活性炭-壳聚糖复合物（共8篇）
活性炭-壳聚糖复合物 篇1
壳聚糖 (chitosan) 是天然聚阳离子多糖衍生物[1], 也是自然界中唯一的带正电荷的支链多糖, 具有抗菌, 抗肿瘤, 增强免疫等功能[2]。本实验采用的这两种壳聚糖是北京理工大学合成的壳聚糖碘和壳聚糖氯络合物, 是将功能性壳聚糖的改良产物与常用抗菌剂元素碘原子和氯原子络合得到的新型的高分子抗菌剂, 常温下为白色粉末状态, 能迅速溶解于水及弱酸, 溶解于水中呈均匀的凝胶状态, 各种理化性能比较稳定, 本实验的目的是为开发新型的消毒产品提供一些实验理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料
季铵盐壳聚糖络合物由北京理工大学材料学院合成提供, 首先将分别将二种壳聚糖络合物溶解于蒸馏水中, 浓度为60G/L备用。
1.1.2 受试菌株
红色毛癣菌 (T.rubrum) , 须发毛癣菌 (T.mentagrophytes) , 白假丝酵母菌 (C.albicans) , 热带假丝酵母菌 (C.tropicalis) 等由本院实验室及长海医院微生物实验室提供。
1.1.3 培养基
M-H肉汤由杭州天和微生物试剂有限公司提供肉汤干粉按说明自行配置。
1.2 方法
1.2.1 最小抑菌 (MIC) 浓度的测定
严格按照《全国临床实验操作规程》第三版中的微量肉汤稀释法的操作规范进行操作, 将菌株接种置血平板, 37℃孵育箱24h后取出, 将接种的细菌用无菌棉签挑至无菌生理盐水中, 调节至0.5麦氏比浊标准的菌液浓度, 并用M-H肉汤稀释100倍至106浓度备用, 取无菌小试管12支排成一行, 共4列, 利用对倍稀释法将壳聚糖溶液稀释成1∶5, 1∶10, 1∶20, 1∶40, 1∶80, 1∶160, 1∶320, 1∶640, 1∶1280, 1∶2560, 放入等量菌液, 第11管为阳性对照, 第12管为空白对照。用无菌橡胶塞盖住所有试管。将以上试管置于37℃孵育箱24h, 48h分别阅读结果。
1.2.2 最小杀菌 (MBC) 浓度的测定
24h以后, 依次从有抑菌作用的管中液体取0.5m L接种到无菌平皿中, 然后倒入45～50℃的营养琼脂, 边倒边混匀, 盖好平放置冷却凝固, 然后置37℃孵育箱24h观察杀菌实验结果。
1.3 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件进行数据分析处理, 设P<0.05时有统计学意义。
2 结果
见表1、2。
3 讨论
碘原子壳聚糖络合和物氯原子壳聚糖络合物对于白假丝酵母菌和热带假丝酵母菌的最小抑菌浓度均为1.5g/L, 最小杀菌浓度均为1.5g/L及3.0g/L, 而对于红色毛癣菌和须发毛癣菌最小抑菌浓度为0.75g/L, 0.75g/L及最小杀菌浓度为1.5g/L和1.5g/L, 这表明这两种壳聚糖络合物对廯菌的效果更明显, 与文献[2]数据符合, 尽管本实验采用的材料与文献[2]材料有所差异, 但是本材料由于是纳米材料, 所以比文献[2]抗菌性能更强, 本实验为开发新的抗真菌材料提供了理论依据。本材料已经通过了相关的动物实验, 结果表明本实验采用的两种材料均不会对皮肤和黏膜产生刺激, 适合做成新型皮肤消毒剂等医用抗菌耗材, 将来成为新的临床应用抗菌材料。壳聚糖对各种菌株都有良好的抗菌效果, 壳聚糖在酸性情况下带正电荷, 其抗菌原理主要是小分子量的壳聚糖能穿透细胞壁进入细胞, 导致细菌的代谢紊乱, 从而起到杀菌作用[3,4], 大分子量的壳聚糖则由于正电荷的作用黏附在细胞壁表面, 破坏细胞膜渗透屏障作用, 从而起到杀菌作用[5], 壳聚糖碘的抑菌原理很复杂, 目前还处于研究阶段[6], 但是作为一种理想的抗菌材料, 应该具有即效, 光谱, 长效, 稳定及安全[7], 目前无论是有机的, 无机的, 天然的, 人造的都没有达到这要求, 只有综合各种抗菌材料的优点, 才能进一步改善抗菌材料的有效性。
参考文献
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活性炭-壳聚糖复合物 篇2
关键词：荸荠皮；壳聚糖；香蕉；保鲜；提取液
中图分类号： TS255.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0291-03
荸荠（Eleocharis tuberose）别称马蹄，属莎草科多年生浅水性草本植物，是一种常见的天然经济作物，营养丰富，具有极高的药用价值[1]。荸荠皮占鲜荸荠质量的20%～25%，主要成分为酚类、有机酸、生物碱、皂苷及游离黄酮类等[2-3]，皮中还含有抑菌成分荸荠英，对多种细菌有抑制作用[4]；目前，荸荠皮丰富的天然棕色素和膳食纤维等生物活性成分已应用于食品、医药、农业及化工等领域[5-6]。在荸荠加工过程中，荸荠皮大部分被丢弃，造成资源严重浪费[8]，而荸荠皮作为一种安全健康的天然保鲜物质，将其用于贮藏保鲜领域，对提高荸荠的综合利用价值具有十分重要的意义。利用荸荠皮的抑菌作用与壳聚糖的有效成膜作用[7]制得的复合保鲜剂对香蕉保鲜具有一定的成效，将其作为低温和气调贮藏的辅助手段，有望进一步提高新鲜果蔬的保鲜水平。
1 材料与方法
1.1 试验材料
红皮荸荠，采自四川内江田家镇生态农业示范园，冬至前后进行采收，剔除荸荠表面的杂质及腐迹，洗净，用刮刀取荸荠皮；将荸荠皮包裹于纱布内浸泡在水中，摩擦洗净，直至基本无果肉附着；自然晾干，于电热鼓风干燥器45 ℃烘干，用粉碎机粉碎。选取新鲜、无腐烂、无机械损伤，且生长于同一簇上的八成熟香牙蕉香蕉，洗净晾干。
1.2 仪器及试剂
1.2.1 仪器 UV-7504PC型紫外可见分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司生产；DF-101S型磁力搅拌机、DTF-100型粉碎机、真空干燥器、大气采样器、吸收管、手持式折光仪、电子天平、离心机、组织捣碎机、BZF-6090型电热鼓风干燥器、电炉等。
1.2.2 试剂 抗坏血酸（维生素C）、氢氧化钠、氢氧化钙、硫酸、草酸、偏磷酸、冰醋酸、氯化钡、钼酸铵、乙二胺四乙酸钠、正丁醇、壳聚糖、邻苯二甲酸氢钾、酚酞试剂等，均为分析纯；试验用水为二次蒸馏水。
1.3 样品预处理
1.3.1 荸荠皮提取液的制备 准确称取1.000 0 g 经烘干粉碎的荸荠皮粉末，置于圆底烧瓶中，加入12 mL 36%冰醋酸，50 ℃浸提4 h，浸提2次，离心得到荸荠皮提取液[9]。
1.3.2 保鲜液的配制及分组处理 试验设4个处理：A1：01%的荸荠皮提取液。荸荠皮提取液稀释定容至100 mL即可获得。A2：0.1%荸薺皮壳聚糖复合提取液。用1%冰醋酸溶解0.100 0 g壳聚糖，与荸荠皮提取液混合，定容至 100 mL。A3：0.1%壳聚糖溶液。准确称取0.100 0 g壳聚糖溶于1%冰醋酸溶液中，定容至100 mL。A4：蒸馏水，作为对照。
1.4 试验设计
将香蕉洗净晾干，称质量，置于保鲜液中浸泡，捞出沥干，置通风阴凉处晾干，以保鲜膜覆盖，在室温下放置数日，统计香蕉的腐烂率、失重率，测定呼吸强度、可滴定酸、维生素C及可溶性固形物含量等指标。重复4次。
1.5 测定方法
1.5.1 腐烂率计算 按果实腐烂的面积大小分为4级，即：0级：无腐烂；1级：腐烂面积小于果实面积的10%；2级：腐烂面积占果实面积的10%～30%；3级：腐烂面积大于果实面积的30%。腐烂率计算公式为：腐烂率=∑（腐烂相应级别果实数）/（最高腐烂级别×试验总果实数）×100%[10]。
1.5.2 失重率计算 计算公式[11]为：失重率=（m0-m1）/m0×100%。式中，m0为香蕉处理前的初始质量，g；m1为香蕉浸泡并放置数日后的质量，g。
1.5.3 呼吸强度测定 采用定量碱液吸收一定时间内果实呼吸所释放的二氧化碳，用酸滴定剩余的碱，即可知呼吸释放的二氧化碳，求得呼吸强度，单位为mg/（kg·h）。计算公式为：呼吸强度（CO2）=（V1-V2）·c/（m·t）×100%[12]。式中，V1为空白滴定H2C2O4溶液的消耗量，mL；V2为测定滴定H2C2O4溶液的消耗量，mL；c为草酸浓度，mg/mL；m为样品质量，kg；t为测定时间，h。
1.5.4 维生素C含量测定 采用钼蓝比色法[13]测定维生素C含量。
1.5.5 可滴定酸含量测定 准确称取经处理的香蕉 25.00 g，捣碎，加水转移至100 mL容量瓶中并定容，离心；准确移取25.00 mL上清液于250 mL锥形瓶中，加入4～5滴酚酞指示剂，用已标定的氢氧化钠溶液滴定至粉红色，确保30 s内不褪色。可滴定酸计算公式为：可滴定酸=cVkV2/（mV1）×100%[14]。式中，c为NaOH的浓度，mol/L；V为NaOH滴定消耗的体积，mL；V1为吸取香蕉液的体积，mL；m为称取的香蕉质量，g；V2为香蕉液的总体积，mL；k为换算系数，即1 mmol NaOH相当于主要酸的克数，取k=0.067[15]。
1.5.6 可溶性固形物含量测定 参照GB/T 12143. 1—1989《饮料中可溶性固形物的测定方法 折光计法》[16]进行测定。
2 结果与分析
2.1 不同处理对香蕉腐烂率的影响
果实腐烂率是判定水果贮藏效果好坏的主要表观指标。由图1可知，在贮藏过程中，香蕉的腐烂率均随贮藏时间的延长而升高，荸荠皮壳聚糖复合提取液对香蕉的保鲜效果最好，贮藏14 d时，腐烂率相对最低，为66.67%；A1、A3处理的香蕉均于贮藏8 d开始出现2级腐烂，贮藏10 d开始出现3级腐烂；A2处理的香蕉在贮藏12 d开始出现2级腐烂，与A1、A3处理比较，2级腐烂时间推迟4 d出现，贮藏14 d腐烂率超过50%，但未出现3级腐烂。
2.2 不同处理对香蕉失重率的影响
香蕉贮藏过程中，水分散失不仅会造成质量减轻，而且使香蕉失去原有的新鲜状态，影响口感，一般失重超过5%，就会产生萎蔫症状。因此，果实失重率是衡量果实保鲜效果的重要指标之一。由图2可知，香蕉失重率随贮藏时间的延长而增大，对照组失重率上升速度最快；A3与A1处理香蕉的失重率差别不大，贮藏4 d时香蕉的失重率分别为4.21%和4.00%；荸荠皮壳聚糖复合提取液的保鲜效果最好，贮藏4 d的香蕉失重率为3.18%，到16 d时也仅为5.66%。
2.3 不同处理对香蕉呼吸强度的影响
水果采后的有序生命代谢需要组织通过呼吸作用提供能量，贮藏过程中呼吸作用的强弱是评价水果采后营养成分消耗和衰老的重要指标，呼吸强度越大，呼吸作用越强。由图3可知，香蕉的呼吸强度在贮藏过程中均呈先增大后减小的趋势，这是由于香蕉为典型的呼吸跃变型果实，进入完熟期或衰老期时，呼吸强度出现骤然升高达到呼吸高峰，随后呼吸强度
趋于下降，组织迅速衰老[17]；对照处理组的呼吸强度上升最快，于贮藏8 d时达到呼吸高峰，A3与A1处理的香蕉均于贮藏10 d时达到呼吸高峰[18]；A2处理的香蕉呼吸高峰出现在贮藏12 d，呼吸高峰较A3、A1处理推迟。在不干扰组织正常呼吸代谢的前提下，A2处理有效地抑制了呼吸作用，减少了呼吸消耗，更好地维持了香蕉的品质。
2.4 不同处理对香蕉维生素C 含量的影响
维生素C是果实中重要的营养成分之一，也是果实体内清除活性氧的一种抗氧化物质，能延缓果实的衰老，但果蔬中的维生素C易被氧化而失去活性。因此，果实体内维生素C含量的高低也是衡量果实保鲜效果的一个重要指标。由图4可知，经过不同处理的香蕉，其维生素C含量均随贮藏时间的延长而下降；经荸荠皮壳聚糖保鲜液处理的香蕉，其维生素C含量均高于其他3个处理；A4处理的香蕉维生素C含量最低，A1、A3处理的香蕉维生素C含量差别不大。
2.5 不同处理对香蕉可滴定酸含量的影响
由图5可知，经过不同处理的香蕉，其可滴定酸含量均随贮藏时期的延长呈下降趋势；相同贮藏期内，对照组的可滴定酸含量相对最低；A1、A2、A3处理均可在不同程度上延缓可滴定酸含量的降低，其中，A2处理对香蕉可滴定酸含量下降的减缓效果最为明显，A1和A3处理的可滴定酸含量降低差别不大，处于A2和A4 处理之间。3种保鲜液均能在香蕉表面形成保护膜，使果实内部形成一个低O2、高CO2的微气调环境[19]，降低了果实的呼吸作用，从而延缓了可滴定酸的分解。
2.6 不同处理对香蕉可溶性固形物含量的影响
可溶性固形物包括可溶性糖类和可溶性蛋白质，是衡量水果品质的重要指标，也是水果储藏过程中呼吸作用的主要底物之一，其含量受到呼吸作用、淀粉水解和组织失水等影响，测定香蕉贮藏期可溶性固形物含量变化，可反映出香蕉贮藏期间营养物质与采后成熟度的变化情况。由图6可知，随着贮藏时间的延长，香蕉的可溶性固形物含量先增加后降低；A4处理的香蕉可溶性固形物含量相对最低，A2处理的香蕉可溶性固形物含量相对最高。
3 结论与讨论
在相同试验环境和相同贮藏时间下，比较浓度均为01%的荸荠皮保鲜液、壳聚糖保鲜液、荸荠皮壳聚糖复合保鲜液对香蕉的保鲜效果，结果表明，不同保鲜液对新鲜香蕉均有不同程度的保鲜作用，其中，荸荠皮壳聚糖复合提取液的保鲜综合效果最佳。
香蕉后熟过程中，细菌病斑的扩散是香蕉贮藏过程中大量腐烂的主要原因。荸荠皮提取液中的酚类物质能使果实表皮细胞膜的蛋白质变性，并与细胞膜中的磷脂反应破坏细胞膜的透性[20]，可减轻香蕉的菌致腐败现象；同時，壳聚糖可以在果实的表面形成半透膜，抑制了香蕉的呼吸和蒸腾作用，可有效降低果实的失重率、延缓可溶性固形物含量的降低，延长了香蕉的贮藏期。另外，荸荠皮提取液中的多酚类物质具有抗氧化活性，而壳聚糖能够延缓果实维生素C的分解[21]，这都在香蕉贮藏过程中起到了抗氧化作用，减缓了维生素C的氧化。使用低成本的荸荠皮作为天然植物食品防腐剂原料，可以进一步开发荸荠的综合利用价值，减少荸荠皮废弃物对环境的污染，荸荠皮与壳聚糖复合保鲜液对香蕉的保鲜作用研究，为香蕉保鲜技术的实际应用提供了可靠的理论依据。
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壳聚糖抗菌活性研究进展 篇3
1 壳聚糖抗菌性能的影响因素
壳聚糖的抗菌性能与其自身的性质以及环境因素有关。壳聚糖溶液浓度、壳聚糖分子量、壳聚糖的脱乙酰度、金属离子浓度以及环境中的p H值等都会影响壳聚糖的抗菌性能。
1.1 壳聚糖浓度
壳聚糖的浓度直接影响着抗菌效果。对于不同的菌种, 壳聚糖的最小抑菌浓度表现出一定的差异性;对同一菌种, 不同分子量的壳聚糖也有着不同的最小抑菌浓度。在一定范围内, 壳聚糖的抗菌性能随着壳聚糖浓度的增加, 其抗菌效果也在提高[2]。
1.2 壳聚糖分子量
壳聚糖分子量是影响壳聚糖抗菌活性的重要因素。分子量的大小对壳聚糖抗菌活性的影响目前还没有统一的结论。郑连英等的研究表明, 对于革兰氏阳性菌, 随着壳聚糖的分子量的增大, 抗菌效果逐渐增强;而对于对革兰氏阴性菌, 随着壳聚糖的分子量减小, 抗菌作用逐渐增强[3]。而宋献周的研究表明, 无论是革兰氏阳性菌, 还是革兰氏阴性菌, 低分子量的壳聚糖的抗菌效果均优于高分子量的壳聚糖[4]。吴小勇、冯小强等人的研究验证了郑连英的观点, 大分子量的壳聚糖对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌效用, 而低分子量的壳聚糖对大肠杆菌有较好的抗菌效果[5,6,7,8]。有研究表明, 羧甲基的抗菌活性及低聚壳聚糖的抗真菌活性随分子量的增加而减弱[8,9]。
1.3 壳聚糖脱乙酰度
壳聚糖的脱乙酰度的定义为壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总的糖残基数的百分数, 它是反映壳聚糖分子链上自由氨基的含量的指标。壳聚糖脱乙酰度越高, 其分子链中的自由氨基的含量就越高。壳聚糖中的氨基 (-NH2) 是目前大家比较认可的消毒因子。等浓度、近分子量壳聚糖溶液, 脱乙酰度高的壳聚糖含有更多的消毒因子, 其抗菌活性也越高。许多研究结果都表明, 壳聚糖的抗菌活性随着脱乙酰度的提高而增强[10,11,12]。
1.4 环境p H
壳聚糖一般只有在弱酸的条件下才能表现出其较好的抗菌活性[7,10,11]。这是因为在较高的p H会使壳聚糖溶解度变差, 而在较低的p H介质中, 溶液中的大量H+会与杀毒因子-NH3+在细菌表面产生竞争性吸附, 导致抗菌活性的下降[10]。
1.5 金属离子
壳聚糖的分子链上含有多个-NH2活性官能团, N上含有孤对电子对, 这使得壳聚糖具有良好螯合能力, 能与多种金属离子螯合。壳聚糖的抗菌活性随着金属离子的增大而减弱, 高浓度金属离子甚至能使壳聚糖的完全失去抗菌活性[12,13,14]。此外, 壳聚糖对金属离子的螯合能力会影响到壳聚糖的抗菌效果。吴俊等的研究表明, 壳聚糖对某种金属离子的螯合能力越强则其抗菌效果就越差, 金属离子对壳聚糖抗菌效果的影响程度由大到小依次为:Zn2+>Mn2+>Ca2+>Mg2+[13]。而氯化钠能增大溶液中的离子浓度, 从而增大壳聚糖的溶解度, 达到提高壳聚糖的抗菌效果。
2 壳聚糖的抗菌机理
壳聚糖作为抗菌剂已被科研工作者研究多年, 虽然到目前为止具体的抗菌机理尚未清楚, 但学者们提出了不少较为合理的抗菌机制。郑连英等认为壳聚糖的抗菌作用主要有以下两种机理:一种是壳聚糖吸附在细胞表面, 形成一层高分子膜, 阻止了营养物质向细胞内的运输, 从而起到抑菌杀菌作用;另外一种机理是壳聚糖通过渗透进入细胞体内, 吸附细胞体内带有阴离子的细胞质, 并发生絮凝作用, 扰乱细胞正常的生理活动, 从而杀灭细菌[3]。壳聚糖分子量的不同, 菌种种属的不同, 其抗菌机理也有所不同。革兰氏阳性菌的细胞壁较厚, 结构紧密, 且细胞壁含有丰富的磷壁酸使细胞壁形成一个负电荷环境, 所以, 高分子量的壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑杀作用可能以第一种机理为主。而革兰氏阴性菌细胞的壁薄, 交联松散[15]。低分子量壳聚糖对大肠杆菌的杀菌作用可能归因于第二种机理。但是, 宋献周的研究表明, 壳聚糖的抗菌作用主要是通过某种途径进入菌体细胞内并扰乱其生理代谢实现的, 因此低分子量的壳聚糖的抗菌效果均优于高分子量的壳聚糖[4]。现有的研究表明, 壳聚糖的抗菌主要是通过在表面成膜和进入菌体两种方式实现的。
2.1 表面成膜
壳聚糖是自然界唯一的天然碱性阳离子多糖, 在溶液中带正电荷, 易吸附在带负电荷的细胞壁上形成一层高分子膜。这层高分子膜能改变细胞膜的选择透过性, 阻止营养物质运输, 致使细胞质流失, 发生质壁分离, 从而起到抑菌杀菌效果[11]。高分子量的壳聚糖较低分子量的壳聚糖具有更好的成膜性, 从而表现出更好的抗菌效果。
一些研究学者通过观察细菌形态特征的变化或检测胞内物质的流出, 从而证明了壳聚糖是通过表面成膜来达到抗菌效果的。杨冬芝等用扫描电镜观察分子量为27万的壳聚糖对大肠杆菌的作用, 发现壳聚糖使菌体凹陷变形, 并伴有自溶现象[10]。吴迪等运用电子显微镜观察了壳聚糖、壳聚糖季铵盐处理前后细菌超微结构的变化, 结果表明, 经壳聚糖作用后细菌的细胞壁发生了明显的缺失, 这表明壳聚糖对细菌的细胞壁有不可逆的破坏作用[16,17,18]。冯小强等[19]对菌悬液的分析结果表明菌悬液含乳酸脱氢酶和谷氨酰转移酶的内酶活性, 证明了壳聚糖的加入引起了胞内物质的泄漏。李淑荣等[20]采用紫外-分光光度法测定了细菌细胞膜完整性, 结果表明, 壳聚糖处理过的实验组在260 nm处具有较高的吸光值, 表明有DNA和RNA流出。
若将壳聚糖的氨基加以保护, 从而使壳聚糖不能吸附在带负电荷的细胞壁上形成一层高分子膜, 那么壳聚糖的抑菌性能将会降低或消失, 这样就可以间接证明的壳聚糖是通过表面成膜来达到抗菌的。冯小强等[21]利用壳聚糖的席夫碱反应将壳聚糖的氨基加以保护, 结果发现, 经席夫碱反应的壳聚糖失去了原有的抑菌活性。滕丽菊等[9]将壳聚糖纳米粒子的氨基保护起来后也无抑菌性。这表明壳聚糖抑菌作用与氨基的质子化和吸附表面成膜有很大的关系。
2.2 进入菌体
壳聚糖可以进入菌体内部, 通过干扰微生物细胞内的正常代谢, 影响其生长繁殖, 从而达到抗菌的目的。杨冬芝等[10]通过激光共焦显微镜对异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的壳聚糖齐聚物 (Mw=8000) 与大肠杆菌作用的观察, 发现壳聚糖进入了菌体内部。李松晔[22]通过观察DNA结构研究表明, 壳聚糖及其衍生物的抗菌作用是通过对DNA复制、基因表达和蛋白质的影响来实现的。
3 壳聚糖衍生物的抗菌性
壳聚糖不溶于水和碱溶液, 只能溶于弱酸, 这使其应用场合受到了较大的限制。对壳聚糖进行改性, 不仅能很好的改善壳聚糖的水溶性, 还能增强它的抗菌性, 这将扩宽壳聚糖的应用范围。目前, 对壳聚糖进行改性的方法主要有将壳聚糖降解为低分子量壳聚糖, 对壳聚糖进行季铵盐化和羧甲基化处理等。
3.1 低分子量壳聚糖
低分子量壳聚糖, 又名壳寡糖, 是壳聚糖的降解产物, 其水溶性好, 其制备方法主要有化学法、酶解法和物理法等。壳寡糖糖分子量越小, 越易进入菌体细胞并干扰其生理代谢。严钦和张筠等研究表明, 壳寡糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用[24,25,26], 并随分子量的减小而增强[27,28]。壳寡糖分子内的氨基和羟基能与很多金属离子形成稳定的配合物。潘素娟和王长青等研究表明, 壳聚糖/镨配合物和壳聚糖/钕配合物具有较强的抗菌性能[29,30]。而且, 宋庆平的研究表明, 壳聚糖/银配合物具有比单一壳聚糖更强的抗菌性能[31]。
3.2 壳聚糖季铵盐
壳聚糖季铵盐具有很好的水溶性, 对细菌和真菌均具有良好的抗菌性能, 尤其是在中性或弱碱性环境条件下显示出更好的抗菌性能[32]。雷万学等[33]制备的季铵盐型壳聚糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌也具有很强的杀效果, 杀菌率高达99%以上。程国君等通过γ射线将壳聚糖进行辐射降解所得到的低分子量壳聚糖保持了壳聚糖原有的分子结构, 该低分子量壳聚糖制得的壳聚糖季铵盐具有更高的季铵盐取代度, 对细菌的抗菌效果也更好[34]。杨俊玲的研究表明壳聚糖季铵盐的抗菌性能随着季铵化程度的增加而增强[35], 但是李明春等合成的N-长烷基壳聚糖季铵盐在碱性及中性条件下, 产物的抗菌活性随着季铵化度的提高而提高, 而在酸性条件下抗菌活性则随着季铵化度提高而降低[36]。
3.3 羧甲基壳聚糖
羧甲基壳聚糖具有更好的水溶性, 其抗菌性能与羧甲基取代的位置有密切的关系。O-羧甲基壳聚糖具有更好的抗菌性[37,38], N, O-羧甲基壳聚糖的抑菌活性下降, 且随取代度的增大而下降[39]。吴迪等[40]研究表明, O-羧甲基壳聚糖的抑菌效果优于N, O-羧甲基壳聚糖和N-羧甲基壳聚糖。
4 结语
活性炭-壳聚糖复合物 篇4
活性染料中含有能够与纤维发生反应形成共价键的活性基, 染色过程中它与纤维发生化学键合[1]。染色初期, 活性染料先溶于水, 染料随着水分子进入纤维内部。染色过程中, 染料向纤维内部开始慢慢扩散, 并与纤维发生化学反应, 此外, 还有部分染料伴随着水解, 水解的染料也能够被纤维所吸附[2]。在活性染料染棉织物过程中, 无机盐氯化钠的加入起到促染的作用, 进一步来提高染料的利用率。在碱性水溶液中, 棉纤维表面带负电荷, 而活性染料也带负电, 之间存在的斥力阻止了染料与纤维之间的吸附。当加入中性电解质后, 电解质会电离出的钠离子中和纤维上的负电荷起电荷屏蔽作用, 减少了染料阴离子与纤维负电荷的库仑斥力, 有助于染料向纤维表面的吸附扩散, 提高了活性染料的上染速率, 起到促染作用。但染液中电解质的存在会使得染料胶素的动电层电位降低, 染料就会发生聚集, 当聚集达到一定程度就会以沉淀形式析出, 导致染色不匀[3]。从保护环境角度来讲, 含有高浓度盐的印染废水如果直接排放到江河湖泊中会导致水质的改变, 生态环境也会被破坏[4]。盐分的高渗透性会引起江河周围的土质出现盐碱化, 降低了沿岸农作物的产量。因此为倡导国家建设资源节约型, 环境友好型社会的理念, 要设法降低活性染料染色过程中的中性电解质的用量, 实现低盐或是无盐染色。要达到此目的, 除了研究开发新型活性染料以适合低盐染色外, 还可以通过化学的方法对棉织物进行改性, 在棉纤维表面引入阳离子基团, 减小了染色过程中染料阴离子与纤维表面之间的库仑力, 从而提高活性染料的上染率, 同时可以降低促染剂无机盐的用量。
2 甲壳质和壳聚糖的结构、性质及制备
甲壳质由2-乙酰胺-2脱氧葡萄糖单体通过β- (1, 4) 连接起来的直接多糖, 是一种天然的高分子化合物, 主要存在于昆虫类或虾、蟹等甲壳类的外壳中, 自然界中分布广泛, 成本低廉。甲壳质最早是被法国人发现和研究的, 随着人们对保护环境意识的提高, 那么在印染行业开发环保型助剂已迫在眉睫[5,6]。甲壳素能够溶于浓硫酸、盐酸、磷酸和无水甲酸, 但主链同时伴随着降解, 不溶于水、浓碱、稀酸和碱、一般的有机溶剂。甲壳质经脱乙酰化转变为壳聚糖, 溶解性能得到了很大程度的改善。壳聚糖在水和碱溶液中不发生溶解, 当遇到稀的硝酸、盐酸等无机酸或大部分有机酸时, 其大分子链会发生缓慢的分解, 溶液黏度会慢慢有所降低[7]。其实质是壳聚糖分子链上游离的氨基有一对未被结合的电子, 在水中此氨基呈弱碱性, 会和水中的一个氢质子结合, 使壳聚糖转变为带阳离子的电解质, 是一种高分子的阳络离子, 或叫做一种高分子盐。这些阳离子的产生使得壳聚糖分子间和分子内的氢键被破坏, 得到能够溶于水的壳聚糖盐。
3 壳聚糖在活性染料低盐染色中的应用
活性染料按照浸染工艺曲线染色棉织物中, 加入了大量的无机盐电解质氯化钠, 以促进活性染料对棉纤维的有效吸附。为了降低染色过程中无机盐对染色成本的负担和环境的破坏, 提高活性染料染棉的染色效率, 我们对棉纤维进行化学改性, 即对纤维阳离子化, 使其对活性染料具有更高的亲和力。因此将壳聚糖采用浸染的工艺流程整理在棉纤维上, 将活性染料浸染经过壳聚糖预处理的棉织物时, 在染料上染阶段染液呈现弱酸性, 使壳聚糖分子中的部分氨基质子化, 在分子中形成带正电的NH3+基团, 会降低棉纤维表面的负电荷, 在活性染料染色过程中降低了染料阴离子对棉纤维表面的库仑斥力, 促进了活性染料阴离子离开染浴向织物上转移, 进而提高了活性染料的上染速率, 上染百分率从而增大, 实现了染色增深的效果[8,9]。因此, 从理论上讲, 壳聚糖改性棉织物后进行活性染料染色, 不仅可以提高染料的上染率, 达到增深效果, 而且可以降低染浴中无机盐的用量, 实现低盐染色[10]。另外在固色阶段, 在染浴中加入纯碱时, 对染料吸附固着在织物上也有所提高, 因而也提高了固着率。
4 结论
本文采用了甲壳质经脱乙酰化制备的壳聚糖对棉织物进行化学改性, 使其棉织物表面带正电, 在活性染料染色过程中, 降低了染料与棉织物之间的库仑斥力, 加大了亲和力, 提高了染料的可染性, 上染率提高, 使得在加入很少无机盐氯化钠的基础上, 染色效果依然很好, 实现了壳聚糖在活性染料染色中的低盐染色。同时本研究中的染色工艺也达到了染色废水清洁化、减少环境污染、节约染料的目的, 这是一项对环境保护的有关课题研究有着重大意义。
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活性炭-壳聚糖复合物 篇5
1 实验
1.1 载银壳聚糖抗菌剂(CTS-Ag)的制备
将一定量壳聚糖(脱乙酰度93%,Mη=1.5×105)加入到100mL 0.1mol/L硝酸银水溶液中,用1mol/L稀硝酸调节pH值呈酸性,并置于黑暗条件下加热搅拌。最后过滤、洗涤样品,用蒸馏水淋洗至无银离子检出,真空干燥,得到产物,将其装入棕色瓶,置于干燥器内保存。
1.2 样品的表征
采用JSM5800型扫描电镜(SEM)和FTIR-1730傅里叶红外光谱仪(FTIR)表征样品的形貌及结构;采用丹东Y-2000型X射线衍射仪(XRD)分析晶体结构;采用ESCLAB MKⅡ型X射线光电子能谱仪(XPS)分析样品中银的价态。
微生物菌种革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)皆由山西医科大学第一人民医院提供。依照中华人民共和国卫生部《消毒技术规范》中抑菌环试验方法进行抗菌性的定性测试;参照文献[9,10]的菌落计数方法定量测试样品对细菌的抗(抑) 菌作用。
2 结果与讨论
2.1 不同因素对CTS-Ag抗菌性能的影响
由于许多因素(如壳聚糖质量、反应时间、反应温度、溶液pH值等)都将影响CTS-Ag抗菌剂的抗菌性能,为了考察各因素对其抗菌性能的影响,以对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果即抑菌环大小为基准进行了讨论。
根据对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径(抑菌环直径越大,抗菌效果越明显),从图1中可以清楚地看出,pH值对CTS-Ag抗菌性能的影响最大,其次为反应时间,再次为壳聚糖质量,最后为反应温度。各因素的较佳参数为:壳聚糖质量1.0g、反应时间2h、反应温度50℃、pH=4。
在实验中采用较佳参数制备出的样品对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为16.5mm,对大肠杆菌的抑菌圈直径为17mm, 抗菌性能不及参数为壳聚糖质量1.0g、反应温度50℃、反应时间6h、pH=4的样品(对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为19mm、20mm)。由此可以看出,采用最佳参数制备的CTS-Ag并不具备最佳的抗菌性能,故对抗菌性能较佳的样品进行了形貌、结构及性能的分析。
2.2 CTS-Ag抗菌剂微观形貌的分析
图2为CTS和CTS-Ag的SEM形貌照片。从图2中可以看出,未载银的壳聚糖颗粒结构紧密,表面平整(图2(a));载银后的壳聚糖表面较粗糙,有很小的颗粒状物质散布在其表面(图2(b)、图2(c))。由此可推断银已经被负载到壳聚糖上。图3为CTS-Ag抗菌剂中银的XPS图谱,图3可以表征出样品中银的存在形式,从而间接证实银被负载到壳聚糖上,且很好地复合在一起。
样品中Ag 3d5/2结合能为368.0eV,而AgNO3中Ag 3d5/2电子结合能为368.6eV,银的结合能变小,说明Ag+有明显得到电子或共享到电子对的趋势,即有与CTS表面的-NH2和-OH发生配位的可能[11]。样品中Ag 3d3/2结合能为374eV,与Ag2O的Ag 3d3/2结合能373.9eV非常接近[12],说明样品中吸附在CTS表面的银以Ag2O的形式存在,原因是物理吸附在CTS表面的Ag+通过与空气中的氧接触形成了Ag2O。由此可见,CTS-Ag抗菌剂中银的主要存在形式为Ag2O和CTS-Ag。
2.3 CTS-Ag样品的红外光谱分析
由图4可知,由于CTS和CTS-Ag复合物的主要成分骨架为壳聚糖,所以两样品的红外谱图基本一致。CTS中-NH2和-OH的伸缩振动偶合形成一宽峰,吸收峰在3426cm-1处[13]。与银结合后,在 CTS-Ag的谱图中向低频方向移动到3375cm-1处,且峰形略有变化,说明CTS上的-NH2或-OH可能参与了配位。但从图4(a)可以看到,δ(N-H) 1600cm-1处的吸收峰和ν(C-N) 1419cm-1处的伸缩振动峰在对应的CTS-Ag复合物的红外谱图上分别位于1581cm-1和1382cm-1处,向低频位移,说明CTS上的-NH2参与了配位。
同时,CTS中伯羟基和仲羟基C-O伸缩振动吸收峰分别位于1075cm-1和1028cm-1[14]处,而相对应的CTS-Ag复合物中对应的吸收峰分别位于1075cm-1和1027cm-1处,基本未变,说明壳聚糖上伯羟基和仲羟基没有参加与银的配位。由以上分析可知,CTS在与银的结合过程中,其分子结构中的-NH2发生了配位反应,与其它文献的报道一致。并且,银与CTS 的配位比为1∶2,其原因是N原子最外层有1对孤对电子,不易失去电子,易成为给电子体。而对于银原子,其电子层结构为[Kr]4d104f5s1,失去电子成为银离子后电子层结构变为[Kr]4d10,次外层的5个d轨道已饱和,故-NH2中的孤对电子只能进入银离子的5s和5p轨道,形成配位键(结构如图5所示)[11,15]。
2.4 CTS-Ag样品的晶体结构分析
图6为CTS和CTS-Ag的XRD谱图。由图6(a)可以看到,壳聚糖具有两种不同的晶体形态,均属于单斜晶系,根据Wu等的研究结果,壳聚糖的这两种晶形分别称为Form Ⅰ(2θ≈10°)和Form Ⅱ(2θ≈20°)[16]。如图6(a)所示,壳聚糖分别在2θ=10.75°、20.15°处显示出2个衍射峰,在10.75°附近的衍射峰对应壳聚糖的水合结晶结构,在20.15°附近的衍射峰对应壳聚糖的Ⅱ形结晶结构。壳聚糖主要是由于分子链内或链间存在较强的氢键作用和分子链的规整性而具有较强的结晶能力。与CTS相比,CTS-Ag(图6(b))在10°左右的衍射峰完全消失,20°左右的衍射峰相对强度明显减弱,无定形面积相对增加。这是因为CTS分子中-NH2与银配位后,破坏了其分子链内或链间较强的氢键作用,减弱了分子链空间立体结构的规整性,使分子内结晶区减少,从而导致结晶度下降。
2.5 CTS-Ag抗菌剂的抗菌性能
表1为CTS、CTS-Ag和空白样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)。从表1中可以看出,它们的抗菌性能为CTS-Ag>CTS,表明CTS-Ag抗菌复合物具有优于单一组分抗菌剂CTS的抗菌性能,原因是在CTS-Ag的抗菌过程中CTS和Ag发挥了协同抗菌作用。其协同作用表现为:①复合物中溶出的银离子能穿透细胞壁进入细菌体内,并与细菌中的巯基反应,使蛋白质凝固,破坏细胞合成酶的活性,从而使细胞丧失分裂增殖能力而死亡[17,18];②壳聚糖上未反应的-NH2质子化生成-NH3+,能够吸附细菌表面带负电荷的分子基团而改变其细胞通透性,从而导致细菌细胞内组分如蛋白质与葡萄糖的泄露,致使细菌死亡;③壳聚糖复合物具有独特的网状结构,当与细菌接触时,其更易堆积在细菌细胞表面而造成细胞代谢减弱,从而抑制细菌繁殖[19,20,21]。
注:“++”表示在培养基中滋生了大量细菌,说明对细菌没有抑菌作用;“+”表示在培养基中有少量细菌,说明对细菌具有部分抑制作用;“±”表示在培养基中有极少细菌,说明对细菌具有较大的抑制作用;“-”表示在培养基中没有细菌,说明对细菌有完全的抑制作用
3 结论
(1)通过对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行抗菌实验,发现pH值对CTS-Ag抗菌性能的影响最大,其次为反应时间,再次为壳聚糖质量,最后为反应温度。
(2)制备的CTS-Ag表面较粗糙,有银散布在其表面,并且CTS在与银的结合过程中,其分子结构中的-NH2发生了配位反应。
(3)CTS-Ag抗菌剂由于CTS分子中-NH2与银配位以后破坏了其分子链内或链间较强的氢键作用,使得结晶度下降,呈无定形结构。
壳聚糖-明胶液晶复合支架性能 篇6
处于固态晶体和无序液体之间的物质第四态-液晶[2],普遍存在于生物体内。双亲分子层 [3,4] 研究探明,在正常的生理条件下,细胞膜处于液晶状态。人们从控制支架生物材料几何特性,保持与天生组织相同的细胞-细胞几何结构、存在促进细胞-基质和细胞-细胞间几何结构形成的物理特性基质的重要性出发,从仿生角度制备的生物液晶材料[5,6],能很好地促进细胞的黏附、生长及分化。因此,高分子液晶生物材料有望成为满足人们需要的新型支架材料。
天然可降解高分子材料-壳聚糖、胶原在一定条件下可以呈现液晶态 [7,8]。壳聚糖-明胶复合材料,是否具有液晶态以及其性能研究国内外还未见报道。
从仿生角度出发,将液晶 [9]性质与高分子性质的融合,采用溶致液晶、减压缓慢蒸发溶剂至液晶临界浓度、冷冻干燥法,制备壳聚糖-明胶液晶支架;对支架的织构、亲水性进行研究,为其在生物医用支架材料领域的应用提供一定的实验基础。
1实验部分
1.1材料
壳聚糖、明胶,Sigma公司;乙酸、乙醇、氢氧化钠等均为分析纯试剂,天津大学科威公司。
1.2测试部分
1.2.1 临界液晶浓度测定
将粘均分子量5KD、脱乙酰度 90%的壳聚糖精制后,把1∶0、7∶3、1∶1、3∶7的4种不同质量配比壳聚糖-明胶(CS-Glu)溶于 2% (wt%) 的乙酸溶液中,配制一系列不同质量百分比浓度的混合溶液,搅拌后密闭,静置 24h 后使用。考察明胶的加入对壳聚糖液晶行为的影响。取少许溶液夹于2块盖玻片间制成液晶盒,以室温下偏光显微镜(POM)观察到双折射的浓度为液晶临界浓度。采用日本O1ympus BX51U 偏光显微镜观测。
1.2.2 支架的制备
将4种不同质量配比 CS-Glu 溶液减压挥发溶剂至液晶临界浓度,冷冻干燥制备支架。用 0.1% NaOH 溶液水洗至中性,再用PBS 溶液浸泡 24h;二次冻干备用。采用德国CHIST ALPHA2-4冷冻干燥机制备。
1.2.3 支架形态观测
将支架在液氮中淬冷,裁剪成 4mm ×8mm 大小的小片,粘贴在试样台上;放进扫描电镜中,抽真空后,选择合适的放大倍数扫描拍摄照片。采用荷兰PHILIPS XL-30扫描电镜观测。
1.2.4 孔隙率测定[1]
取出 48 孔培养板制备的支架,测量其厚度,计算出支架的体积为 V(cm3);称重为 M1(g);将其浸入无水乙醇溶液中至饱和后,称重为 M2(g);无水乙醇的密度记为 ρ(g/cm3);则多孔支架的孔隙率:P% = (M2-M1)/(ρV) ×100%。
1.2.5 吸水性测试[1]
称取支架在干态时的质量为 M1(g);将支架在蒸馏水中浸泡后,用滤纸吸干表面的水分,称重为 M2(g);则支架吸水率 X(倍) = (M2-M1)/M1 或含水量h % = ( M2-M1)/M2×100%。
2结果与讨论
2.1临界浓度分析
室温下,4种不同配比的 CS-Glu 液晶织构如图 1 所示:平行走向的消光条纹即指纹织构;明胶的加入,对壳聚糖胆甾相液晶织构有一定影响,其溶致液晶的临界浓度增大,指纹织构螺距减小;其旋光性也有一定的改变。
2.2支架形貌测试结果
壳聚糖-明胶支架的形貌如图2所示。
制得的支架为乳白色或微黄色,用手触摸感觉有弹性,较柔软,可以弯折但不会开裂,说明支架具有比较好的柔韧性。另外,壳聚糖含量比例高的支架比壳聚糖含量比例低的支架强度要高。
从图2(b1) POM 图可以看出指纹织构,冷冻干燥过程其液晶织构可以保持,图2 中SEM照片显示其孔的结构较好,支架的孔与孔之间相互连通构成了通孔。由于在壳聚糖中添加了明胶,制备的复合支架在结构上会反映出明胶的特征:复合支架的孔内部和孔间会分布有纤维状的明胶丝,支架内的纤维丝的多少与明胶含量有关,纤维丝能够更好地诱导细胞向支架上和支架内爬行和生长。此外,不同比例复合的支架,孔径的大小有所不同,明胶含量高的支架孔径相对要大一些。
2.3孔隙率及吸水性测定结果
不同配比壳聚糖-明胶支架的孔隙率及吸水性如表1。
表1数据显示:多孔支架的孔隙率均在93%以上,且液晶支架的孔隙率较高,能够满足组织工程细胞粘附生长高孔隙率,有足够大的表面积的要求。
多孔支架中的水含量,一部分来自支架本体溶胀吸收的水,另一部分则是存在于支架孔隙中的水。壳聚糖相对明胶的比例越高,支架的吸水性能越好,这种现象可能是含明胶比例高的支架,其亲水基团与壳聚糖相互作用而减少得比较多的缘故;再者,明胶含量高的支架孔径大,水很容易漏掉,不利于支架含水,因此含水量也会少,但各个支架间的含水量差别并不大,均在85%左右波动。一般来说,较高的孔隙率其样品应具有较高的含水量,这和表1中所测得的孔隙率的数据并不完全相吻合,这可能是由于支架的含水量还受其他一些因素的综合影响,比如液晶有序结构、支架的亲水基、不同成分所产生的孔结构不同等。
3结论
从仿生角度出发,制备出壳聚糖-明胶液晶支架。支架形态结构、孔隙率及吸水性结果显示:壳聚糖-明胶质量比为7∶3,液晶支架呈现典型的胆甾相液晶织构,孔隙率和吸水性分别在95%和85%左右;其性能优于他配比的液晶复合支架。一般讲,亲水性、有一定细微纹沟取向表面的材料对细胞黏附有促进作用。此外,壳聚糖-明胶液晶支架能否表现出良好的力学性能和生物相容性,更好地促进细胞黏附、生长、增殖及分化,有待今后做进一步研究。
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活性炭-壳聚糖复合物 篇7
关键词：纳米粒,基因治疗,RNA干扰
基因治疗是一种将外源基因导入目的细胞并有效表达,从而达到治病目的的治疗方法[1]。基因治疗中,高效安全的基因转染载体是一个重要研究课题。理想的基因转运系统,应具有较高的基因转染效率、良好的靶向性和生物相容性、较高的稳定性及生物可降解性。目前,基因治疗常用的载体系统主要包括两大类:病毒类载体(viral vector)和非病毒类载体(non-viral vector)[2]。病毒类载体虽具有较高的转染效率,但是在临床上暴露出的免疫原性和致瘤性等安全性问题,阻碍着它的进一步发展[3,4,5]。因而目前对基因治疗载体转运系统的研究重点从病毒载体系统转移到了非病毒载体系统。
壳聚糖纳米粒作为一种新型的基因递送系统,以其具备无毒性、生物可降解性和良好的生物相容性[6]、药物缓释和药物靶向传递[7],以及其本身带正电荷易与DNA、RNA结合等特性成为良好的基因载体[8]。但是,由于壳聚糖分子间氢键的存在,使它不溶于一般的有机溶剂和水。为了改进其溶解性,抑制其作为载体时被单核吞噬细胞(MPS)系统的识别,可通过接枝的方法将亲水的聚乙二醇链段引入壳聚糖链段中。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
1.1.1 主要实验试剂
三聚磷酸钠(成都科龙化工试剂厂),壳聚糖(Aldrich公司),单甲氧基聚乙二醇5000(美国Sigma公司),l l'-羰基二咪唑(浙江临海市凯乐化工厂),甲醇、氢氧化钠、氯化钠等其他试剂均为一般国产分析纯。
1.1.2 主要实验仪器
纳米激光粒度分析仪(上海爱建纳米科技发展有限公司);pH计(Bechman公司);高速冷冻离心机(德国Sigma公司);电热恒温水浴箱(江苏省金坛市大地自动化仪器厂);台式恒温振荡器(江苏省金坛市大地自动化仪器厂);透射电子显微镜(日本Jeol公司);79-1磁力加热搅拌器(江苏省富华仪器有限公司);超净工作台。
1.2 实验方法
1.2.1 活化单甲氧基聚乙二醇
5000(MPEG-CDM)的合成称取适量单甲氧基聚乙二醇(MPEG)和l l'-羰基二咪唑(CDM)(MPEG∶CDM摩尔比为1∶6)于圆底烧瓶中,加入二氧六环-二甲亚砜(v/v 2∶1),37℃磁力搅拌24 h后,冷至室温,于冰水浴中、搅拌下滴加无水乙醚沉淀产物(白色沉淀),布氏漏斗抽滤,冷二氧六环-二甲亚砜-无水乙醚(2∶1∶3)适量洗涤沉淀,再用冷无水乙醚洗涤3次,真空干燥后备用。
1.2.2 壳聚糖-
聚乙二醇接枝共聚物(CS-PEG)的合成壳聚糖(CS)与MPEG-CDM按摩尔比1∶1投料于圆底烧瓶中加入CS,用0.7%盐酸溶液溶解后,再加入MPEG-CDM,37℃磁力搅拌;18 h后,冷至室温,滴加0.5 M氢氧化钠至pH 7～8(呈白色凝胶状),于冰水浴中、搅拌下滴加等量丙酮和2倍量无水乙醚,G4玻砂漏斗抽滤,冷水-丙酮(v/v 1∶10)适量洗涤沉淀,80℃干燥后备用。
1.2.3 空白壳聚糖-聚乙二醇纳米粒的粒径及ζ电位测定
形态测定:取少量纳米粒混悬液滴至铺有碳膜的铜网上,静止2 min,用滤纸吸干混悬液,再滴加2%(w/v)磷钨酸负染2 min,于透射电子显微镜下观察纳米粒形态,并选取几个有代表性的视野进行拍照。
粒径及Zeta电位测定:取纳米粒混悬液适量,加双蒸水稀释后用纳米激光粒度分析仪测定粒径、分散度及ζ电位。
1.2.4 Survivin si R NA的构建
根据Genebank提供的基因序列,编号为NM_001168,2 655 bp,利用从Genbank中寻找Survinvin基因的m RNA序列,参照si RNA设计原则,利用si RNA设计工具"siRNA Sequence Selector"设计针对Survivin的si RNA序列,再利用BLAST分析所设计序列的特异性。由上海吉凯生物公司体外合成靶向survivin si RNA。
1.2.5 壳聚糖-聚乙二醇纳米粒与survivin si R NA质粒结合物的制备
取纯化、干燥、灭菌的CS-PEG纳米粒10 mg,用0.3 mol/L氯化钠溶解,使其浓度为10 mg/m L,再稀释成10μg/m L。将提取纯化的重组质粒稀释至20μg/m L。在无菌条件下,以设计比例加入CS-PEG纳米粒,使DNA与纳米粒的比例(w/w)为4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20,将一定浓度的CS-PEG溶液(pH 5.0)和500μL一定浓度的基因溶液(含一定浓度三聚磷酸钠,STPP)分别置于55℃水浴恒温20 min,精密吸取CS-PEG溶液500μL在漩涡混合条件下逐滴加入到质粒基因溶液中,混合30 min,即得载基因纳米粒混悬液。
1.2.6 纳米粒的包封率测定
精密量取λDNA标准品贮备液适量,用双蒸水稀释成一定浓度的对照品溶液,另取基因纳米复合物与不含DNA的纳米颗粒胶体溶液在40 000 r/min、4℃条件下超速冷冻离心后,精密吸取等量上清液分别作为供试品溶液与阴性对照液,以上溶液混匀后加入石英比色杯,用紫外分光光度计检测在260 nm处的吸光度,根据标准曲线,即可算出供试品溶液中游离的DNA含量,并按下式计算包封率:包封率(%)=(W总-W游)/W总×100%(W总:供试品总的DNA量;W游:上清液中游离的DNA量)
1.2.7 DNA保护性试验
为了验证基因纳米复合物对DNA的保护作用,选用核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)作为酶源进行抗核酸酶试验。吸取按不同比例配制的各样品或质粒DNA(pDNA)溶液20μL(相当于pDNA 1μg),分别加入130 U/m L DNase I 4μL,37℃反应15 min,0℃冰浴中放置30 min,中止反应,用含有0.5μg/m L溴化乙啶的8%琼脂糖凝胶进行电泳分析(100 V,30 min),同时与pDNA进行对照,观察纳米粒对DNA的保护效果。
1.2.8 基因-纳米复合物转染效率评价
取HT-29细胞传代接种于6孔板内,调整细胞浓度,使每孔细胞数为1×105个,常规条件下培养24 h,在显微镜下观察,细胞融合达到约90%时开始转染。转染前均换为不含血清的RPMI-1640培养基,细胞分为基因-纳米复合物组、和裸基因组,每组设3个复孔,转染时每组DNA含量相等,转染16小时后再换用RPMI-1640完全培养基。分别于转染24、48、72、96和120 h后,把培养板直接放在倒置荧光显微镜下观察,激发波长为490 nm,在400倍的视野中,每孔随机计数10个视野,分别计数荧光下和白光下的细胞数量,发出荧光的细胞占全部细胞的比例即为该批细胞的平均转染效率。
2 结果
2.1 壳聚糖-聚乙二醇纳米粒的的形态、粒径及ζ电位
由图1可见制备出的壳聚糖-聚乙二醇纳米颗粒近似球形、形态规则。其粒径为(61.1±12.6)nm,粒度分布均匀,粒径大都集中于53～68 nm之间,ζ电位为(36±6.2)m V。
2.2 质粒的提纯鉴定
经酶切和凝胶电泳法鉴定,转化成功了pGenesil-1质粒,并成功提取了pGenesil-1质粒;紫外分光光度计检测DNA浓度为2.1μg/μl,纯度为1.87。
2.3 包封率测定
随着CS-PEG浓度的加大,基因纳米复合物的粒径也逐渐增大,ζ电位也逐渐增大,而药物的包封率减少(即未被结合的DNA增加);载药量总的趋势是随DNA浓度的加大而增加。考虑到纳米粒的粒径是影响基因转运的重要因素,在一定范围内,粒径越大,其转染效率越低,再参考包封率和基因保护实验结果,基因/纳米为1∶5的条件制备的基因纳米复合物更适合进行基因转染。
2.4 载基因纳米颗粒对基因的保护作用评价
经琼脂糖凝胶电泳、照相结果显示裸基因完全被消化,孔内外看不到透亮条带,载基因纳米溶液中的游离DNA由于被酶消化孔外也看不到透亮带,但孔内的基因纳米复合物则不被消化,结合的基因越多,亮度越强,说明纳米粒对基因有很好的保护作用。
2.5 基因-纳米复合物转染效率评价
由流式细胞仪测得壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的survivin RNAi基因纳米复合物在体外HT-29细胞上的细胞转染率为80.75%(n=3)。从转染效率比较来看,最大转染效率出现在转染后72h;在96 h、120 h仍有较高的转染效率,可能原因是纳米粒中由于含有聚乙二醇,能起到对基因的缓慢释放,同时也进一步证明纳米粒对基因有很好的保护作用;裸基因的转染效果明显低于基因纳米复合物,且持续时间很短,在72 h后看不到带荧光细胞,也充分说明了纳米载体的载基因功能和缓释功能。
3 讨论
近年来研究证明[9,10,11],利用RNA干扰技术沉默Survivin基因促进肿瘤细胞凋亡,能够使多种人类恶性肿瘤细胞的凋亡率显著增高、增殖速度明显减低。但是由于核酸酶的作用使Survivin si RNA会迅速在细胞中代谢掉,导致RNA干扰的作用十分短暂和有限。
壳聚糖纳米粒作为一种新型的基因递送系统,具备无毒性、生物可降解性和良好的生物相容性、药物缓释和药物靶向传递等性质。实验证明,在盐溶液或乙酸溶液中壳聚糖易与DNA结合,并且可以有效地防止DNA降解[12,13]。但由于壳聚糖分子间氢键的存在,使它不溶于一般的有机溶剂和水,而通过接枝的方法将亲水的聚乙二醇链段引入壳聚糖链段则能改进其溶解性,抑制其作为载体时被MPS系统的识别。
纳米银/壳聚糖复合材料研究进展 篇8
纳米银的物理和化学性能稳定。不同于传统的抗生素,纳米银是一种安全环保的天然抑菌剂,对革兰氏阴性菌(G-菌)和革兰氏阳性菌(G+菌)等共数十种致病微生物均有强烈的抑制作用。壳聚糖(CS)是一种安全无毒,具有广谱抗菌性和生物相容性的天然碱性多糖,能被生物体完全吸收,同时作为稳定剂能够防止纳米银的团聚,使纳米银分布均匀。纳米银/CS复合材料结合了抗菌剂纳米银和CS的诸多优点,是一种极具应用潜力的抗菌材料。本研究从制备方法、抗菌机理及抗菌性能、应用现状等方面综述了纳米银/CS复合材料的研究进展。
1 复合材料的制备方法
1.1 分别制备
采用分别制备的方法,首先制备好纳米银溶胶,然后将纳米银溶胶通过静电力、分子间作用力等方式同CS结合制成复合材料。Lu等[1]通过柠檬酸钠还原AgNO3制得银溶胶,而后将CS薄膜低温浸入银溶胶中12h制成载银抗菌敷料。动物实验表明,该敷料与CS敷料和磺胺嘧啶银敷料相比,加快了感染伤口的愈合速率,降低了血液和组织中的银含量。罗勇华等[2]以柠檬酸三钠为还原剂,水热法制备纳米银,然后将纳米银同羧甲基CS混合制成生物敷料。在羧甲基CS溶液中加入纳米银,抗菌能力提高了4~10倍,对金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)和绿脓杆菌(P.aeruginosa)的最低抑菌浓度分别为0.05、0.1和0.1mmol/L。
1.2 原位生成法
CS与银盐复合得到CS-银盐前驱体,通过化学还原法、辐射法和水热法等方法,将CS-银盐前驱体还原成纳米银/CS复合材料。
化学还原法是目前最常用的纳米银溶胶制备方法,需在溶液中加入一定的还原剂和稳定剂,以使银盐还原成纳米银并防止其团聚。由于CS本身具有一定的还原性和稳定性,部分实验中采用CS本身作为还原剂和稳定剂。Twu等[3]将CS醋酸溶液用NaOH调至碱性,搅拌条件下滴加AgNO3溶液,CS将银盐还原成纳米银。Potara等[4]先以硼氢化钠还原制得的纳米银作为种子,同CS及还原剂柠檬酸二钠和抗坏血酸混合后,滴加AgNO3溶液制得纳米银溶胶。
辐射法采用射线或紫外线照射,促进银盐还原成纳米银,不需要使用还原剂和进行复杂的后续处理。Chen等[5]以γ射线照射含AgNO3的CS溶液,还原银盐得到纳米银,粒径在4nm左右且分布均匀。徐雄立等[6]将AgNO3加入到明胶/CS纺丝液中,静电纺丝后采用紫外光照射还原生成纳米银。发现制得的纳米纤维对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌性,纺丝时加入1%AgNO3抑菌率能达到99%以上。
水热法采用水作为反应体系,利用产生的较高温度和较高压力条件稳定的生成银纳米粒子。该方法一般反应时间较长,能耗较高。Wei等[7]在95℃下加热AgNO3和CS的混合液,经12h后将银盐还原成纳米银溶胶。王元林等[8]在140℃下,使CS与AgNO3反应4h,制得纳米银溶胶。该溶胶稳定性较好,室温下可长期保存。改变初始pH值可调控银纳米粒子的大小和形貌。
2 抗菌机理及抗菌性能
2.1 抗菌机理
CS和纳米银均为抑菌材料,二者结合不是简单相加,而是具有协同作用。由于CS中—OH、—COOH、—NH2、—CONH2等官能团的存在,复合材料能够吸收大量的水,有利于纳米银同细菌的充分接触。同时CS能够改变细胞膜的通透性,让纳米银更易进入细胞内,能更好的抑制细菌生长。Huang等[9]发现复合材料对高细胞膜通透性的G-菌绿脓杆菌和鲍氏不动杆菌协同作用最强,而对细胞膜通透障碍的G+菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的协同作用最弱,证明了两种材料在抑菌方面存在的协同作用。Banerjee等[10]将CS/纳米银复合物同碘分子结合,细菌吸附在材料表面,细胞壁遭到破坏,产生的活性氧导致细胞死亡。机理解释:带负电荷的细菌结合到带正电荷的CS上,纳米银使细胞壁孔隙增多,碘产生的活性氧最终杀死细菌。
2.2 抗菌性能
纳米银/CS复合材料既保留了纳米银和CS的主要特点,又通过协同作用提高了材料的抑菌性能,增强了抑菌的广谱性,拓展了复合材料在抗菌领域的应用。
Chang等[11]研究了CS的脱乙酰度、分子量、纳米银浓度对CS/2-甘油磷酸酯/纳米银水凝胶理化性质、抑菌性和细胞毒性的影响。结果表明,6×10-6及12×10-6纳米银含量的水凝胶对HS68细胞有细胞毒性,对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌实验表明,纳米银浓度的增加及CS分子量的降低均能导致水凝胶抗菌性能的增强。因而可以通过制备低分子量CS、低纳米银浓度的水凝胶来降低材料的细胞毒性,同时又可以获得高分子量CS、高纳米银浓度水凝胶的抗菌性能。
李冬红等[12]通过冷冻干燥技术制备了载纳米银的CS海绵,相对于生物海绵和明胶海绵,该海绵对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌无论是体内还是离体均有明显的抑制作用,尤其是对铜绿假单胞菌。Rhim等[13]将CS薄膜分别与纳米银、未改性蒙脱土、有机改性蒙脱土和Ag-沸石共4种类型的纳米微粒结合,分析发现纳米银结合组展现出了最强的抑菌性。
倪付花等[14]评价了CS和羧甲基CS纳米银复合材料对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌的抑制作用。发现CS纳米银复合物对3种菌的抑菌效果明显优于CS、AgNO3及CS/纳米银,而羧甲基CS纳米银复合物抑菌效果低于AgNO3和羧甲基CS,可能是羧甲基CS粘稠度高,将银包埋其中,不利于银与细菌的接触,降低了纳米银的抑菌效果。
3 复合材料的应用
由于该复合材料具有广谱抗菌性和良好的生物相容性,可制成微球、薄膜、海绵、纤维等多种形式,因此广泛应用于水净化处理、包装工程、组织工程、纺织工程、医用敷料等诸多领域。
3.1 水净化处理
田华等[15]在CS和聚乙烯吡咯烷酮混合液中加入TiO2粉末成膜后,浸入AgNO3后取出,紫外照射生成纳米银。结果表明,该薄膜抑菌性与纳米银和CS有关,而与TiO2无关。薄膜浸入水中,水体中Ag+浓度为7μg/L,远低于国家水质非常规指标极限值50μg/L,可用于对水体的净化处理。
3.2 包装工程
Wei等[7]等制得的银/CS纳米微粒,对G-菌和G+菌均有较强的抗菌活性。热处理得到的纳米银/CS薄膜比纯CS薄膜有更快速而持久的抗菌效力。Tankhiwale等[16]将乳酸交联的CS薄膜浸入纳米银溶胶后制成抗菌薄膜,对大肠杆菌展现出良好的抑菌性,能够用于食品包装材料。
3.3 组织工程
Saravanan等[17]采用冷冻干燥技术将CS/纳米羟基磷灰石混合液制成支架材料,然后将支架材料浸入AgNO3溶液中,CS上的羟基将银离子还原成纳米银。支架材料有较强的抑菌性且无细胞毒性,在骨组织重建过程中能够有效抑制外源性细菌感染。Tylman等[18]采用电沉淀法将CS/磷酸钙支架材料表面用纳米银改性,该方法能控制材料表面厚度在15μm左右,且CS与纳米银之间的相互作用使得纳米银层强力粘附于支架材料表面。材料疏松多孔,生物降解性良好,抑菌性优良,可用于组织工程修复。
3.4 纺织工程
Bae[19]用CS溶液和纳米银溶液处理无纺布,评价了CS与纳米银的不同配比对无纺布抑菌性、吸湿性和除臭性的影响。研究发现,随着纳米银比例的提高,无纺布的抑菌性和除臭性均提高,当CS∶纳米银=3∶1(质量比)时,复合材料的空气透过率最佳。彭俊军等[20]采用CS改性棉和涤纶织物,并通过CS原位还原制备纳米银。发现改性后的织物表面均匀形成了纳米银,大小为5~10nm,织物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌率可达99%以上,50次水洗后抑菌率可达94%以上。
3.5 医用敷料
纳米银/CS抗感染敷料能有效抑制金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、变形杆菌等外伤感染细菌的生长,有效控制全身性败血症,对烧伤感染有良好的抑制效果。Kumar等[21]制备了β-甲克质/纳米银复合支架用于伤口愈合,结果表明,材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较强抑菌性,凝血性良好,上皮细胞能粘附于支架材料表面。Zhao等[22]将纳米银与聚乙烯醇、羧甲基CS混合静电纺丝。测量了纳米纤维的体外银释放量,并对大肠杆菌的抑菌性进行了评价。结果表明,10mg纳米纤维浸入50mL菌液中,银释放量为600~700PPb,细胞毒性低,纳米纤维在同104CFU/mL大肠杆菌菌液12h的接触时间内,抑菌率达到了98%。
4 展望