布。对国内专利地域分布进行分析可以发现, 我国沙蚕毒素类仿生农药技术主要集中在江苏、山东、陕西、广东等地区, 其中江苏以72件独占鳌头, 主要申请人有江苏天容集团股份有限公司, 该公司专利申请量占到江苏申请总量的29.1%, 是全国沙蚕毒素类仿生农药专利申请大户, 也是国内该行业内的领军企业。山东以34件专利位居第2, 主要的申请人有济南凯因生物科技有限公司, 该公司共有8件相关专利, 技术主要涉及沙蚕毒素类仿生农药的应用, 均与利用沙蚕毒素类仿生农药配置组合杀虫剂相关。除此之外, 陕西和广东分别以26件和23件专利位居第3和第4位, 前4位的省份申请量占到全国申请总量的48.0%, 可见沙蚕毒素类仿生农药技术的地区集中度较高, 但我国沙蚕毒素类仿生农药生产企业多数规模较小, 具有国际竞争能力的龙头企业屈指可数, 还无法形成产业集群。国内沙蚕毒素类仿生农药专利区域分布如图4所示。

(3) 沙蚕毒素类仿生农药国外来华专利申请情况分析。从国际看, 随着欧美国家环保标准越来越高, 以及国际化分工更加精细, 发达国家的农药原药及制剂生产能力逐步向发展中国家转移, 国际农药大公司纷纷到中国建设独资、合资工厂和研究机构, 对我国农药工业既是机遇也是挑战, 一方面可以利用国外龙头企业的先进技术, 提升自身技术水平, 另一方面将冲击国内竞争力弱的企业。石原产业株式会社是最早在中国进行沙蚕毒素类仿生农药专利申请的国外企业。在国内专利中, 国外来华申请的企业和个人主要来自于德国、瑞士、日本、美国等6个国家。其中有26件通过PCT申请进入中国, 其余均为直接在中国进行专利申请, 可见这些公司在这些技术上比较重视中国的市场, 主要的申请人包括巴斯夫欧洲公司、拜耳公司等, 这些公司也是国际上农药研发生产的龙头企业, 是国内杀虫剂生产企业强有力的竞争对手。国外来华沙蚕毒素类仿生农药专利区域分布如图5所示。

2.3 沙蚕毒素类仿生农药主要申请人排名情况

(1) 国外沙蚕毒素类仿生农药专利申请人排名。国外沙蚕毒素类仿生农药排名前10的企业均是国外知名的农药生产商, 其中日本武田药品工业株式会社是最早从事沙蚕毒素类仿生农药研究的企业, 目前已被日本住友化学株式会社收购, 排名前10的申请人中五位来自日本, 这与日本企业在全球积极进行专利布局的策略相关, 这些企业除在本国申请专利外, 还通过PCT申请进入多个国家和地区, 例如巴斯夫欧洲公司, 在中国申请的专利90%以上都是通过PCT申请进入中国。

国外沙蚕毒素类仿生农药专利多涉及生产工艺等技术, 而组合杀虫剂类的应用型专利相对国内少, 由此看出, 国外沙蚕毒素类仿生农药专利的含金量较高, 核心竞争力强。国外沙蚕毒素类仿生农药专利主要申请人排名如表2所示。

(2) 国内沙蚕毒素类仿生农药专利申请人排名。对国内沙蚕毒素类仿生农药专利申请人进行排名, 前十名的企业如下表所示, 江苏天容集团股份有限公司以21件专利排名第1, 巴斯夫欧洲公司及拜耳公司等两家外国公司分别位居2、3位。国内沙蚕毒素类仿生农药专利主要为发明专利, 国外公司多通过PCT申请进入中国, 许多PCT申请的法律状态处于实质审查阶段, 因此还会有专利陆续授权, 同时说明这些国外公司近几年开始在中国申请专利, 进行专利布局, 需引起国内企业的关注。排在前10的申请人中, 有企业、科研院所, 同时还有以个人名义申请, 例如申请人叶长东为广西易多收生物科技有限公司的法人代表。国内沙蚕毒素类仿生农药专利主要申请人排名如表3所示。

2.4 沙蚕毒素类仿生农药专利申请人类型分析

沙蚕毒素类仿生农药专利主要申请人类型如图6所示。

我国沙蚕毒素类仿生农药起步较晚, 但我国目前正在大力推进高毒农药替代工程, 因此以低毒、高效、环境相容性好的沙蚕毒素类仿生农药发展形势良好。通过对专利申请人类型进行分析可见, 相关专利申请主力还是企业, 但除江苏天容集团股份有限公司以合成工艺或清洁生产工艺为主, 专利质量相对较高外, 绝大多数企业的专利主要集中在组合杀虫剂及应用上, 含金量相对较低。为此企业可以选择与高校及科研院进行产学研合作, 即可以让企业拥有具有竞争力的专利技术, 同时解决了高校科技成果转化的难题, 从而互惠互利。

注:JP日本;US美国;WO世界知识产权组织;EP欧洲专利局;KR韩国;CA加拿大;DE德国;GB英国;RU瑞士;MY马来西亚;JO约旦;AU澳大利亚;NZ新西兰;TW台湾;CH瑞士;FR法国;EA欧亚专利组织

2.5 沙蚕毒素类仿生农药专利主要发明人分析

沙蚕毒素类仿生农药专利共有发明人702位, 对专利发明人进行排名, 排名第1位的是江苏天容集团股份有限公司总经理魏明阳, 共参与了17件专利的发明工作。前10位发明人均是沙蚕毒素类仿生农药领域的专家, 企业可通过关注这些发明人的最新专利或论文, 了解目前沙蚕毒素类仿生农药技术的最新研究进展。沙蚕毒素类仿生农药专利主要发明人如图7所示。

2.6 沙蚕毒素类仿生农药专利技术分布

沙蚕毒素类仿生农药专利技术分类如图8所示。

从技术发展趋势来看, 国内沙蚕毒素类仿生农药专利主要围绕生产工艺、应用、相关化合物的合成、检测方法以及副产物的利用等几个方面进行申请, 如图8所示。通过阅读专利全文, 当前沙蚕毒素类仿生农药的研究热点和研究方向主要包括几个方面: (1) 通过沙蚕毒素类仿生农药或中间产物生产工艺的改进, 不断提高生产效率, 简化工艺, 降低成本;或是通过对剂型的改变增加杀虫剂的利用率; (2) 通过对沙蚕毒素进行结构改造, 获得沙蚕毒素的衍生物, 从而筛选出具有杀虫效果的化合物; (3) 利用沙蚕毒素类仿生农药和其他类型杀虫剂的组合使用, 提高杀虫效力, 这个研究方向是目前沙蚕毒素类仿生农药研究的热点, 相关专利数量占比高, 从图中也可以看出, 该类型的专利申请量呈逐年上升的趋势, 主要由于农药新品种的研发具有高风险、高投入和周期长等特点, 而组合农药制剂的创新相对容易; (4) 对残留沙蚕毒素类仿生农药检测方法的创新; (5) 对沙蚕毒素类仿生农药在生产过程中的副产物的利用, 减少了沙蚕毒素类仿生农药生产过程中副产物对环境的污染, 同时进行副产物的循环使用, 实现了沙蚕毒素类仿生农药的清洁生产。

结合以上数据分析可以看出, 国内沙蚕毒素类仿生农药的技术主要集中在应用类, 一方面新型沙蚕毒素类仿生农药的研发相对较难, 对创新能力和科研实力要求较高;另一方面, 目前沙蚕毒素类仿生农药生产技术相对成熟, 再要开发新的合成工艺, 难度很大, 而杀虫剂在应用过程中创新点相对较多, 易于申请专利。检测方法和副产物应用方面专利较少, 国内沙蚕毒素类仿生农药生产企业重视产品专利的申请, 对这2个技术方向研发成果的专利保护意识不强, 企业可在这些研究较少的领域申请外围专利, 保护自身的核心专利或制约他人的重要专利。

3 结论与建议

(1) 国内外发展步伐不均。国外较早开始进行沙蚕毒素类仿生农药的研究, 日本武田药品工业株式会社是最早从事相关技术研究的企业, 从全球范围来看, 日本、欧洲等国家在沙蚕毒素类仿生农药领域起步较早, 并于20世纪90年代得到了快速的发展。国内对沙蚕毒素类仿生农药的研究最早开始于20世纪70年代, 相比国外起步晚, 但目前正处于极大的发展和进步期, 专利数量保持持续上升的趋势, 尤其自2006年, 在国家出台的各类政策的推动下, 专利数量迅速增加, 越来越多的申请人进入该领域进行专利申请, 但有效专利占专利总量的24.1%, 失效专利占专利总量的48.6%, 专利的有效率有待进一步提高。国内已有企业开始进行国际专利申请或在其他国家进行专利布局。

(2) 专利申请区域分布集中。国外沙蚕毒素类仿生农药专利申请涉及的国家和地区有20个, 但数量相对集中, 其中日本占据国外沙蚕毒素类仿生农药相关专利申请总量的47%, 这与日本是最早进行沙蚕毒素类仿生农药研究的国家, 技术相对成熟密切相关, 同时也与日本的国家专利战略有关, 广撒网, 设置外围专利墙等等;WIPO和欧洲专利局的专利数量分别占11.9%和7.3%, 这些专利可能进入多个国家和地区。

我国沙蚕毒素类仿生农药专利申请地主要集中在江苏、山东、陕西、广东等地区, 其中江苏以72件独占鳌头, 主要申请人有江苏天容集团股份有限公司, 该公司也是沙蚕毒素类仿生农药专利申请大户, 位居世界第2位。

(3) 主要竞争对手多为国外知名企业。江苏天容集团股份有限公司是国内沙蚕毒素类仿生农药专利申请的领军企业, 位居其后的便是巴斯夫欧洲公司及拜耳公司, 这些国外公司通过PCT申请, 将其技术在国内申请专利, 进行专利布局。巴斯夫欧洲公司及拜耳公司沙蚕毒素类仿生农药的PCT申请主要是近几年进入中国, 大多处于实质审查阶段, 届时会陆续获得专利权。除此之外, 日本住友化学株式会社以及其收购的日本武田药品工业株式会社都是沙蚕毒素类仿生农药技术强有力的竞争对手。安徽华星化工股份有限公司是市场上的重点竞争对手, 但其技术创新方面与江苏天容集团股份有限公司相比还有一定差距。

(4) 企业成专利申请“主力军”, 企业间研发力差别大, 少进行国际申请。国内相关专利申请主要源于企业, 充分说明越来越多的企业意识到, 专利在技术创新知识产权保护中的重要地位, 其中江苏天容集团股份有限公司的专利量可与一些国际知名企业抗衡, 其他国内企业与之差距较大。

(5) 国内专利申请呈现少和散的局面。沙蚕毒素类仿生农药专利申请人共199位, 前10位申请人专利申请总和占总申请量的21.8%, 集中度较高, 但后99位申请人的专利申请量仅占25.6%, 多数企业仅有1件相关技术专利, 因此总体来看, 沙蚕毒素类仿生农药产业集中度总体较低, 布局分散, 具有国际竞争能力的龙头企业少, 技术较为分散, 并未形成一定的合力。但发明人团队较为庞大, 每件专利申请几乎都有较多的发明人参与, 由于农药研究投入大、周期长的特点, 决定了在此领域需要较大的配合度。

(6) 专利技术点在沙蚕毒素类仿生农药的应用。国内沙蚕毒素类仿生农药技术主要集中在应用类, 一方面新型沙蚕毒素类仿生农药的研发相对较难, 对创新能力和科研实力要求较高;另一方面, 目前单一的沙蚕毒素类仿生农药生产技术相对成熟, 而杀虫剂在应用过程中创新点相对较多, 易于申请专利。

摘要：文章论述了沙蚕毒素类仿生农药的发展概况, 研究了沙蚕毒素类仿生农药专利态势, 得出了相应的结论, 并提出了建议。

关键词：沙蚕毒素类,仿生农药,专利,态势

细菌内毒素检查方法综述 篇2

方法、机理:美国药品食品管理局承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法, 即凝胶法、生色法和动态浊度法[2]。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法, 酶联免疫吸附法。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100, 且灵敏度更高, 抗干扰能力更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂 (TAL) 溶液在试管中混匀, 一般各0.1 ml, (37±1) ℃反应 (60±2) 分钟。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素, 且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度 (λ) 时, 就会在试管中显示阳性反应, 即形成凝胶;否则呈阴性反应, 即呈澄明溶液或轻度混浊, 视内毒素的浓度而定[1]。该反应极其灵敏, 凝胶形成速率与内毒素浓度成正比。

2 影响细菌内毒素检查的因素

2.1

检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分, 都会影响到检查结果的准确性, 只有证实检品对凝集反应无干扰之后, 检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。鲎试剂的非特异性内毒素不是唯一能激活鲎试剂凝集系统的物质, 还有其他物质可以通过G因子这个“旁路”激活鲎试剂的凝集系统。

2.2 影响鲎实验的因素:

混合液的pH6.0～8.0;保温温度: (37±1) ℃;保温时间: (60±2) 分钟;在鲎试验过程中防止试管受到振动;所用器皿均应彻底洗涤干净;阳性对照存在。

3 特殊值的确定

3.1

药品的内毒素限值 (L) 药品细菌内毒素检查是一种限度实验, 首先确定供试品的细菌内毒素限值。当供试品含内毒素低于L值时, 按规定给药途径用药, 就不会引起热原反应;相反就有可能引起热原反应[1]。细菌内毒素限值确定方法有三种。

3.1.1 药典给出药典规定细菌内毒素检查的品种, 在药典正文可以查到相应的L值。

3.1.2根据热原检查的兔剂量计算L=K/M, M规定家兔注射剂量, 以ml/kg等表示;K为规定临床无任何不良反应的内毒素阈值, 以Eu/kg表示。3.1.3根据人的最大注射剂量计算L=K·W/M, M为规定人的最大注射剂量同样以ml/kg等表示;W为人的平均体重, 中国成人按60 kg计算。

3.2 药品的最大有效稀释 (MVD) :用MVD表示。其计算公式如下:MVD=L/λ。

4 重要的实验-预实验

4.1 鲎试剂标示灵敏度的复核实验:

鲎试剂是一种有生物活性的试剂, 稳定性受多种因素的影响, 因此各国的细菌内毒素检查法都规定:每批鲎试剂在用于细菌内毒素检查前都必须对该批试剂标示的灵敏度进行复核。当复核的灵敏度值λ0在标示值λ的0.5-2.0λ范围, 方可用于细菌内毒素检查。

4.2 检品的干扰实验

4.2.1

干扰实验的目的判断某个品种在某种浓度状态下是否宜作细菌内毒素检查, 就需要对其作干扰实验。

4.2.2 干扰实验的方法干扰实验是由两部分实验组成:

其一是鲎试剂与内毒素在水溶液中的反应实验, 这部分与鲎试剂的灵敏度复核实验完全相同。其二是鲎试剂与内毒素在检品溶液中的反应实验。

4.2.3

阳性产品对照用SMVD复溶鲎试剂, 然后加2λ浓度的标准内毒素溶液与之反应, 若反应结果为阴性说明检品对检查有抑制作用。若反应结果为阳性说明检品对检查无抑制作用, 但并未能表示无增强作用。

摘要：细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。针对细菌内毒素检查方法进行论述。

关键词：细菌内毒素检查法,机理,预实验,特殊值

参考文献

[1]黄清泉, 夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志, 1997, 32 (2) :72.

[2]王茂林.鲎试剂法检查热原的应用范围[J].中国医院药学杂志, 1990, 10 (4) :41.

医疗器械的细菌内毒素检验 篇3

1 医疗器械细菌内毒素检验标准

(1) GB/T 14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分:生物学试验方法[1]; (2) 2015年版《中国药典》1143细菌内毒素检查法[2]。

2 医疗器械细菌内毒素检验所需主要设备

(1) 电热干燥箱, 温度达到250℃, 用于除外源性内毒素。 (2) 旋涡混合器。 (3) 试管恒温仪、恒温水浴箱或适宜的恒温器, 可设定温度为 (37±1) ℃。 (4) 天平, 精度为0.1 mg以下。 (5) 鲎试剂, 应具有国家主管部门的批准文号。 (6) 细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品, 应具有国家主管部门的批准文号。 (7) 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准, 其内毒素含量小于0.015 EU/ml (用于凝胶法) 或0.005 EU/ml (用于光度测定法) , 且对内毒素试验无干扰作用。 (8) 实验用具:剪刀、砂轮、试管、三角瓶、试管架、洗耳球、封口膜、75%乙醇棉、时钟、移液管 (或刻度吸管) 、凝集管 (10 mm×75 mm) 、微量加样器及无热原吸头。耐热器皿须经250℃干烤至少30 min。若使用与微量加样器配套的吸头等塑料器具时, 应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

3 试验准备

3.1 玻璃器皿的洗涤

将玻璃器皿放入铬酸洗液中充分浸泡, 然后取出将洗液控干, 用自来水将残留洗液彻底洗净, 再用蒸馏水反复冲洗3遍以上, 控干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内, 放入电热干燥箱。

3.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素

玻璃器皿置电热干燥箱后, 待干燥箱温度升至250℃后开始计时, 干烤30 min以上。达到规定时间后, 关断电源, 待干燥箱温度自然降至室温。

3.3 供试品溶液的制备

供试品应使用细菌内毒素检查用水为浸提介质, 一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的p H值为6.0~8.0为宜。采用无热原氢氧化钠或盐酸溶液调节供试液的p H值。无热原氢氧化钠或盐酸溶液须用细菌内毒素检查用水, 在已去除内毒素的容器中配制。也可使用不含内毒素和干扰因子且经过验证的缓冲液。

4 凝胶法操作方法

利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的机制, 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。如经检验证实供试品对细菌内毒素试验有不能排除的干扰作用则不适宜采用本试验。本试验操作过程应防止内毒素的污染。

4.1 鲎试剂灵敏度复核

在使用一批新的鲎试剂进行供试品细菌内毒素检查或供试品干扰试验前, 实验室必须进行鲎试剂灵敏度复核试验。目的为考察鲎试剂的灵敏度是否准确, 同时也考查检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。

4.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备

取细菌内毒素国家标准品或工作标准品1支, 按照标准品说明书, 加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物, 用封口膜将瓶口封严, 置旋涡混合器上混合15min。然后进行稀释, 制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液, 即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ (λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度) , 每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 s。

4.1.2 待复核鲎试剂的准备

取规格为0.1 ml/支的鲎试剂18支, 每支加入0.1 ml检查用水溶解, 轻轻转动瓶壁, 使内容物充分溶解, 避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1 ml/支时, 取若干支按其标示量加入检查用水复溶, 充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起, 取18支10 mm×75 mm凝集管每管分装0.1 ml, 备用。

4.1.3 加样

在试管架上放入已充分溶解的待复核鲎试剂18支 (管) , 排成5列, 其中4列4支 (管) , 每支分别加入0.1 ml 2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液;1列2支 (管) , 每支分别加入0.1 ml检查用水。结束加样后, 将鲎试剂用封口膜封口, 轻轻振动混匀, 避免产生气泡, 连同试管架放入 (37±1) ℃水浴或适宜恒温器中, 试管架保持水平状态, 保温 (60±2) min。

4.1.4 观察并记录结果

将试管架从水浴或恒温器中轻轻取出, 避免振动, 将每管拿出缓缓倒转180°观察, 若管内形成凝胶, 并且凝胶不变形, 不从管壁滑脱者为阳性, 记录为 (+) ;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性, 记录为 (-) 。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

4.1.5 试验结果计算

最低浓度0.25λ4管均为阴性, 如最大浓度2.0λ4管均为阳性, 阴性对照为阴性时试验为有效, 按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果 (λc)

式中X代表反应终点浓度的对数值 (lg) , 反应终点浓度指系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。n为每个浓度的平行管数。

4.1.6 结果判断

当λc在0.5~2.0λ (包括0.5λ和2.0λ) 时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格, 可用于干扰试验和供试品细菌内毒素检查, 并以λ (标示灵敏度) 为该批鲎试剂的灵敏度。

4.1.7 举例

待复核鲎试剂的灵敏度为0.25 EU/ml。试验结果, 见表1。

所复核鲎试剂λc在0.5~2λ (包括0.5λ和2λ) 范围内, 可用于细菌内毒素检查。并以标示灵敏度0.25 EU/ml为该批鲎试剂的灵敏度。

4.2 干扰试验

目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。

制备溶液A、B、C和D, 制备要求, 见表2。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数 (MVD) 的溶液, 按鲎试剂灵敏度复核试验向下操作。

只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性, 并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时, 试验方为有效。当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时, 认为供试品在该浓度下无干扰作用。其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰, 应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释, 再重复干扰试验。

注:A:供试品溶液;B:干扰试验系列;C:鲎试剂标示灵敏度的对照系列;D:阴性对照;-:空白或无数据

可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法 (如中和、过滤、透析或加热处理等) 排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性, 要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

当进行新产品的内毒素检查试验前, 或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时, 须进行干扰试验。

4.3 供试品细菌内毒素检查[3,4]

在细菌内毒素检查中, 每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照, 同时每次试验须做2支阳性对照和2支阴性对照。

(1) 供试品溶液的制备:首先计算MVD。

式中L为供试品的细菌内毒素限值, 一般以EU/ml、EU/mg或EU/U (活性单位) 表示。C为供试品溶液的浓度, 当L以EU/ml表示时, C等于1.0 ml/ml;当L的单位以EU/mg或EU/U表示时, C的单位需为mg/ml或U/ml。λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度, 在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。

然后将供试品进行稀释, 其稀释倍数不得超过MVD。当L以EU/件为供试品的细菌内毒素限值时, 浸提介质体积V (单位:ml) 的计算公式为:V=L/λ。 (2) 阳性对照溶液的制备:用检查用水将标准品稀释制成2.0λ浓度的内毒素标准溶液。 (3) 供试品阳性对照溶液的制备:用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2.0λ浓度的内毒素溶液。 (4) 阴性对照液即细菌内毒素检查用水。 (5) 鲎试剂的准备:操作同前 (6) 加样:取8支 (管) 溶解好的鲎试剂, 其中2支加入0.1 ml供试品溶液或其稀释液 (其稀释倍数不得超过MVD) 作为供试品管, 2支加入0.1 ml阳性对照溶液作为阳性对照管 (PC) , 2支加入0.1 ml检查用水作为阴性对照 (NC) , 2支加入0.1 ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管 (PPC) 。 (7) 将试管中溶液轻轻混匀后, 用封口膜封闭管口, 垂直放入 (37±1) ℃水浴或适宜恒温器中, 保温 (60±2) min。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 (8) 结果判断:当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时, 试验方为有效。若供试品2管均为阴性, 认为该供试品符合规定;如供试品2管均为阳性, 应认为不符合规定;如2管中1管为阳性, 1管为阴性, 按上述方法另取4支供试品管复试, 4管中如有1管为阳性, 即认为不符合规定。若第一次试验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管均为阳性或2管中1管为阳性时, 按同样方法复试, 复试时要求将其稀释至MVD。 (9) 举例:供试品为注射用水, 其内毒素限值为0.25 EU/ml, 设所用鲎试剂的灵敏度为0.125 EU/ml。

将样品进行2倍稀释, 并做2倍稀释下的供试品阳性对照, 结果显示:供试品阳性对照, 阳性对照及阴性对照结果均有效, 说明该批注射用水内毒素含量<0.25 EU/ml, 符合规定。

5 注意事项

(1) 试验前, 须用肥皂洗手, 用75%乙醇棉球消毒, 试验操作应在清洁环境中进行, 过程中应防止内毒素的污染。 (2) 在使用洗耳球、移液管取样时, 应注意不要将洗耳球中的气体吹入溶液中, 以防止气体中的内毒素进入供试液。 (3) 试验所用器具经250℃干烤30 min以上, 要待烤箱温度升至250℃后开始计时。在不打开金属容器的情况下, 可在2 d内使用;如果玻璃器皿用锡箔纸包装, 在不打开包装的情况下可在两周内使用, 否则须再次干烤。 (4) 开启细菌内毒素国家标准品或工作标准品、鲎试剂时, 先轻弹瓶壁, 使粉末落入瓶底, 然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕, 75%乙醇棉球擦拭后启开, 启开过程中应防止玻璃碎片落入瓶内。 (5) 无菌医疗器械生产企业在生产过程中须严格控制产品初始污染菌, 以免导致灭菌后产品细菌内毒素指标超过限值。 (6) 对于非液态产品企业制定产品技术要求时, 如按EU/ml规定细菌内毒素限值在试验方法中则需明确产品的浸提液体积。 (7) 按GB/T 14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分:生物学试验方法进行供试品细菌内毒素检验时, 供试液应在 (37±1) ℃恒温箱中浸提不小于1 h, 供试液贮存应不超过2 h。 (8) 溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时, 不要剧烈振荡避免产生气泡;试验过程中应注意更换吸头, 以避免检查用水的污染及溶液的交叉污染。 (9) 由于凝集反应是不可逆的, 所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动, 以免使凝胶破碎产生假阴性结果。 (10) 进行干扰试验时, 标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行;如经检验证实供试品对细菌内毒素试验有不能排除的干扰作用则不适宜采用凝胶限度法。 (11) 在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰试验和供试品细菌内毒素检查时, 各个试验中要求的对照应同时进行, 并在试验有效的情况才能进行计算和判断。 (12) 对于一个初包装内有多组件的成套器械, 如规定的内毒素限值是针对成套器械的, 可以用一份浸提液对所有组件浸提, 也可将各组件分别浸提后混合, 各组件所用的浸提液总体积应不超过MVD, 当组合后样品出现结果不确定时, 则需分别检验各组件, 以研究各组件的污染源。 (13) 如一个初包装产品为多个医疗产品的集合, 在临床应用中每种医疗器械独立使用, 则应有各自的产品内毒素限值, 且应分别进行试验和评价。 (14) 2015年版《中国药典》1143细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法, 后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时, 可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时, 除另有规定外, 以凝胶限度试验结果为准。

参考文献

[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化专业委员会.医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分:生物学试验方法:GB/T 14233.2-2005[S].北京:中国标准出版社, 2006.

[2]国家药典委员会.中国药典[M].四部.2015年版.北京:中国医药科技出版社, 2015:154-156.

[3]中国药品生物制品检定所, 中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[M].2010年版.北京:中国医药科技出版社, 2010:310-316.

鲎试剂检测细菌内毒素的体会 篇4

1 鲎试剂的分类

鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的蓝色血液中提取变形细胞溶解物, 经低温冷冻干燥而成的生物试剂, 专用于细菌内毒素检测。

1.1 按原料来源分。

是由美洲鲎血液提取的称美洲鲎试剂 (Limulus Amebocyte Lysate) , 缩写为LAL, 由美国生产;另一种是由东方鲎血液中提取的称东方鲎鲎试剂 (Tachypleus Amebocyte Lysate) , 缩写为TAL。TAL与LAL有相同的功效。

1.2 按实验方法分。

细菌内毒素检查法包括两种方法, 即凝胶法和光度测定法, 后者又包括浊度法和显色基质法[1]。则鲎试剂可分为:凝胶法鲎试剂、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂。

凝胶法鲎试剂通过与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。

动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂则都是定量检测内毒素的。

1.3 按使用特点分。

1.3.1 普通鲎试剂。灵敏度0.5~0.125EU/ml, 适用于仅需要检测内毒素限量的样品。

1.3.2 高灵敏度鲎试剂。灵敏度0.06~0.015EU/ml, 适用于内毒素限量较低的样品细菌内毒素检查。

1.3.3 特异性鲎试剂。灵敏度0.5~0.015EU/ml, 适用于成分较为复杂, 会对鲎试剂产生干扰的样品。

1.3.4 定量法鲎试剂。最低检测限0.03~0.005EU/ml, 适用于需要对内毒素进行定量测定的样品。

2 鲎试剂在细菌内毒素检查法中的正确使用

一般最常用的是家兔发热试验法 (RT) 与鲎试验法 (LT) 。RT为一种定性检测内毒素的方法, 应用历史悠久, 有很多限制, 如家兔对内毒素反应上有个体差异, 敏感度不高、耗时、不能定量检测等。LT具有快速、简便、敏感度高、假阳性少、试剂耗费少等优良, 可广泛应用于注射剂的热原控制, 组液法对非内毒素引起的热原则不敏感。

内毒素检查法结果准确与否与所用鲎试剂的灵敏度相关性很大[2], 而鲎试剂的灵敏度与它的正确使用又密切相关。所以, 一定要严格执行鲎试剂的质量标准, 规范使用鲎试剂。

3 影响细菌内毒素检查的因素

3.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分, 都会影响到检查结果的准确性, 得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。

只有证实检品对凝集反应无干扰之后, 检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。

3.2 鲎试剂的非特异性内毒素不是唯一能激活鲎试剂凝集系统

的物质, 还有其他物质可以通过G因子这个“旁路”激活鲎试剂的凝集系统。因此鲎试剂并不是专一对内毒素反应的试剂。由旁路反应产生的阳性结果称细菌内毒素检查的“假阳性”。

3.3 影响细菌内毒素检查的因素。

3.3.1 混合液的pH6.0~8.0才能形成最佳凝集。

3.3.2 保温温度:温度应为 (37±1) ℃[3]。

3.3.3 保温时间: (60±2) min[3]。

3.3.4 在鲎试验过程中应防止使试管受到振动。

3.3.5 所用器皿均应彻底洗涤和冲洗干净。

3.3.6 阳性对照存在。

3.3.7 鲎试剂的贮存。虽然冻干的鲎试剂在常温条件下是相对稳定的, 但还是应存放在2~8℃下, 避免长时间放置在高于25℃的温度条件下导致因贮藏不当、质量下降而引起的检验误差。

4 建议

4.1 当夏天室温较高时, 控制鲎试剂使用过程中温度的变化, 可通过在冰水浴中进行加样以取得较好效果;

同时, 实验操作从鲎试剂的复溶到放入恒温仪应尽量在1.5h内完成。

4.2 虽然目的鲎试剂相对稳定很多, 但还是应存放于2~8℃的条

件下, 并保持温度的稳定, 如冰箱发生故障, 无法保持温度时, 就应及时换贮存设备。

4.3 对于已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好放置在冰冷的表面上或于2~8℃的冰箱内存放24h以内;

亦或在复溶并冻结后将其存放在-20℃以下, 可存放28天, 但只能冻融一次。

5 应用前景

细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典, 成为一种法定的药检方法, 反映了药典标准水平、药检技术水平的提高, 标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。随着历史的发展, 必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。它具有方法多样化、自动化、微量化的特点。细菌内毒素检查法所具有的优点表明它比家免热原检查法更适应现代制药工业的发展。它可以应用于药检, 也可以用于药品生产质量控制、临床诊断及其它领域。该法用于药品成品的检查, 属于一种事前控制的质控手段, 对提高药品质量, 避免造成药品成批报废有重要意义;在临床上可作为快速诊断革兰氏阴性细菌感染的疾病的一种辅助方法, 但不能区分病原体。

参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典[M].北京:化学工业出版社, 2005.

[2]梁苹, 蔡红.鲎试剂灵敏度对细菌内毒素限量检查的影响[J].华西药学, 1999, 14 (3) :204-204.

酒精性肝病的内毒素信号通路研究 篇5

1 LPS对机体的影响

LPS是革兰阴性菌细胞壁的组成成分, 其化学本质为脂多糖, 它由3个部分组成:碳水化合物“O-抗原”、核心区域的寡糖、脂质部分“类脂A”。只有类脂A基团是有毒性的, 具有激活先天性免疫反应的功能, LPS本身无毒性作用, 在细菌死亡或繁殖活跃时释放, 能够刺激体内多种细胞合成并释放多种内源性生物活性因子;LPS的生物活性很广泛, 可引起发热反应;促进前列腺素合成;促使血管活性物质的释放;降低血压;激活凝血系统和补体;引起局部过敏;影响或参与免疫反应;影响血糖及肿瘤坏死等, 严重的会致死。目前认为, 在ALD的发病过程中, 肠渗漏是引起内毒素血症的主要原因。在正常情况下, 只有少量来自肠道的革兰阴性菌的LPS能穿透肠黏膜进入门脉循环, kupffer细胞和肝细胞通过不同系统识别LPS, 并在肝脏将其清除。Mashall于1998年正式提出“肠-肝轴”的概念, 机体受到刺激后, 一方面肠屏障功能受损, 肠道内细菌和LPS大量进入门静脉系统;另一方面, 肝脏内的细胞被LPS激活, 释放炎性因子, 这些炎性因子可进一步造成肠道黏膜及远隔器官的损伤[1]。过量饮酒时, 在酒精的刺激下, 肠道细菌异常增多, 菌群紊乱, 肠道通透性增强, 肝脏kupffer细胞对LPS的清除能力减弱等, 这些都是引发ALD的原因。

2 LPS信号传导通路

慢性酒精摄入使肠道通透性增强, 肠道LPS通过肠系膜进入门静脉循环, LPS先与内毒素结合蛋白 (LPS binding protein, LBP) 结合形成复合物, 该复合物再结合到kupffer细胞表面的膜白细胞分化抗原14 (CD14) 上, 然后与细胞上带有调节蛋白MD-2的Toll样蛋白4 (TLR4) 结合, 最后激活核转录因子 (NF-κB) , 产生一系列细胞因子, 介导LPS的信号转导, 导致炎症反应和肝脏损伤的发生、发展。

2.1 LPS与LBP的结合

kupffer细胞是位于肝窦内表面的吞噬细胞, 能够清除血液中的外来抗原、抗原抗体复合物和细胞碎片等物质, 是全身单核吞噬细胞系统的重要组成部分, 也是肝脏防御系统主要成员, 在全身和肝脏疾病的发生、发展过程中起重要作用。kupffer细胞形状不规则, 在受到如LPS等刺激而被激活时会发生胞质铺展、体积增大等形变, 同时能够合成并释放多种细胞因子[2]。kupffer细胞与LPS存在相互作用, kupffer细胞可以清除LPS, 而LPS也可以激活kupffer细胞产生多种细胞因子和活性氧介质, 激发肝脏的炎症过程。在ALD的发病过程中, LPS增多, 而kupffer细胞对其清除的能力却减弱了。血液中的LPS与肝脏来源的LBP结合形成复合物。LBP是肝脏合成的急性期血清蛋白, 在应激情况下合成作用明显增强, 是一种可溶性蛋白质, 直接与LPS结合, 促进LPS与CD14的相互作用。Takehiko等人通过对比研究酒精性肝损伤的LBP基因敲除小鼠及野生型小鼠时发现, 酒精对前者肝脏造成的损伤明显轻于后者, 同时肿瘤坏死因子-α (TNF-α) mRNA在LBP基因敲除小鼠中表达下调, 这证实LBP在早期酒精性肝损伤中起重要作用。

2.2 CD14的信号转导

LPS和LBP形成复合物后要与kupffer细胞表面的CD14结合。LBP与LPS结合位点位于LBP肽链的N末端, 与CD14结合位点位于其C端[3]。CD14是kupffer细胞表面LPS的高亲和力受体, 介导LPS信号转导, 激活单核巨噬细胞, 在机体免疫、防御系统引起的一系列反应中起关键作用。CD14蛋白在人体内存在两种形式:膜结合CD14 (m CD14) 和可溶性CD14 (s CD14) 。m CD14是非跨膜糖蛋白, 缺乏跨膜区和胞内区, 通过糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定在细胞表面。s CD14有2个独立的功能结构域:一个是LPS结合区;另一个是介导LPS-CD14与信号传导分子相互作用的区域, 完成CD14结合LPS及激活细胞双重功能[4]。单核细胞表面的m CD14与血清中的s CD14可通过不同途径与LPS相互作用, 导致细胞激活。在ALD发病过程中, 主要是m CD14与LPS-LBP复合物识别并结合, 一方面m CD14传递信息, 介导免疫反应和炎症反应;另一方面介导单核细胞等对LPS-LBP复合物的吞噬, 清除与LBP结合的LPS[5]。

2.3 TLR4与MD-2的信号转导

LPS-LBP复合物与CD14结合后, 由于CD14缺少胞内段, 所以这个复合物要与能延伸至细胞内结构的TLR4结合才可传递信号, 激活细胞。TLR4是TLR家族成员之一, 是由胞外区、跨膜段和胞内区3部分组成的Ⅰ跨膜蛋白, 它能识别LPS的脂质A, 是LPS识别受体复合体的主要组成成分, 介导LPS引起的kupffer细胞活化, 激活NF-κB, 诱导TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子的表达[6,7]。这些细胞因子又反过来作用于kupffer细胞, 引起NF-κB再次激活, 过度地产生细胞因子。试验结果表明, TLR4需要有调节蛋白MD-2的存在才能发挥作用[8]。MD-2是LPS跨膜信号传导的重要调节蛋白, 是与TLR4在胞外区相连的一种分泌蛋白, 可以促进和强化细胞对LPS的反应。仅有细胞表面TLR4表达增强, 而无MD-2存在, TLR4对刺激物是没有反应的。可能是MD-2与TLR4在物理结构上的连接比其单独存在要稳定。

2.4 NF-κB的激活

NF-κB存在于多种细胞内, 参与体内多种基因表达调控, 是由Rel蛋白家族成员组成的二聚体。在哺乳动物中, 这些蛋白包括P50 (NF-κB1) 、P52 (NF-κB2) 、P65 (Rel A) 、Rel B、c-Rel、P105和P100等, 它们构成同源二聚体或异源二聚体存在于细胞质中。NF-κB的抑制蛋白IκB也是一个大的蛋白家族, 包括高等脊椎动物的IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBε、Bcl-3和果蝇的catus蛋白等。在正常情况下, NF-κB以无活性状态存在于胞浆中, 由NF-κB1和Rel构成的二聚体, 与其抑制蛋白 (IκB) 结合形成三聚体, 掩盖NF-κB和IκBa的核定位信号 (NLS) , 进而阻止NF-κB进入细胞核内。当多种外部信号如LPS、TNR-α、细胞因子、双链RNA和病毒感染作用于细胞时, 可诱发IκB家族成员的顺序磷酸化和泛素化, IκB降解并从NF-κB上解离下来, 暴露NF-κB的核定位信号, 使NF-κB通过核孔进入细胞核, 并与特定基因的κB位点结合, 激活靶基因转录, 从而参与细胞分化、发育、凋亡、黏附及炎症反应。在发生ALD情况下, 肝巨噬细胞表达的促炎介质主要受NF-κB调控, LPS介导NF-κB活化进入细胞核, 与DNA上特异的κB位点结合, 诱导其转录和翻译, 产生炎症反应。

3 细胞因子对ALD的作用

细胞因子是一类能在细胞与细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的小分子蛋白质或小分子多肽。根据其在炎症反应中的不同作用分为:促炎细胞因子和抗炎细胞因子。促炎细胞因子包括TNF-α和白细胞介素 (IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等) ;抗炎细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、脂连素、转化生长因子-β (TGF-β) 、IL-1受体抗体 (IL-1ra) 等[9]。

3.1 TNF-α与ALD

TNF-α的变化是肝脏损伤最早发生的活动之一, 刺激其他细胞因子产生。在正常情况下, 肝脏产生少量TNF-α, 但在发生ALD时, 血液中TNF-α水平显著上升。TNF-α的主要作用方式有两种:直接作用和间接作用。长期大量饮酒刺激肝脏kupffer细胞激活NF-κB, 产生致炎因子TNF-α、IL-1等。一方面TNF-α与细胞表面受体TNF-R1及TNF-R2结合诱导细胞死亡。TNF-α通过多种途径诱导细胞凋亡, TNF-α与肿瘤坏死因子受体1 (TNFR1) 结合, TNFR1募集接头分子瘤坏死因子受体死亡结构域 (TRADD) 和Fas相关的死亡区域 (FADD) , 激活caspase级联反应, 最终导致caspase3活化, 细胞核染色质固缩、染色体DNA片段化, 肝细胞凋亡。另一方面TNF-α能激活NF-κB信号通路, 进而增加炎性因子活性, 导致炎性因子IL-1等的合成, 诱导IL-6合成, 进一步加重肝脏炎症反应。TNF-α还可以促进肝脏纤维化形成, A.A.Nanji等[10]研究发现, 抑制NF-κB活性、降低TNF-α水平能明显抑制胶原生成和肝脏纤维化。血清中TNF-α水平与肝脏病变的严重程度及死亡率有关。ALD不仅增加细胞因子的水平和活性, 而且也提高肝细胞对细胞因子的敏感性。随着TNF-α与ALD发病机制的研究越来越清晰, TNF-α已成为治疗ALD新靶点。通过抑制TNF-α的形成与应用TNF-α抗体来治疗ALD。

3.2 其他细胞因子与ALD

TGF-βs通过自分泌、旁分泌、内分泌等方式参与体内细胞反应, 分泌后的TGF-βs大都存在于细胞外基质中, 被认为是与肝脏纤维化密切相关的因子, 对细胞外基质有促进合成和抑制降解作用。研究发现, TGF-β1在各型ALD血清中均升高, 在实验动物及临床病人中均发现TGF-β1的升高与酒精诱导的肝脏纤维化密切相关。细胞外基质 (ECM) 的合成与降解在很大程度上由TGF-β调控。试验结果表明, TGF-β基因表达水平升高后, 胶原合成开始增加, 这提示TGF-β在肝脏纤维化激活过程中有重要作用[11]。

促炎细胞因子IL-1和IL-6也与肝脏损伤的严重程度有关。在ALD患者血液中, IL-1与IL-6水平显著升高。动物试验发现, 酒精使肝脏内IL-1β水平增高;然而临床发现, 在ALD病人血清中IL-10水平明显减少[12]。抗炎细胞因子IL-10具有潜在的抗炎和抗纤维化作用, 可以通过各种机制抑制炎症反应。如可以减少T淋巴细胞分泌IL-2, 通过激活单核细胞及巨噬细胞来减少IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-8的分泌。但是IL-10抗炎反应机制还没有完全弄清楚, 仍需要继续探索。

4 结论

许多因素会改变肝细胞对酒精的敏感性, 最终导致酒精性肝损害。本文主要讨论LPS信号传导通路在ALD发病过程中的作用机制, 酒精使肠道通透发生改变, 肠源性LPS释放到血液中, 与LBP形成复合体, 再与kupffer细胞表面的CD14结合介导信号转导, 激活NF-κB, 产生细胞因子, 各种细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6和TGF-β等进一步活化kupffer细胞, 产生更多的细胞因子, 加重对肝脏的损伤。研究表明, 许多信号通路参与ALD, 但LPS信号传导通路一直是研究的热点。各种证据证明, 信号分子包括CD14、Toll样受体、NF-κB及细胞因子等在ALD发病过程中的重要作用。这将为治疗ALD及药物的研发提供更好的思路和解决方法。

参考文献

[1]刘玉兰, 胡营.“肠-肝轴”带给我们的启示[J].中国内科杂志, 2011, 50 (5) :361-363.

[2]周俊英, 姚树坤.库普弗细胞在酒精性肝病发病机理中的作用[J].国际消化道杂志, 2006, 26 (1) :17-20.

[3]HAILMAN E, LICHENSTEIN H S, WURFEL M M, et al.Lipopolysaccharide (LPS) -binding protein accelerates the binding of LPS to CD14[J].J Exp Med, 1994, 179 (1) :269-277.

[4]STELTER F, BERNHEIDEN M, Menzel R, et al.Mutation of amino acids 39-44 of human CD14 abrogates binding of lipopolysaccharide and Escherichia coli[J].Eur J Biochem, 1997, 243 (1/2) :100-109.

[5]赵虎, 周庭银.CD14的结构和功能[J].免疫学杂志, 2000, 16 (1) :74-77.

[6]ADEREM A, ULEVITCH R J.Toll-like receptors in the induction of the innate immune response[J].Nature, 2000, 406 (6797) :782-787.

[7]MIYASO H, MORIMOTO Y, OZAKI M, et al.Protective effects of nafamostat mesilate on liver injury induced by lipopolysaccharide in rats:possible involvement of CD14 and TLR-4 downregulation on kupffer cells[J].Dig Dis Sci, 2006, 51 (11) :2007-2012.

[8]SHIMAZU R, AKASHI S, OGATA H, et al.MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4[J].J Exp Med, 1999, 189 (11) :1777-1782.

[9]GODUKHIN O V.The role of cytokines in the seizure activity development in the brain[J].Zh Vyssh Nerv Deiat Im I P Pavlova, 2007, 57 (5) :541-552.

[10]NANJI A A, JOKELAINEN K, LAU G K, et al.Arginine reverses ethanol-induced inflammatory and fibrotic changes in liver despite continued ethanol administration[J].J Pharmacol Exp Ther, 2001, 299 (3) :832-839.

[11]党双锁, 李亚萍.TGF-1在肝纤维化研究中的新进展[J].世界华人消化杂志, 2010, 18 (16) :1631-1636.

细菌内毒素检查法的应用进展 篇6

1 细菌内毒素检查法概述

BET是一种体外热源试验法, 它是通过考察药品中存在的微量细菌内毒素而建立起来的, 该法一经创立, 即具备操作简单、实验费用少、结果迅速可得等优点, 除了在临床上用于检测内毒素血症外, 在药品热源检查方面发展迅速。

2 细菌内毒素检查法的国内外发展简述

BET是1968年由美国学者Dr.Levin和Bang首先建立, 作为法定的检查方法, 最早被USPXX (1980版) 正式收载, 随后EP (1987版) BPⅧ1990年增补本, JP1991年改正版相继收载了此法。作为一项新技术、新方法, 细菌内毒素检查法以其突出的优点而得到了迅速发展, 到USPXXIV (2000版) 已有580多种注射用药品采用了此法, 仅有30余种药品因干扰因素难以排除而采用传统的热源法。

与国外相比, 我国在这方面的研究还存在着较大的差距, 由于技术和观念上的原因, 发展较慢。最早应用细菌内毒素检查始于1988年, 由卫生部颁布试行, 随后于中国药典 (1995版) 正式收载, 到中国药典 (2000版) , 共收载了69个品种[1]。随着2010版中国药典的颁布实施, 它将迎来蓬勃发展的阶段, 将被更广泛地应用于各种药品的质量控制。

3 实验方法及其影响因素

3.1 实验方法

细菌内毒素检查法分为凝胶法和定量法两种。凝胶法是一种限量法, 是经典的细菌内毒素检查法。定量法则包括浊度法和显色基质法, 均属于分光光度法。前者是测定凝胶形成过程中伴随的浊度化 (测定波长为360nm) , 又可分为终点浊度法和动态浊度法。其突出优点是定量、快速 (一般少于20min) 、灵敏度高 (可达0.1005Eu/ml) , 仪器价格低, 但过程复杂, 测定范围窄。后者是测定一种特殊底物中释放出来的生色团的方法 (测定波长为405nm或545nm) , 也分为终点显色基质法和动态显色基质法, 优点是快速、灵敏度高 (可达0.1001Eu/ml) 、测定范围宽。

3.2 影响因素

3.2.1 鲎试剂的灵敏度

鲎试剂灵敏度的复核是使用该鲎试剂的前提。中国药典 (2000版) 在灵敏度复核项下规定, 只有当实测值λc在015～210λ (包括015λ和210λ) 时, 方可用于细菌内毒素检查, 并以λ为该批试剂的灵敏度, 同时要求所用鲎试剂的灵敏度须小于供试品的内毒素限值, 因此灵敏度的准确与否直接关系到判断结果的正误, 应尽量选用测定值与标示值一致 (λc =λb) 的鲎试剂。

3.2.2 供试品细菌内毒素限值

以前细菌内毒素的限值是按照热源检查法所需的家兔剂量计算的, 由于家兔剂量往往高于人用最大剂量的几倍甚至几十倍, 势必造成对产品内毒素要求过于严格, 使很多合格产品被判为不合格产品或使药品生产成本增加, 所以在USP、BP和EP 中, 相继采用人用最大剂量来计算药品细菌内毒素的限值。

3.2.3 干扰试验

内毒素实验是鲎试剂在无干扰的条件下与内毒素发生的一种凝集反应, 因此能直接采用该法检查的药品并不多, 绝大多数药品都是通过干扰试验, 排除干扰后采用此法检查的。通常的做法是先根据所使用的鲎试剂的灵敏度和供试品的内毒素限值计算出供试品的最大有效稀释倍数, 然后据此进行干扰初筛试验, 初步筛选出对检查无干扰的样品浓度范围及相应的鲎试剂灵敏度, 最后根据干扰初筛试验所提供的参数进行干扰试验, 确定消除干扰的条件, 进行内毒素检查。

最常用的消除干扰的方法是稀释法, 相关文献报道较多。另外还有冷析法、化学法、溶剂抽提法、调节pH值法、超滤法等。

3.2.4 阳性对照 (PC) 和阴性对照 (NC)

PC主要是用来证明在试验条件下鲎试剂的灵敏度符合规定。NC的目的在于证明所用的内毒素检查用水中不存在可被检查到的内毒素。中国药典 (2000版) 增加了供试品阳性对照 (PPC) , 目的在于证明本试验条件下被检查的供试品溶液不存在抑制因素[2]。只有在PC (+) 、NC (-) 、PPC (+) 时, 内毒素检查的结果才有意义。

4 细菌内毒素检查法的应用

4.1 凝胶法

凝胶法是经典的内毒素限度检查方法, 在早期取代传统的热源检查法过程中发挥了重要作用, 但因是限度检查, 不能直接反映药品中内毒素量值, 且不同操作者之间误差较大, 已不能适应实际工作的需要。中国药典 (2000版) 在附录XIXF“细菌内毒素检查法应用指导原则”下附有“细菌内毒素定量法”, 但规定“鉴于与凝胶法有不同的测定原理, 当测定结果有争议时, 以凝胶法为准”, 可见凝胶法的法律意义。

4.2定量法

目前应用较广的是动态浊度法。与凝胶法相比, 内毒素动态定量分析技术最大限度地消除了内毒素标准品对试验结果的影响, 在标准曲线建立后, 试验结果不再受内毒素标准品准确性的影响, 同时建立在定量分析基础上的回收率更具科学性, 对样品干扰行为的描述更为准确, 尤其对于当前新兴的中药注射剂而言, 其定量意义更为重要。

5结语

通过查阅文献, 发现某些样品由不同检测者检测得到的结果差别较大。如对同是氧氟沙星葡萄糖注射液, 隋妍蕾等[3]报道结果与董建英等[4]报道结果存在较大的差异。因此必须加强细菌内毒素检查法的质量控制, 减少人为误差, 使之系统工程化。

因定量法能更真实、更客观地反映药品的内在质量, 其应用已得到广泛认同, 近年来相关报道也急剧增多, 但由于经济、技术等方面的原因, 还未得到普遍开展, 因此须进一步加大投入, 加强这方面的基础研究。

摘要：细菌内毒素检查法正以其突出的优点得到日益广泛的应用, 但国内多用于限度检查, 定量法应用尚待普及。本文就细菌内毒素检查法在药品热源检查方面的研究、应用和进展进行综述。

关键词：细菌内毒素检查,应用,进展

参考文献

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[M].二部.北京:化学工业出版社, 2000:附录86.

[2]黄清泉, 夏振民.浅谈细菌内毒素检查法中的供试品阳性对照[J].药物分析杂志, 1998, 18 (5) :353.

[3]隋妍蕾, 张建国, 于秀芬, 等.氧氟沙星注射液细菌内毒素检查法的研究[J].中国现代应用药学, 2001, 18 (1) :62.

细菌内毒素法检查5%果糖注射液 篇7

1 仪器与试药

1.1 器械

XW-80旋涡混合器 (上海第一医学院仪器厂) ;DL-203B电热干燥箱 (天津实验仪器厂) ;S648型电热恒温水浴锅 (上海医疗器械七厂) ;吸管 (0.1mL、0.5mL、1mL、5mL) ;凝集管 (75mL/100mm) ;稀释用普通小试管、吸耳球、封口膜、试管架。所用玻璃器皿必须用25℃干热1h。

1.2 鲎试剂

批号:0603031, 规格:0.5mL, 灵敏度:0.5Eu/mL, 湛江安度斯生物有限公司;批号:051211, 规格:0.6mL, 灵敏度:0.5Eu/mL, 湛江海洋博康生物有限公司;批号:0603190, 规格:0.1mL, 灵敏度:0.25Eu/mL, 湛江海洋博康生物有限公司。

1.3 细菌内毒素检查用水

批号:20031210, 规格:10mL, 湛江海洋博康生物有限公司。

1.4 细菌内毒素工作标准品

批号:2006-4, 规格:160Eu/支, 中国药品生物制品检定所。

1.5 供试品

果糖注射液 (江苏正大丰海制药有限公司) 。规格:250mL:12.5g。批号:0703184, 0704162, 0704202。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值的确定

根据L=K/M, L为供试品细菌内毒素限值, K为内毒素阈值, 即每人每小时最大可接受的内毒素剂量, 注射剂为5Eu/ (kg·h) , M为每人用每公斤体重每小时的最大剂量, 本品临床用量为250~500mL, 人以60kg计, L理论值为0.6Eu/mL, 参照2006年《新品种建立细菌内毒素检查法指导原则》中对于100mL以上大输液的内毒素限值可定为0.5Eu/mL, 拟订本品内毒素限值L为0.5Eu/mL。

注:λc为鲎试剂灵敏度测定值。

2.2 鲎试剂灵敏度 (λ) 的复核

用细菌内毒素检查用水溶解细菌内毒素工作标准品, 制成含内毒素1.0, 0.5, 0.25, 0.125λ四个浓度的溶液, 每一浓度平行做4支, 同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管进行灵敏度复核, 结果均符合规定, 见表1。

2.3 供试品的干扰实验

细菌内毒素标准溶液的制备:用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素标准品稀释成2, 1, 0.5, 0.25λ的内毒素标准溶液。供试品内毒素溶液的制备:用不同浓度的供试品将同一支标准品制成2, 1, 0.5, 0.25λ的供试品内毒素溶液。用鲎试剂与上述2个内毒素溶液反应, Es (为细菌内毒素检查用水制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值) 在0.5~2λ之间, 该供试品原液无干扰作用。

2.4 供试品的细菌内毒素检查

根据干扰试验结果和拟定的细菌内毒素限值0.5Eu/mL, 根据公式MVD=C·L/λ, 用0.25Eu/mL鲎试剂, 将果糖注射液稀释2倍, 进行细菌内毒素检查, 结果均符合规定, 见表2。

3 讨论

试验表明, 果糖注射液原液对内毒素无干扰作用, 可以用细菌内毒素检查代替热源检查。其限值为每1毫升中含内毒素的量应小于0.5Eu。

参考文献