细菌内毒素检验

细菌内毒素检验（精选8篇）

细菌内毒素检验 篇1

细菌内毒素检查法是利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素, 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

1 医疗器械细菌内毒素检验标准

(1) GB/T 14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分:生物学试验方法[1]; (2) 2015年版《中国药典》1143细菌内毒素检查法[2]。

2 医疗器械细菌内毒素检验所需主要设备

(1) 电热干燥箱, 温度达到250℃, 用于除外源性内毒素。 (2) 旋涡混合器。 (3) 试管恒温仪、恒温水浴箱或适宜的恒温器, 可设定温度为 (37±1) ℃。 (4) 天平, 精度为0.1 mg以下。 (5) 鲎试剂, 应具有国家主管部门的批准文号。 (6) 细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品, 应具有国家主管部门的批准文号。 (7) 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准, 其内毒素含量小于0.015 EU/ml (用于凝胶法) 或0.005 EU/ml (用于光度测定法) , 且对内毒素试验无干扰作用。 (8) 实验用具:剪刀、砂轮、试管、三角瓶、试管架、洗耳球、封口膜、75%乙醇棉、时钟、移液管 (或刻度吸管) 、凝集管 (10 mm×75 mm) 、微量加样器及无热原吸头。耐热器皿须经250℃干烤至少30 min。若使用与微量加样器配套的吸头等塑料器具时, 应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

3 试验准备

3.1 玻璃器皿的洗涤

将玻璃器皿放入铬酸洗液中充分浸泡, 然后取出将洗液控干, 用自来水将残留洗液彻底洗净, 再用蒸馏水反复冲洗3遍以上, 控干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内, 放入电热干燥箱。

3.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素

玻璃器皿置电热干燥箱后, 待干燥箱温度升至250℃后开始计时, 干烤30 min以上。达到规定时间后, 关断电源, 待干燥箱温度自然降至室温。

3.3 供试品溶液的制备

供试品应使用细菌内毒素检查用水为浸提介质, 一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的p H值为6.0~8.0为宜。采用无热原氢氧化钠或盐酸溶液调节供试液的p H值。无热原氢氧化钠或盐酸溶液须用细菌内毒素检查用水, 在已去除内毒素的容器中配制。也可使用不含内毒素和干扰因子且经过验证的缓冲液。

4 凝胶法操作方法

利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的机制, 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。如经检验证实供试品对细菌内毒素试验有不能排除的干扰作用则不适宜采用本试验。本试验操作过程应防止内毒素的污染。

4.1 鲎试剂灵敏度复核

在使用一批新的鲎试剂进行供试品细菌内毒素检查或供试品干扰试验前, 实验室必须进行鲎试剂灵敏度复核试验。目的为考察鲎试剂的灵敏度是否准确, 同时也考查检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。

4.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备

取细菌内毒素国家标准品或工作标准品1支, 按照标准品说明书, 加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物, 用封口膜将瓶口封严, 置旋涡混合器上混合15min。然后进行稀释, 制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液, 即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ (λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度) , 每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 s。

4.1.2 待复核鲎试剂的准备

取规格为0.1 ml/支的鲎试剂18支, 每支加入0.1 ml检查用水溶解, 轻轻转动瓶壁, 使内容物充分溶解, 避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1 ml/支时, 取若干支按其标示量加入检查用水复溶, 充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起, 取18支10 mm×75 mm凝集管每管分装0.1 ml, 备用。

4.1.3 加样

在试管架上放入已充分溶解的待复核鲎试剂18支 (管) , 排成5列, 其中4列4支 (管) , 每支分别加入0.1 ml 2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液;1列2支 (管) , 每支分别加入0.1 ml检查用水。结束加样后, 将鲎试剂用封口膜封口, 轻轻振动混匀, 避免产生气泡, 连同试管架放入 (37±1) ℃水浴或适宜恒温器中, 试管架保持水平状态, 保温 (60±2) min。

4.1.4 观察并记录结果

将试管架从水浴或恒温器中轻轻取出, 避免振动, 将每管拿出缓缓倒转180°观察, 若管内形成凝胶, 并且凝胶不变形, 不从管壁滑脱者为阳性, 记录为 (+) ;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性, 记录为 (-) 。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

4.1.5 试验结果计算

最低浓度0.25λ4管均为阴性, 如最大浓度2.0λ4管均为阳性, 阴性对照为阴性时试验为有效, 按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果 (λc)

式中X代表反应终点浓度的对数值 (lg) , 反应终点浓度指系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。n为每个浓度的平行管数。

4.1.6 结果判断

当λc在0.5~2.0λ (包括0.5λ和2.0λ) 时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格, 可用于干扰试验和供试品细菌内毒素检查, 并以λ (标示灵敏度) 为该批鲎试剂的灵敏度。

4.1.7 举例

待复核鲎试剂的灵敏度为0.25 EU/ml。试验结果, 见表1。

所复核鲎试剂λc在0.5~2λ (包括0.5λ和2λ) 范围内, 可用于细菌内毒素检查。并以标示灵敏度0.25 EU/ml为该批鲎试剂的灵敏度。

4.2 干扰试验

目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。

制备溶液A、B、C和D, 制备要求, 见表2。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数 (MVD) 的溶液, 按鲎试剂灵敏度复核试验向下操作。

只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性, 并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时, 试验方为有效。当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时, 认为供试品在该浓度下无干扰作用。其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰, 应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释, 再重复干扰试验。

注:A:供试品溶液;B:干扰试验系列;C:鲎试剂标示灵敏度的对照系列;D:阴性对照;-:空白或无数据

可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法 (如中和、过滤、透析或加热处理等) 排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性, 要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

当进行新产品的内毒素检查试验前, 或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时, 须进行干扰试验。

4.3 供试品细菌内毒素检查[3,4]

在细菌内毒素检查中, 每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照, 同时每次试验须做2支阳性对照和2支阴性对照。

(1) 供试品溶液的制备:首先计算MVD。

式中L为供试品的细菌内毒素限值, 一般以EU/ml、EU/mg或EU/U (活性单位) 表示。C为供试品溶液的浓度, 当L以EU/ml表示时, C等于1.0 ml/ml;当L的单位以EU/mg或EU/U表示时, C的单位需为mg/ml或U/ml。λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度, 在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。

然后将供试品进行稀释, 其稀释倍数不得超过MVD。当L以EU/件为供试品的细菌内毒素限值时, 浸提介质体积V (单位:ml) 的计算公式为:V=L/λ。 (2) 阳性对照溶液的制备:用检查用水将标准品稀释制成2.0λ浓度的内毒素标准溶液。 (3) 供试品阳性对照溶液的制备:用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2.0λ浓度的内毒素溶液。 (4) 阴性对照液即细菌内毒素检查用水。 (5) 鲎试剂的准备:操作同前 (6) 加样:取8支 (管) 溶解好的鲎试剂, 其中2支加入0.1 ml供试品溶液或其稀释液 (其稀释倍数不得超过MVD) 作为供试品管, 2支加入0.1 ml阳性对照溶液作为阳性对照管 (PC) , 2支加入0.1 ml检查用水作为阴性对照 (NC) , 2支加入0.1 ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管 (PPC) 。 (7) 将试管中溶液轻轻混匀后, 用封口膜封闭管口, 垂直放入 (37±1) ℃水浴或适宜恒温器中, 保温 (60±2) min。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 (8) 结果判断:当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时, 试验方为有效。若供试品2管均为阴性, 认为该供试品符合规定;如供试品2管均为阳性, 应认为不符合规定;如2管中1管为阳性, 1管为阴性, 按上述方法另取4支供试品管复试, 4管中如有1管为阳性, 即认为不符合规定。若第一次试验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管均为阳性或2管中1管为阳性时, 按同样方法复试, 复试时要求将其稀释至MVD。 (9) 举例:供试品为注射用水, 其内毒素限值为0.25 EU/ml, 设所用鲎试剂的灵敏度为0.125 EU/ml。

将样品进行2倍稀释, 并做2倍稀释下的供试品阳性对照, 结果显示:供试品阳性对照, 阳性对照及阴性对照结果均有效, 说明该批注射用水内毒素含量<0.25 EU/ml, 符合规定。

5 注意事项

(1) 试验前, 须用肥皂洗手, 用75%乙醇棉球消毒, 试验操作应在清洁环境中进行, 过程中应防止内毒素的污染。 (2) 在使用洗耳球、移液管取样时, 应注意不要将洗耳球中的气体吹入溶液中, 以防止气体中的内毒素进入供试液。 (3) 试验所用器具经250℃干烤30 min以上, 要待烤箱温度升至250℃后开始计时。在不打开金属容器的情况下, 可在2 d内使用;如果玻璃器皿用锡箔纸包装, 在不打开包装的情况下可在两周内使用, 否则须再次干烤。 (4) 开启细菌内毒素国家标准品或工作标准品、鲎试剂时, 先轻弹瓶壁, 使粉末落入瓶底, 然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕, 75%乙醇棉球擦拭后启开, 启开过程中应防止玻璃碎片落入瓶内。 (5) 无菌医疗器械生产企业在生产过程中须严格控制产品初始污染菌, 以免导致灭菌后产品细菌内毒素指标超过限值。 (6) 对于非液态产品企业制定产品技术要求时, 如按EU/ml规定细菌内毒素限值在试验方法中则需明确产品的浸提液体积。 (7) 按GB/T 14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分:生物学试验方法进行供试品细菌内毒素检验时, 供试液应在 (37±1) ℃恒温箱中浸提不小于1 h, 供试液贮存应不超过2 h。 (8) 溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时, 不要剧烈振荡避免产生气泡;试验过程中应注意更换吸头, 以避免检查用水的污染及溶液的交叉污染。 (9) 由于凝集反应是不可逆的, 所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动, 以免使凝胶破碎产生假阴性结果。 (10) 进行干扰试验时, 标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行;如经检验证实供试品对细菌内毒素试验有不能排除的干扰作用则不适宜采用凝胶限度法。 (11) 在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰试验和供试品细菌内毒素检查时, 各个试验中要求的对照应同时进行, 并在试验有效的情况才能进行计算和判断。 (12) 对于一个初包装内有多组件的成套器械, 如规定的内毒素限值是针对成套器械的, 可以用一份浸提液对所有组件浸提, 也可将各组件分别浸提后混合, 各组件所用的浸提液总体积应不超过MVD, 当组合后样品出现结果不确定时, 则需分别检验各组件, 以研究各组件的污染源。 (13) 如一个初包装产品为多个医疗产品的集合, 在临床应用中每种医疗器械独立使用, 则应有各自的产品内毒素限值, 且应分别进行试验和评价。 (14) 2015年版《中国药典》1143细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法, 后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时, 可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时, 除另有规定外, 以凝胶限度试验结果为准。

参考文献

[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化专业委员会.医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分:生物学试验方法:GB/T 14233.2-2005[S].北京:中国标准出版社, 2006.

[2]国家药典委员会.中国药典[M].四部.2015年版.北京:中国医药科技出版社, 2015:154-156.

[3]中国药品生物制品检定所, 中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[M].2010年版.北京:中国医药科技出版社, 2010:310-316.

[4]国家食品药品监督管理局.细菌内毒素试验方法常规控制与跳批检验.YY/T 0618-2007[S].北京:中国标准出版社, 2007.

脆弱的细菌,顽强的毒素 篇2

前不久，一批不合格的水饺又让人们认识了一个新名词：金黄色葡萄球菌。工商部门在水饺中检测到了它的存在，在2011年12月21日前施行的国家标准中，速冻水饺中“不得检出”该细菌，所以这批水饺需要下架召回。厂家承认了水饺中检出金黄色葡萄球菌的事情，不过宣称“按照即将施行的新国标，就是合格产品”。

金黄色葡萄球菌到底是种什么样的细菌?为什么国家标准会“降低”?作为消费者，我们又该如何保护自己呢?

脆弱的细菌产生顽强的毒素

金黄色葡萄球菌是一种球状细菌，在显微镜下看，它们聚集成簇，像葡萄一样。不管有没有氧气的存在，它们都可以生长。在良好的营养环境中，它们会长成黄色的“菌落”。

这种细菌在自然界广泛存在，人和动物是它们的优良居所。在我们身上，鼻子、喉和手是最适合它们生长的地方。此外，如果有伤口，伤口处也容易大量滋生这种细菌。

它们对温度很敏感，在高温下相当脆弱。超过46℃，就有细菌hold不住了；在55℃下，它们中的90％撑不过3分钟；煮饺子的温度，对它们比“秒杀”还要迅速。

不过，它们“作恶”并不是通过自身，而是由生前分泌的毒素来完成。这些胃肠道毒素会引起恶心、呕吐、胃痉挛和腹泻等症状。这种中毒是急性的，一般在1到6小时之内发作，最快的甚至半小时就出现症状。大多数症状不会严重，在两三天内会恢复健康。

虽然它们很脆弱，但是它们的毒素极为顽强，在牛奶中，加热70分钟之后都还会有10％的活性留下。它们的毒性也比较强，1微克就可以引发症状。如果食物中的金黄色葡萄球菌达到每毫升10万个，就能够产生这个水平的毒素。

因为细菌本身很容易杀灭，而真正的罪魁祸首毒素却能够经受酷热考验，所以金黄色葡萄球菌的检测结果高，可以“充分”判定食物受到了污染，但是，检测结果低却不能说明该食物就一定没有问题。比如说，如果一种食物曾经被该细菌大量污染，然后又经过加热，那么检测结果将是“细菌数合格”，但其中同样可能存在足以致病的毒素。

最容易感染金黄色葡萄球菌的食物有：肉类、禽类、蛋类、水产类、奶制品，等等。

国家标准与国际标准的区别

消费者都希望食物“绝对安全”，对于“可能危害健康”的东西“零容忍”。但是这并不现实。就金黄色葡萄球菌来说，因为它在自然界，尤其是人体中广泛存在，要实现“零容忍”将会使生产成本大大提高。生产成本的增加，最终还是要由消费者来埋单。

因为金黄色葡萄球菌产生毒素需要比较多的细菌，像控制沙门氏菌那样追求“零容忍”也没有必要。国际微生物规格委员会制定的《食品微生物限量规定》中，有对各种食物中金黄色葡萄球菌的要求。其中没有速冻水饺，不过有“冷冻面食”和“冷冻禽肉”可以参考。

食品中的微生物往往不是均匀分布，所以取样和检测方法很关键。对于这两种食品，国际微生物规格委员会的规定是：取5个样品分别检测，只要有1个样品的金黄色葡萄球菌超过每克10000个，就不合格。对于冷冻面食，如果只有1个样品的菌数高于每克100个但是不超过10000个，那么也算合格；如果有2个或者更多这样的样品，则不合格。而对于冷冻禽肉，则是允许1个样品高于每克1000个但是不超过10000个，而其他4个样品都不超过1000即可。在其他食品中的规定不尽相同，不过也都允许一定量的存在。

现行国家标准中，规定速冻水饺中“不得检出”金黄色葡萄球菌。与国际标准相比，的确是过于严格了。不清楚实际上执行得如何，至少从法规制定的角度来说，是没有必要的。在新国标的征求建议稿中，标准改成了与国际标准中的冷冻禽肉一致，就比较合理了。

六招赶走“脆弱的凶手”

金黄色葡萄球菌的感染，不仅仅会发生在工业食品中，自制食品同样也有感染风险。为了避免金黄色葡萄球菌感染，美国疾控中心提供如下建议：

1.制备食物之前用肥皂和水充分洗手，尤其是指甲内；

2.鼻子或者眼睛感染时不要去制备食物；

3.手或者手腕有伤口时不要制备食物，也不要给其他人端送食物；

4.保持厨房与就餐区域的清洁卫生；

5.如果食物要保存2小时以上，要么在60℃以上保温，要么在4℃以下冷藏；

6.做好的食物装在宽而浅的容器中尽快冷藏。

细菌内毒素检验 篇3

1 临床材料

1.1 一般材料

鲎试剂 (动态浊度法专用) , 福建省福州东方鲎试剂厂生产的批号:990820, 灵敏度:0.5EU/mL, 装量:0.5mL/支。细菌内毒素检查用水, 批号:000313, 装量:2mL/支, 湛江海洋生物制品厂生产。细菌内毒素国家标准品, 批号:981, 装量:9000EU/支, 中检所制。乳酸环丙沙星注射液:广西裕源药业有限公司国药准字H20033501, 批号:201012856 201035846 201052321 201003656 201045741, 每瓶100mL。

1.2 实验材料

器皿自动旋涡混合器:天津药典标准仪器厂;DC-3型干式恒温器:南京三爱斯技术有限开发公司;试管、吸管等所需器皿均经250℃lh除去外源性内毒素。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值的确定

乳酸环丙沙星注射液热源检查剂量按家兔体重每1kg注射3mL。静脉给药时无任何不良反应的内毒素阈剂量K=5Eu/Kg, 依据2000年版药典规定本品热原检查注射液剂量M=12mL/kg[2], 本品细菌内毒素理论限值L=0.417Eu/mL。

2.2 最大有效稀释倍数

L值确定后, 根据所用鲎试剂的λb值确定样品的稀释倍数。最大有效稀释倍数MVD=L/λb[3], 本实验采用λb为0.5Eu/mL的鲎试剂, 0.1%乳酸环丙沙星注射液MVD=1.2。

2.3 抑制增强试验

我们采用λ=0.5.5Eu/mL的鲎试剂做抑制增强试验[4]。用细

菌内毒素检查用水将乳酸环丙沙星注射液稀释3.2倍;将内毒素工作标准品用乳酸环丙沙星注射液稀释液样品溶液溶解, 在旋涡混合器上进行混合15min, 然后制备成合适的稀释浓度, 1.0Eu/mL0.5Eu/mL, 0.25Eu/mL, 0.125Eu/mL;进行抑制增强试验, 乳酸环丙沙星注射液稀释液样品溶液代替水为阴性对照, 测的了批样品的反应结果一致;说明0.1%乳酸环丙沙星注射液对细菌内毒素检查无干扰, 具体见表1。

2.4 样品的细菌内毒素检测

将5批样品与0.5Eu/mL鲎试剂混合后, 按细菌内毒素检查法检查, 均为阴性。5批样品家兔热原检查结果 (按照中国药典1995年版操作) 均为阴性, 与细菌内毒素检查法检查结果相同。

3 结语

中国药典200年版规定, 乳酸环丙沙星注射的热原检查采用家兔检查法[5];通过我们对本次实验结果表明, 0.1%乳酸环丙沙星注射液采用细菌内毒素检查法 (BET) 进行热原检查, 该方法简便快速, 可以取代家兔法检查热原。鲎试剂检验方法更简便、快速、灵敏、准确[6]。

摘要：目的 探讨研究乳酸环丙沙星注射液细菌内毒素检验方法。方法 采用鲎试剂细菌内毒素检查法进行乳酸环丙沙星注射液细菌内毒素检验。结果 0.1%乳酸环丙沙星注射液对细菌内毒素检查无干扰;5批样品家兔热原检查结果均为阴性, 与细菌内毒素检查法检查结果相同。结论 乳酸环丙沙星注射液采用细菌内毒素检查法 (BET) 进行热原检查, 该方法简便快速, 可以取代家兔法检查热原。鲎试剂检验方法更简便、快速、灵敏、准确。

关键词：乳酸环丙沙星注射液,细菌内毒素,检验方法,分析

参考文献

[1]曲道杰.20%、25%、50%葡萄糖注射液细菌内毒索检验方法的试验研究[J].药物分析杂志, 2006, 15 (3) :305～308.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典 (一部) [M].北京:化学工业出版社, 2005:附录86, 204.

[3]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社, 2001:389.

[4]黄俊.乳酸环丙沙星注射液细菌内毒素检查法的建立[J].广西医学, 2009, 31 (5) :875.

[5]陈铭军.鲎实验法检查乳酸环丙沙星注射液的细菌内毒素限量[J].广西中医学院学报, 2000, 17 (1) :53.

细菌内毒素检查方法综述 篇4

方法、机理:美国药品食品管理局承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法, 即凝胶法、生色法和动态浊度法[2]。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法, 酶联免疫吸附法。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100, 且灵敏度更高, 抗干扰能力更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂 (TAL) 溶液在试管中混匀, 一般各0.1 ml, (37±1) ℃反应 (60±2) 分钟。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素, 且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度 (λ) 时, 就会在试管中显示阳性反应, 即形成凝胶;否则呈阴性反应, 即呈澄明溶液或轻度混浊, 视内毒素的浓度而定[1]。该反应极其灵敏, 凝胶形成速率与内毒素浓度成正比。

2 影响细菌内毒素检查的因素

2.1

检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分, 都会影响到检查结果的准确性, 只有证实检品对凝集反应无干扰之后, 检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。鲎试剂的非特异性内毒素不是唯一能激活鲎试剂凝集系统的物质, 还有其他物质可以通过G因子这个“旁路”激活鲎试剂的凝集系统。

2.2 影响鲎实验的因素:

混合液的pH6.0～8.0;保温温度: (37±1) ℃;保温时间: (60±2) 分钟;在鲎试验过程中防止试管受到振动;所用器皿均应彻底洗涤干净;阳性对照存在。

3 特殊值的确定

3.1

药品的内毒素限值 (L) 药品细菌内毒素检查是一种限度实验, 首先确定供试品的细菌内毒素限值。当供试品含内毒素低于L值时, 按规定给药途径用药, 就不会引起热原反应;相反就有可能引起热原反应[1]。细菌内毒素限值确定方法有三种。

3.1.1 药典给出药典规定细菌内毒素检查的品种, 在药典正文可以查到相应的L值。

3.1.2根据热原检查的兔剂量计算L=K/M, M规定家兔注射剂量, 以ml/kg等表示;K为规定临床无任何不良反应的内毒素阈值, 以Eu/kg表示。3.1.3根据人的最大注射剂量计算L=K·W/M, M为规定人的最大注射剂量同样以ml/kg等表示;W为人的平均体重, 中国成人按60 kg计算。

3.2 药品的最大有效稀释 (MVD) :用MVD表示。其计算公式如下:MVD=L/λ。

4 重要的实验-预实验

4.1 鲎试剂标示灵敏度的复核实验:

鲎试剂是一种有生物活性的试剂, 稳定性受多种因素的影响, 因此各国的细菌内毒素检查法都规定:每批鲎试剂在用于细菌内毒素检查前都必须对该批试剂标示的灵敏度进行复核。当复核的灵敏度值λ0在标示值λ的0.5-2.0λ范围, 方可用于细菌内毒素检查。

4.2 检品的干扰实验

4.2.1

干扰实验的目的判断某个品种在某种浓度状态下是否宜作细菌内毒素检查, 就需要对其作干扰实验。

4.2.2 干扰实验的方法干扰实验是由两部分实验组成:

其一是鲎试剂与内毒素在水溶液中的反应实验, 这部分与鲎试剂的灵敏度复核实验完全相同。其二是鲎试剂与内毒素在检品溶液中的反应实验。

4.2.3

阳性产品对照用SMVD复溶鲎试剂, 然后加2λ浓度的标准内毒素溶液与之反应, 若反应结果为阴性说明检品对检查有抑制作用。若反应结果为阳性说明检品对检查无抑制作用, 但并未能表示无增强作用。

摘要：细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。针对细菌内毒素检查方法进行论述。

关键词：细菌内毒素检查法,机理,预实验,特殊值

参考文献

[1]黄清泉, 夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志, 1997, 32 (2) :72.

[2]王茂林.鲎试剂法检查热原的应用范围[J].中国医院药学杂志, 1990, 10 (4) :41.

鲎试剂检测细菌内毒素的体会 篇5

1 鲎试剂的分类

鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的蓝色血液中提取变形细胞溶解物, 经低温冷冻干燥而成的生物试剂, 专用于细菌内毒素检测。

1.1 按原料来源分。

是由美洲鲎血液提取的称美洲鲎试剂 (Limulus Amebocyte Lysate) , 缩写为LAL, 由美国生产;另一种是由东方鲎血液中提取的称东方鲎鲎试剂 (Tachypleus Amebocyte Lysate) , 缩写为TAL。TAL与LAL有相同的功效。

1.2 按实验方法分。

细菌内毒素检查法包括两种方法, 即凝胶法和光度测定法, 后者又包括浊度法和显色基质法[1]。则鲎试剂可分为:凝胶法鲎试剂、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂。

凝胶法鲎试剂通过与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。

动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂则都是定量检测内毒素的。

1.3 按使用特点分。

1.3.1 普通鲎试剂。灵敏度0.5~0.125EU/ml, 适用于仅需要检测内毒素限量的样品。

1.3.2 高灵敏度鲎试剂。灵敏度0.06~0.015EU/ml, 适用于内毒素限量较低的样品细菌内毒素检查。

1.3.3 特异性鲎试剂。灵敏度0.5~0.015EU/ml, 适用于成分较为复杂, 会对鲎试剂产生干扰的样品。

1.3.4 定量法鲎试剂。最低检测限0.03~0.005EU/ml, 适用于需要对内毒素进行定量测定的样品。

2 鲎试剂在细菌内毒素检查法中的正确使用

一般最常用的是家兔发热试验法 (RT) 与鲎试验法 (LT) 。RT为一种定性检测内毒素的方法, 应用历史悠久, 有很多限制, 如家兔对内毒素反应上有个体差异, 敏感度不高、耗时、不能定量检测等。LT具有快速、简便、敏感度高、假阳性少、试剂耗费少等优良, 可广泛应用于注射剂的热原控制, 组液法对非内毒素引起的热原则不敏感。

内毒素检查法结果准确与否与所用鲎试剂的灵敏度相关性很大[2], 而鲎试剂的灵敏度与它的正确使用又密切相关。所以, 一定要严格执行鲎试剂的质量标准, 规范使用鲎试剂。

3 影响细菌内毒素检查的因素

3.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分, 都会影响到检查结果的准确性, 得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。

只有证实检品对凝集反应无干扰之后, 检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。

3.2 鲎试剂的非特异性内毒素不是唯一能激活鲎试剂凝集系统

的物质, 还有其他物质可以通过G因子这个“旁路”激活鲎试剂的凝集系统。因此鲎试剂并不是专一对内毒素反应的试剂。由旁路反应产生的阳性结果称细菌内毒素检查的“假阳性”。

3.3 影响细菌内毒素检查的因素。

3.3.1 混合液的pH6.0~8.0才能形成最佳凝集。

3.3.2 保温温度:温度应为 (37±1) ℃[3]。

3.3.3 保温时间: (60±2) min[3]。

3.3.4 在鲎试验过程中应防止使试管受到振动。

3.3.5 所用器皿均应彻底洗涤和冲洗干净。

3.3.6 阳性对照存在。

3.3.7 鲎试剂的贮存。虽然冻干的鲎试剂在常温条件下是相对稳定的, 但还是应存放在2~8℃下, 避免长时间放置在高于25℃的温度条件下导致因贮藏不当、质量下降而引起的检验误差。

4 建议

4.1 当夏天室温较高时, 控制鲎试剂使用过程中温度的变化, 可通过在冰水浴中进行加样以取得较好效果;

同时, 实验操作从鲎试剂的复溶到放入恒温仪应尽量在1.5h内完成。

4.2 虽然目的鲎试剂相对稳定很多, 但还是应存放于2~8℃的条

件下, 并保持温度的稳定, 如冰箱发生故障, 无法保持温度时, 就应及时换贮存设备。

4.3 对于已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好放置在冰冷的表面上或于2~8℃的冰箱内存放24h以内;

亦或在复溶并冻结后将其存放在-20℃以下, 可存放28天, 但只能冻融一次。

5 应用前景

细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典, 成为一种法定的药检方法, 反映了药典标准水平、药检技术水平的提高, 标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。随着历史的发展, 必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。它具有方法多样化、自动化、微量化的特点。细菌内毒素检查法所具有的优点表明它比家免热原检查法更适应现代制药工业的发展。它可以应用于药检, 也可以用于药品生产质量控制、临床诊断及其它领域。该法用于药品成品的检查, 属于一种事前控制的质控手段, 对提高药品质量, 避免造成药品成批报废有重要意义;在临床上可作为快速诊断革兰氏阴性细菌感染的疾病的一种辅助方法, 但不能区分病原体。

参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典[M].北京:化学工业出版社, 2005.

[2]梁苹, 蔡红.鲎试剂灵敏度对细菌内毒素限量检查的影响[J].华西药学, 1999, 14 (3) :204-204.

蓝域染色剂的细菌内毒素检测 篇6

关键词：细菌内毒素,干扰试验,鲎试剂

蓝域染色剂:含0.1%台酚蓝,用于白内障手术中前囊的染色,辨别撕囊时前囊和其下灰色不着色的晶体组织。作为Ⅲ类医疗器械管理。作为评价医用生物材料生物学安全性指标之一的细菌内毒素试验,是检测其是否含有引起机体发热的内毒素的方法。细菌内毒素试验利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象,来判断样品中细菌内毒素限量是否符合规定,具有简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。本文依据《中华人民共和国药典》2005年版附录XIE细菌内毒素检查法[1]的要求,考察蓝域染色剂细菌内毒素检查方法的可行性。

1. 材料与仪器

1.1 试剂

细菌内毒素检查用水(BET水):批号:0802030,规格:25ml,生产单位:湛江安度斯生物有限公司。

细菌内毒素工作标准品:批号:2007-5,规格:100EU,生产单位:中国药品生物制品检定所。

鲎试剂:灵敏度:0.03EU/ml,批号:0805082,规格:0.1ml,生产单位:湛江安度斯生物有限公司。

鲎试剂:灵敏度:0.03EU/ml,批号:08012221,规格:0.1ml,生产单位:福州新北生化工业有限公司。

1.2 样品

蓝域染色剂:批号:070507,规格:0.5ml/支,生产单位:德国飞龙公司。

1.3 仪器

电热鼓风干燥箱:型号:DL-101-2RS,生产单位:天津市中环实验电炉有限公司。

恒温水浴箱:型号:42,生产单位:北京市长风仪器仪表公司。

2. 方法

2.1 试验准备

实验所用器材,经180℃烘烤3小时以上除去可能存在的外源内毒素。

2.2 鲎试剂灵敏度的复核

按《中华人民共和国药典》2005年版附录XIE细菌内毒素检查法复核鲎试剂灵敏度[1,2],结果见表1。所用两个厂家的鲎试剂灵敏度为0.03EU/ml,其灵敏度符合规定,可用于试验。

2.3 计算样品的最大有效稀释倍数

参照蓝域染色剂的企业标准,本品限值定为0.5EU/ml。目前市售鲎试剂灵敏度一般在0.5~0.03EU/ml,所以供试品在对应不同灵敏度鲎试剂时的最大有效稀释倍数分别为2倍、4倍、8倍、16倍。

2.4 干扰预试验

取样品原液,用BET水制成2倍、4倍、8倍、16倍系列稀释溶液[3],用此系列稀释溶液作溶剂,稀释内毒素工作标准品,以制成含细菌内毒素工作标准品2λ浓度的内毒素溶液,用两个厂家灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂进行试验,同时做阳性和阴性对照(试验结果见表2)。结果表明,样品的低倍稀释液对细菌内毒素试验有抑制作用,在8倍或16倍稀释后有可能排除干扰。

2.5 干扰试验

按《中华人民共和国药典》2005年版附录XIE进行干扰试验[4],分别用BET水及样品16倍稀释液将细菌内毒素工作标准品配制成浓度为0.06、0.03、0.015、0.0075EU/ml的溶液,同时用BET水和样品16倍稀释液各做两管阴性对照,用两个厂家灵敏度均为0.03EU/ml的鲎试剂进行试验(试验结果见表3)。结果表明,Es均在0.5λ~2.0λ,Et均在0.5Es~2.0Es,说明样品16倍稀释液对细菌内毒素试验无干扰作用,该产品可以采用细菌内毒素检查法控制其质量。

2.6 样品检测

取样品16倍稀释液,用灵敏度为0.03 EU/ml的鲎试剂按中国药典进行细菌内毒素检查(结果见表4)。结果表明,该产品的细菌内毒素检查是符合规定的,即样品中的细菌内毒素含量小于0.5EU/ml。

3. 讨论

本文先根据公式计算出蓝域染色剂的有效稀释倍数,先进行干扰实验的预试验推测无干扰的稀释浓度,再由正式的干扰试验进行验证,从而减少试验的盲目性,避免浪费试剂并且节省时间。由于样品对细菌内毒素检查法存在抑制性干扰,实验结果证实此干扰作用可通过稀释原液16倍的方法而消除。试验结果还表明,蓝域染色剂的细菌内毒素含量小于0.5EU/ml,该产品的细菌内毒素检查是符合规定的。该产品可以用细菌内毒素检查法来控制样品中的细菌内毒素含量。

参考文献

[1]中国药典,2005年,二部附录XIE:85~88

[2]张逸,鲁双云,高文娟等.建立可吸收医用膜细菌内毒素检查的新方法.现代预防医学,2007,34,(18):3442~3446

[3]冯智敏,江肖明,黄得坤.碳酸氢盐人工肾透析液的细菌内毒素检测.广东药学院学报,2005,2(3):274~278

细菌内毒素法检查5%果糖注射液 篇7

1 仪器与试药

1.1 器械

XW-80旋涡混合器 (上海第一医学院仪器厂) ;DL-203B电热干燥箱 (天津实验仪器厂) ;S648型电热恒温水浴锅 (上海医疗器械七厂) ;吸管 (0.1mL、0.5mL、1mL、5mL) ;凝集管 (75mL/100mm) ;稀释用普通小试管、吸耳球、封口膜、试管架。所用玻璃器皿必须用25℃干热1h。

1.2 鲎试剂

批号:0603031, 规格:0.5mL, 灵敏度:0.5Eu/mL, 湛江安度斯生物有限公司;批号:051211, 规格:0.6mL, 灵敏度:0.5Eu/mL, 湛江海洋博康生物有限公司;批号:0603190, 规格:0.1mL, 灵敏度:0.25Eu/mL, 湛江海洋博康生物有限公司。

1.3 细菌内毒素检查用水

批号:20031210, 规格:10mL, 湛江海洋博康生物有限公司。

1.4 细菌内毒素工作标准品

批号:2006-4, 规格:160Eu/支, 中国药品生物制品检定所。

1.5 供试品

果糖注射液 (江苏正大丰海制药有限公司) 。规格:250mL:12.5g。批号:0703184, 0704162, 0704202。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值的确定

根据L=K/M, L为供试品细菌内毒素限值, K为内毒素阈值, 即每人每小时最大可接受的内毒素剂量, 注射剂为5Eu/ (kg·h) , M为每人用每公斤体重每小时的最大剂量, 本品临床用量为250~500mL, 人以60kg计, L理论值为0.6Eu/mL, 参照2006年《新品种建立细菌内毒素检查法指导原则》中对于100mL以上大输液的内毒素限值可定为0.5Eu/mL, 拟订本品内毒素限值L为0.5Eu/mL。

注:λc为鲎试剂灵敏度测定值。

2.2 鲎试剂灵敏度 (λ) 的复核

用细菌内毒素检查用水溶解细菌内毒素工作标准品, 制成含内毒素1.0, 0.5, 0.25, 0.125λ四个浓度的溶液, 每一浓度平行做4支, 同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管进行灵敏度复核, 结果均符合规定, 见表1。

2.3 供试品的干扰实验

细菌内毒素标准溶液的制备:用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素标准品稀释成2, 1, 0.5, 0.25λ的内毒素标准溶液。供试品内毒素溶液的制备:用不同浓度的供试品将同一支标准品制成2, 1, 0.5, 0.25λ的供试品内毒素溶液。用鲎试剂与上述2个内毒素溶液反应, Es (为细菌内毒素检查用水制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值) 在0.5~2λ之间, 该供试品原液无干扰作用。

2.4 供试品的细菌内毒素检查

根据干扰试验结果和拟定的细菌内毒素限值0.5Eu/mL, 根据公式MVD=C·L/λ, 用0.25Eu/mL鲎试剂, 将果糖注射液稀释2倍, 进行细菌内毒素检查, 结果均符合规定, 见表2。

3 讨论

试验表明, 果糖注射液原液对内毒素无干扰作用, 可以用细菌内毒素检查代替热源检查。其限值为每1毫升中含内毒素的量应小于0.5Eu。

参考文献

细菌内毒素检验 篇8

1实验材料

1.1 试药与试剂

精氨酸:白色粉末,规格:原料药,批号:09021004、09021005、09021006,由苏州东瑞制药有限公司提供。细菌内毒素工作标准品:批号:150601-200861,效价:150 EU·支,由中国药品生物制品检定所提供。鲎试剂:批号:0807260,灵敏度:0.125 EU/ml,由湛江博康海洋生物有限公司生产;批号:0903311,灵敏度:0.125 EU/ml,由湛江安度斯生物有限公司生产,试验前2批鲎试剂的灵敏度复核均符合规定。细菌内毒素检查用稀释剂II(调节供试品的碱性,以下简称稀释剂II):批号:0903160,规格:4 ml/支,内毒素含量小于0.003 EU/ml,由湛江安度斯生物有限公司提供。

1.2 仪器

ZH-2型自动漩涡混合器,由天津药典标准仪器厂生产;DC-3A型细菌内毒素检查干式恒温器,由南京三爱斯技术开发有限公司生产。

2方法与结果

2.1 精氨酸中细菌内毒素限值的计算

按《中国药典2005年版》[2]规定,细菌内毒素限值(L)由公式L=K/M计算。其中,K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,注射剂K值为5 EU/(kg·h) ;M为人每公斤体重每小时的最大给药剂量,精氨酸为原料药,根据其制剂盐酸精氨酸注射液临床使用最大剂量换算得到, M值为83 mg/(kg·h)。据此计算,精氨酸的L值为0.06 EU/mg,精氨酸是原料药,考虑之后还有一个制剂生产过程,所以慎重起见,我们最后确定精氨酸的L值为0.01 EU/mg。

2.2 精氨酸稀释度的确定

计算供试品最小有效稀释浓度的公式为C=λ/L(L值为0.01 EU/mg,λ为鲎试剂的标示灵敏度),当λ分别为0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.062 EU/ml、0.031 EU/ml时,则供试品的最小有效稀释浓度C应分别为50 mg/ml、25 mg/ml、 12.5 mg/ml、6.2 mg/ml、3.1 mg/ml。

注:“+”为凝固,“-”为未凝固 由表1可见,当供试品溶液浓度≤12.5 mg/ml时,对两个厂家的鲎试剂不产生干扰作用,也就是对λ=0.125 EU/ml以上灵敏度的鲎试剂无干扰。

2.3 干扰试验

2.3.1 干扰试验预实验

试验前验证供试品热原试验均符合规定。为排除供试品溶液对细菌内毒素检查的干扰,求出最高无干扰浓度,先进行干扰试验预实验。将3批精氨酸分别用稀释剂II配制成50 mg/ml、25 mg/ml、 12.5 mg/ml、6.2 mg/ml、3.1 mg/ml 5个不同浓度的供试品溶液(NPC),并配制此系列浓度中含2λ的供试品阳性液(PPC)。选择两个厂家的λ为0.125 EU/ml的鲎试剂,分别加入0.1 ml稀释剂II溶解,再分别加入0.1 ml不同浓度的NPC和PPC,混匀后,于37℃保温60 min,同时作阳性对照(PC)和阴性对照(NC),试验重复2管,结果见表1。

2.3.2 干扰确证试验

为进一步确证供试品溶液对λ为0.125 EU/ml的鲎试剂是否存在干扰作用,用稀释剂II和浓度为0.25 mg/ml的3个批号供试品溶液分别将细菌内毒素工作标准品配制成0.250、0.125、0.062、0.031 EU/ml4个浓度的系列内毒素标准溶液。再分别用两个厂家的λ为0.125 EU/ml的鲎试剂实验,同时做供试品溶液的对照,试验重复4管,结果见表2。

由表2可见,内毒素标准溶液的Es值在0.5～2.0λ(包括0.5λ和2λ)范围内,而供试品的Et值则在0.5～2.0 Es(包括0.5Es和2.0 Es)范围内,确证浓度为12.5 mg/ml的3个供试品溶液 对λ为0.125 EU/ml鲎试剂无干扰作用。

注:“+”为凝固,“-”为未凝固

2.4 精氨酸的细菌内毒素检查

取3个批号的精氨酸,分别用稀释剂II配制成浓度为12.5 mg/ml的供试品溶液,然后用两个厂家的λ为0.125 EU/ml鲎试剂进行细菌内毒素检查,并设供试品阳性(2λ)、PC及NC,结果见表3。

注:“+”为凝固,“-”为未凝固

由表3可见,3批精氨酸细菌内毒素检查均符合规定。

3讨论

本实验考察了精氨酸是否对鲎试剂与内毒素的凝聚反应有干扰作用,结果证明将精氨酸按《中国药典》2005年版(二部)附录Ⅺ E中细菌内毒素检查法试验,对鲎试剂与内毒素凝聚反应没有干扰,使用λ为0.125 EU/ml的鲎试剂进行细菌内毒素检查是可行的,确证了细菌内毒素检查法完全可以代替传统的兔热原法用于该制剂的质量控制。据此,提出精氨酸的细菌内毒素检查参考标准:取本品,以能够调节本品的pH值的缓冲液稀释,依照《中国药典》2005年版(二部)附录Ⅺ E检查,每1 mg精氨酸中含内毒素的量应小于0.01 EU。

摘要：目的 建立精氨酸的细菌内毒素检查法。方法 按照《中国药典》2005年版(二部)附录ⅪE中细菌内毒素检查法,使用两个厂家的鲎试剂对精氨酸进行干扰试验研究。结果 精氨酸对采用鲎试剂进行细菌内毒素检查无干扰作用。结论 精氨酸可以用细菌内毒素检查法(凝胶法)代替家兔热原检查法控制其产品质量。

关键词：精氨酸,细菌内毒素,鲎试剂,干扰试验

参考文献

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(二部).化学工业出版社,2005:831.