壳聚糖硫酸盐

壳聚糖硫酸盐（精选4篇）

壳聚糖硫酸盐 篇1

摘要：通过热脱氢交联 (DHT) -碳化二亚胺 (EDC) 复合改性制备胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜材料。对复合膜的力学强度、吸水率、降解性能、细胞毒性进行了表征, 并将其应用于全层皮肤损伤动物修复实验。结果表明:复合膜具有良好的力学性能和吸水性, 耐酶解性, 生物相容性, 并能加速创面愈合, 作为一种潜在的皮肤组织工程支架将具有良好的应用前景。

关键词：胶原,壳聚糖,硫酸软骨素,医用复合膜,创面修复

引言

胶原因其特殊的四级结构, 具有独特的理化性质和优良的生物相容性、可降解性、低免疫原性等, 在生物医用材料领域得到了广泛的应用[1,2,3]。壳聚糖是甲壳质的脱乙酰产物, 具有极好的生物相容性和可降解性、无刺激性、无免疫原性、无热源性, 并具有促进创面愈合的功能。大量胶原-壳聚糖复合材料研究表明, 壳聚糖和胶原是多种人体组织细胞生长繁殖良好的诱导支架材料和细胞生长基质[4,5]。硫酸软骨素 (CS) 是一种糖胺聚糖, 具有抗炎、加速伤口愈合等作用, 加入CS, 可提高材料的生物相容性[6]。本研究在胶原-壳聚糖二元复合膜制备[7]、胶原-壳聚糖分子间作用力[8]等前期工作基础上, 通过热脱氢交联 (DHT) -碳化二亚胺 (EDC) 复合改性, 将CS引入胶原-壳聚糖二元复合膜中, 为材料提供多糖类的生物活性, 进一步提高材料的生物稳定性和生物相容性。DHT是一种通过加热使胶原上的羧基和伯胺侧基发生缩合反应而交联的改性方法, 其优点在于没有引入有潜在毒性的化学试剂。EDC是一种通过在羧基和伯胺侧链基团之间形成酰胺键而交联的改性方法, 其优点是使反应后留下的水溶性异脲能很容易被洗掉。因此DHT-EDC复合改性既能有效交联, 又不会造成细胞毒性, 是一种有效的交联改性方法[9]。

1 实验

1.1 主要试剂和仪器

2-N-吗啉乙烷磺酸 (MES, 美国Amresco公司) , 碳化二亚胺 (EDC, 上海延长生化公司) , N-羟基丁二酰亚胺 (NHS, 上海延长生化公司) , 壳聚糖 (脱乙酰度>87%, 成都科龙化工试剂厂) , 硫酸软骨素 (CS, 美国Sigma公司) , 茚三酮 (德国MERCK公司) , 溶菌酶 (生物纯, 成都天泰生命科技有限公司) , 甘氨酸 (美国AMRESCO公司) , 人重组bFGF (生物纯, 美国Sigma公司) , 胶原 (实验室自制) [10,11], 其它试剂均为市售分析纯试剂, 且使用前未经任何处理。

冷冻干燥机 (Freeze 6型, 美国Labconco公司) , CO2细胞培养箱 (SANYO , JAPAN) , 倒置相差显微镜照相系统 (Olympus IX70, JAPAN) , 离心机 (Heraeus Varifuge 3.0RS , Germany) , 扫描电子显微镜 (JSM-5900LV, 日本电子株式会社) 。

1.2 实验方法

1.2.1 DHT-EDC改性胶原-壳聚糖-硫酸软骨素膜的制备

胶原和壳聚糖按1∶1比例混合, 溶解于0.5 mol/L的醋酸, 置于自制模具中冷冻干燥成膜。将未改性胶原基二元膜在常温下抽真空, 升温, 在110 ℃下处理2 h。将制得的脱氢加热改性 (DHT) 膜置于40 mL pH5.0～6.0, 50 mmol/L 2-N-吗啉乙烷磺酸 (2-N-morpholino ethanesulfonic acid, MES) 的40%乙醇中浸泡30 min, 再在50 mmol/L MES、33 mmol/L 1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺[1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC]、20 mmol/L N-羟基丁二酰亚胺 (N-hydroxysuccinimide, NHS) 和1%硫酸软骨素的40%乙醇溶液中室温浸泡4 h。最后将上述复合支架在0.1 mol/L Na2HPO4 (pH值为9.1) 溶液中清洗4 h, 再在不同浓度的NaCl溶液中清洗过夜, 双蒸水反复清洗至中性, 冻干, 得DHT-EDC复合改性膜。

胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜EDC改性后, 分别用浓度为0.1～1.0 mol/LNa2HPO4 (pH8.0～9.1) 、1～2 mol/L NaCl、5～50 mmol/L甘氨酸、双蒸水反复清洗, 再将自制的b-FGF缓释微球用磷酸盐缓冲液 (PBS) 分散, 均匀喷涂于膜上, 复合冻干得含缓释微球的胶原基体表创伤修复膜。将上述创伤修复膜无菌封装在医用包装袋内用60Co辐照仪辐照灭菌, 照射剂量为25 kGy。

1.2.2 胶原-壳聚糖-硫酸软骨素改性膜的性能表征

(1) 拉伸强度测定

将膜材料用模具制成哑铃状, 空气调节48 h, 在拉力机上以10 mm/min速度测定材料的拉伸强度, 每个样品测5次取平均值。

(2) 降解性表征

将膜样品 (10 mm×25 mm) 真空干燥, 精确称量, 置于试管中, 然后加入5 mL的溶菌酶降解液 (1.0 mg/mL, 缓冲液为PBS) 将其浸泡。试管封口, 置于 (37±1) ℃水浴中振荡 (固定转速为80) , 于1 d、2 d、3 d、5 d、8 d、12 d、15 d时取样。为了保持酶的活力, 需每72h更换一次酶液。样品水洗、干燥至恒重, 通过降解后样品质量的减少来确定样品的降解性。

(3) 三元膜浸提液细胞毒性试验

剪取约1 cm2大小膜材, 于4 mL培养基中37 ℃浸提3 d, 每天取一份浸提液, 进行成纤维细胞培养。浸提液培养细胞3 d后, 用MTT法检测和光境观察。

(4) 全层皮肤损伤动物修复实验

选取一级新西兰大白兔20只, 雌雄各半, 体重1.5～2.0 kg。用速眠新对新西兰白兔肌肉注射作全身麻醉, 在兔背侧胸腰部脊柱两侧1 cm处, 脱毛、消毒。10 min后麻醉起效后, 切割建立3 cm×4 cm的全层皮肤损伤。在左侧创口敷以胶原基复合膜, 作为实验组, 右侧创口作空白对照, 两侧同时敷以灭菌的油纱和纱布, 并在纱布边缘用1号线与皮肤缝合, 1周拆除。术后连续3 d注射氨苄青霉素0.25 g/只。观察创口的出血量, 创口愈合时间及愈合创面的特征等。

2 结果与讨论

2.1 拉伸强度

胶原-壳聚糖二元EDC改性膜的拉伸强度为1.06 MPa, 胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元EDC改性膜的拉伸强度为1.19 MPa, 两者比较, 三元膜机械强度更高, 这与三元膜改性指数高于二元膜有关。

2.2 降解性能

图1表明了改性膜在溶菌酶液中的降解情况:EDC改性三元膜和EDC改性二元膜的生物降解性, 比未改性膜显著增强;在溶菌酶液中水解15 d后, EDC改性二元膜保留了89.74%的质量, 三元膜保留了93.02%的质量, 而未改性膜保留质量不到60%。这说明EDC技术能提供有效的交联, 提高材料的抗酶解能力;EDC改性三元膜的性能更加优越, CS的加入也有利于提高复合材料的抗酶解能力。

2.3 含缓释b-FGF微球的三元膜浸提液细胞毒性试验

用含缓释b-FGF微球的胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜浸提液培养成纤维细胞, 检测其细胞毒性。分别浸提1、2、3 d的浸提液和空白培养基培养成纤维细胞, 3 d后用MTT法测得结果。如图2所示, 3组浸提液中繁殖的细胞都多于空白对照组, 且浸提液浸提时间越长, 繁殖的细胞就越多。可见此复合三元膜浸提液无细胞毒性, 并可促进细胞的增殖。图3是空白培养基和浸提液中培养3 d后的成纤维细胞照片。由图可见:浸提液中细胞几乎覆盖了整个培养孔板, 其细胞生长繁殖较空白培养基快。浸提液能够促进细胞的增殖, 与膜材中含缓释b-FGF微球有关。浸提时间越长, 缓释的b-FGF越多, 浸提液中b-FGF含量也就越高, 其细胞增殖就越快。

(A:空白培养基, B:三元膜浸提液)

A: single cuture medium; B contain extracted solution of ternary membrane

2.4 含缓释b-FGF微球的三元膜对全层皮肤损伤修复的动物实验

胶原基创伤修复膜作为细胞生长的依附和支持物, 能诱导细胞增殖、分化和移行, 与创面愈合过程关系密切。胶原基修复膜能大量吸收组织渗出液, 并平稳地附着在创面上, 维持一定湿度, 防止机械损害和二次细菌感染, 作为创面覆盖材料, 对创伤修复十分有效。我们将bFGF明胶缓释微球与胶原基修复膜复合, 形成一种新型覆盖材料, 采用兔皮肤全层缺损模型观察其对创面愈合的影响。

图4是兔全层皮肤损伤伤口模型的建立过程, 图5伤口覆盖修复膜和油纱后的照片。覆盖胶原基修复膜后, 伤口组织液和血液被膜材吸收, 修复膜平稳的附着在创面上, 提供了一个较佳的伤口愈合微环境。术后3 d观察, 实验组创面干燥, 与油纱和纱布无黏连, 修复膜与创面之间贴合紧密, 创口无红肿热, 动物未出现皮肤过敏现象;对照组创面多有渗出液, 与油纱和纱布黏连。

创口修复情况及愈合时间如表1所示:对照组术后有6例发生出血, 占30%, 实验组仅有1例创口发生出血, 占5%;对照组有1例创口发生感染, 实验组无一例感染;对照组术后20.73 d伤口愈合, 实验组仅为18.00 d。可见实验组愈合过程较空白组更快更好。图6是一只兔子3周后伤口愈合情况照片, 兔背脊左侧是实验组, 右侧是对照组。由图可知, 左侧实验伤口已完全愈合, 愈合的新生组织与周围组织融合良好, 无瘢疤产生;右侧对照伤口还未愈合完全, 有小块瘢痕存在。

本研究研制的胶原基体表创伤修复膜复合了组织相容性和降解性良好的壳聚糖和硫酸软骨素, 并经过了EDC交联改性, 膜材的生物稳定性和生物相容性得以提高, 可自然对抗胶原酶, 具有抑制细菌、真菌生长, 止血、止痛, 促进伤口愈合的作用, 可称为一种性能良好的新型体表创伤修复材料。本实验选用具有良好促愈合作用的胶原基膜作载体, 复合能持续释放bFGF的缓释微球, 以膜的形式覆盖皮肤缺损创面, 为表皮细胞及肉芽组织的迁移、增殖提供了支架, 且能在较长时间内缓释bFGF发挥促进细胞生长和组织再生的作用, 有效地缩短了创面愈合的时间。在保护创面的同时, 也具有减少渗出、利于引流等特点。动物皮肤全层缺损模型实验表明:复合bFGF缓释微球的胶原基修复膜与创面之间贴合紧密, 有防止术后粘连、止血、促进伤口愈合以及诱导皮肤再生的作用。

3 小结

(1) DHT-EDC改性三元膜拉伸强度、降解稳定性高于DHT-EDC改性二元膜; (2) EDC改性技术和CS的加入, 均有利于提高复合膜的抗酶解能力; (3) 复合缓释b-FGF微球的三元膜成纤维细胞培养试验, 证明了膜材料无细胞毒性, 可促进细胞的增殖, 细胞与膜材间黏附良好; (4) 复合缓释b-FGF微球的三元膜对兔全层皮肤损伤修复实验结果表明, 修复膜与创面之间贴合紧密, 有防止术后粘连、止血、促进伤口愈合和诱导皮肤再生的作用。

参考文献

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壳聚糖硫酸盐 篇2

目前多糖的测定中用到最多探针的一般有有机染料[2,3]和表面活性剂[4], 共振瑞利散射法测定多糖利用量子点做探针的报道较少, 测定葡聚糖硫酸钠利用碲化镉量子点做探针共振瑞利散射法测定的目前还未见报道。

1 实验部分

1.1 试剂

巯基乙胺, 天津市光复精细化工研究所;硼氢化钠, 天津市环威精细化工有限公司;单质碲, 上海美兴化工有限公司;氯化镉, 上海试剂厂;硫酸重庆川东化工有限公司化学试剂厂) , 氢氧化钠, N2, 葡聚糖硫酸钠 (缩写为DSS, Biosharp) 。用酸度计校正醋酸-醋酸钠缓冲溶液的p H值。实验所用的试剂均是分析纯, 二次蒸馏水为实验用水。

1.2 仪器

UV-8500型紫外-可见分光光度计, 上海天美公司;Hitachi F-2500型荧光分光光度计, 日立公司;p HS-3C型精密酸度计, 中国上海精密科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

水溶性Cd Te QDs的合成:按照已有文献方法[5]合成。

Cd前体液的制备:将0.132 9 g巯基乙胺, 0.075 2 g Cd Cl2·2.5H2O和15 m L水加入到250 m L三颈瓶中, 节溶液的p H为5~6 (1.0 mol/L的Na OH水溶液调) 。

Cd Te QDs的制备:将Te粉0.015 1 g和适量水混合加入到50 m L三口烧瓶中, 用氮气作为保护气, 将三颈瓶与导气管相连, 通氮气, 磁力搅拌, 约20 min后加入过量Na BH4, 瓶口用带注射器针头的塞子塞住。待Te粉全部反应完后滴加0.5 mol/L H2SO4至反应完全, 当溶液变为橘黄色后, 升温至96℃, 回流, 2 h后可得橙红色Cd Te QDs溶液 (浓度以Cd2+计为:2.5×10-3mol/L) 。

选用10.0 m L比色管, 依次加入Cd Te QDs溶液1.0 m L, 醋酸-醋酸钠缓冲溶液 (p H=5.0) 适量和DSS工作溶液适量, 定容, 摇匀, 静置10 min。在荧光分光光度计上扫描RRS光谱, 在最大散射峰处分别测量该体系的散射强度 (IRRS) 和Cd Te QDs空白的RRS强度 (I0RRS) , 且Cd Te QDs-DSS体系的RRS强度ΔIRRS=IRRS-I0RRS。

2 结果与讨论

2.1 共振瑞利散射光谱

Cd Te QDS-DSS体系的RRS图见图2:从图2可知:①葡聚糖硫酸钠和碲化镉量子点单独存在时共振瑞利散射光谱均很弱;②当二者结合后则可观察到RRS强度急剧增加, 且在一定范围内呈现线性关系;该体系的RR峰在343 nm值最大, 所以测定波长选择为343 nm。

2.2 反应条件的选择

2.2.1 溶液酸度的影响

分别实验了缓冲溶液酒石酸-酒石酸钠、Na Ac-HAc、BR (Britton-Robinson) 等对Cd Te-QDs和葡聚糖硫酸钠体系共振瑞利散射强度的影响, 实验结果显示Na Ac-HAc缓冲溶液缓冲效果对体系最好。同时针对不同p H值对体系的影响进行了考察, 结果见图3。由图3可看出该体系在p H为4.8~5.2之间时ΔI值较大, 本实验选择p H值为5.0的Na Ac-HAc缓冲溶液, 其最佳用量为1.0 m L。

2.2.2 碲化镉量子点浓度的影响

试验对碲化镉量子点浓度对散射强度的影响做了相关探讨, 结果如图4, 结果表明碲化镉量子点的浓度为2.5×10-4mol·L-1其ΔI值较大, 故本实验选择2.5×10-4mol·L-1的碲化镉量子点溶液1.0 m L进行实验。

2.2.3 反应时间及体系的稳定性

本实验考察了时间对Cd Te-QDs和葡聚糖硫酸钠体系RRS强度的影响, Cd Te-QDs和葡聚糖硫酸钠之间发生聚合, 反应速度较快, 体系5 min后反应基本完全, 体系能恒定3 h, 综合考察本实验选在10 min后测定。

2.3 标准曲线

根据实验结果得出了Cd Te-QDs和葡聚糖硫酸钠体系的线性回归方程、相关系数、检出限和线性范围, 它的线性回归方程为ΔI=924.79c+42.53, 相关系数r为0.999 4, 检出限为2.1μg·m L-1, 线性范围为0.007 1~1.2μg·m L-1。

3 方法的选择性和分析应用

3.1 共存物质的影响

本实验考察了一些常见共存干扰物质的影响, 结果见于表1。结果显示:金属离子、无机酸根离子、氨基酸和一些糖对测定没有影响, 允许倍量在50倍以上, 由此可知该方法具有较好的选择性。

3.2 分析应用

取人血清样品1.0 m L, 加入乙腈1.0 m L, 混合后, 离心分离, 使血清中的蛋白质沉淀完全。按实验方法测定人血清中葡聚糖硫酸钠的含量。取上层清液1.0 m L于比色管中, 依次加入Cd Te量子点1.0 m L, p H5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液1.0 m L, 用二次蒸馏水定容至10.0 m L, 摇匀, 静置10 min。按标准加入法检验方法的回收率, 结果列于表2。回收率在95.8%~103%之间。

4 结语

本论文利用Cd Te量子点作探针共振瑞利散射法测定葡聚糖硫酸钠, 实验结果说明了在弱酸性介质中DSS与Cd Te QDS相互作用导致RRS显著增强, 且它在一定范围内与DSS的浓度成正比。据此, 建立一种以Cd Te QDS做探针RRS法测定DSS的新方法。并运用于血样中样品的测定, 效果较好。

参考文献

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[2]Hong Qun Luo, Shao Pu Liu, Nian Bing Li.Resonance Rayleigh scattering, frequency doubling scattering and second-order scattering spectra of the heparin-crystal violet system and their analytical application[J].Analytica Chimica Acta, 2002, 468:275-286.

[3]Shaopu liu, Hong Qun Luo, Nianbing Li, Zhongfang Liu.Resonance Rayleigh scattering study of the interaction of Heparin with some basic Diphenyl Naphthylmethane Dyes[J].Anal.Chem., 2001, 73 (16) :3907-3914.

[4]王晓洲.西南大学硕士学位论文, 2008.

壳聚糖硫酸盐 篇3

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

昆明种小鼠,20±2g,雌雄各半[SCXK (黑)20020001],购于哈尔滨医科大学动物中心;瘤株S180购自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院。

1.1.2 实验仪器

低速离心机:北京医用离心机厂LD4-2A型;超净工作台:苏州净化设备厂;电热恒温振荡水浴箱:上海益恒实验仪器有限公司DKZ系列;生物显微镜:南京江南光学仪器厂;CO2培养箱:日本三洋MCO-175/175M;酶标仪:奥地利TECAN公司SUNRISE(A-5082型)。

1.1.3 实验试剂

阿拉伯半乳聚糖硫酸酯(AGS):东北林业大学方桂珍教授提供,纯度:96%。黄芪多糖(APS):由哈尔滨商业大学博士后工作站提供;肝素钠:上海生物化学制药厂;RPMI-1640培养液:HYCLONE产品;胎牛血清:HYCLONE产品;Yac-1细胞株:购自中科院上海细胞生物研究所;NAD:上海华舜生物工程有限公司,AM-RESCO 0455 NBT:上海华舜生物工程有限公司,AM-RESCO,USA;NP-40:AMRESCO,E109;苔盼兰:Sigma T6146;RPMI-1640:Hyclone,AQB22858;PBS:武汉博士德生物工程有限责任公司,AR00304;Tris:天象人生物工程有限责任公司;小鼠血清TNF-α、IFN-γ定量ELISA试剂盒购自武汉博士德生物有限公司;其它试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 阿拉伯半乳聚糖硫酸酯对S180小鼠血清中红细胞免疫调节因子活性的影响

选用昆明种小鼠,体重20±2g,雌雄各半。将小鼠随机分为6组,每组10只。无菌条件下抽取接种7天,生长良好的S180荷瘤小鼠腹水,用4℃无菌生理盐水按体积比1:4稀释,小鼠右肢腋部皮下接种,0.2mL/只。接种24h后,分别对6组小鼠进行皮下注射给药。分别为AGS高(400mg/kg)、中(200mg/kg)、低剂量组(100mg/kg)[3],阳性对照组给环磷酰胺(25mg/kg)、黄芪多糖(100mg/kg),阴性对照组给相同体积的生理盐水。皮下注射,每日0.2mL/只,连续给药7d。于停药次日处死。断头,取全血,0.1%肝素抗凝。取三支试管,第一、第二支试管加入待测新鲜血清各0.075mL,第一管放58℃水浴30min,第二管放室温,第三管加0.075mL生理盐水,然后每管再加入胎牛血清0.05mL混匀,放入37℃水浴3min,加5滴生理盐水,混匀,再加2滴0.25%戊二醛混匀。从各管中取出约1/3细胞悬液水平涂片,吹干,加甲醛固定,用瑞氏染液染色,高倍镜观察[4]。

RBC-C3b受体花环促进率(RFER),RBC-C3b受体花环抑制率(RFIR)。

1.2.2 阿拉伯半乳聚糖硫酸酯对S180荷瘤小鼠NK细胞活性的影响

靶细胞的制备:

取传代培养24～48h对数生长期的YAC-1细胞,用RPMI-1640培养液洗涤2次,1 000r/min离心5min。10%FCS-RPMI-1640培养液重悬细胞,并用0.5%苔盼蓝染色检测细胞存活率>95%,调整细胞浓度至1×105个/mL。

效应细胞的制备:

分组及给药同“1.2.1”。连续给药7d。于停药次日将小鼠颈椎脱臼处死,用酒精棉球消毒腹部,无菌取出脾脏,除去脂肪等,放入加有5mL PBS液的平面皿中,用5mL注射器抽取平面皿内液体缓缓注入脾脏内,将脾细胞冲洗出来,离心洗一次。加5mL红细胞裂解液,冰浴下裂解10min,每2min摇动一次,1 000r/min离心10min,重复洗一次,用10%FCS-RPMI-1640培养液重悬细胞,计数细胞,调整细胞浓度至1×107个/mL。

孵育:

取效应细胞和靶细胞各0.1mL(E:T=100:1)加入96孔培养板中,设3个复孔,同时设靶细胞自然释放孔(0.1mL靶细胞+0.1mL10%FCS-RPMI-1640培养液)和最大释放孔(0.1mL靶细胞+0.1mL1%NP-40),1 000r/min离心10min。置37℃,5%CO2培养箱孵育2h,1 000r/min,离心5min。

测定:

吸取各孔上清0.1mL加至新96孔板中,37℃,10min。每孔在加入0.1mL新配制的LDH底物(NBT 4mg,NAD 10mg,PMS 1mg,加蒸馏水2mL溶解,混匀后取上清液1.6mL,加1mol/L乳酸钠0.4mL,然后加PBS(pH7.4)至10mL),室温避光反应10～15min,加入0.05mL HCl终止酶促反应。用酶标仪在490nm波长下读各孔A值[5,6]。

计算公式:

1.2.3 阿拉伯半乳聚糖硫酸酯对S180荷瘤小鼠TNF-α及IFN-γ产生的影响

(1)分组及给药:

同“1.2.1”。停药次日眼眶取血,2 000r/min离心,10min。取血清备用。参照小鼠TNF-αELISA试剂盒,在酶标仪上测量OD450值。

(2)工作原理:

博士德所提供的小鼠TNF-αELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒(Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay,ELISA)。预先包被的抗体为单克隆抗体,克隆号TN3-19.12。检测后抗体也为多克隆抗体,经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后,PBS洗涤。随后加入过氧化物标记的亲和素反应;经过PBS彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化为最终的黄色。颜色的深浅和样品中的TNF-α及IFN-γ呈正相关。

1.2.4 数据处理

数据经统计分析采用SPSS 13.0方差检验进行显著性分析,结果均以()表示。

2 结果与分析

2.1 阿拉伯半乳聚糖硫酸酯对S180小鼠血清中红细胞免疫调节因子活性的影响

血清中存在着红细胞免疫功能的正负调节因子,红细胞免疫抑制因子是一种不耐热的大分子糖蛋白,而促进因子是一种耐热的物质,肿瘤机体往往促进因子活性明显下降,而抑制因子活性明显上升,血清中红细胞免疫抑制物质上升与肿瘤细胞大量繁殖产生免疫抑制物质有关。

实验结果如表1所示:S180组荷瘤小鼠RBC-C3b受体的促进率与抑制率均明显低于和高于正常组。与生理盐水组比较,各AGS给药组中促进率和抑制率也有了不同程度的改变,其中以AGS高剂量组对RBC-C3b受体的抑制率改变最为明显,有明显差异(P<0.01),其他各组与生理盐水比较后结果有统计学差异(P<0.05)。

注:**与对照组比较P<0.01,*与对照组比较P<0.05。

2.2 阿拉伯半乳聚糖硫酸酯对S180荷瘤小鼠NK细胞活性的影响

如表2所示,AGS各剂量组均能使NK细胞活性提高,其中以低、高剂量组差异最为明显(P<0.01);与黄芪多糖对照组比较,AGS各剂量组结果显示出差异(P<0.05)。

注:**与对照组比较P<0.01,*与对照组比较P<0.05,△与APS比较P<0.05。

研究显示,多糖经硫酸化后,其免疫调节功能有不同程度的提高,对于荷瘤小鼠,AGS各剂量组都显示出了较好的激活作用。与生理盐水组相比,AGS中,低剂量组对激活荷瘤小鼠的NK细胞活性有显著差异(P<0.01),高剂量组有统计学差异(P<0.05)。由此说明AGS对荷瘤小鼠的NK细胞有较强的激活作用,此外在其激活NK细胞毒作用的同时,可能由NK细胞进一步促使机体某些细胞因子如IFN-γ和TNF-α的产生,从而达到更好的抗肿瘤免疫的作用[7]。

2.3 阿拉伯半乳聚糖硫酸酯对S180荷瘤小鼠血清中TNF-α和IFN-γ含量的影响

如表3所示:AGS能够刺激小鼠分泌TNF-α和IFN-γ。高、中剂量组结果与生理盐水组相比有显著性差异(P<0.01);与阳性对照黄芪多糖组比较,AGS高剂量组对促进TNF-α的结果有差异(P<0.05);与AG对照组比较,AGS中、高剂量组对IFN-γ促进作用优于AG组;同时发现环磷酰胺对荷瘤小鼠的TNF-α和IFN-γ分泌有一定的抑制作用。

注:**与对照组比较P<0.01,*与对照组比较P<0.05,△与APS比较P<0.05。

研究中发现肿瘤的形成可使小鼠体内TNF-α和IFN-γ产生不同程度的下降,从而干预了免疫系统的抗肿瘤功能,以利于肿瘤的生长。观察实验结果发现:AGS各剂量组均能提高荷瘤小鼠血清中TNF-α和IFN-γ含量;实验结果表明:AGS确实具有促进TNF-α和IFN-γ分泌的作用,进一步揭示了AGS抗肿瘤的作用机制,是通过调节机体免疫功能实现的。由于机体内的IFN-γ和IL-2可以通过不同的机制刺激NK细胞增值和增强NK细胞活性,而NK细胞在一定条件刺激下,能够产生IFN-γ和IL-2,三者相互作用共同组成了NK-IL-2-IFN-γ系统,参与机体正常免疫调节系统,在机体抗肿瘤方面发挥重要作用。

3 结论

AGS对荷瘤小鼠下降的红细胞免疫功能有一定的提高。实验结果显示,AGS对荷瘤小鼠的红细胞免疫功能有一定的改变,AGS能够明显激活荷瘤小鼠NK细胞活性。其中AGS低、高剂量组与生理盐水组相比,表现出显著性差异(P<0.01)。结果证明激活NK细胞的杀伤活性是AGS抗肿瘤作用的主要途径之一。AGS能够明显促进荷瘤小鼠分泌TNF-α和IFN-γ(P<0.01)。结果提示,两种细胞因子能够更有效活化NK细胞,参与其杀伤作用,从而更好地发挥其抗肿瘤作用,故AGS的抗肿瘤作用与其免疫调节作用相关。

参考文献

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壳聚糖硫酸盐 篇4

关键词：N-乙酰半胱氨酸,N，N’-联乙醯-L-胱氨酸,硫酸葡聚糖钠,实验性肠炎,巨噬细胞,谷胱甘肽

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一组病因不明的慢性肠道炎症性疾病(IBD),包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。其病因学机制与包括免疫异常,遗传影响,和环境因素的相互作用有关。巨噬细胞(Mf)在IBD的免疫机制中发挥重要作用。近年来的研究发现,反应性氧簇(reactive oxygen species,ROS)大量生成对IBD的发生、发展起着重要作用。胃肠道黏膜自身有抗氧化防御系统,通过中和不断生成的ROS从而抵消其损害的影响。在这些防御网络中,内生巯基团,主要是还原型谷胱苷肽(GSH),在一些动物模型中对胃肠道黏膜细胞保护抵抗氧化应激起着重要的作用。之前对抗氧化剂作用的大量研究中,已经报道了在IBD病人和实验性肠炎中包括GSH在内的抗氧化剂水平的降低[1,2,3,4]。

N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)是一种被广泛研究的GSH的抗氧化前体物质,对于因自由基导致的各种疾病状态均起到有益的作用。Ardite等[1]研究了NAC对TNBS+乙醇诱导的大鼠实验性肠炎的治疗作用,发现NAC可以通过提高黏膜GSH水平起到减轻急性肠炎的作用。然而NAC对DSS诱导的实验性肠炎是否有预防及治疗作用目前还不清楚。本试验通过对DSS诱导的BALB/C小鼠实验性肠炎在致模前后腹腔内给予还原型MΦ诱导剂NAC及氧化型MΦ诱导剂(NACOMe)2以探讨这两种MΦ诱导剂对硫酸葡聚糖钠(Dextran Sodium Sulphate,DSS)诱导的小鼠肠炎模型中MΦ内GSH及GSH/GSSG比值的影响,以及NAC是否对DSS实验性肠炎有预防及治疗作用。

1 材料和方法

1.1 动物

雄性BALB/C小鼠,5～6周龄,体重18～22g。

1.2 试剂

DSS(Sodium Dextran Sulfate 5000):(Wako Pure Chemical Industries Ltd.大阪,日本);NAC(Sigma公司);谷胱甘肽检测试剂盒(Cayman公司),小鼠IL-4、IFN-g检测试剂盒(Sigma公司)。

1.3 实验性肠炎模型的建立

将DSS加入蒸馏水中配成5%的DSS溶液,给小鼠自由饮用7天。

1.4 分组及给药方法

正常对照组:10只,给予正常饮食。

生理盐水预处理DSS肠炎组:10只,给予生理盐水0.5ml/次腹腔注射3次/周连续3周,从第3周开始同时给予5%的DSS溶液自由饮用7天。

生理盐水治疗DSS肠炎组:10只,第1周给予5%的DSS溶液自由饮用7天,从第2周开始给予生理盐水0.5ml腹腔注射3次/周连续2周。

还原型MΦ诱导剂预处理组:10只,给予还原型MΦ诱导剂0.8%的NAC 0.5ml/次[200mg/(kg·次)]腹腔注射3次/周连续3周,从第3周开始同时给予5%的DSS溶液自由饮用7天。

还原型MΦ诱导剂治疗组:10只,第1周开始给予5%的DSS溶液自由饮用7天,从第2周开始给予还原型MΦ诱导剂0.8%的NAC 0.5ml/次[(200mg/(kg·次)]腹腔注射3次/周连续2周。

氧化型MΦ诱导剂预处理组:10只,给予氧化型MΦ诱导剂0.004%的(NACOMe) 2 0.5ml/次(20mg/次)腹腔注射3次/周连续3周,从第3周开始同时给予5%的DSS溶液自由饮用7天。

氧化型MΦ诱导剂治疗组:10只,第1周开始给予5%的DSS溶液自由饮用7天。从第2周开始给予氧化型MΦ诱导剂0.004%的(NACOMe)20.5ml/次(20mg/次)腹腔注射3次/周连续2周。

1.5 腹腔MΦ采集

实验第3周末,将小鼠处死,向腹腔内注入冰镇无酚红、无抗生素的RPMI1640 5ml,翻转小鼠使液体在腹腔内充分流动,之后将RPMI1640从腹腔内吸出,反复3次。在4℃、1500rpm条件下离心15分钟,取2×106/2ml的量置于微平皿中,在37℃CO2孵箱培养3小时后,RPMI 1640洗脱,用橡胶棒将附壁细胞剥离收集。

1.6 肠炎的评估

1.6.1各组小鼠处死后,先将整段结肠取下,测量结肠长度,肉眼观察结肠的形态,充血、溃疡、糜烂程度和范围。

1.6.2结肠标本病理评分:炎症细胞的渗出评分标准:0分—黏膜固有层内有极少量炎症细胞,1分一黏膜固有层内有较多的炎症细胞或黏膜固有层内的炎症细胞增多,2分—炎症细胞扩散至黏膜下层,3分一全层均有炎症细胞渗出;组织损坏评分标准:0分一无黏膜损伤,1分—非连续的黏膜上皮损坏,2分—表层黏膜糜烂,3分—广泛的黏膜破损并向肠壁深层扩展。

1.7 腹腔MΦ内GSH,GSSG的测定

应用谷胱甘肽检测试剂盒检测MΦ中的总谷胱苷肽和GSH,并计算GSSG及GSH/GSSG比值。

1.8 病变局部产生细胞因子的测定

应用小鼠IL-4、IFN-γ检测试剂盒(ELISA法)测定IL-4、IFN-γ。

1.9 统计学处理

应用STATA 7.0软件进行统计学处理,先用F检验,验证方差齐性,再进行t检验,P0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 临床症状及病理学评价

BALB/C小鼠给予5%的DSS溶液7天后均出现不同程度的急性肠炎,表现为体重增长较正常组缓慢,便血,腹泻等;病理显示各实验组小鼠结肠均有不同程度的结肠黏膜腺体结构紊乱,单核细胞和多核细胞浸润。

2.1.1体重变化:

对照组体重增加(6.9±0.8) g,NAC、生理盐水及(NACOMe)2预处理组体重变化分别为(5.3±1.2)g,(3.9±0.9)g,(5.5±1.3)g,P>0.05。NAC、生理盐水、(NACOMe)2治疗组分别为(6.5±2.0) g,(5.0±1.7) g,(5.7±1.9) g,P>0.05。

2.1.2 结肠长度:

对照组结肠长度(10.36±0.8)cm。NAC、生理盐水及(NACOMe)2预处理组分别为(9.76±0.4)、(9.02±0.4)、(8.45±0.5),P<0.05。NAC、生理盐水及(NACOMe)2治疗组分别为(9.89±0.9),(9.65±0.6),(9.55±0.7),P>0.05。

2.1.3 结肠病理评分:

NAC、生理盐水、(NACOMe)2预处理组分别为(1.6±0.5)、(3.0±0.5),(4.4±0.7),P<0.001。NAC、生理盐水、(NACOMe)2治疗组分别为(1.3±1.2),(1.5±0.9),(2.1±0.7),P>0.05。

2.2 小鼠腹腔MΦ内总谷胱苷肽及GSH、GSH/GSSG

2.2.1 总谷胱苷肽:

对照组(4.1±1.1)μM/2×106;NAC、生理盐水、(NACOMe)2预处理组分别为(6.1±0.3)μM/2×106,(3.1±0.2)μM/2×106,(2.7±0.5)μM/2×106,P<0.05。NAC、生理盐水、(NACOMe)2治疗组分别为(5.3±1.1)μM/2×106,(3.3±0.7)μM/2×106,(3.6±0.9)μM/2×106,P>0.05。

2.2.2 GSH:

对照组(3.2±0.9)μM/2×106;NAC、生理盐水、(NACOMe)2预处理组分别为(3.5±0.2)μM/2×106,(2.0±0.3)μM/2×106,(1.4±0.3)μM/2×106,P<0.05;NAC、生理盐水、(NACOMe)2治疗组分别为(4.4±0.5)μM/2×106,(2.0±0.3)μM/2×106,(2.1±0.3)μM/2×106,P<0.05。

2.2.3 GSH/GSSG比值:

对照组3.55;NAC、生理盐水、(NACOMe)2预处理组分别为1.35,1.82,1.08。NAC、生理盐水、(NACOMe)2治疗组分别为4.89,1.54,1.4。

2.3 病变结肠IL-4及IFN-γ表达

2.3.1 L-4:

对照组(28.4±2.9)pg/ml;NAC、生理盐水、(NACOMe)2预处理组分别为(40.4±4.9)pg/ml,(38.7±4.7) pg/ml,(88.2±7.2) pg/ml.P<0.001)。NAC、生理盐水、(NACOMe)2治疗组分别为(11.7±5.2) pg/ml,(59.5±4.5) pg/ml,(66.0±6.6)pg/ml,P<0.001)。

2.3.2 IFN-γ:

对照组(19.4±3.9)pg/ml;NAC、生理盐水、(NACOMe)2预处理组分别为(9.2±4.7)pg/ml,(20.6±5.7) pg/ml,(19.6±5.2) pg/ml,P<0.01。NAC、生理盐水、(NACOMe)2治疗组分别为(2.7±1.4)pg/ml,(10.7±3.8) pg/ml,(36.5±7.3)pg/ml,P<0.01。

3 讨论

NAC是一种GSH的抗氧化前体物质,可以刺激代谢,中和反应性氧簇[5],抑制DNA相关的自发突变[6],并可以抑制恶性细胞的趋化和浸润[7]。另外,NAC在体内及体外均表现出对吞噬细胞吞噬过程的刺激作用[8,9]并可刺激某些淋巴细胞的功能[10]。近年来由于其具有抑制致炎分子合成的能力而受到广泛关注。

Ardite等[1]曾报告NAC对TNBS+乙醇诱导的大鼠实验性肠炎有治疗作用。本实验证实,NAC预处理的DSS肠炎小鼠,腹腔MΦ内GSH及GSH/GSSG升高,病理学指标均优于(NACOMe)2及生理盐水预处理组,提示NAC预防性应用可以减轻DSS诱导的小鼠肠炎。此外,致模后应用NAC治疗可以明显减低MΦ内GSSG,提高GSH和GSH/GSSG比值,并明显降低病变结肠IL-4和IFN-γ,小鼠体重明显增加,结肠炎症及黏膜损坏减轻等均提示:应用NAC治疗可使DSS诱导的小鼠肠炎得到缓解。

(NACOMe)2是一种氧化型MΦ诱导剂。Murata等[11,12,13,14,15]研究发现,其可能是通过非直接的方式诱导氧化型MΦ,从而使Th1/Th2失衡并向Th2倾斜。Yamada J等[6]实验发现,给予(NACOMe)2处理的移植小鼠Th1反应减弱,但没有发现Th2型反应升高。本实验研究发现,(NACOMe)2预处理致使腹腔MΦ内GSH和GSH/GSSG比值降低、GSSG升高,小鼠肠炎临床症状及结肠黏膜病理损伤程度加剧,且伴随病变结肠分泌的Th2型细胞因子IL-4亢进,但对IFN-γ无明显影响。

巨噬细胞在宿主抵御有害因素入侵的防御机制中发挥重要作用。根据细胞内GSH的含量可将巨噬细胞分为两种类型:GSH含量高的还原型MΦ(reductive macrophages,RMp)和含少量GSH的氧化型MΦ(oxidative macrophages,OMp)。两者之间的平衡可以通过RMp产生的NO、IL-12、IL-18、IFN-γ和OMp产生的IL-6、IL-10和PGE2等来调节[13]。谷胱苷肽是细胞防御氧化损伤的第一道防线。巨噬细胞内的GSH可以通过调节MAPK p38的活性成为IL-12分泌的必需物质,说明细胞内的GSH水平对于决定Th1/Th2反应孰占优势起着关键性作用。将MΦ暴露于IFN-γ可以增加细胞内GSH/GSSG的比值,而暴露于IL-4则结果相反[11,12,13,14]。Hamuro和Peterson等[17,18]报道了鼠的抗原提呈细胞(APC)或腹腔定居的MΦ中GSH的损耗可使IL-12的分泌减少并导致典型的Th1反应向Th2反应模式转化。Peterson等[18]的研究还显示外源性损耗或补充GSH物质致MΦ内GSH水平变化可以影响Th1/Th2失衡。将GSH损耗小鼠的T细胞与正常GSH小鼠的MΦ一起培养可产生正常量的IFN-γ。另外Jeannin等[19]在易于产生IL-4的培养细胞系统中提高GSH浓度可使IL-4生成降低,且呈量效依赖关系。上述研究结果充分表明MΦ内的GSH水平在调节免疫反应向Th1或Th2细胞因子转化的发展趋势具有重要作用。

我们以往的研究亦发现[3,4]DSS诱导的实验性小鼠肠炎局部及脾脏分泌的IL-4增高、IFN-γ降低且MΦ内GSH降低、GSSG增高,提示该肠炎模型是Th2细胞因子和氧化型MΦ(OMp)占优势的类型,而且MΦ内GSH的降低与DSS诱导的实验性肠炎中黏膜损坏、IL-4增高、IFN-γ降低相关。本实验进一步证实:DSS诱导的小鼠肠炎模型中腹腔MΦ经过NAC处理后,其MΦ内GSH明显增多,使其从氧化型MΦ(OMp)优势向还原型MΦ(RMp)优势转化,从而使IL-4的生成降低。