聚糖反应（精选7篇）
聚糖反应 篇1
非淋菌性宫颈炎属于慢性宫颈炎的一种,一般是指由沙眼衣原体和支原体等所致的黏液脓性宫颈炎(MPC),它是宫颈管内膜异位区红肿、易出血伴黏液脓性分泌物等表现的宫颈内膜炎,国内外研究表明沙眼衣原体、淋球菌感染可引起MPC,黏液脓性宫颈炎分成淋球菌和衣原体宫颈炎,其中衣原体及支原体宫颈炎即非淋菌宫颈炎比较严重
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2014年10月~2016年4月在本院治疗的非淋菌性宫颈炎患者100例,其中男67例,女33例,纳入标准:①均确诊为非淋菌性宫颈炎;②严重肝、肾疾病及恶性肿瘤患者除外。随机将患者分成对照组和试验组,每组50例。对照组男33例,女17例,年龄29~61岁,平均年龄(44.5±9.6)岁,病程0.3~3.6年,平均病程(2.3±0.1)年,平均体重(53.2±2.0)kg;试验组男34例,女16例,年龄28~63岁,平均年龄(44.2±9.8)岁,病程0.4~3.8年,平均病程(2.4±0.3)年,平均体重(53.1±1.8)kg。两组患者性别、年龄及体重等一般资料对比差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 方法
对照组仅给予多西环素(广东卫伦生物制药有限公司,国药准字H20051974)进行治疗,100 mg/次,2次/d,连续用药2周。
试验组进行多西环素+壳聚糖宫颈抗菌膜疗法。即除按照对照组同样服用多西环素外,同时使用壳聚糖宫颈抗菌膜进行治疗。过程中需用干净的棉棒将宫颈表面和阴道中的分泌物进行清理,按压10~15 s,保证抗菌膜和宫颈表面粘合后,将带线的纱球合理进行放置,1 d后取出纱球,1次/周,连续治疗2个月
1.3 观察指标观察两组的临床疗效、病原体转阴情况及不良反应(轻微恶心或胃肠道刺激)等指标。
1.4 疗效判定标准<xref id="83" rectid="p188-b11-r52" href="n118-m52;n118-m54;n118-m56">[3,4,5]</xref>
患者的自觉症消除,阴道没有出现显著分泌物,支原体检查显示阴性为痊愈;患者的自觉症与治疗前比较有显著好转迹象,阴道内没有明显分泌物,且支原体检查显示阴性为显效;患者的自觉症与治疗前比较逐渐好转,支原体检查结果显示阳性为有效;否则无效,总有效率=显效率+有效率。
1.5 统计学方法
采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验;计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 两组的临床疗效对比试验组患者中痊愈25例、显效13例、有效10例、无效2例,对照组患者中痊愈20例、显效7例、有效12例、无效11例,试验组临床总有效率(96.0%)明显高于对照组(78.0%),差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2 两组的病原体转阴情况及不良反应对比
试验组的病原体转阴率(92.0%)明显高于对照组(64.0%),差异具有统计学意义(P<0.05)。且试验组无明显不良反应发生,而对照组出现4例轻微恶心或胃肠道刺激,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表1 两组的临床疗效对比[n(%)]
注:与对照组比较,aP<0.05
表2 两组的病原体转阴情况及不良反应对比[n(%)]
注:与对照组比较,aP<0.05
3 讨论
非淋菌性宫颈炎作为一种妇科常见的感染性疾病,患者常有非婚性接触史或配偶有尿道炎感染史,临床表现为阴道分泌物异常,下腹部不适,尿急、尿痛等,但也有相当数量的患者症状轻微或无任何症状,妇科检查发现有宫颈充血、水肿,触之易出血,黄色粘稠分泌物增多
为此本院在本研究中采用多西环素+壳聚糖宫颈抗菌膜的疗法取得了一定的成果,结果显示出试验组中25例痊愈、13例显效、10例有效、2例无效,其临床总有效率(96.0%)明显高于对照组(78.0%),差异具有统计学意义(P<0.05),试验组的病原体转阴率(92.0%)明显高于对照组(64.0%),差异具有统计学意义(P<0.05),且试验组无明显不良反应发生,而对照组出现4例轻微恶心或胃肠道刺激,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明了多西环素+壳聚糖宫颈抗菌膜疗法在治疗非淋菌性宫颈炎过程中的有效性和安全性,具有一定的临床价值。
综上所述,对于非淋菌性宫颈炎,多西环素结合壳聚糖宫颈抗菌膜的疗法显著改善患者症状,疗效较佳,安全性较高,值得临床推广应用。
摘要：目的 分析研究多西环素结合壳聚糖宫颈抗菌膜用于非淋菌性宫颈炎治疗疗效及不良反应。方法 100例非淋菌性宫颈炎患者,随机分成对照组和试验组,各50例。对照组仅给予多西环素治疗,试验组进行多西环素+壳聚糖宫颈抗菌膜疗法,分析比较两组的临床疗效、病原体转阴情况及不良反应。结果 试验组患者中25例痊愈、13例显效、10例有效、2例无效,对照组患者中20例痊愈、7例显效、12例有效、11例无效,试验组临床总有效率(96.0%)明显高于对照组(78.0%),差异具有统计学意义(P<0.05)。试验组的病原体转阴率(92.0%)明显高于对照组(64.0%),差异具有统计学意义(P<0.05)。且试验组无明显不良反应发生,而对照组出现4例轻微恶心或胃肠道刺激,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 对于非淋菌性宫颈炎,多西环素结合壳聚糖宫颈抗菌膜的疗法显著改善患者症状,疗效较佳,安全性较高,值得临床推广应用。
关键词：多西环素,壳聚糖宫颈抗菌膜,非淋菌性宫颈炎,疗效,不良反应
聚糖反应 篇2
魔芋葡甘露聚糖(KGM)是一种植物多糖,具有优良的增稠性及独特的胶凝性,在食品、化工、纺织、医药等行业具有重要用途[2]。魔芋葡甘聚糖(KGM)作为一种天然高分子化合物,与壳聚糖共混时分子间强烈的氢键相互作用和良好的相容性,能使成膜后的拉伸强度及断裂伸长率较壳聚糖纯膜显著提高。但随着KGM的比例增加,虽然提高了共混膜的机械强度等物理参数,但抑菌活性随之降低,不利于创面的愈合。
本课题前期研究发现,将CS溶液和KGM溶液按1:1比例混合,所制成的壳聚糖/魔芋葡甘露聚糖复合膜能够显著促进SD实验大鼠的疮面愈合[3],为进一步观察该复合膜应用于内脏实质器官的止血效果,本课题于2011年12月~2012年3月以成年大白兔为研究对象开展了实验研究,获得了良好的疗效,现报告如下。
1 材料
1.1 试剂与仪器
壳聚糖(CS,分子量75000,脱乙酰度≥85%,Sigma化学制剂有限公司);魔芋葡甘露聚糖(95%KGM,中国成都);DMEM培养基(Gibco美国);胎牛血清FBS(赛默飞世尔生物化学制品有限公司);MTT,DMSO,苯酚,乙醇,氯仿,冰醋酸,磷酸盐缓冲液(PBS,p H 7.4),氢氧化钠及其他化学试剂均购置于sigma公司;实验用水均为去离子水,其他试剂为分析纯。所用仪器包括:多歧管台式冷冻干燥机,Vir Tis bench top 2K;恒温培养箱,上海医疗器械七厂。
1.2 实验动物
健康成年大白兔30只,雌雄不限,体重2.4~2.7kg,由中国人民解放军第302医院实验动物中心提供。
2 方法
2.1 CS/KGM膜的制备
KGM先用苯酚和乙醇(4:1,v/v)提取五次,再用氯仿和乙醇(5:1,v/v)提取三次,真空干燥,得到纯化后的KGM[4]。配制浓度为1%(w/v)的KGM溶液,配制浓度为1%(w/v)的CS溶液(溶剂为1%的冰醋酸)。CS溶液和KGM溶液以1:1混合,混合均匀的溶液(20ml)倒入直径10cm的培养皿里。真空冷冻干燥,得到疏松多孔膜。用1%氢氧化钠溶液浸泡膜以中和冰醋酸,然后用水洗两次。再次冷冻干燥膜,得到CS/KGM膜同法制备CS膜。
2.2 评价膜的止血作用
健康大白兔30只,分为三个组:普通医用纱布对照组、云南白药组和复合膜组各10只。所有兔用3%戊巴比妥钠经耳静脉注射麻醉,仰卧固定于手术台上,剪去腹部兔毛,标准的正中开腹,游离、暴露肝脏,在距每叶肝脏前端约1.0cm处剪去肝组织,造成出血创面,自由出血3s后,按如下方法敷压创口,并开始计时,当不再出血后计时结束。
实验组以CS/KGM膜组敷压创口,并以精确称重的普通医用纱布收集肝叶破损后至完全止血时的肝脏出血,50g砝码加压,止血后进行称重,计算术中总的出血量。
云南白药组在用云南白药止血时,为防止止血粉散落腹中各处,先将已称重的止血粉倒在已称重的普通医用纱布上,再将其包在创面进行敷压,止血后进行称重,计算术中总的出血量。
普通医用纱布对照组使用已精确称重的普通医用纱布敷压创口,50g砝码加压,收集肝叶破损后至完全止血时的肝脏出血,止血后进行称重,计算术中总的出血量。
待肝脏完全止血后,游离、暴露脾脏,在距脾脏前端约1.0cm处剪去组织,其余步骤同前。
2.3 统计学处理方法
止血时间及出血量属于计量资料,如果所获数据均服从正态性和方差齐性,则应用方差分析的方法进行组间整体统计分析,组间两两比较应用q检验;如果所获数据任一组不服从正态性,或整体不服从方差齐性,则应用秩和检验进行组间整体比较及两两比较,两两比较时,α=0.05/3=0.0167。
所获数据录入至Excel表中,借助SAS9.1统计分析软件进行统计分析。
3 结果
3.1 组间整体比较统计分析结果
见表1。
3.2 组间两两比较统计分析结果
注:“膜”为CS/KGM膜组;“白药”为云南白药组;“空白”为普通医用纱布组
4 讨论
在战场、地震、突发性事故和医院的外科手术中,早期有效地止血是减少患者死亡的最佳策略,因而止血剂的研发成为国内外医药科研人员关注的焦点[5]。
近年来,基于壳聚糖的止血性能和促进愈合作用的研究正成为创伤敷料研究热点[6]。虽然壳聚糖有良好的生理活性,但由于壳聚糖形成的膜力学性能不好,往往采取与其他材料进行交联[7]或者混合[8]以改善其力学性能。本实验制备的CS/KGM膜为多孔的三维网状结构,在CS中加入KGM后,由于KGM良好的亲水性,显著提高了复合膜的吸水性能。同时KGM分子的羟基与CS分子的氨基形成分子间氢键,加强了分子间相互作用提高了复合膜的力学性能,减小了复合膜的孔径,因而可以有效地实现止血功能。
本研究的实验结果表明,KGM与CS按1:1的比例制成的复合膜用于肝、脾脏外科损伤,无论在止血时间还是出血量,与云南白药相比,无显著的统计学意义(P>0.05),但二者与普通医用纱布的疗效比较,均具有显著的统计学意义(P<0.05),提示二者止血的疗效均优于普通医用纱布。从实际实验数据看,CS/KGM复合膜组尚有较云南白药疗效更佳的趋势,由于本研究的样本量所限,有待进一步开展更大样本量的实验证实。
本实验的结果表明,CS/KGM复合膜能有效地治疗肝、脾脏外伤止血,具有较强的应用价值,为进一步开发提供了实验依据。
参考文献
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壳聚糖的研究进展 篇3
关键词：甲壳质,壳聚糖,降解,生物材料
壳聚糖是一种新型的天然医用生物材料。虾、蟹类作为壳聚糖的原料,在我国具有分布量大,资源丰富的特点,从环保、经济可持续发展的角度来考虑,壳聚糖作为一种天然的材料不仅无毒、无污染,而且还具有很好的生物降解性和相容性。因此非常有必要加大对壳聚糖的研究,以开发更多的产品。本文综述了壳聚糖的结构性质、制备、体内降解过程及其在生物医用材料的应用等方面。
1 壳聚糖的结构与性质
1.1 壳聚糖的结构
壳聚糖是甲壳质的脱乙酰化产物。甲壳质是N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过β-1,4糖苷键相连的直链状氨基多糖,其化学名为聚(1,4)–2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖,也称为聚(N-乙酰基-D-葡糖胺),甲壳质在碱性条件下水解,脱去部分乙酰基后就转变成壳聚糖,其化学名为:聚(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖。甲壳质和壳聚糖并非单一的化学实体,来源和制造过程不同,它们的成分就会发生改变。当N-乙酰氨基-D-葡糖胺单元的含量超过50%时,该高分子聚合物就是甲壳质,反之,当N-氨基-D-葡糖胺单元的含量超过50%时即为壳聚糖[1]。图示如下:
1.2 壳聚糖理化特性
壳聚糖是甲壳质最主要的衍生物,不同程度的的脱乙酰作用可以获得不同脱乙酰度的壳聚糖。粗壳聚糖分子量为1×105~10×105,通常其脱乙酰度为80%~95%。纯净壳聚糖为白色或灰白色,半透明的片状固体。主要特性有:1)不能完全溶解于水和碱溶液中,但可溶于稀酸(PH<6),游离氨基质子化促进溶解。溶于稀酸呈粘稠状,在稀酸中壳聚糖的β-1,4糖苷键会慢慢水解,生成低分子壳聚糖。2)壳聚糖在溶液中是带正电荷多聚电解质,具有很强的吸附性。3)壳聚糖的溶解性与脱乙酰度、分子量、粘度有关,脱乙酰度越高,分子量越小,越易溶于水;分子量越大,粘度越大[2]。
1.3 壳聚糖的生物活性
壳聚糖是一种天然、无毒、可生物降解的化合物,与机体之间有良好的生物相容性。主要生物活性有:1)壳聚糖属天然高分子化合物,其分子链上的游离氨基在弱酸溶液中结合一个质子,生成阳离子聚合体,有很强的吸附能力,是一种良好的絮凝剂[3]。2)带有正电荷的壳聚糖与带有负电荷的粘多糖、蛋白多糖等相互发生静电作用,这一特性是相当有意义的,因为大量的细胞浆和生长因子的移动都和粘多糖有关,特别是对于肝磷脂和类肝素硫酸盐,包含有壳聚糖和粘多糖的支架借助于细胞繁殖可以维持和促进生长因子分泌。3)壳聚糖可以做成不同的几何结构,例如容易形成多孔结构,多孔支架可用于体内细胞生长和骨重建[4]。4)壳聚糖具有抗菌性,研究表明它可以减缓实验白兔金葡萄球菌引起的骨髓炎感染。壳聚糖在细菌细胞膜表面可以抑制生物合成,破坏穿过细菌细胞膜的能量传输,加快细菌的死亡。此外,壳聚糖还可作为药物释放载体,如与羟基磷灰石等复合能够持续释放万古霉素和磷霉素,在骨科感染疗程中发挥作用[5]。
2 壳聚糖的制备
2.1 壳聚糖的工业合成
2.1.1 主要原料
甲壳质和壳聚糖都是天然的多聚糖,甲壳质是甲壳类动物的外壳,昆虫的骨骼和真菌的细胞膜的主要组成成分[6]。虾壳中壳聚糖含量为20%,龙虾壳中含量为25%,蟹壳中含量为17%~18%,其余为35%~50%的碳酸钙,30%~40%的蛋白质。从这类动物中提取甲壳质,粗制壳聚糖,再进行深加工制成高科技产品有很高的经济价值。
2.1.2 生产工艺
壳聚糖的制取通常采用化学法,制备工艺程序为[7]甲壳→脱钙→脱蛋白质→脱色→甲壳质→脱乙酰基→壳聚糖。
先将虾、蟹壳洗净干燥后,用5%稀盐酸在室温浸泡数小时,直至不冒泡为止,目的是脱除碳酸钙,使碳酸钙变成氯化钙随溶液排出,再经水洗、干燥、粉碎,用烧碱溶液浸泡,于100℃煮沸分解蛋白质,经多次处理后得到粗壳质,再用1%高锰酸钾溶液浸泡氧化脱色,水洗,再加入1%草酸溶液,于70℃保温30min,除去过量的高锰酸钾,得白色甲壳质。将此甲壳质浸于40%~60%的浓碱中,于120℃反应1h可得脱乙酰度为70%左右的壳聚糖,再更换一次碱液,在相同条件下继续水解1h最后可得脱乙酰度为92%以上的壳聚糖。
国内生产的壳聚糖产品主要存在灰分含量高和氨基含量高的缺点。为了获得高质量的甲壳素,国外采用多种有机溶剂在闪蒸下操作或用微波幅射,用50%浓碱溶液,于80℃反应18min,完成甲壳质到壳聚糖的转化。
2.2 壳聚糖的实验室制法
目前在实验室制备壳聚糖通常采用两种方法:
Broussignac[8]等先制备混合物作为该无水反应的中间体,将96%乙醇溶液和乙烯乙二淳溶液混合,再逐步加入固态KOH粉末并不断搅拌。此溶解过程是放热过程,温度上升至90℃。这一步骤的优点是反应可在玻璃或不锈钢容器中进行。在向混合物中逐渐加入甲壳质,温度达到预期温度后,乙醇挥发又回到反应容器中,持续反应一段时间后,过滤,蒸馏水洗至中性,在室温下干燥,得到产物壳聚糖。
Kurita[9]等将壳质悬浮液和Na OH溶液混合加热至80℃,反应过程中持续通入N2流,到达预定时间后,过滤,蒸馏水洗至中性,再加入甲醇和丙酮,放置烘箱中,恒定50℃时干燥12小时,得到壳聚糖。也可在脱乙酰过程中加入Na BH4苯硫酚,这两种物质和壳质的质量比为1:1,目的是防止聚合物降解。
3 壳聚糖的体内降解
壳聚糖的降解方式包括超声波降解[10]、辐射降解、光降解、酸降解、氧化降解[11]、酶降解等多种方式,但其在生理环境中的降解主要是酶降解法。
壳聚糖在体内的降解主要溶菌酶水解所引起的,而蛋白酶等对壳聚糖的降解能力较低。溶菌酶[12]是人体体液中含量较高的一种抗菌物质,在泪液中含量最多,约占人体泪液蛋白含量的20%~40%。壳聚糖具有部分N-乙酰基葡萄糖残基,而溶菌酶能识别N-乙酰基残基,所以水解产物是由氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖残基组成的不同长度寡糖[13],溶菌酶对壳聚糖的催化水解速度随着脱乙酰度的升高而降低,脱乙酰度超过85%的壳聚糖难于在体内被溶菌酶催化水解,而低脱乙酰度的壳聚糖的降解速度较快。由于溶菌酶能识别乙酰氨基葡萄糖序列,因此可以从低脱乙酰度的壳聚糖获得高聚合度(dp>5)的甲壳低聚糖。此外,医用植入材料的壳聚糖脱乙酰化度控制在70%左右。目前,商业化溶菌酶的生产主要来自于蛋品加工厂,这种酶在酶法规模制备甲壳低聚糖中应该具有潜在的价值。
甲壳质和壳聚糖除了被和溶菌酶降解外,还有许多酶制剂[14]如葡萄糖酶、蛋白酶、脂酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等30多种酶能水解壳聚糖和甲壳质。酶对多糖的水解具有高度的选择性,而无其它副反应。
4 壳聚糖在生物医用材料方面的应用
对壳聚糖分子表面进行化学修饰和改性,利用其良好的成膜性、生物降解性和生物相容性,可使其成为具有广泛医学用途的新型天然医用生物材料。
4.1 用于膜材料
多聚糖及其衍生物易相互交联形成网状结构[15],利用适当的溶剂,可制成透明的薄膜。甲壳质、脱乙酰壳聚糖作为药物控释膜,是药物的良好载体[16],具有缓释、长效的特点。由于生产成本低,目前国外正大量研究将其作为许多药物的缓释剂,有做成膜的,也有压成片状的。作为药物控释膜,发现酸性药物的透过性优于碱性药物,小分子量药物较之大分子量药物易于透过。国内有研究表明,调整壳聚糖或改变戊二醛为交联剂的交联度,均可改变释放速度。有关报道[9]表明,壳聚糖苹果酸盐用于数种小分子药物体外释放研究,其释药性为零级释放模式。壳聚糖凝胶应用于利多卡因药也证实了这一点,并且脱乙酰化度对转移扩散性能影响较大。壳聚糖作为蛋白质和多肽等不易透皮吸收的大分子药物和疫苗控释载体目前已引起人们的关注。
另外,壳聚糖能有效地促进伤口愈合,防止伤口感染,镇静止血。目前也有甲壳质无纺布人工皮肤在国外销售,用于整形内科、皮肤科作为Ⅱ、Ⅲ度烧伤、采皮伤、植皮伤以及肤介伤的被覆保护材料[17]。
壳聚糖易成膜,透过性优于纤维素膜,仅强度稍低,经共混处理可提高壳聚糖膜的强度。壳聚糖中加入聚乙烯醇而制成的3.0μm膜,在25℃时可吸收102%的水且具有较高的强度和尿素的透过性,可望在人工肾中获得应用。
4.2 外科手术可吸收缝合线[18]
壳聚糖类可吸收缝合线具有高强度,易打结,柔韧性好的机械性能和促进伤口愈合,抗溃疡等药理作用。并且可以通过对壳聚糖的化学修饰如乙酰化等增强纤维性能,或与其它物质如丝胶蛋白共混制成功能化纤维,以此改善天然材料在体内环境中抗张强度损耗快的缺陷,同时也避免了较大的组织反应。
4.3 用于骨组织材料
壳聚糖被广泛地应用于骨组织工程,壳聚糖有良好的生物相容性,生物降解性,骨诱导性,生物再吸收性,易于形成多孔结构,它能促进造骨细胞成长和骨质沉积。壳聚糖-磷酸钙(CP)复合材料的应用被广泛研究,张[19]等人将大孔磷酸钙植入多孔壳聚糖海绵体。在这个支架中,壳聚糖海绵体嵌套通过基质增强增大了磷酸钙的机械力并保持了造骨细胞的形态。此外,包含有HA或具有相互连接的多孔结构且孔径为100 mm的磷酸钙玻璃的大孔壳聚糖支架已经被合成[20],壳聚糖-磷酸钙之类的复合材料在临床上有很大的应用前景。葛[21]等人报道HA–甲壳质复合材料具有骨诱导性,在体内三个月的时间内,快速降解并促进了新血管形成。Kawakam等研究表明在体内将壳聚糖–HA涂在骨膜切除的胫骨表面时,一个星期后可以观察到新骨形成并在接下来的20个星期内继续生长,无不良症状。由此说明壳聚糖–HA作为骨填充材料[22]在临床上具有很高的研究价值。此外以壳聚糖为基体的复合材料有很强的抗压性能,壳聚糖–HA强度和弯曲系数高,适用于长骨碎裂的内部固定材料。壳聚糖也可作为骨水泥的辅助剂,用于外科手术中。
5 展望
牛蒡低聚糖防潮颗粒的研制 篇4
关键词：牛蒂低聚糖防潮颗粒,中药制药工艺
牛蒡低聚糖具有促使双歧杆菌增殖、防止便秘、保护肝脏、降低血清胆固醇、增强机体免疫力、抗癌等作用, 本院以提取的牛蒡低聚糖为主要原料, 做成颗粒剂。由于牛蒡低聚糖比较容易吸湿, 本实验通过用不同的辅料制备颗粒剂, 并分别对颗粒剂的溶化性、吸湿性等进行考察, 优选较适宜的吸湿性小的辅料, 同时用植物油或液体石蜡对牛蒡低聚糖颗粒进行粉体改性, 以降低其吸湿性, 从而研制出具保健作用的牛蒡低聚糖防潮颗粒剂, 并对其进行定性检测。
1 实验材料
1.1 仪器
DZF-6050型真空干燥箱:上海精宏实验设备有限公司。数显鼓风干燥箱:上海博迅实业有限公司。数显恒温水浴锅:上海浦东电理仪器厂。旋转薄膜蒸发仪:BUCHI ROTOR VAPOR R-114电子天平:北京赛多利斯仪器有限公司。BY-300A型小型包衣机、BY-300A型包衣机恒温控制器:上海黄海药检仪器有限公司。麦达利喷枪:乐清市精工工具有限公司。OD1012空压机:龙海力霸通用机械有限公司。
1.2 材料
95%乙醇、可溶性淀粉、氯化钠、微晶纤维素、乳糖:上海精细化工科技有限公司。轻质液状石蜡:江西德成制药有限公司。大豆油:上海嘉里食品工业有限公司。
2 方法与结果
2.1 牛蒡低聚糖粉的制备
称取牛蒡药材粗粉一定量, 加10倍量水, 提取温度90℃, 提取两次, 每次提取时间90分钟, 分次浸提牛蒡根粗粉, 分次过滤, 合并提取液, 将提取液减压浓缩至牛蒡根粗粉∶浓缩液=1∶1, 用3倍体积的95%乙醇醇沉, 抽滤, 收集滤液, 用乙醇反复洗涤, 然后于60℃真空干燥, 粉碎, 过60目筛得牛蒡低聚糖细粉[1]。
2.2 处方的筛选
分别选用乳糖、微晶纤维素、可溶性淀粉作为稀释剂与主药混合均匀 (见表1) , 采用湿法制粒, 加85%的乙醇做润湿剂制软材, 过10目筛制粒, 置烘箱中45℃干燥。对颗粒得率、颗粒外观、溶化性、流动性、口感、吸湿性等指标进行考察。结果见表2。
2.2.1 颗粒得率的测定
将制备好的颗粒称重, 先过1号筛, 再过4号筛, 收集能通过1号筛但不能通过4号筛的颗粒, 称重。颗粒得率 (%) =能通过1号筛但不能通过4号筛的颗粒质量/过筛前颗粒质量×100%
2.2.2 休止角的测定
采用固定漏斗法, 将漏斗固定于水平放置的坐标纸上1cm的高度处, 将颗粒沿漏斗壁倒入漏斗中直到坐标纸上形成的颗粒圆锥体尖端接触到漏斗口为止, 由坐标纸测出圆锥底部的直径 (2R) , 计算出休止角 (tgα=H/R) , 做5次, 计算平均值。结果见表2。
2.2.3 颗粒剂溶化性检测方法
在室温22℃条件下, 将2天内新制备的纯化水用电磁炉加热至约80℃, 取待检查低聚糖颗粒剂10g, 置于洁净玻璃烧杯中加热水200ml, 立即用不锈钢药匙搅拌并开始计时, 搅拌力度以液面出现深度旋转旋涡为宜。5分钟后停止搅拌, 朝向亮处, 于自然光下由液面上部向下部观察, 先观察药液的浑浊程度和药液中有无漂移的异物, 再观察药液底部有无焦屑和沉淀的固体物[2]。结果见表2。
2.2.4 颗粒吸湿性的测定
样品的准备:R1:以乳糖为辅料的颗粒。R2:以可溶性淀粉为辅料的颗粒。R3:以微晶纤维素为辅料的颗粒。R4:以微晶纤维素和乳糖 (1∶1) 混合辅料制成的颗粒。R5:以微晶纤维素和乳糖 (1∶2) 混合辅料制成的颗粒。为确保几份样品初始条件一样, 将其置于40℃烘箱中放置3小时。
将底部盛有过饱和氯化钠溶液的干燥器在25℃放置48小时, 使其内部相对湿度恒定在75.28%。在已干燥至恒重的称量瓶底部放入厚约2mm的颗粒, 精密称重后置于25℃, 盛有过饱和氯化钠溶液的干燥器中 (称量瓶盖打开) 于1、2、3、6、9、12、24、36、48小时, 精确称量称量瓶与样品的重量, 计算吸湿百分率。
吸湿率 (%) =吸湿后药粉重量-吸湿前药粉重量/吸湿前药粉重量×100%
以时间为横坐标, 吸湿百分率为纵坐标绘制出吸湿曲线 (见图1) 。通过对吸湿曲线进行比较, 得出表2的吸湿性结果。
从表2可知, R5所制得的颗粒剂外观、溶化性符合规定, 流动性较好, 口感好, 吸湿性较小, 吸湿后不容易发黏, 不容易液化, 综合质量优于R1、R2、R3、R4[3,4]。
2.3 润湿剂乙醇浓度的考察
以乳糖和微晶纤维素 (2∶1) 为辅料, 辅料∶低聚糖=2∶1, 辅料与低聚糖混合均匀, 分别采用65%、70%、75%、85%、90%、95%乙醇溶液为润湿剂制备软材, 以颗粒得率、颗粒硬度、成型难易为指标进行考察, 85%以下浓度乙醇制粒时黏度大, 所制颗粒均偏硬, 有时甚至难以过筛, 颗粒得率偏低;85%以上浓度制粒时, 明显感觉黏度不足, 所得颗粒细颗粒较多, 颗粒流动性较差, 有些松散, 无论是颗粒得率、颗粒硬度, 还是成型难易, 都以85%乙醇为最佳[5]。
2.4 低聚糖颗粒剂的改性
以乳糖和微晶纤维素 (2∶1) 为辅料, 辅料∶低聚糖=2∶1, 辅料与低聚糖混合均匀, 以85%乙醇为润湿剂制备软材, 过10目筛制粒, 置烘箱中45℃干燥, 用1号筛和4号筛整粒, 能通过1号筛不能通过4号筛的颗粒为合格颗粒。分别称取120g合格颗粒置热风预热过的糖衣锅中滚动, 包衣锅锅头转速45r/min, 包衣锅温度40℃, 包衣锅的倾斜角度以颗粒能在锅内保持翻转为最佳 (40~45度) , 用40℃左右的热风将颗粒预热10分钟, 启动空压机, 使压力维持在0.1~0.2mPa。将改性剂 (大豆油或液状石蜡) 分别用喷枪喷于滚动的颗粒表面, 喷浆间隔约10分钟, 喷浆后先吹热风, 后吹冷风让颗粒干燥。待改性完成后, 停机, 用4号筛筛除过小的颗粒, 所得颗粒外观均匀、硬度适中、粒度分布集中。改性的颗粒比未改性颗粒颜色深, 用大豆油改性的颗粒比用液状石蜡改性的颗粒颜色深。所用改性剂量均为4ml, 喷改性剂过程中感觉到大豆油比液状石蜡黏稠度大。
改性后的颗粒剂吸湿性的比较:样品准备:①未改性颗粒;②大豆油改性的颗粒;③液状石蜡改性的颗粒。为确保3份样品初始条件一样, 将其置于40℃烘箱中放置3小时。
吸湿性考察方法同2.2.4。以时间为横坐标, 吸湿百分率为纵坐标绘制出吸湿曲线 (见图2) 。
通过对吸湿曲线进行比较, 结合改性颗粒剂的外观、口味、溶化性及吸湿性考查48小时后的外观、松散性、是否变黏情况可知, 大豆油和液状石蜡改性效果均比较好, 都能显著降低粉体的吸湿性。
2.5 质量控制
2.5.1 性状
本品为浅黄棕色均匀干燥颗粒, 色泽一致, 味微甜, 无吸潮、软化、结块、潮解等现象。
2.5.2 颗粒剂的常规检测
取牛蒡低聚糖颗粒剂按《中华人民共和国药典》2005年版附录颗粒剂项目的质量标准进行检测, 其溶化性、粒度、水分均符合要求。
2.5.3 稳定性试验
将铝塑包装后的颗粒剂进行湿度加速稳定性试验。取用铝塑包装袋包装好的牛蒡低聚糖颗粒剂置于相对湿度75.28%密闭干燥器中, 在25℃条件下放置3个月, 观察包装情况, 颗粒剂的外观、含水量。结果表明, 改性后的颗粒具有较好的稳定性, 水分、外观均符合《卫生部药品标准中药成方制剂 (第十三册) 》中相关规定。
3 讨论
中药浸膏粉通常具有较强的吸湿性, 故直接制粒有一定难度。为了降低其吸湿性而便于制粒, 一般加入适量的辅料与之混合。乳糖易溶于水, 性质稳定, 吸湿性非常小, 口感好, 与大多数药物不起化学反应, 对主药含量测定的影响较小, 是很好的稀释剂, 但乳糖一但吸湿容易发黏, 容易液化。微晶纤维素吸湿性也比较小, 但制成的颗粒较松散, 口感不好。本实验结果表明, 将乳糖和微晶纤维素以2∶1的比例混合作辅料, 低聚糖粉与辅料以1∶2混合制粒比较容易, 所制颗粒稳定, 不容易吸湿, 易于溶化, 且流动性好, 制成颗粒后有助于分装和贮存的稳定性。
因牛蒡低聚糖本身具有较高的黏性, 因此考虑采用一定浓度的乙醇溶液作润湿剂来制备软材, 且乙醇的最佳浓度为85%。采用粉体表面改性技术, 用大豆油或液状石蜡进行粉体表面改性, 最终研制出外观良好、口味佳、吸湿性比较小的牛蒡低聚糖颗粒剂, 含乳糖的颗粒口感、防潮性能均较好。
大豆油为部颁标准所载辅料, 对改善中药提取物的黏性, 改变粉体表面的性质, 降低吸湿性有重要作用。液状石蜡服后不被吸收, 能使粪便稀释变软, 同时润滑肠壁, 使粪便易于排出。因此用大豆油或液状石蜡进行粉体表面改性, 既能改变粉体表面的性质, 由亲水性变为疏水性, 降低吸湿性, 又无毒副作用。
因低聚糖吸湿性比较强, 所以除了采用防潮效果比较好的辅料, 采用粉体表面改性技术外, 还要采用严密防潮包装, 这样才能很好的控制产品的质量。
参考文献
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蟹壳制备壳聚糖的工艺研究 篇5
甲壳类动物是甲壳素最主要的来源,蟹壳中甲壳素含量高达20%～25%[1]。甲壳素具有无毒、无味、耐晒、耐热、耐腐蚀、耐酸碱,可生物降解等特点,应用前景广阔。近年来,甲壳素及壳聚糖作为膜材料、药物载体被广泛应用于食品添加剂、医药、环保、饲料、化妆品等多个领域[2,3,4]。本文以晾干蟹壳为原料,探讨了壳聚糖的制备工艺,通过实验得到制备壳聚糖的最佳工艺。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
实验材料:干燥蟹壳粉,购自烟台;盐酸;氢氧化钠;EDTA;K-B指示剂;甲基橙指示剂;NH3-NH4Cl缓冲液,上海凌峰化学试剂公司。
仪器:T6 紫外-可见光分光光度计,北京普析通用仪器有限公司);PHS-2C型pH计,上海理达仪器厂;DK-0A恒温水浴锅,上海精密实验设备有限责任公司;TGL-16离心机,金坛市医疗仪器厂;NDJ-8S数显旋转粘度计,上海羽通仪器仪表厂。
1.2 工艺路线
蟹壳中除了含有甲壳素外,还有大量的碳酸钙、蛋白质及微量的色素。以蟹壳为原料制备壳聚糖可先用酸脱钙,碱液除蛋白,得到的甲壳素再与浓碱反应,脱除乙酰基,即可得到壳聚糖。工艺路线如下:
原料→粉碎→酸浸脱钙→水洗过滤→稀碱脱蛋白→氧化脱色→洗涤→浓碱脱酰基→水洗至中性→干燥→壳聚糖
1.3 甲壳素提取
1.3.1 脱钙
将干燥蟹壳粉碎至一定粒度,边搅拌边缓慢加入一定量2%～12%盐酸,pH上升至6左右时,补加一定量盐酸,使蟹壳里的无机盐溶解。搅拌反应2～12 h,当pH下降至1左右时,脱钙结束,测定脱钙率。
脱钙率的测定[5]:取5 mL处理后的样液于250 mL锥形瓶中,加入50 mL H2O2,5 mL NH3-NH4Cl缓冲液,4滴K-B指示剂,混匀。用EDTA溶液滴定,当溶液由紫红色变为蓝色即为滴定终点。脱钙率按下式计算:
脱钙率
式中:CEDTA——EDTA浓度,mol·L-1
VEDTA——滴定消耗EDTA体积,L
MCa——Ca摩尔浓度,g·moL-1
V——样品体积,L
m——蟹壳的质量,g
1.3.2 脱蛋白
脱钙结束后,过滤抽干,滤渣中加入一定量2%～14%氢氧化钠,85 ℃下反应4 h,以除去蛋白质,趁热过滤,测定脱蛋白率。碱液处理过的蟹壳水洗至中性,加入高锰酸钾脱色,水洗后干燥即可得到甲壳素产品。
脱蛋白率的测定[6]:将待测蛋白质溶液稀释n倍,用紫外分光光度计测定280 nm和260 nm处的吸光值A280和A260。当样品吸光值A280/A260约为1.8时,可用下式计算蛋白质含量:
蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45A280-0.74A260)×n
1.4 壳聚糖的制备方法
称取一定量的干燥甲壳素,加入20%～65%氢氧化钠,用量以1:5(g:mL)为适,搅拌加热至40～90 ℃,保温3～10 h。冷却后过滤,反应物水洗至中性,干燥后可得壳聚糖产品。测定脱乙酰度和粘度。
脱乙酰度的测定[7]:准确称取一定量的壳聚糖,室温下用25 mL 0.1 mol/L HCl溶解,加入甲基橙指示剂,用0.1 mol/L氢氧化钠滴定,溶液变为黄色即为滴定终点。 按质量计算酸脱乙酰度:
WNH2=(C1V1-C2V2)×MNH2×100%/m
脱乙酰度=203WNH2×100%/(16+42WNH2)
式中:C1——所用盐酸标准溶液浓度,mol·L-1
V1——所用盐酸体积,L
C2——所用氢氧化钠标准溶液浓度,mol·L-1
V2——所用氢氧化钠体积,L
m——壳聚糖质量,g
2 结果与讨论
2.1 甲壳素的提取
以蟹壳为原料提取甲壳素,盐酸浓度、脱钙时间、脱蛋白用氢氧化钠浓度、脱蛋白温度等对甲壳素的提取均有一定影响。以下内容主要考察这些因素对甲壳素提取率的影响。
2.1.1 盐酸浓度对脱钙率的影响
由图1可以看出,由蟹壳制备甲壳素时,随着盐酸浓度的升高脱钙率也上升。当盐酸浓度升至6%后,再提高盐酸浓度脱钙率上升也不明显。当盐酸浓度超过8%以后,随着盐酸浓度的升高,脱钙率反而有所下降,这可能是由于高浓度的盐酸会加速甲壳素的降解。故在保证充分脱钙的前提下,为了提高甲壳素的提取率,选择6%的盐酸进行脱钙较为合适。
2.1.2 盐酸浸泡时间对脱钙率的影响
取一定量经粉碎后的蟹壳,加入烧杯中,分别在常温和60 ℃ 下用6%的盐酸搅拌浸泡2～12 h,反应结束后测定脱钙率。盐酸浸泡时间对脱钙率的影响见图2。
由图2可知,盐酸浸泡时间越长,脱钙率越高,浸泡时间超过4 h后,随着浸泡时间的延长脱钙率变化不大。浸泡时间超过10 h会使甲壳素分子降解,从而降低壳聚糖的利用率。加热虽有利于蟹壳的脱钙,但是脱钙率提高不明显,从节约能源和缩短反应周期等方面综合考虑,选择常温脱钙6 h即可。
2.1.3 氢氧化钠浓度对脱蛋白率的影响
从图3可知,氢氧化钠浓度对脱蛋白率的影响并不大,氢氧化钠浓度上升至6%之后,脱蛋白率基本没有变化,从节约碱的用量方面考虑,选择6%的氢氧化钠脱蛋白较为合适。
2.1.3 反应温度对脱蛋白率的影响
取干燥的甲壳素,加入一定量6%的氢氧化钠在30～100 ℃下反应4 h,反应结束后测定脱蛋白率。由图4可知升高温度对脱蛋白有利。常温下甲壳素的脱蛋白率较低,当温度上升至80 ℃,脱蛋白率明显提高,当温度超过80 ℃后脱蛋白率提高不显著。提高温度可减少反应时间,综合考虑各方面因素选择可将加入碱液的甲壳素迅速升温至90 ℃,之后80 ℃保温4 h即可基本反应完全。
2.2 壳聚糖的制备
2.2.1 碱浓度对脱乙酰度及粘度的影响
由图5可知,在一定范围内,脱乙酰度随氢氧化钠浓度的增大而增大,但是当碱液浓度超过50%时,脱乙酰度反而有所下降。粘度随着氢氧化钠浓度的增大呈上升趋势,当碱液浓度超过60%后上升趋势不明显。故甲壳素脱乙酰操作中选用50%的氢氧化钠较为合适。
2.2.2 温度对脱乙酰度及粘度的影响
称取一定量的甲壳素用50%的氢氧化钠在一定温度下反应4 h,反应结束后测定脱乙酰度和粘度。从图6可以看出,反应温度对甲壳素的脱乙酰度有很大的影响,反应温度升高脱乙酰度也随之增大,也是由于升高温度可以使反应快速进行,故脱乙酰度也增大。虽然升高温度对脱乙酰度的增大有利,但是反应温度对产品的粘度也有很大的影响。温度小于70 ℃时,产品的粘度随温度的上升而增大,温度超过70 ℃后,随着温度的上升产品的粘度反而下降。这可能是因为温度升高会造成壳聚糖分子链的裂解,分子量下降,产品粘度降低。虽然脱乙酰度增大,产品粘度增大,但是增加的幅度小于裂解的幅度,故温度过高会使产品粘度下降,影响产品质量。考虑壳聚糖产品的质量,选择先将反应液加热至85 ℃,然后70 ℃保温4 h的工艺较为合适。
3 结 论
以干燥蟹壳为原料制备壳聚糖的最佳工艺条件为:
(1)甲壳素提取:干燥蟹壳中滴加3倍量体积的6%的盐酸,pH上升至4,当pH升至6,再补加2倍量的6%盐酸,常温下搅拌反应6 h。脱钙结束后加入4倍体积的6%氢氧化钠,可先将反应液迅速加热至95 ℃,80 ℃保温反应4 h,过滤后得到甲壳素产品。
(2)壳聚糖的制备:在得到的甲壳素中加入3倍体积的50%氢氧化钠溶液,迅速加热至85 ℃,70 ℃左右搅拌反应4 h,过滤,水洗至中性,干燥后得到壳聚糖产品。
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壳聚糖抗菌活性研究进展 篇6
1 壳聚糖抗菌性能的影响因素
壳聚糖的抗菌性能与其自身的性质以及环境因素有关。壳聚糖溶液浓度、壳聚糖分子量、壳聚糖的脱乙酰度、金属离子浓度以及环境中的p H值等都会影响壳聚糖的抗菌性能。
1.1 壳聚糖浓度
壳聚糖的浓度直接影响着抗菌效果。对于不同的菌种, 壳聚糖的最小抑菌浓度表现出一定的差异性;对同一菌种, 不同分子量的壳聚糖也有着不同的最小抑菌浓度。在一定范围内, 壳聚糖的抗菌性能随着壳聚糖浓度的增加, 其抗菌效果也在提高[2]。
1.2 壳聚糖分子量
壳聚糖分子量是影响壳聚糖抗菌活性的重要因素。分子量的大小对壳聚糖抗菌活性的影响目前还没有统一的结论。郑连英等的研究表明, 对于革兰氏阳性菌, 随着壳聚糖的分子量的增大, 抗菌效果逐渐增强;而对于对革兰氏阴性菌, 随着壳聚糖的分子量减小, 抗菌作用逐渐增强[3]。而宋献周的研究表明, 无论是革兰氏阳性菌, 还是革兰氏阴性菌, 低分子量的壳聚糖的抗菌效果均优于高分子量的壳聚糖[4]。吴小勇、冯小强等人的研究验证了郑连英的观点, 大分子量的壳聚糖对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌效用, 而低分子量的壳聚糖对大肠杆菌有较好的抗菌效果[5,6,7,8]。有研究表明, 羧甲基的抗菌活性及低聚壳聚糖的抗真菌活性随分子量的增加而减弱[8,9]。
1.3 壳聚糖脱乙酰度
壳聚糖的脱乙酰度的定义为壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总的糖残基数的百分数, 它是反映壳聚糖分子链上自由氨基的含量的指标。壳聚糖脱乙酰度越高, 其分子链中的自由氨基的含量就越高。壳聚糖中的氨基 (-NH2) 是目前大家比较认可的消毒因子。等浓度、近分子量壳聚糖溶液, 脱乙酰度高的壳聚糖含有更多的消毒因子, 其抗菌活性也越高。许多研究结果都表明, 壳聚糖的抗菌活性随着脱乙酰度的提高而增强[10,11,12]。
1.4 环境p H
壳聚糖一般只有在弱酸的条件下才能表现出其较好的抗菌活性[7,10,11]。这是因为在较高的p H会使壳聚糖溶解度变差, 而在较低的p H介质中, 溶液中的大量H+会与杀毒因子-NH3+在细菌表面产生竞争性吸附, 导致抗菌活性的下降[10]。
1.5 金属离子
壳聚糖的分子链上含有多个-NH2活性官能团, N上含有孤对电子对, 这使得壳聚糖具有良好螯合能力, 能与多种金属离子螯合。壳聚糖的抗菌活性随着金属离子的增大而减弱, 高浓度金属离子甚至能使壳聚糖的完全失去抗菌活性[12,13,14]。此外, 壳聚糖对金属离子的螯合能力会影响到壳聚糖的抗菌效果。吴俊等的研究表明, 壳聚糖对某种金属离子的螯合能力越强则其抗菌效果就越差, 金属离子对壳聚糖抗菌效果的影响程度由大到小依次为:Zn2+>Mn2+>Ca2+>Mg2+[13]。而氯化钠能增大溶液中的离子浓度, 从而增大壳聚糖的溶解度, 达到提高壳聚糖的抗菌效果。
2 壳聚糖的抗菌机理
壳聚糖作为抗菌剂已被科研工作者研究多年, 虽然到目前为止具体的抗菌机理尚未清楚, 但学者们提出了不少较为合理的抗菌机制。郑连英等认为壳聚糖的抗菌作用主要有以下两种机理:一种是壳聚糖吸附在细胞表面, 形成一层高分子膜, 阻止了营养物质向细胞内的运输, 从而起到抑菌杀菌作用;另外一种机理是壳聚糖通过渗透进入细胞体内, 吸附细胞体内带有阴离子的细胞质, 并发生絮凝作用, 扰乱细胞正常的生理活动, 从而杀灭细菌[3]。壳聚糖分子量的不同, 菌种种属的不同, 其抗菌机理也有所不同。革兰氏阳性菌的细胞壁较厚, 结构紧密, 且细胞壁含有丰富的磷壁酸使细胞壁形成一个负电荷环境, 所以, 高分子量的壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑杀作用可能以第一种机理为主。而革兰氏阴性菌细胞的壁薄, 交联松散[15]。低分子量壳聚糖对大肠杆菌的杀菌作用可能归因于第二种机理。但是, 宋献周的研究表明, 壳聚糖的抗菌作用主要是通过某种途径进入菌体细胞内并扰乱其生理代谢实现的, 因此低分子量的壳聚糖的抗菌效果均优于高分子量的壳聚糖[4]。现有的研究表明, 壳聚糖的抗菌主要是通过在表面成膜和进入菌体两种方式实现的。
2.1 表面成膜
壳聚糖是自然界唯一的天然碱性阳离子多糖, 在溶液中带正电荷, 易吸附在带负电荷的细胞壁上形成一层高分子膜。这层高分子膜能改变细胞膜的选择透过性, 阻止营养物质运输, 致使细胞质流失, 发生质壁分离, 从而起到抑菌杀菌效果[11]。高分子量的壳聚糖较低分子量的壳聚糖具有更好的成膜性, 从而表现出更好的抗菌效果。
一些研究学者通过观察细菌形态特征的变化或检测胞内物质的流出, 从而证明了壳聚糖是通过表面成膜来达到抗菌效果的。杨冬芝等用扫描电镜观察分子量为27万的壳聚糖对大肠杆菌的作用, 发现壳聚糖使菌体凹陷变形, 并伴有自溶现象[10]。吴迪等运用电子显微镜观察了壳聚糖、壳聚糖季铵盐处理前后细菌超微结构的变化, 结果表明, 经壳聚糖作用后细菌的细胞壁发生了明显的缺失, 这表明壳聚糖对细菌的细胞壁有不可逆的破坏作用[16,17,18]。冯小强等[19]对菌悬液的分析结果表明菌悬液含乳酸脱氢酶和谷氨酰转移酶的内酶活性, 证明了壳聚糖的加入引起了胞内物质的泄漏。李淑荣等[20]采用紫外-分光光度法测定了细菌细胞膜完整性, 结果表明, 壳聚糖处理过的实验组在260 nm处具有较高的吸光值, 表明有DNA和RNA流出。
若将壳聚糖的氨基加以保护, 从而使壳聚糖不能吸附在带负电荷的细胞壁上形成一层高分子膜, 那么壳聚糖的抑菌性能将会降低或消失, 这样就可以间接证明的壳聚糖是通过表面成膜来达到抗菌的。冯小强等[21]利用壳聚糖的席夫碱反应将壳聚糖的氨基加以保护, 结果发现, 经席夫碱反应的壳聚糖失去了原有的抑菌活性。滕丽菊等[9]将壳聚糖纳米粒子的氨基保护起来后也无抑菌性。这表明壳聚糖抑菌作用与氨基的质子化和吸附表面成膜有很大的关系。
2.2 进入菌体
壳聚糖可以进入菌体内部, 通过干扰微生物细胞内的正常代谢, 影响其生长繁殖, 从而达到抗菌的目的。杨冬芝等[10]通过激光共焦显微镜对异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的壳聚糖齐聚物 (Mw=8000) 与大肠杆菌作用的观察, 发现壳聚糖进入了菌体内部。李松晔[22]通过观察DNA结构研究表明, 壳聚糖及其衍生物的抗菌作用是通过对DNA复制、基因表达和蛋白质的影响来实现的。
3 壳聚糖衍生物的抗菌性
壳聚糖不溶于水和碱溶液, 只能溶于弱酸, 这使其应用场合受到了较大的限制。对壳聚糖进行改性, 不仅能很好的改善壳聚糖的水溶性, 还能增强它的抗菌性, 这将扩宽壳聚糖的应用范围。目前, 对壳聚糖进行改性的方法主要有将壳聚糖降解为低分子量壳聚糖, 对壳聚糖进行季铵盐化和羧甲基化处理等。
3.1 低分子量壳聚糖
低分子量壳聚糖, 又名壳寡糖, 是壳聚糖的降解产物, 其水溶性好, 其制备方法主要有化学法、酶解法和物理法等。壳寡糖糖分子量越小, 越易进入菌体细胞并干扰其生理代谢。严钦和张筠等研究表明, 壳寡糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用[24,25,26], 并随分子量的减小而增强[27,28]。壳寡糖分子内的氨基和羟基能与很多金属离子形成稳定的配合物。潘素娟和王长青等研究表明, 壳聚糖/镨配合物和壳聚糖/钕配合物具有较强的抗菌性能[29,30]。而且, 宋庆平的研究表明, 壳聚糖/银配合物具有比单一壳聚糖更强的抗菌性能[31]。
3.2 壳聚糖季铵盐
壳聚糖季铵盐具有很好的水溶性, 对细菌和真菌均具有良好的抗菌性能, 尤其是在中性或弱碱性环境条件下显示出更好的抗菌性能[32]。雷万学等[33]制备的季铵盐型壳聚糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌也具有很强的杀效果, 杀菌率高达99%以上。程国君等通过γ射线将壳聚糖进行辐射降解所得到的低分子量壳聚糖保持了壳聚糖原有的分子结构, 该低分子量壳聚糖制得的壳聚糖季铵盐具有更高的季铵盐取代度, 对细菌的抗菌效果也更好[34]。杨俊玲的研究表明壳聚糖季铵盐的抗菌性能随着季铵化程度的增加而增强[35], 但是李明春等合成的N-长烷基壳聚糖季铵盐在碱性及中性条件下, 产物的抗菌活性随着季铵化度的提高而提高, 而在酸性条件下抗菌活性则随着季铵化度提高而降低[36]。
3.3 羧甲基壳聚糖
羧甲基壳聚糖具有更好的水溶性, 其抗菌性能与羧甲基取代的位置有密切的关系。O-羧甲基壳聚糖具有更好的抗菌性[37,38], N, O-羧甲基壳聚糖的抑菌活性下降, 且随取代度的增大而下降[39]。吴迪等[40]研究表明, O-羧甲基壳聚糖的抑菌效果优于N, O-羧甲基壳聚糖和N-羧甲基壳聚糖。
4 结语
壳聚糖-明胶液晶复合支架性能 篇7
处于固态晶体和无序液体之间的物质第四态-液晶[2],普遍存在于生物体内。双亲分子层 [3,4] 研究探明,在正常的生理条件下,细胞膜处于液晶状态。人们从控制支架生物材料几何特性,保持与天生组织相同的细胞-细胞几何结构、存在促进细胞-基质和细胞-细胞间几何结构形成的物理特性基质的重要性出发,从仿生角度制备的生物液晶材料[5,6],能很好地促进细胞的黏附、生长及分化。因此,高分子液晶生物材料有望成为满足人们需要的新型支架材料。
天然可降解高分子材料-壳聚糖、胶原在一定条件下可以呈现液晶态 [7,8]。壳聚糖-明胶复合材料,是否具有液晶态以及其性能研究国内外还未见报道。
从仿生角度出发,将液晶 [9]性质与高分子性质的融合,采用溶致液晶、减压缓慢蒸发溶剂至液晶临界浓度、冷冻干燥法,制备壳聚糖-明胶液晶支架;对支架的织构、亲水性进行研究,为其在生物医用支架材料领域的应用提供一定的实验基础。
1实验部分
1.1材料
壳聚糖、明胶,Sigma公司;乙酸、乙醇、氢氧化钠等均为分析纯试剂,天津大学科威公司。
1.2测试部分
1.2.1 临界液晶浓度测定
将粘均分子量5KD、脱乙酰度 90%的壳聚糖精制后,把1∶0、7∶3、1∶1、3∶7的4种不同质量配比壳聚糖-明胶(CS-Glu)溶于 2% (wt%) 的乙酸溶液中,配制一系列不同质量百分比浓度的混合溶液,搅拌后密闭,静置 24h 后使用。考察明胶的加入对壳聚糖液晶行为的影响。取少许溶液夹于2块盖玻片间制成液晶盒,以室温下偏光显微镜(POM)观察到双折射的浓度为液晶临界浓度。采用日本O1ympus BX51U 偏光显微镜观测。
1.2.2 支架的制备
将4种不同质量配比 CS-Glu 溶液减压挥发溶剂至液晶临界浓度,冷冻干燥制备支架。用 0.1% NaOH 溶液水洗至中性,再用PBS 溶液浸泡 24h;二次冻干备用。采用德国CHIST ALPHA2-4冷冻干燥机制备。
1.2.3 支架形态观测
将支架在液氮中淬冷,裁剪成 4mm ×8mm 大小的小片,粘贴在试样台上;放进扫描电镜中,抽真空后,选择合适的放大倍数扫描拍摄照片。采用荷兰PHILIPS XL-30扫描电镜观测。
1.2.4 孔隙率测定[1]
取出 48 孔培养板制备的支架,测量其厚度,计算出支架的体积为 V(cm3);称重为 M1(g);将其浸入无水乙醇溶液中至饱和后,称重为 M2(g);无水乙醇的密度记为 ρ(g/cm3);则多孔支架的孔隙率:P% = (M2-M1)/(ρV) ×100%。
1.2.5 吸水性测试[1]
称取支架在干态时的质量为 M1(g);将支架在蒸馏水中浸泡后,用滤纸吸干表面的水分,称重为 M2(g);则支架吸水率 X(倍) = (M2-M1)/M1 或含水量h % = ( M2-M1)/M2×100%。
2结果与讨论
2.1临界浓度分析
室温下,4种不同配比的 CS-Glu 液晶织构如图 1 所示:平行走向的消光条纹即指纹织构;明胶的加入,对壳聚糖胆甾相液晶织构有一定影响,其溶致液晶的临界浓度增大,指纹织构螺距减小;其旋光性也有一定的改变。
2.2支架形貌测试结果
壳聚糖-明胶支架的形貌如图2所示。
制得的支架为乳白色或微黄色,用手触摸感觉有弹性,较柔软,可以弯折但不会开裂,说明支架具有比较好的柔韧性。另外,壳聚糖含量比例高的支架比壳聚糖含量比例低的支架强度要高。
从图2(b1) POM 图可以看出指纹织构,冷冻干燥过程其液晶织构可以保持,图2 中SEM照片显示其孔的结构较好,支架的孔与孔之间相互连通构成了通孔。由于在壳聚糖中添加了明胶,制备的复合支架在结构上会反映出明胶的特征:复合支架的孔内部和孔间会分布有纤维状的明胶丝,支架内的纤维丝的多少与明胶含量有关,纤维丝能够更好地诱导细胞向支架上和支架内爬行和生长。此外,不同比例复合的支架,孔径的大小有所不同,明胶含量高的支架孔径相对要大一些。
2.3孔隙率及吸水性测定结果
不同配比壳聚糖-明胶支架的孔隙率及吸水性如表1。
表1数据显示:多孔支架的孔隙率均在93%以上,且液晶支架的孔隙率较高,能够满足组织工程细胞粘附生长高孔隙率,有足够大的表面积的要求。
多孔支架中的水含量,一部分来自支架本体溶胀吸收的水,另一部分则是存在于支架孔隙中的水。壳聚糖相对明胶的比例越高,支架的吸水性能越好,这种现象可能是含明胶比例高的支架,其亲水基团与壳聚糖相互作用而减少得比较多的缘故;再者,明胶含量高的支架孔径大,水很容易漏掉,不利于支架含水,因此含水量也会少,但各个支架间的含水量差别并不大,均在85%左右波动。一般来说,较高的孔隙率其样品应具有较高的含水量,这和表1中所测得的孔隙率的数据并不完全相吻合,这可能是由于支架的含水量还受其他一些因素的综合影响,比如液晶有序结构、支架的亲水基、不同成分所产生的孔结构不同等。
3结论
从仿生角度出发,制备出壳聚糖-明胶液晶支架。支架形态结构、孔隙率及吸水性结果显示:壳聚糖-明胶质量比为7∶3,液晶支架呈现典型的胆甾相液晶织构,孔隙率和吸水性分别在95%和85%左右;其性能优于他配比的液晶复合支架。一般讲,亲水性、有一定细微纹沟取向表面的材料对细胞黏附有促进作用。此外,壳聚糖-明胶液晶支架能否表现出良好的力学性能和生物相容性,更好地促进细胞黏附、生长、增殖及分化,有待今后做进一步研究。
参考文献
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