木聚糖酶研究（共12篇）
木聚糖酶研究 篇1
纤维素酶和木聚糖酶在研究和生产领域中应用广泛, 它们主要是通过微生物发酵利用纤维素类物质的途径获得。研究表明, 在自然界中纤维素通常是与木聚糖等半纤维素结合在一起的, 因此大多数微生物在自然条件下一般同时产生纤维素酶和木聚糖酶。在两种酶的实际应用中, 很多场合只需要用到其中一种而不需要另一种, 杂质酶的存在甚至对生产有害。例如:在造纸工业中, 用木聚糖酶处理硫酸盐纸浆不但可以大大减少后续漂白处理化学试剂的用量, 而且可以提高纸浆的白度和纤维性能;但要求木聚糖酶中尽可能无纤维素酶活, 否则纤维强度和纸浆得率将下降。因而, 要寻找具有如下性状的菌株:它一方面能高产木聚糖酶 (纤维素酶) , 另一方面产纤维素酶 (木聚糖酶) 的活性很低。当然, 采用现代生物化学及分子生物学的方法也可在发酵后分离、提纯两种酶, 但是这些方法得率低、成本高, 利用单一酶高产菌, 简化纯化工艺是降低其生产成本的关键。
有关两种酶的产酶菌株的文献很多, 对木聚糖酶产生菌的报导主要集中在真菌中的黑曲霉属 (Aspergillus) 和里氏木霉 (Trichoderma reesei) ;细菌中的芽孢杆菌属 (Bacillus) 和转入大肠杆菌 (E.coli) 工程菌中的海栖热孢菌 (Thermotoga maritima) , 而对康宁木霉 (Trichoderma koningii) 产木聚糖酶的报导很少。本研究试图采用改变碳源种类、碳源浓度、碳氮比大小及分批添加碳源和氮源的方法来提高康宁木霉 (Trichoderma koningii) 选择性地合成木聚糖酶的可行性。
(一) 材料与方法
1. 菌种:
产酶菌为康宁木霉, 购于中国工业微生物菌种保藏中心, CICC编号:40505。
2. 化学试剂:
酵母抽提物:购于oxoid公司;桦木木聚糖, 羧甲基纤维素钠:购于sigma公司;其余试剂均为国产分析纯
3. 甘蔗渣粗木聚糖:
100g的甘蔗渣, 加浓度10%的氢氧化钠1.5L, 放入灭菌锅120℃蒸煮60min。冷却后过滤, 滤液用6 mol/L HC1调节至pH4.5。静置12h后离心 (4000r/min, 20min) 得沉淀A。向上清液加3倍体积的工业酒精, 静置12h后离心 (4000r/min, 20min) 得沉淀, 水洗沉淀, 离心 (4000r/min, 20min) 得沉淀B。将A、B沉淀混合并于40℃烘干后备用。
4. 培养基和培养方法:
(1) PDA斜面:4℃条件下用于保存菌种; (2) 摇瓶种子培养基:葡萄糖20g, 酵母抽提物10g, 水1000 mL, pH自然; (3) 摇瓶产酶培养基:碳源若干, (NH4) 2SO4 (氮源) , KH2PO4 1g, MgSO4-7H2O 0.5g, 水1000 mL, 初始pH4.0; (4) 培养方法:将PDA斜面菌种接种一环入50 mL摇瓶种子培养基, 28～30℃, 150r/min摇床培养24h后移取10mL转接入100 mL摇瓶产酶培养基, 28～30℃, 150r/min摇床培养72h。
5. 分析方法
将摇瓶产酶培养基发酵液离心 (6000r/min, 20min) , 取上清液 (上清液即为粗酶液) DNS法测木聚糖酶活:0.2 mL经适当稀释的酶液和1.8 mL用pH4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制的1% (w/v) 桦木木聚糖悬浮液混合, 于50℃下保温30 min, 加入3mL DNS试剂, 沸水浴中加热5 min, 用冰水迅速冷却, 定容到25 mL, 于540 nm波长测定OD值。同时以100℃灭活的粗酶液作对照。
木聚糖酶酶活单位定义为上述条件下每分钟每毫升酶液水解木聚糖产生的木糖的物质的量 (μmol) 为一个酶活力单位 (U) 。
纤维素酶的测定参照国标法。纤维素酶酶活单位定义为37℃、pH5.5条件下每分钟从浓度为4mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位 (U) 。
(二) 结果与分析
1. 碳源类型对木聚糖酶选择性合成的影响
真菌木聚糖酶是诱导酶, 在微生物生长过程中作碳源的物质同时又是诱导物或诱导物的主要来源。一般认为纯木聚糖是诱导木聚糖酶合成最好的诱导物, 但研究发现乳糖诱导木聚糖酶合成的能力比纯木聚糖更强, 结果见表1。
产酶条件:碳源浓度10 g/L, 氮源浓度10 g/L。
从表1中可看出, 纯木聚糖可专一地诱导木聚糖酶的合成, 而含纤维素的碳源诱导合成的木聚糖酶中含有纤维素酶, 且纤维素含量愈高产生的纤维素酶愈多。由于甘蔗渣粗木聚糖含纤维素很少, 故以之作碳源产生的木聚糖酶中纤维素酶活相对较低, 两种酶活的比值为13.4;而羧甲基纤维CMC中纤维素含量高, 用作碳源时两种酶活的比值仅为1.1, 可见碳源类型影响木聚糖酶的选择性合成。虽然乳糖作碳源产生的木聚糖酶酶活最高, 但是以甘蔗渣粗木聚糖作碳源可以更好的研究菌株产木聚糖酶和纤维素酶的关系, 所以往下的实验中均以甘蔗渣粗木聚糖作碳源进行分析。
2. 碳源浓度对木聚糖酶选择性合成的影响
表2是以甘蔗渣粗木聚糖为碳源、不同碳源浓度下产酶的部分结果。从表2可以看出, 随着碳源浓度的增大, 木聚糖酶活和纤维素酶活均有提高, 但纤维素酶活提高的幅度更大, 因而两种酶活的比值下降。当碳源浓度由5 g/L提高到20g/L时, 两种酶活的比值由17.0下降到6.9, 因此, 维持低碳源浓度发酵有利于提高木聚糖酶选择性合成的程度。
产酶条件:碳源:甘蔗渣粗木聚糖;碳源浓度:氮源浓度=2∶1。
微生物首先产生木聚糖酶分解易利用的木聚糖, 由于培养基中甘蔗渣粗木聚糖浓度低, 微生物生长缓慢, 生物量少, 生成的木聚糖酶和纤维素酶都少。随着碳源浓度的提高, 微生物迅速生长, 生成的木聚糖酶和纤维素酶也就多。碳源浓度高, 微生物生长快, 木聚糖消耗也快, 估计菌株产木聚糖酶的量与培养基中游离存在的诱导物多少有关, 因而碳源浓度的提高对木聚糖酶活提高的幅度影响不大。而随着粗木聚糖带入的纤维素物质的增多, 诱导产生的纤维素酶增加, 导致两种酶活的比值下降。
3. 碳氮比对木聚糖酶选择性合成的影响
由于甘蔗渣粗木聚糖所含碳源的种类和数量不十分明确, 因而不能准确的确定碳氮比, 但是可以把甘蔗渣粗木聚糖和 (NH4) 2SO4的质量比近似的看作碳氮比, 由此来观察碳氮比变化对产酶结果的影响, 见表3。
产酶条件:碳源:甘蔗渣粗木聚糖浓度=10 g/L。
由表3数据可看出, 当碳氮源质量比由1:1增大到10∶1时, 两种酶活的比值从9.7提高到43.4, 即木聚糖酶选择性合成的程度提高。同时可以看出, 木聚糖酶的合成存在一个较适的碳氮比条件, 当碳氮源质量比为5∶1时木聚糖酶活高达216.7 U/mL, 此时纤维素酶活为10.1U/mL, 两种酶活的比值为21.5, 进一步提高或降低碳氮源质量比, 木聚糖酶活反而下降。而纤维素酶活随着碳氮比的升高呈下降趋势。在碳源浓度一定的条件下, 提高碳氮比, 也就是降低氮源浓度。碳氮比低, 氮源充足, 微生物生长快, 代谢功能强, 木聚糖消耗快, 故产生的木聚糖酶不多;至产酶后期, 由于主要靠利用剩余的难分解的纤维素维持生长, 所以会产生一定量的纤维素酶。而随着碳氮比升高, 氮源浓度低、消耗快, 成为生长限制因子, 微生物生长缓慢, 代谢功能相对较弱, 导致木聚糖酶的合成也有所减少;同时由于极少利用难分解的纤维素物质, 故产生的纤维素酶也少。
4. 低纤维素酶活的木聚糖酶选择性合成的调控
纯木聚糖可诱导康宁木霉专一地合成木聚糖酶, 但纯木聚糖制备成本高, 无工业应用价值;乳糖可诱导高产木聚糖酶, 但纤维素酶产量也高, 发酵后还需进行复杂的提纯工序, 因而诱导物 (也是碳源) 应采用可简单、经济地从植物纤维中分离出的粗木聚糖。但如前所示, 以粗木聚糖做碳源时, 即使在低碳源浓度条件下产生的木聚糖酶中仍含有一定量的纤维素酶, 为了提高两种酶活的比值, 实现低纤维素酶活的木聚糖酶的生产目的, 一方面要进一步促进木聚糖酶的合成, 提高其活力;另一方面要尽可能抑制纤维素酶的合成。前面的研究表明, 以甘蔗渣粗木聚糖为碳源, 在低碳源浓度、高碳氮比条件下木聚糖酶选择性合成的程度提高。图1是以甘蔗渣粗木聚糖为碳源, 总碳源浓度为10g/L时分批添加碳源和氮源的产酶历程, 在整个产酶过程控制培养基中的碳源浓度在5 g/L以下, 碳氮源质量比在10∶1以上。
如图1所示, 产酶初期基本检测不到纤维素酶活, 但是有明显的木聚糖酶产生, 说明微生物在生长初期仅以易分解的木聚糖作碳源。第2天后开始有少量纤维素酶产生, 而木聚糖酶活逐步提高;至第4天纤维素酶活微量下降, 而木聚糖酶活仍继续升高。整个过程中纤维素酶活维持在8 U/mL以下, 而木聚糖酶活最高达310.6 U/mL, 此时纤维素酶活为7U/mL, 两种酶活的比值为44.4。由此可以看 (下转第71页) (上接第104页) 出, 在发酵过程中通过对碳氮源进行限制性控制, 不但可以限制纤维素酶的合成, 而且可以延长木聚糖酶的产酶时间, 提高酶活, 从而提升木聚糖酶选择性合成的程度, 这与刘超纲[7]等的研究结果接近。
(三) 结论
康宁木霉是工业上生产纤维素酶常用的一种真菌, 但其同时具有很强的合成木聚糖酶的能力。它在以纤维素物质为底物时可同时产生纤维素酶和木聚糖酶, 尽管两种酶的合成调控机制尚不很清楚, 但许多实验事实证明两种酶的合成受不同的基因调控, 在适当条件下可选择性地诱导木聚糖酶的合成, 而纤维素酶的合成受到抑制。选择性合成程度与碳源的类型、浓度、碳氮比大小有关。低纤维素污染的碳源是选择性合成低纤维素酶活的木聚糖酶的前提;在发酵过程中维持较低的碳源浓度和较高的碳氮比, 可以提高木聚糖酶选择性合成的程度。以甘蔗渣粗木聚糖为碳源, 采用分批添加碳源和氮源的方式, 控制发酵过程中碳源浓度在5 g/L以下, 碳氮源质量比在10∶1以上, 培养5天后产生的木聚糖酶活和纤维素酶活分别为310.6 U/mL和7 U/mL, 两种酶活的比值为44.4。
参考文献
[1]胡沂淮.木聚糖酶[J].生命的化学, 2002, 22 (3) :281-285.
[2]PELLERIN P, et al.Enzyme and Microbiol.Technol.[J].1991, 13:617-621.
[3]王雪鹏.半纤维素制备方法的改进及其应用[J].无锡轻工大学学报, 2003, 22 (6) :85-88.
[4]费笛波.饲用木聚糖酶活性测定方法的研究[J].浙江农业学报, 2004, 16 (2) :53-58.
[5]Yang S Q, et a1.High-1evel of xylanase production by the thermophilic Paecilomyces themophila Jl8on wheat straw in solid-state fermentation[J].Bioresour Technol, 2006, 97 (15) :1794-1800.
木聚糖酶研究 篇2
羟丙基壳聚糖、壳聚糖铈/银的合成、表征和抗菌性能研究
以壳聚糖和硝酸铈铵为原料,并对壳聚糖进行改性,合成了两种新型的`配合物.通过红外光谱、X射线光电子能谱、差热-热重分析、透射电镜等对合成物进行表征.由透射电镜照片发现合成物由分散的纳米颗粒组成.通过抗菌实验对其抑菌效果进行研究,结果表明这两种配合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抑菌作用,最小抑菌浓度(MIC)分别为130/μg/mL,70μg/mL和75μg/mL,60μg/mL,属于广谱抗菌荆,抗菌效果明显优于单独的壳聚糖、羟丙基壳聚糖、稀土化合物.
作 者：杨自芳 王智杰 许东芳 夏庆春 沈智慧 何其庄 YANG Zi-fang WANG Zhi-jie XU Dong-fang XIA Qing-chun SHEN Zhi-hui HE Qi-zhuang 作者单位：上海师范大学生命与环境科学学院,上海,34 刊 名：化学世界 PKU英文刊名：CHEMICAL WORLD 年，卷(期)： 50(2) 分类号：O614.33 O626.3 关键词：壳聚糖 羟丙基壳聚糖 硝酸铈铵 抗菌性能壳聚糖的制备及其医院制剂的研究 篇3
【关键词】壳聚糖;生物活性;乙酰基;医院制剂
【中图分类号】R680【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）10-0078-01
甲壳质（chitin）又称甲壳素，当其分子中脱去一定量的乙酰基，就转变成壳聚糖，它能溶于2%醋酸和1%维生素C溶液中，称为可溶性甲壳质[1]。当甲壳质脱乙酰基率达90%以上，就达到药用壳聚糖（chitin-chitosan for medicine）的标准。
1壳聚糖的制备
1.1壳聚糖的提取
采用高浓度碱于室温下长时间反应制取壳聚糖。原料虾、蟹壳购自北海水产加工场，经鉴定，虾壳为长臂虾科动物多种海水虾的壳，蟹壳为蝤蛑科三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的壳，其主要成分碳酸钙和磷酸盐约占45%，粗蛋白和脂肪约27%，蟹壳含甲壳质17%~18%，虾壳含20%~25%。所用化学试剂为盐酸、氢氧化钠、高锰酸钾、冰醋酸和维生素C粉。
甲壳素-壳聚糖的制备方法，参照文献[2-5]。
壳聚糖新制备法[5]：
1.2操作注解
1.2.1甲壳素和壳聚糖的制取：实际操作分为脱钙、蛋白质两个步骤，一个指标为脱乙酰基率。掌握适当的酸碱浓度，控制温度和加温时间，是脱乙酰基率是否达标的关键操作。
1.2.2脱钙盐时，要除尽壳内的无机盐，又不使大分子链发生降解，在用酸浸时可采用循环套浸法（即第一次浸泡酸液浓度稍偏低，第二次浸泡时酸液配足量，以充分溶解钙盐，两次的傾出液作第二批第一次浸泡用，如此循环操作）。由于酸浓度偏低，反复浸泡，对甲壳质分子链影响较小。
1.2.3脱乙酰基必须在高浓度碱液中，于高温下恒温进行反应，但往往受条件限制，不易操作。如用浓度低于30%的碱即使温度再高，时间再长，一般也只能脱50%乙酰基，所以壳聚糖的质量与脱乙酰基工序密切相关[1]，如图1示。
如采用高浓度碱，低温（室温），长时间进行反应，可得到较好的产品。我院制得的产品检测结果：脱乙酰基90%以上，灰份0.37%，水份0.67%。
1.2.4甲壳素的漂白主要在强氧化剂中进行，高锰酸钾可破坏虾红素，但同时又使甲壳素分子链离解，影响质量，锰离子残留会影响粘度。最好在微酸性条件下，用阳光照射漂白，使虾红素被氧化脱色而得到白色的甲壳素。
2医院制剂举例
2.1抗菌消炎霜剂
处方1：壳聚糖、茶多酚、氮硐、霜剂基质（乳化剂非阴离子型）。
处方2：壳聚糖、利福平、霜剂基质（乳化剂非阴离子型）。
2.2壳聚糖烧伤膜剂
处方3：壳聚糖、利福平、甘油、明胶、PVA-124（聚乙烯醇124）。
先将利福平制成水包油型乳剂再与壳聚糖混合依法制成膜剂，质检合格即得。用消毒剪刀按剂量裁剪贴敷患处。
上述三个处方为外用药，主要用于外伤和烧伤病人患处炎症的抗菌消炎，促进伤口愈合，加快内芽生长。
2.3几丁质酒剂
处方4：壳聚糖、海马、蛤蚧、杜仲、淫羊藿、党参、杞子、肉苁蓉、肉桂等10种中药、红米酒，中药经提取后加50度米酒浸渍，最后加壳聚糖勾兑成30度酒剂，供内服。能壮阳、舒筋活络，补精益肾，增强免疫力。每次20—40ml，一日2—3次。
处方分析：动物体内的甲壳质平均分子量在40—100万之间，经脱乙酰基后壳聚糖分子量均为40万。处方中的海马、海龙、蛤蚧等均含大分子物质，用通常中药煎煮方法很难得到高疗效的物质成分，经生物半透膜动态透析实验证明[6]，用低度酒作载体制成的酒剂，能把有效成份输送到机体靶位组织，疗效更佳，生物利用度高，壳聚糖在乙醇中的稳定性较好，我们认为制成“载体”剂型的外用药比内服剂（如片剂、胶囊剂）效果好，吸收快，生物利用率高，因为内服要通过体内生物转化作用后而吸收发挥使用。
参考文献
[1]谢雅明，可溶性甲壳质的制造和用途，化学世界，1983.(4)：118~121
[2]李兆龙编，甲壳和贝壳的综合利用，北京：海洋出版社，1991：13~15
[3]屈步华、李德平、吴晴斋，等，甲壳素制备工艺改进——天然甲壳素的提取，中国生化药物杂志，1995.(2)：63~64
[4]曾宪放，陈苏陵，李吉高，等，甲壳质和甲壳胺寡聚糖的制备，中国海洋药物，1995.(3)：46~49
[5]单虎、王宝维、张丽萍，等，甲壳素及壳聚糖提取工艺的研究，食品科学.1997.18(1)：14~15
木聚糖酶研究 篇4
广义上的木聚糖酶是指可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一组酶的总称,主要包括内切β-D-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶;狭义上的木聚糖酶是指β-1,4-内切木聚糖酶(E.C3.2.1.8)[2]。内切木聚糖酶随机水解木聚糖的β-D-1,4-木糖苷键(β-D-1,4-xylosidic linkages)[3]。据统计,世界上工业常用16种酶制剂所占市场份额排名中,木聚糖酶排在第7位[4]。木聚糖酶在食品、饲料、造纸等众多行业有着广阔的应用前景[5]。近年来,低聚木糖作为一种功能性食品而倍受瞩目,它以富含木聚糖的植物(如玉米芯、蔗渣、棉籽糖等)为原料,通过木聚糖酶水解,分离精制而得的一类非消化性低聚糖[6]。在动物饲料中加入木聚糖酶,可以起到降解其中半纤维素的作用,从而提高饲料利用率[7]。环境污染最大的来源之一是造纸工业中的废水排放,木聚糖酶作为一种生物漂白剂可以减少20%～40%的含氯化学漂白剂用量[8],大大减轻对环境的压力。
本研究报道了一株高产木聚糖酶短小芽胞杆菌HJ-04,在最佳发酵条件及最佳反应条件下,其酶活力高达942.4IU/mL,和已报道诸多细菌木聚糖酶活力相比,处于领先水平。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
土壤样品:采自长白山天池附近、武汉磨山景区及沈阳农业大学后山果园等10处土样;玉米芯、麸皮及甘蔗渣:采自农大农场及购自市郊。
1.1.2 试剂
桦木木聚糖,Sigma公司;DNA Marker DL2000,大连宝生物公司;化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器
PCR仪,TECHNE公司;凝胶成像系统,伯乐公司;HZQ-X100振荡培养箱,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
1.1.4 培养基
①富集培养基(%):
蔗渣木聚糖1.0,蛋白胨0.5,NaCl 0.5,pH 7.5。
②筛选培养基(%)A:
蔗渣木聚糖3.0,KNO3 0.1,MgSO4·7H2O 0.05,NaCl 0.5,K2HPO4 0.05,琼脂2,pH 7.5～8。
③筛选培养基(%)B:
商品木聚糖2.0,KNO3 0.1,MgSO4·7H2O 0.05,NaCl 0.5,K2HPO4 0.05,琼脂2,pH 7.5～8。
④种子培养基(%):
牛肉膏0.5,蛋白胨1,NaCl 0.5,pH 7.2～7.4。
⑤产酶培养基(%):
麸皮4,酵母膏0.5,蛋白胨1,KH2PO4 0.5,MgSO4·7H2O 0.1,自然pH。
1.2 方法
1.2.1 蔗渣木聚糖的提取:
按常规碱提法进行[9]。
1.2.2 木聚糖酶活力的测定
发酵液6 000r/min离心10min。在20mL的具塞刻度试管中加入2.3mL pH为6.5的PBS缓冲液及0.6mL浓度为1%的木聚糖溶液,并于50℃水浴中预热5分钟,再加入0.1mL经适当稀释后的酶液(使OD540nm值小于1),在50℃下反应10min,立即加入2mL DNS溶液终止反应,在沸水浴中煮沸10min,迅速冷却加入15mL蒸馏水,在540nm处测OD值,对照管的酶液先煮沸5min灭活,其余组分一样。以木糖作标准曲线,将1min水解生成1μmol还原糖(以木糖计)的酶量定义为一个酶活力单位(IU/mL)。
1.2.3 菌种的初筛
取10种土壤样品各1g放入装有玻璃珠及100mL无菌水的三角瓶中150r/min,30℃条件下振荡30min,吸取1mL土样溶液于富集培养基中,150r/min、30℃振荡培养48h。将富集培养液梯度稀释至10-8,吸0.2mL于筛选培养基A上涂平板。于30℃培养箱中倒置培养48h观察菌落生长情况。
1.2.4 复筛
将在筛选培养基A上产透明圈的菌株挑至筛选培养基B上,将仍能产透明圈的菌株进行发酵产酶实验。取10h种子培养液,按0.5%接种。
1.2.5 菌种鉴定
按参考文献[10,11]进行细菌形态学观察、革兰氏染色、芽胞染色及生理生化鉴定。16SrDNA分子水平鉴定送由Takara公司完成。
1.2.6 发酵条件的优化研究
1.2.6.1 单因素实验
(1)不同氮源对产酶的影响:选择不同氮源,有机氮源以1%计,无机氮源以0.2%计。
(2)表面活性剂对产酶的影响:分别加入0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的Tweeen-80。
(3)pH对产酶的影响:将发酵初始pH分别调为4、5、6、7、8、9、10、11,并测定发酵后pH。
(4)培养温度对产酶的影响:采用30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃及42℃七个不同温度进行发酵。
1.2.6.2 正交试验
选择碳源、Mg2+、KH2PO4及pH进行四因素三水平(L934)试验,每组设两个重复。由于木聚糖是木聚糖酶的诱导物,而玉米芯中木聚糖含量较高,因此在正交试验时将麸皮与玉米芯作为复合碳源,最佳氮源也采用复合氮源。
1.2.7 产酶曲线
按最优成分配制培养基,最佳条件培养。测定96h的产酶曲线,每6h测一次。
1.2.8 木聚糖酶作用条件及酶学性质的研究
1.2.8.1 酶作用的最适温度及热稳定性
选取30℃、40℃、50℃、60℃及70℃作为酶的反应温度;将用PBS稀释后的酶液分别放置4℃冰箱,40℃、50℃、60℃及70℃水浴1h测酶活,以4℃组为相对酶活100%。
1.2.8.2 酶作用的最适pH值及pH稳定性
将反应体系的pH用缓冲液调为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0;将原酶发酵液用pH为5、6、7、8、9、10的缓冲液稀释相同倍数后放置4℃冰箱中1.5h测酶活,以pH 7组为相对酶活100%。
1.2.8.3 酶作用的最适底物浓度
在反应体系中分别加入0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL的木聚糖溶液。
2 结果与分析
2.1 菌种筛选
经过两次筛选得到在两种筛选培养基上均能产透明圈的菌株7株,图1为HJ-04降解桦木木聚糖所产生的透明圈。经发酵培养,各菌株酶活力测定结果见表1。将酶活最高的HJ-04纯化保存。
2.2 菌种鉴定
2.2.1 形态观察及镜检
HJ-04在LB及PDA培养基上均能良好生长,菌落生长前期边缘整齐,后期出现褶皱,白色,后期微黄,不透明。革兰氏染色呈阳性,直杆状,两端稍圆,菌体大小为0.5～0.7μm×2.5～3.5μm。芽胞中生。
2.2.2 生理生化鉴定
鉴定指标及结果见表2。
2.2.3 16SrDNA分子水平鉴定
序列测定为1461bp。图2为PCR产物电泳图。在NCBI上进行序列比对,扩增序列与Bacillus pumilus的16SrDNA的同源性为99%。
M:DNAMarker:DL2000;1 and 2:PCR product.
综合形态观察、镜检、生理生化鉴定及16SrDNA同源性分析,鉴定产木聚糖酶菌株HJ-04为短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)。
2.3 单因素实验结果
2.3.1 不同氮源对产酶的影响
NH4NO3最利于产酶(图3),总体是无机氮源比有机氮源更利于HJ-04产酶。
2.3.2 Tween-80浓度对产酶的影响
添加较低浓度的表面活性剂能促进产酶,说明该菌产生的木聚糖酶是一种胞外酶,表面活性剂的添加增加了细胞膜的通透性,有利于酶的分泌(图4)。
2.3.3 pH对产酶的影响
pH的改变对产酶有很大影响,从图5可以看出HJ-04在碱性条件下比酸性环境更有利于产酶。pH在7、8、9、10条件下产酶几乎一样,说明该菌的产酶pH适应范围较大。初始pH为4～8的培养液在发酵后pH均有所上升,而初始pH为9～11的培养液在发酵后pH均有所下降,说明发酵pH向趋于中性的方向变化。
2.3.4 温度对产酶的影响
38℃是HJ-04的最适产酶温度(图6)。温度过低不利于菌的生长,温度过高导致菌迅速繁殖,短时间内耗尽营养物质,大大缩短产酶时间。
2.4 正交实验结果
正交实验结果见表3,从表3中可见HJ-04的最佳产酶条件为A3B2C3D3,即麸皮5%,玉米芯2%,KH2PO4 1%,MgSO4·7H2O 0.5%, 起始pH为9。极差分析显示,各因素对产酶的影响顺序为:A>D>B>C,即碳源>pH>磷源>Mg2+。
2.5 HJ-04的产酶曲线
从产酶曲线(图7)可以看出,前24h产酶量极低,从24h到36h产酶迅速增长,36h以后增速减缓,到60h为最大产酶量,其酶活力达358.8IU/mL,之后缓慢减弱。
2.6 酶作用条件及酶学性质
2.6.1 温度对酶作用的影响及酶的耐热性
60℃为所产木聚糖酶的最适温度,在50℃水浴中处理1h其酶活力仍保留59.9%(图8),说明该酶具有较好的耐热性。
2.6.2 pH对酶作用的影响及酶耐酸碱性
HJ-04所产木聚糖酶最适pH为6.5,说明该木聚糖酶是弱酸性酶,特别是在pH8.0时,其酶活只有pH6.5时的20.9%(图9),说明该酶极不适宜在碱性条件反应。HJ-04所产木聚糖酶的最适反应pH是6.5,但耐酸碱能力却很强,从图中可以看出酶液在pH5及pH10的缓冲溶液中放置1.5h其酶活力分别保留87.3%及91.4%。
2.6.3 底物加入量对酶活的影响
底物浓度对该酶活力有非常大的影响,酶液与2.0mL的底物作用时的酶活最高(图10)。在总反应体系3.0mL的溶液中,加入0.5mL底物时,其反应体系中的底物浓度只有2.0mL的1/4,酶活也只有其的40.2%,但是当底物浓度过高时,对酶促反应不再有促进作用甚至出现抑制作用。这也符合酶促反应动力学说中,Henri和Wurtz提出的酶底物中间络合物学说。
3 讨论
本研究利用蔗渣木聚糖进行初筛,有效地缩小了目的菌株的筛选范围,并减少了昂贵商品木聚糖的使用。对筛选到的产木聚糖酶菌株HJ-04进行形态学观察、生理生化鉴定及16SrDNA同源性分析,将其鉴定为Bacillus pumilus。
通过对产酶条件的优化,其酶活力从120.3IU/mL提高到358.8IU/mL,是优化前的2.98倍。对酶的作用条件(温度及pH)和反应体系(底物用量)的研究发现,底物浓度对酶活力有非常大的影响,在反应体系中加入2.0mL木聚糖溶液时,其酶活力高达942.4IU/mL,是加入0.5mL时酶活的2.52倍,之前包怡红[12]及白云玲[13]报道的细菌木聚糖酶活力较高,分别为553.4IU/ml及600IU/ml。但从目前有关木聚糖酶的研究来看,少有对酶作用底物这个关键因子进行探讨,木聚糖酶活力测定方法虽以DNS法为主,却没有一个统一标准,底物用量、木聚糖的种类与配置浓度也不尽相同[14,15],因此不同报道的酶活不能作一个精确的比较。但是根据酶活力的测定方法[1],认为酶活力测定应该在最优条件下进行,即包括最适底物浓度。在发酵条件优化后的酶活力测定过程中,作者仅用相当于1/2000mL原酶液(0.1mL离心后的上清液稀释至20mL,再取0.1mL作为反应酶液)作用于底物10min,其OD540nm达0.372,也进一说明HJ-04所产木聚糖酶的活力很高。
木聚糖酶研究 篇5
酶法改性大豆低聚糖免疫功能的研究
目的:探讨酶法改性大豆低聚糖对小鼠免疫作用的影响.方法:实验采用动物试验,将小白鼠(雌雄各半,体重18～22g)分为三个模型实验组,每组40只,分别进行小鼠外周血中淋巴细胞酶标记染色测定法试验、鸡红细胞作免疫原的溶血素测定试验、腹腔巨噬细胞功能测定试验,时间均为21d.分别设高、中、低剂量组给小鼠灌胃,另设空白对照.结论:酶法改性大豆低聚糖对小鼠细胞免疫、非特异性免疫、体液免疫有明显的.促进作用,可以全面提高机体的免疫功能.
作 者：赵秀红 李长彪 刘长江 张春红 刘欣 王传杰 李小成 孟宪军 ZHAO Xiu-hong LI Chang-biao LIU Chang-jiang ZHANG Chun-hong LIU Xin WANG Chuan-jie LI Xiao-cheng MENG Xian-jun 作者单位：沈阳农业大学食品学院,辽宁,沈阳,110161 刊 名：食品科学 ISTIC PKU英文刊名：FOOD SCIENCE 年，卷(期)： 27(11) 分类号：Q539 关键词：大豆低聚糖 细胞免疫 非特异性免疫 体液免疫木聚糖酶研究 篇6
关键词：β-壳聚糖β-壳寡糖胆固醇吸附活性研究
一、概述
1.甲壳素和壳聚糖
甲壳素又名甲壳质、几丁质等，化学名β-（1，4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，广泛存在于节肢动物的外壳及某些微生物的细胞壁中，是自然界存在的第二大天然有机化合物，仅次于纤维素。甲壳素经强碱处理，脱乙酰形成壳聚糖，壳聚糖的化学名为β-（1，4）-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，壳聚糖与纤维素有相似的结构，只是纤维素2位上是羟基，壳聚糖的是氨基。甲壳素与壳聚糖结构式如图1：
甲壳素与壳聚糖作为天然产物， 具有资源丰富、安全无毒、生物相溶性、生物可降解性、细胞亲和性、抗菌性等优点， 应用于诸多领域。但因其只溶于酸性介质，而不溶于水或一般有机溶剂，使其应用方面仍受到一定限制。
2.β-壳聚糖
随着海洋渔业发展，每年都有大量的鱿鱼骨由于其不可食用性而作为生产垃圾丢弃，这不仅浪费资源，也污染环境。鱿鱼骨是重要的海洋资源——β-壳聚糖的主要来源。β-壳聚糖具有不同于α-壳聚糖的平行结构，导致其在制备方法和实际应用上，也与α-壳聚糖有着明显差别。通常β-壳聚糖较α-壳聚糖具有相对弱的分子间作用力，因而溶解性、反应活性和对溶剂的亲和性更好。作为一种可再生的天然多糖材料，β-壳聚糖已经广泛应用于伤口缝合和软骨损伤等医药领域，能够促进细胞再生、防止疤痕形成。此外研究发现，β-壳聚糖具有更好的保水性和保湿性；同样条件下，β-甲壳素更易脱乙酰基。
当下肥胖日益普遍，并带来一系列健康问题，过多摄入胆固醇是肥胖的起因之一。而目前尚缺乏对β-壳寡糖后对胆固醇吸附能力的研究，通过实验研究可以为减肥药物的研发提供相关数据。
二、材料与方法
1.实验材料
鱿鱼骨（日本枪乌贼，Loligo Japonica）；1%的氢氧化钠溶液；4%的盐酸溶液；
过氧化氢；冰乙酸溶液；纤维素；胆固醇；氯化钠；油醇。
2.实验仪器
超声波微波组合反应系统（南京先欧仪器制造有限公司）
电子天平（Electronic Scale）；水浴锅（IKA HB10 digital）
立式压力蒸汽灭菌器（BOXUN）；超声波细胞粉粹机（宁波新芝科器研究所）
震荡培养箱ZQLY-180F（上海知楚仪器）；胆固醇试剂盒
高效液相色谱分析仪（Agilent Technologies）
3.处理方法
（1）制备β-壳聚糖
将鱿鱼骨表面的组织残留物清洗干净后烘干，称取20g鱿鱼骨置于一定浓度盐酸中室温下浸泡7h，洗净至中性后置于1%的氢氧化钠中90℃，水浴反应2h进行脱蛋白，洗净至中性烘干，即得β-甲壳素。称取5gβ-甲壳素，用40%的氢氧化钠95℃反应6-8 h脱乙酰基处理，即得β-壳聚糖。
（2）β-壳聚糖降解及分子量测定
称取12g自制β-壳聚糖，溶解于400 ml浓度为2%的冰乙酸溶液（v/v），搅拌溶解直至获得澄清、均质的β-壳聚糖。将50ml溶解后的β-壳聚糖倒入100ml微波反应器中，加入30%过氧化氢1.5-3mL，600W，70℃条件下500r/min，依次反应5 min、10 min、20 min。反应结束后，微波炉内放置冷却5～10 min，取出，加1mol/l氢氧化钠中和，抽滤除去不溶物。滤液用3～4倍量无水乙醇充分沉淀，抽滤取滤液。最后检验产品是否溶于水。
将降解后的β-壳寡糖透析，冷冻干燥得到粉末状壳寡糖样品，分别将反应5 min、10 min、20 min的样品进行高相液相色谱分析。
（3）胆固醇吸附活性研究
①配制胆固醇胶束（PH=7.4，15mmol/L）
②用超声波细胞粉碎机粉碎细胞。
③实验设置实验组和对照组，对照组分别是空白组和纤维素组，实验组有5组，分别加入10、20、40、60、80mg的β-壳寡糖（分子量约为5000）。所有组均加入5ml胆固醇胶束。
④用振荡培养箱恒温振荡（37℃）培养两个小时，离心上清液，用胆固醇试剂盒测胆固醇吸附率。
三、结果
1.制备β-壳聚糖成品（图2）
2.壳聚糖浓度与其胆固醇吸附能力的关系（表1）
四、结果分析
1.β-壳聚糖处理时间与分子量结果分析
随着处理时间增长，波峰向右移动，根据公式，推算出分子量逐渐减小，得到结论：微波辅助过氧化氢降解时间越长，所得寡糖分子量越小（表2）。
2.胆固醇吸附率结果分析（图3）
不同剂量壳寡糖（分子量约为5000）对胆固醇的结合能力如图所示，当壳寡糖加入量小于40mg时，增大壳寡糖剂量，结合能力显著提高。但当壳寡糖加入量为40mg时，即使再增大壳寡糖剂量，结合能力也无显著性差异，说明结合已达饱和。
同等浓度时，β-壳寡糖对胆固醇的结合能力远大于纤维素，即使纤维素浓度为β-壳寡糖数倍，结合能力仍明显不足。
五、实验结论
结合上述分析及文献资料，可以发现：
①微波辅助过氧化氢可降解β-壳聚糖，得到分子量小的β-壳寡糖。
②降解时间与所得β-壳寡糖分子量成反比。
③在一定浓度范围内，β-壳寡糖对胆固醇的吸附能力与浓度成正比。
④与纤维素相比，β-壳聚糖具有良好的胆固醇吸附能力。
六、前景及创新点
1.前景
本实验研究了β-壳聚糖的降解与降解后的β-壳寡糖对胆固醇的吸附能力，为进一步研究提供了数据及方向。
鱿鱼骨是一种一直未被利用的生物资源，具有产量大，成本低的优势，因此具有广阔的研究与利用前景。本实验中只测定了分子量约5000的β-壳寡糖对胆固醇的吸附率，在进一步研究中，可以测定不同分子量的β-壳寡糖的吸附能力，找出最佳吸附分子量，并进行动物活体实验，测定其具体的减肥功效及副作用，如条件允许，可以研发相关减肥药物，在肥胖率居高的今天，健康的减肥药物市场前景光明。同时，β-壳聚糖目前尚无工业化生产方法，只能人力清洗鱿鱼骨并在实验室内处理，进一步研究也可以探索β-壳聚糖的工业制备方法，为实际应用时的大规模生产奠基。
2.创新点
（1）使用β-壳聚糖
目前国际研究以α-壳聚糖为主，而对β-壳聚糖的研究较少，因此研究β-壳聚糖得出的成果更具有创新性。
（2）研究胆固醇吸附率
过多摄入胆固醇可引起肥胖，通过研究β-壳寡糖对胆固醇的吸附，为进一步研究其对减肥的作用奠定基础，开辟β-壳聚糖及β-壳寡糖的新应用领域。
参考文献：
[1]张万瑞，丁纯梅，李芳等.不同脱乙酰度壳聚糖对活性fm黑的吸附性能研究[J].安徽工程大学学报，2011，（03）：7-9.
[2]李巧霞，宋宝珍，仰振球.微波间歇法快速制备高粘均分子量和高脱乙酰度的壳聚糖[J].过程工程学报，2006，（05）：789-793.
[3]Jingna Liu，Jiali Zhang，Wenshui Xia.Hypocholesterolaemic effects of different chitosan samples in vitro and in vivo[J].Food Chemistry，2008，（107）：419-425.
木聚糖酶研究 篇7
本文以微生物教研室保存的一株黑曲霉为出发菌株, 以玉米芯为主要原料, 进行该菌株固体发酵产木聚糖酶的条件优化研究, 旨在提高玉米芯的利用率的同时为黑曲霉产木聚糖酶的大规模工业化生产和应用提供参考。
1材料和方法
1.1 材料菌株
黑曲霉菌株 (Aspergillus niger) , 东北师范大学生科院微生物教研室保存;固态基础发酵培养基:麸皮1g, 玉米芯9g, 含水量15ml, pH值自然。
1.2 木聚糖酶酶活定义及酶活力测定方法
木聚糖酶酶活力国际单位定义为:标准反应条件下, 每分钟生成1umol木糖所需要的酶量 (以木聚糖为底物) 为1个酶活单位。酶活检测采用DNS还原糖测定法。
1.3 固体发酵粗酶液的制备
在培养后的固体发酵物中加入100ml自来水, 震荡摇匀, 尼龙纱布过滤后, 取1.5ml至离心管中, 12000r/min、4℃离心20min除去孢子, 10倍稀释后测定酶活。
2结果与分析
2.1 Mandel盐对发酵产酶的影响
对照组采用固态基础发酵培养基, 实验组在对照组基础上添加Mandel盐溶液 (A盐:溶液=10%, B盐:溶液=0.1%) , 28℃培养72h, 测定并比较酶活力。由表1可知, 相对于不加Mandel盐的对照组, 加盐后酶活显著升高1.4倍。说明广泛应用于纤维素酶与半纤维素酶培养的Mandel盐对菌株产酶具有较强的促进作用。故以下单因素研究中加入Mandel盐。
2.2 不同氮源对酶活的影响
分别采用单一的有机或无机氮源进行试验, 对照组为无氮的Mandel盐, 试验组分别为0.15% (NH4) 2SO4, 0.15%NH4Cl, 0.1%NH4NO3, 0.25%NaNO3, 0.2%牛肉膏, 0.2%蛋白胨, 0.2%酵母膏, 0.8%黄豆粉, 28℃培养72h。结果表明 (图1) , 在固体基础发酵培养基中添加NaNO3作为氮源时, 酶活最高, 对黑曲霉产木聚糖酶具有明显的促进作用, 为最优氮源。并且黑曲霉在含有无机氮源培养基中的生长要优于在有机氮源中。
2.3 含水量对酶活的影响
水分的高低会影响到基质的透气性和菌丝生长状况, 也会影响代谢活动和目的产物的合成。由图2可知, 含水量在5ml～35ml之间时, 酶活力与含水量成正相关。当初始含水量为35ml时, 黑曲霉生长最旺盛, 产酶量最高, 酶活力达最高峰, 所以35ml为最佳初始含水量。
2.4 不同接种量对酶活的影响
在无菌条件下, 分别向培养基中接入不同量的菌株 (106个/ml) , 28℃培养72h。结果如图3所示, 曲线较为平缓, 酶活力总体水平差别不大, 影响不是很显著, 其中当接种量为0.2ml时, 酶活力最高。
2.5 初始PH对值酶活的影响
将菌种分别在不同初始pH下进行培养, 测定结果如图4所示, 当pH值为4～5时, 黑曲霉生长和产酶明显被促进, 酶活力达到最高峰;当pH值高于5后, 酶活逐渐降低, 不利于黑曲霉生长和产酶。经检测固态基础发酵培养基自然pH值在5.5左右, 为降低工业生产成本, 提高生产效率, 最优pH值取自然pH值。
2.5 培养时间对酶活的影响
培养过程中, 每间隔24h取一次样, 结果如图5所示, 木聚糖酶的酶活力随培养时间延长发生明显变化, 大致可分为4个时期:
2.5.1 迟缓期:0～48h;
2.5.2 指数期:48h～72h;
2.5.3 稳定生长期:72h～96h;
2.5.4 快速下降期:96h之后。
由图可知, 当培养时间为96h时酶活力达最高峰, 但菌株在72h～96h期间, 酶活均维持在一个较高的水平上, 这段时期内酶活力无显著差异。为降低生产成本, 提高生产效率, 72h为最优培养时间。
2.6 培养温度对酶活力的影响
由图6可知, 当培养温度低于25℃时, 菌体生长较为缓慢, 产酶量较少, 而当培养温度过高时, 菌株虽然生长速度较快, 但易衰老死亡, 且分解代谢速度加快, 其中产生的热量使培养基温度进一步升高, 从而使产酶量下降。当培养温度为32℃时, 黑曲霉生长最旺盛, 酶活力达到最高峰, 所以32℃为最佳培养温度。
6结论
通过以上多种单因子的优化实验得到固态发酵黑曲霉产木聚糖酶的优化培养基配方:碳源:麸皮:玉米芯=1:9, 氮源:0.25%NaNO3, 含水量:35ml, Mandel盐;优化培养条件为:接种量0.2ml, 初始pH值4～5, 培养温度为32℃, 培养时间为3天。经测定, 培养基经优化后, 酶活力从原来的450.1IU/g增加到893.5IU/g, 显著提高了1.985倍。
参考文献
[1]薛业敏等.利用玉米芯木聚糖酶法制备低聚木糖的研究[J].中国酿造, 2003 (06) .
[2]付晓蕾.促进黑曲霉发酵提高木聚糖降解酶系活性的研究[D].北京化工大学, 2010.
木聚糖酶研究 篇8
1 材料与方法
1.1 菌种与粗酶液制备
菌种:作者实验室分离保藏的枯草芽孢杆菌菌株UD-20。
粗酶液制备:斜面保藏的菌种经活化12h,种子培养12h,转接到发酵在37℃培养基中培养72h,10 000r/min离心5min,收集的上清液即为粗酶液。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器与设备
超净工作台,ZHJH-C1112B型,上海智械分析仪器制造有限公司;分光光度计723N,上海精密科学仪器有限公司;nanodrop 2000微量紫外分光光度计,NanoDrop。
1.2.2 主要试剂
魔芋粉,湖北强森魔芋科技有限公司;槐豆胶,湖北强森魔芋科技有限公司;无水乙醇,郑州派尼化学试剂厂;硫酸铵,国药集团化学试剂有限公司;PEG2000,北京鼎国生物技术有限责任公司。
1.3 培养基
种子培养基(W/V):魔芋粉1.0%,蛋白胨0.5 %,MgSO4 0.03 %,KCl 0.1 %,K2HPO4 0.1 %,酵母膏0.5%,pH 7.0,121 ℃灭菌30 min。
活化培养基(W/V ):酵母膏0.5 %,蛋白胨0.5 %,NaCl 0.5 %,pH 7.0,121 ℃灭菌30 min。
摇瓶发酵培养基 (W/V ):魔芋粉3 %,蛋白胨0.3%,MgCl2 0.0407%,CaCl2 0.033 %,BaCl2 0.00489%,NH4NO3 0.3 %,Tween 80 0.1 %,pH 7.0,121 ℃灭菌30 min。.
1.4 分离纯化方法
1.4.1 硫酸铵盐析
试验参照向冰冰[5]采取分级沉淀方法,在装有一定体积粗酶液的离心管中分别边搅拌边加入不同量干燥的硫酸铵,使酶液中硫酸铵饱和度分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%,4℃静置过夜,10 000 r/min 离心 30min,测定上清液中酶的收率及沉淀酶收率,绘制盐析曲线。
1.4.2 乙醇沉淀
向100ml酶液中加入预冷过(-20℃)的乙醇,置冰箱沉淀15 min,8 000 r/min离心,收集沉淀,用预冷乙醇洗涤2次,收集沉淀,DNS法测酶活。
1.4.3 双水相萃
参照周红航、[6]孟玲[7]等配置双水相体系的方法,初始体系总质量为10g,依次加入酶液量为3g、PEG2000 20%( m/m)、(NH4)2SO4 16%( m/m),不足部分以水补充。离心( 2 000 r/min,5min) 分相。有关计算公式为:相比R = 上相体积/ 下相体积;β-甘露聚糖酶分配系数K e= 上相酶活/ 下相酶活;蛋白质分配系数 Kp=上相蛋白质浓度/下相蛋白质质量分数;萃取率C= R K / ( 1+ R K ),Ce和Cp分别代表β-甘露聚糖酶和总蛋白的萃取率。
1.5 酶活测定 (DNS法)
参照Akins T[8]方法进行测定,并按照以下公式计算样品的甘露聚糖酶活力:U=m·N/(M·a·b)
U―β-甘露聚糖酶活力,(μmol/min);
m―根据吸光度在标准曲线上查得(或从回归方程计算出)的还原糖生成量(μg);
N―样品的稀释倍数;
M―样品的摩尔质量(g/mol);
a―参与反应的酶量(mL);
b―反应时间(min)。
1.6 蛋白质含量测定
参照紫外吸收法测定A280 nm[9],采用微量分光光度计法进行测定,此分光光度计可直接测定粗酶液中蛋白含量。
2 结果与分析
2.1 硫酸铵盐析
将经饱和度为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的硫酸铵处理过的沉淀测酶活,以粗酶液酶活为100%,绘制盐析曲线,结果如图1所示,硫酸按饱和度为20%时的沉淀物无酶活即沉淀为杂蛋白,上清液酶活几乎无损失且离心效果好。40%～80%时离心不彻底,出现蛋白絮状漂浮,沉淀蛋白不易收集。30%、40%上清残余收率较高,50%～80%酶收率较低,选取饱和度20%为分级沉淀的初始浓度。分级沉淀结果如图2,上清中酶活呈下降趋势,与盐析曲线相同,但当硫酸铵浓度达到75%后,再加入硫酸铵上清酶收率无明显下降,沉淀中回收酶呈上升趋势,但沉淀酶收率最高仅达15%,回收酶活太少研究意义不大,因此硫酸铵盐析法不适宜UD-20 产β-甘露聚糖酶的提纯。
2.2 乙醇纯化
以50ml粗酶液为出发酶液,在不同酶液/乙醇(V/ V)梯度下,测定其上清及沉淀酶活力,得到酶收率如图2、3所示,上清酶收率随乙醇用量增加而降低,符合纯化规律,沉淀酶活收率随乙醇用量逐渐升高,但酶收率最高才达7.5%,对酶纯化而言没有较大的纯化意义。
2.3 双水相法纯化
2.3.1 PEG 浓度对酶分离的影响
固定( NH4 )2SO4 浓度18%(m/m),以不同浓度的PEG为双水相体系,测定其上下相体积、酶活力及蛋白含量,结果如表1所示。酶萃取率在低于22%时呈上升趋势,高于22%时开始下降,蛋白萃取率则呈上升趋势。 可能是因为当PEG浓度较低时,( NH4 )2SO4 的盐析作用占主导作用,使酶主要分配在上相;随PEG 浓度增加,粘度增加,阻止相间分子转移的能力增加,相界面张力亦将增大[10]。PEG 浓度为22%(m/m) 时,其酶的萃取率最高,上相总酶活力最高,可高达360.7U/min,因此选取PEG 22%(m/m)为萃取甘露聚糖酶的最佳浓度。
2.3.2 (NH4)2SO4浓度对酶分离的影响
固定PEG浓度为22%( m/m),以不同(NH4)2SO4浓度为成相体系,测定酶活和萃取率。结果如表2所示,随(NH4)2SO4浓度增加,R相比减小,而酶分配系数和酶萃取率均呈先上升后下降趋势,二者在(NH4)2SO4 16%( m/m)时达最大值,分别为51.25、98.03,蛋白质萃取率此时最小,表明此浓度下萃取蛋白多为酶蛋白,但总体而言蛋白萃取率变化无规律,可能是盐浓度过大时,破坏了酶表面水化层,使酶的分配系数和萃取率下降;同时干扰了双水相系统和破坏两相电位差,改变各相中成相物质的组成和相体积比。因此选取甘露聚糖酶的 (NH4)2SO4 16%(m/m) 为分离最佳浓度。
2.3.3 NaCl浓度对酶分离的影响
在优化过的体系中,加入不同量的NaCl后,体系变化结果如表3所示,随NaCl浓度增加,蛋白萃取率及酶萃取率均呈先升后降趋势,且在NaCl浓度为2%时酶萃取率高达99.26%。与未加NaCl相比,酶萃取率及酶纯度均有所提高,可能是由于正负离子在体系中有着不同的分配性能,从而导致各相的溶液电荷发生改变,使蛋白质的分配行为随之也会发生变化。同时本实验中发现加入NaCl后立即出现双水相,并使酶纯度及酶萃取率均有提高,因此对本实验所用酶而言加入NaCl 2%是必要的。
2.4 三种纯化方法对β-甘露聚糖酶纯化的影响
由以上试验可知硫酸铵盐析、乙醇沉淀和PEG/(NH4)2SO4萃取三种方法中,PEG/(NH4)2SO4萃取在最优的PEG/(NH4)2SO4体系为PEG 22%(m/m)、(NH4)2SO4 16%(m/m)、NaCl 2%(m/m)、酶液30%、水30%时。酶收率高达97.16%,纯化倍数为2.820 。如表4所示。
3 讨论
β-甘露聚糖酶的分离纯化,通常先用盐析或有机溶剂沉淀等粗分离,再用离子交换、吸附层析、凝胶过滤、亲和层析等精细分离方法[11,12]。粗分离方法中冯娜等[13]用硫酸铵盐析法β-甘露聚糖酶收率可达83.90%,蒋燕军[2]等用丙酮沉淀法β-甘露聚糖酶收率可达74.76%,余红英等用双水相法萃取β-甘露聚糖酶,其萃取率可高达98.79%。廖婷婷[14]等用硫酸铵盐析并进行细分离后,酶收率达到24.8%,而在本实研究中UD-20产的β-甘露聚糖酶仅经双水相处理不仅萃取酶活高达99.26%,且在加入NaCl 2%后很快出现分相现象,2 000r/min离心5min即可分相完全,最终上相酶收率可高达97.16%,纯化倍数了2.820倍,对酶的的精细分离纯化及进一步的研究分析均有较高的意义,但在研究中也存在一定的问题,PEG溶度相对偏高用量为22%,导致上下相在分离中难以彻底分开,需用移液枪慢慢分离,本研究正在研究一种较为方便的分离上下相的方法,并对分离的酶采用离子交换法进行纯化,以便提高酶纯度。
4 结论
壳聚糖的研究进展 篇9
关键词：甲壳质,壳聚糖,降解,生物材料
壳聚糖是一种新型的天然医用生物材料。虾、蟹类作为壳聚糖的原料,在我国具有分布量大,资源丰富的特点,从环保、经济可持续发展的角度来考虑,壳聚糖作为一种天然的材料不仅无毒、无污染,而且还具有很好的生物降解性和相容性。因此非常有必要加大对壳聚糖的研究,以开发更多的产品。本文综述了壳聚糖的结构性质、制备、体内降解过程及其在生物医用材料的应用等方面。
1 壳聚糖的结构与性质
1.1 壳聚糖的结构
壳聚糖是甲壳质的脱乙酰化产物。甲壳质是N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过β-1,4糖苷键相连的直链状氨基多糖,其化学名为聚(1,4)–2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖,也称为聚(N-乙酰基-D-葡糖胺),甲壳质在碱性条件下水解,脱去部分乙酰基后就转变成壳聚糖,其化学名为:聚(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖。甲壳质和壳聚糖并非单一的化学实体,来源和制造过程不同,它们的成分就会发生改变。当N-乙酰氨基-D-葡糖胺单元的含量超过50%时,该高分子聚合物就是甲壳质,反之,当N-氨基-D-葡糖胺单元的含量超过50%时即为壳聚糖[1]。图示如下:
1.2 壳聚糖理化特性
壳聚糖是甲壳质最主要的衍生物,不同程度的的脱乙酰作用可以获得不同脱乙酰度的壳聚糖。粗壳聚糖分子量为1×105~10×105,通常其脱乙酰度为80%~95%。纯净壳聚糖为白色或灰白色,半透明的片状固体。主要特性有:1)不能完全溶解于水和碱溶液中,但可溶于稀酸(PH<6),游离氨基质子化促进溶解。溶于稀酸呈粘稠状,在稀酸中壳聚糖的β-1,4糖苷键会慢慢水解,生成低分子壳聚糖。2)壳聚糖在溶液中是带正电荷多聚电解质,具有很强的吸附性。3)壳聚糖的溶解性与脱乙酰度、分子量、粘度有关,脱乙酰度越高,分子量越小,越易溶于水;分子量越大,粘度越大[2]。
1.3 壳聚糖的生物活性
壳聚糖是一种天然、无毒、可生物降解的化合物,与机体之间有良好的生物相容性。主要生物活性有:1)壳聚糖属天然高分子化合物,其分子链上的游离氨基在弱酸溶液中结合一个质子,生成阳离子聚合体,有很强的吸附能力,是一种良好的絮凝剂[3]。2)带有正电荷的壳聚糖与带有负电荷的粘多糖、蛋白多糖等相互发生静电作用,这一特性是相当有意义的,因为大量的细胞浆和生长因子的移动都和粘多糖有关,特别是对于肝磷脂和类肝素硫酸盐,包含有壳聚糖和粘多糖的支架借助于细胞繁殖可以维持和促进生长因子分泌。3)壳聚糖可以做成不同的几何结构,例如容易形成多孔结构,多孔支架可用于体内细胞生长和骨重建[4]。4)壳聚糖具有抗菌性,研究表明它可以减缓实验白兔金葡萄球菌引起的骨髓炎感染。壳聚糖在细菌细胞膜表面可以抑制生物合成,破坏穿过细菌细胞膜的能量传输,加快细菌的死亡。此外,壳聚糖还可作为药物释放载体,如与羟基磷灰石等复合能够持续释放万古霉素和磷霉素,在骨科感染疗程中发挥作用[5]。
2 壳聚糖的制备
2.1 壳聚糖的工业合成
2.1.1 主要原料
甲壳质和壳聚糖都是天然的多聚糖,甲壳质是甲壳类动物的外壳,昆虫的骨骼和真菌的细胞膜的主要组成成分[6]。虾壳中壳聚糖含量为20%,龙虾壳中含量为25%,蟹壳中含量为17%~18%,其余为35%~50%的碳酸钙,30%~40%的蛋白质。从这类动物中提取甲壳质,粗制壳聚糖,再进行深加工制成高科技产品有很高的经济价值。
2.1.2 生产工艺
壳聚糖的制取通常采用化学法,制备工艺程序为[7]甲壳→脱钙→脱蛋白质→脱色→甲壳质→脱乙酰基→壳聚糖。
先将虾、蟹壳洗净干燥后,用5%稀盐酸在室温浸泡数小时,直至不冒泡为止,目的是脱除碳酸钙,使碳酸钙变成氯化钙随溶液排出,再经水洗、干燥、粉碎,用烧碱溶液浸泡,于100℃煮沸分解蛋白质,经多次处理后得到粗壳质,再用1%高锰酸钾溶液浸泡氧化脱色,水洗,再加入1%草酸溶液,于70℃保温30min,除去过量的高锰酸钾,得白色甲壳质。将此甲壳质浸于40%~60%的浓碱中,于120℃反应1h可得脱乙酰度为70%左右的壳聚糖,再更换一次碱液,在相同条件下继续水解1h最后可得脱乙酰度为92%以上的壳聚糖。
国内生产的壳聚糖产品主要存在灰分含量高和氨基含量高的缺点。为了获得高质量的甲壳素,国外采用多种有机溶剂在闪蒸下操作或用微波幅射,用50%浓碱溶液,于80℃反应18min,完成甲壳质到壳聚糖的转化。
2.2 壳聚糖的实验室制法
目前在实验室制备壳聚糖通常采用两种方法:
Broussignac[8]等先制备混合物作为该无水反应的中间体,将96%乙醇溶液和乙烯乙二淳溶液混合,再逐步加入固态KOH粉末并不断搅拌。此溶解过程是放热过程,温度上升至90℃。这一步骤的优点是反应可在玻璃或不锈钢容器中进行。在向混合物中逐渐加入甲壳质,温度达到预期温度后,乙醇挥发又回到反应容器中,持续反应一段时间后,过滤,蒸馏水洗至中性,在室温下干燥,得到产物壳聚糖。
Kurita[9]等将壳质悬浮液和Na OH溶液混合加热至80℃,反应过程中持续通入N2流,到达预定时间后,过滤,蒸馏水洗至中性,再加入甲醇和丙酮,放置烘箱中,恒定50℃时干燥12小时,得到壳聚糖。也可在脱乙酰过程中加入Na BH4苯硫酚,这两种物质和壳质的质量比为1:1,目的是防止聚合物降解。
3 壳聚糖的体内降解
壳聚糖的降解方式包括超声波降解[10]、辐射降解、光降解、酸降解、氧化降解[11]、酶降解等多种方式,但其在生理环境中的降解主要是酶降解法。
壳聚糖在体内的降解主要溶菌酶水解所引起的,而蛋白酶等对壳聚糖的降解能力较低。溶菌酶[12]是人体体液中含量较高的一种抗菌物质,在泪液中含量最多,约占人体泪液蛋白含量的20%~40%。壳聚糖具有部分N-乙酰基葡萄糖残基,而溶菌酶能识别N-乙酰基残基,所以水解产物是由氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖残基组成的不同长度寡糖[13],溶菌酶对壳聚糖的催化水解速度随着脱乙酰度的升高而降低,脱乙酰度超过85%的壳聚糖难于在体内被溶菌酶催化水解,而低脱乙酰度的壳聚糖的降解速度较快。由于溶菌酶能识别乙酰氨基葡萄糖序列,因此可以从低脱乙酰度的壳聚糖获得高聚合度(dp>5)的甲壳低聚糖。此外,医用植入材料的壳聚糖脱乙酰化度控制在70%左右。目前,商业化溶菌酶的生产主要来自于蛋品加工厂,这种酶在酶法规模制备甲壳低聚糖中应该具有潜在的价值。
甲壳质和壳聚糖除了被和溶菌酶降解外,还有许多酶制剂[14]如葡萄糖酶、蛋白酶、脂酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等30多种酶能水解壳聚糖和甲壳质。酶对多糖的水解具有高度的选择性,而无其它副反应。
4 壳聚糖在生物医用材料方面的应用
对壳聚糖分子表面进行化学修饰和改性,利用其良好的成膜性、生物降解性和生物相容性,可使其成为具有广泛医学用途的新型天然医用生物材料。
4.1 用于膜材料
多聚糖及其衍生物易相互交联形成网状结构[15],利用适当的溶剂,可制成透明的薄膜。甲壳质、脱乙酰壳聚糖作为药物控释膜,是药物的良好载体[16],具有缓释、长效的特点。由于生产成本低,目前国外正大量研究将其作为许多药物的缓释剂,有做成膜的,也有压成片状的。作为药物控释膜,发现酸性药物的透过性优于碱性药物,小分子量药物较之大分子量药物易于透过。国内有研究表明,调整壳聚糖或改变戊二醛为交联剂的交联度,均可改变释放速度。有关报道[9]表明,壳聚糖苹果酸盐用于数种小分子药物体外释放研究,其释药性为零级释放模式。壳聚糖凝胶应用于利多卡因药也证实了这一点,并且脱乙酰化度对转移扩散性能影响较大。壳聚糖作为蛋白质和多肽等不易透皮吸收的大分子药物和疫苗控释载体目前已引起人们的关注。
另外,壳聚糖能有效地促进伤口愈合,防止伤口感染,镇静止血。目前也有甲壳质无纺布人工皮肤在国外销售,用于整形内科、皮肤科作为Ⅱ、Ⅲ度烧伤、采皮伤、植皮伤以及肤介伤的被覆保护材料[17]。
壳聚糖易成膜,透过性优于纤维素膜,仅强度稍低,经共混处理可提高壳聚糖膜的强度。壳聚糖中加入聚乙烯醇而制成的3.0μm膜,在25℃时可吸收102%的水且具有较高的强度和尿素的透过性,可望在人工肾中获得应用。
4.2 外科手术可吸收缝合线[18]
壳聚糖类可吸收缝合线具有高强度,易打结,柔韧性好的机械性能和促进伤口愈合,抗溃疡等药理作用。并且可以通过对壳聚糖的化学修饰如乙酰化等增强纤维性能,或与其它物质如丝胶蛋白共混制成功能化纤维,以此改善天然材料在体内环境中抗张强度损耗快的缺陷,同时也避免了较大的组织反应。
4.3 用于骨组织材料
壳聚糖被广泛地应用于骨组织工程,壳聚糖有良好的生物相容性,生物降解性,骨诱导性,生物再吸收性,易于形成多孔结构,它能促进造骨细胞成长和骨质沉积。壳聚糖-磷酸钙(CP)复合材料的应用被广泛研究,张[19]等人将大孔磷酸钙植入多孔壳聚糖海绵体。在这个支架中,壳聚糖海绵体嵌套通过基质增强增大了磷酸钙的机械力并保持了造骨细胞的形态。此外,包含有HA或具有相互连接的多孔结构且孔径为100 mm的磷酸钙玻璃的大孔壳聚糖支架已经被合成[20],壳聚糖-磷酸钙之类的复合材料在临床上有很大的应用前景。葛[21]等人报道HA–甲壳质复合材料具有骨诱导性,在体内三个月的时间内,快速降解并促进了新血管形成。Kawakam等研究表明在体内将壳聚糖–HA涂在骨膜切除的胫骨表面时,一个星期后可以观察到新骨形成并在接下来的20个星期内继续生长,无不良症状。由此说明壳聚糖–HA作为骨填充材料[22]在临床上具有很高的研究价值。此外以壳聚糖为基体的复合材料有很强的抗压性能,壳聚糖–HA强度和弯曲系数高,适用于长骨碎裂的内部固定材料。壳聚糖也可作为骨水泥的辅助剂,用于外科手术中。
5 展望
壳聚糖提取工艺的研究 篇10
1.1 壳聚糖溶液的配制
用电子天平称量一定量的壳聚糖溶于1%的醋酸依次配制0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%的壳聚糖溶液, 溶胀2小时使壳聚糖充分溶解。再加入氯化镉固体, Cd2+与-NH2配位 (1:4) , 溶解后静置过夜得到Cd2+-CTS整理液。氯化镉固体要稍微多点, 因为它本身就带有结晶水, 放置时间过长易氧化。
1.2 选择性吸附Cd2+的SMS丙纶无纺布过滤材料的制备
在Cd2+-CTS整理液里, 依次加入浓度为0.005mol/L、0.0075mol/L、0.01mol/L、0.0125mol/L的交联剂戊二醛, 均匀搅拌。将丙纶无纺布按浴比为1:80浸泡, 两浸两轧。然后置于微波炉里, 用中高火辐射2分钟、3分钟、4分钟。将整理过的布样在1%的Na OH溶液中浸泡1小时, 再用0.1 mol/L的H2SO4溶液清洗布样, 至检验不出Cd2+离子。然后用高纯度的蒸馏水清洗至中性, 放在干净的托盘里自然晾干。仍将烘箱的温度设为102℃烘两小时, 等布样烘干以后在真空干燥器中干燥两小时, 用电子天平称整理过的质量, 看每块布样增重多少。
1.3 SMS丙纶无纺布整理后质量变化计算
根据交联剂用量、微波整理时间与SMS丙纶无纺布整理前后质量变化
式中:m1、m2分别表示整理前后SMS丙纶复合无纺布的质量;表示SMS丙纶复合无纺布整理后的质量变化率。
1.4 测定壳聚糖中游离氨基的含量
首先配制Nacl和Hcl的标准溶液。用基准物质邻苯二甲酸氢钾以酚酞为指示剂标定Na OH标准溶液的浓度, 用无水碳酸钠为基准物质保定HCl标准溶液的浓度。每种溶液需要测定三次, 标定以后计算出配制溶液的浓度, 并计算出三次测定的平均值。得到Na OH标准溶液的浓度为0.0956mol/L, HCl标准溶液的浓度为0.0984 mol/L。将两种标准溶液稀释100倍, 裁剪几块布样在稀释的盐酸溶液中浸泡3个小时。用甲基橙作指示剂酸碱滴定, 滴定时颜色无变化。用828型酸度计测定, 将裁好的布样在盐酸溶液中浸泡3个小时, 在磁力搅拌的作用下, 用Na OH溶液滴定, 最后算出涂附在布样上壳聚糖中游离的含量。
自由氨基的百分数即为壳聚糖试样中的氨基含量占理论氨基含量的百分数。
2 实验结果与讨论
2.1 微波整理对SMS丙纶复合无纺布结构性能的影响
2.1.1 差热分析
在空气环境下, 对整理前后无纺布进行差热分析测试。实验得出:在350℃以内, 整理后增重最大的无纺布产生了两个峰。一个为吸热峰, 另一个为放热峰;未整理的无纺布只有最高吸热峰, 没有产生放热峰。由此看来微波整理前后无纺布的熔解温度和热分解温度都发生了变化。
2.1.2 热重分析
在空气环境下, 对整理前后的无纺布进行热重分析测试。实验得出:在空气环境下, 500℃以内, 整理前后的无纺布都产生了一次明显的重量损失。整理后增重最大的丙纶无纺布在312℃时开始产生明显的质量损失。未整理的丙纶无纺布在383.30℃时开始产生明显的质量损失448.09℃完全分解。由此看来微波整理前后无纺布的热稳定性发生了变化。
2.2 交联剂与有效成分的关系
2.2.1 交联剂与壳聚糖整理量的关系
在不同浓度的交联剂戊二醛中加入0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%的Cd2+-CTS整理液, 在一定的时间内经微波整理, 观察无纺布的质量变化。
实验得出, 当交联剂在整理液中的浓度达到0.01ml/ml时, 不同浓度下的整理液, 无纺布的质量都增加到最大。当交联剂浓度从0.005ml/ml增到0.0075ml/ml时, 五种浓度的整理液整理过的无纺布的质量都有所减少。
2.2.2 整理时间与壳聚糖整理量的关系
在0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%的Cd2+-CTS整理液中加入相同量的交联剂戊二醛, 进行不同时间的微波整理, 观察无纺布的质量变化。
实验得出, 最佳整理时间为4分钟。如果时间过长, 微波炉内温度过高, 无纺布会胶结。当微波时间从2分钟变为3分钟, 四种整理液整理后的无纺布的质量均减少。
3 结论
(1) 以源于自然界的壳聚糖为原料, 利用Cd2+与壳聚糖C2的-NH2发生Schiff碱反应。以Cd2+为保护剂有效地保护了壳聚糖上的自由氨基, 经戊二醛交联。微波整理SMS丙纶复合无纺布制备出了选择性吸附Cd2+的过滤材料。
(2) Pb2+-CTS整理液浓度越高, 整理接枝量越高, 交联剂浓度为0.01ml/ml时, 整理剂接枝量最高, 且4分钟为最佳整理时间。
(3) 含镉废水是世界上危害较大的工业废水之一, 用壳聚糖处理含镉废水探讨壳聚糖吸附Cd2+机理, 既具有理论意义又具有很高的实际应用价值。
综上所述, 在微波条件下经壳聚糖整理过的丙纶无纺布能够有效地对水体中重金属离子 (Cd2+) 进行螯合吸附和离子交换, 且自身易于降解, 能够作为一种环保材料。
参考文献
[1]张文清, 柴平海, 金鑫荣.壳聚糖及其衍生物在化妆品中的应用[J].高分子通报, 1999 (02) :73—76.
[2]蒋挺大.壳聚糖[M].北京:化学工业出版社, 2001 (03) :12—16.
[3]杨定国编.波谱分析基础及应用[M].中国纺织出版社, 1993 (01) :33—36.
木聚糖酶研究 篇11
关键词：金雀异黄素；壳聚糖；纳米粒子；制备；药物缓释
中图分类号： TQ460.6文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0226-03
收稿日期：2013-10-31
基金项目：江苏省研究生科技创新计划（编号：CXZZ13_0893）。
作者简介：王莹（1988—），女，江苏镇江人，硕士研究生，主要从事胶体与界面化学研究。E-mail：yingw1988@126.com。
通信作者：刘天晴，博士，教授，博士生导师，主要从事胶体与界面化学研究。Tel：（0514）87975290；E-mail：tqliu@yzu.edu.cn。金雀异黄素是大豆异黄酮的主要成分，又称染料木素、染料木黄酮，是源于豆类植物和齿状植物的异黄酮类化合物，其化学名为4，5，7-三羟异黄酮，具有多种生理或药理活性[1-2]。金雀异黄素在分子的相对两极带有2个酚羟基，溶于乙醇等有机溶剂，不易溶于水，因此直接口服生物利用率较低。壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的，不仅是具有良好生物相容性和可降解性的天然生物材料，也是自然界中唯一大量存在的阳离子聚合物，由于其特有的性质且价格低廉，已成为新型的纳米药物载体。目前，利用壳聚糖为包璧材料制备药物微胶囊的方法有共价交联法、离子诱导法以及自组装法等。其中共价交联法由于经常使用的交联剂如甲醛、戊二醛等有机物含有一定的毒性，无法适用于体内给药；自组装法虽对控制大分子药物的释放具有一定的优势，但其制备方法较为繁琐；离子诱导法是制备壳聚糖纳米粒最为普遍的1种方法，制备条件温和、工艺简单、条件可控[3-7]，但该方法一般只适用于亲水性药物。本研究首次将离子诱导法用于疏水性药物，采用壳聚糖离子诱导法制备疏水性药物金雀异黄素纳米粒子乳液，以三聚磷酸钠为离子交联剂对其进行物理交联、包覆，制备金雀异黄素纳米粒子，并对其载药率和包裹率、释放性能进行了探讨。
1材料与方法
1.1试验试剂与仪器
试剂：壳聚糖（CS，AR，国药集团化学试剂有限公司），冰醋酸（AR，国药集团化学试剂有限公司），金雀异黄素（原药，纯度>99%，上海融合医药科技发展有限公司），聚乙二醇400（PEG400，CP，国药集团化学试剂有限公司），三聚磷酸钠（TPP，AR，国药集团化学试剂有限公司），二次蒸馏水。
仪器：透射电子显微镜（TECNAI 12 Philip Apparatus Co.，USA），紫外-可见分光光度计（UV-2550，日本岛津公司），傅里叶红外光谱仪（Tensor27，德国BRUKER公司），粒径分布仪（ZEN3690，英国Malvern公司），恒温槽（DK-S22，上海精宏实验设备有限公司）。
1.2试验方法
1.2.1金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的制备采用离子诱导法制备金雀异黄素纳米粒子，称取适量壳聚糖溶于醋酸中，调节pH值，获得壳聚糖醋酸溶液。将三聚磷酸钠水溶液与含有金雀异黄素的PEG400水溶液混合后，缓慢加入到壳聚糖醋酸溶液中，搅拌反应1 h，即可得金雀异黄素纳米粒子乳液。考察壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比、体系pH值和PEG400的浓度对所获得的纳米粒子的粒径、载药率及药物包裹率的影响，筛选最佳制备工艺条件。
1.2.2金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的形貌表征通过透射电子显微镜观察与分析，可获得金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的形貌、大小及分布。
1.2.3金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的成分分析用傅里叶红外光谱仪对金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的成分进行分析、测定。
1.2.4包裹率及载药率的测定包裹率和载药率是评价粒子好坏的重要指标之一，包裹率和载药率经计算而得。
包裹率B=实际药物质量/理论药物质量×100%（1）
载药率Z=药物质量/药物微粒的质量×100%（2）
1.2.5金雀异黄素纳米粒子体外释放性能测定采用透析法考察金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放性能。金雀异黄素为疏水性药物，选择40%乙醇PBS缓冲溶液为释放介质，将金雀异黄素对照品和金雀异黄素壳聚糖纳米粒子分别装入处理过的透析袋中，加入20 mL释放介质，将透析袋置于装有200 mL 释放介质中，在37 ℃恒温水浴中旋转搅拌，定时取样5 mL，并同时补充等量的释放介质。样液使用紫外分光光度法测定金雀异黄素含量，并计算累积药物释放量。
2结果与分析
2.1金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的制备与表征
2.1.1金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的粒径分布图1为金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的粒径（Rh）分布图，在制备工艺的筛选中，纳米粒子粒径大小是重要的影响因素之一。由图1可知，该粒径分布范围在100～350 nm，平均粒径大小约为200 nm。
2.1.2CS/TPP质量比对金雀异黄素壳聚糖纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响图2、图3分别为CS/TPP质量比对纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响。从图2可以看出，当质量比m（CS）/m（TPP）为4～6时，粒径在200～300 nm范围，明显低于m（CS）/m（TPP）为3时的微米级粒径。图3表明，质量比m（CS）/m（TPP）与药物包裹率和载药率成反比，当质量比为3时包裹率和载药率为最大，分别为44.5%和111%，但此时粒径也最大，达微米级；当质量比为4时，粒径在200 nm左右且包裹率和载药率分别为38.5%和9.6%，因此，选择m（CS）/m（TPP）为4比较合适。
nlc202309040728
2.1.3pH值对金雀异黄素壳聚糖纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响图4、图5分别为体系pH值对纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响。从图4可见，纳米粒子的平均粒径与体系pH值成正比关系，pH值为2～4时，粒径在200～300 nm之间；当pH值为5～6时，粒子粒径在700～800 nm之间。从图5可以看出，粒子的包裹率和载药率随体系pH值增大出现缓慢下降的趋势，这是由于随着pH值增大，壳聚糖溶液中带正电荷的离子减少，在三聚磷酸钠中负电荷一定的情况下正电荷与负电荷之间的作用力就相应减弱，药物的包裹率及载药率则相应下降。因此，试验时，通常选择体系pH值为3，这时制备粒子的包裹率及载药率最大，分别为37.1%和9.3%。
2.1.4PEG400浓度对金雀异黄素壳聚糖纳米粒粒径和包裹率、载药率的影响图6、图7分别为在CS与TPP质量比为 4 ∶1、壳聚糖溶液pH值为3的条件下，考察助溶剂PEG400浓度的改变对形成纳米粒子粒径和包裹率、载药率的影响。从图6可以看出，在C（PEG400）为0.49 mol/L时，粒径最大，为 500～600 nm；随着PEG400浓度的增大，纳米粒子的粒径减小，C（PEG400）为0.81 mol/L时粒径为200～300 nm。从图7可见，在C（PEG400）为0.81 mol/L时，包裹率和载药率达到最大；但随着PEG400浓度继续增大时，溶解金雀异黄素的PEG用量就会增加，使得溶解在水中的金雀异黄素的浓度减小，导致被包裹的药物量减少，包裹率和载药率就会相应下降，因此，试验时选择C（PEG400）为0.8 mol/L。
综上分析，制备金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的最佳条件是m（CS）/m（TPP）为4∶1、体系pH值为3、C（PEG400）为 0.8 mol/L、金雀异黄素用量为10 mg。最佳工艺制备的金雀
异黄素壳聚糖纳米粒子的包裹率和载药率分别为37.1%和9.3%。
2.1.5金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的红外光谱特征通过金雀异黄素壳聚糖纳米粒子、金雀异黄素和壳聚糖的红外光谱（图8），可以看出在3 400 cm-1附近有较大的吸收峰，在800～1 750 cm-1附近出现了较多的吸收峰。不难看出，纳米粒子的红外光谱是壳聚糖和金雀异黄素红外图谱的叠加，但峰强度又较之强很多，这是因为金雀异黄素较少吸附在粒子表面，而被一起包裹在壳聚糖内部，并且相对含量较少。
2.1.6金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的形貌特征图9为金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的透射电镜图。由图9可见，纳米粒子呈圆球状，形状较规整，粒径分布在200～300 nm左右；粒子中间黑色部分为包裹的金雀异黄素，外围淡黑色部分为壳聚糖与三聚磷酸钠交联形成的壁壳。
2.2金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放特征
图10和图11分别为金雀异黄素对照品和金雀异黄素纳米粒子的体外释放曲线。从图10可以看出，金雀异黄素对照品的体外释放几乎与释放时间呈线性关系，在7 h内释放量Q达到94.05%，之后的释放量Q保持不变，说明7 h内金雀异黄素对照品几乎释放完毕。图11是金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放曲线，可以看出在60 h之后的释放量Q达到96.07%，表明金雀异黄素壳聚糖纳米粒子具有明显的缓释效果。
3结论
采用壳聚糖离子诱导法制备了1种新的疏水性药物金雀异黄素纳米粒子，以三聚磷酸钠为离子交联剂对其进行交联包裹形成纳米粒子，该法条件温和、工艺简单，克服了使用醛类交联剂和有机溶剂带来的毒性；壳聚糖是无毒无害可生物降解的天然高分子，可以增加药物对生物膜的通透性；三聚磷酸钠是一种食品中常用的添加剂，在人体内有较好的生物降解性。根据条件的考察确定制备金雀异黄素纳米粒子的最佳工艺是在室温条件下，壳聚糖与三聚磷酸钠质量比为 4 ∶1、体系pH值为3、PEG400浓度为0.8 mol/L、金雀异黄素用量为10 mg时，制备出的纳米粒子粒径为200～300 nm，药物包裹率和载药率分别为37.1%和9.3%，且药物的结构和性质没有发生变化；释放性能试验表明，该法制备的纳米粒子具有明显的缓释效果。这为疏水性药物金雀异黄素纳米粒子的制备和缓释研究提供了1种新的方法。
参考文献：
[1]Kumar N B，Cantor A，Allen K，et al. The specific role of isoflavones on estrogen metabolism in premenopausal women[J]. Cancer，2002，94（4）：1166-1174.
[2]Yu Z L，Tang Y N，Hu D S，et al. Inhibitory effect of genistein on mouse colon cancer MC-26 cells involved TGFI/Smad pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，333（3）：827-832.
[3]Prabaharan M，Mano J F. Chitosan-based particles as controlled drug delivery systems[J]. Drug Delivery，2005，12（1）：41-57.
[4]Shu X Z，Zhu K J. Controlled drug release properties of ionically cross-linked chitosan beads：the influence of anion structure[J]. International Journal of Pharmaceutics，2002，233（1/2）：217-225.
[5]Prego C，Torres D，Fernandez-Megia E，et al. Chitosan-PEG nanocapsules as new carriers for oral peptide delivery：Effect of chitosan pegylation degree[J]. Journal of Controlled Release，2006，111（3）：299-308.
[6]Kim J H，Kim Y S，Park K，et al. Antitumor efficacy of cisplatin-loaded glycol chitosan nanoparticles in tumor-bearing mice[J]. Journal of Controlled Release，2008，127（1）：41-49.
[7]Gan Q，Wang T，Cochrane C，et al. Modulation of surface charge，particle size and morphological properties of chitosan-TPP nanoparticles intended for gene delivery[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2005，44（2/3）：65-73.
蟹壳制备壳聚糖的工艺研究 篇12
甲壳类动物是甲壳素最主要的来源,蟹壳中甲壳素含量高达20%～25%[1]。甲壳素具有无毒、无味、耐晒、耐热、耐腐蚀、耐酸碱,可生物降解等特点,应用前景广阔。近年来,甲壳素及壳聚糖作为膜材料、药物载体被广泛应用于食品添加剂、医药、环保、饲料、化妆品等多个领域[2,3,4]。本文以晾干蟹壳为原料,探讨了壳聚糖的制备工艺,通过实验得到制备壳聚糖的最佳工艺。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
实验材料:干燥蟹壳粉,购自烟台;盐酸;氢氧化钠;EDTA;K-B指示剂;甲基橙指示剂;NH3-NH4Cl缓冲液,上海凌峰化学试剂公司。
仪器:T6 紫外-可见光分光光度计,北京普析通用仪器有限公司);PHS-2C型pH计,上海理达仪器厂;DK-0A恒温水浴锅,上海精密实验设备有限责任公司;TGL-16离心机,金坛市医疗仪器厂;NDJ-8S数显旋转粘度计,上海羽通仪器仪表厂。
1.2 工艺路线
蟹壳中除了含有甲壳素外,还有大量的碳酸钙、蛋白质及微量的色素。以蟹壳为原料制备壳聚糖可先用酸脱钙,碱液除蛋白,得到的甲壳素再与浓碱反应,脱除乙酰基,即可得到壳聚糖。工艺路线如下:
原料→粉碎→酸浸脱钙→水洗过滤→稀碱脱蛋白→氧化脱色→洗涤→浓碱脱酰基→水洗至中性→干燥→壳聚糖
1.3 甲壳素提取
1.3.1 脱钙
将干燥蟹壳粉碎至一定粒度,边搅拌边缓慢加入一定量2%～12%盐酸,pH上升至6左右时,补加一定量盐酸,使蟹壳里的无机盐溶解。搅拌反应2～12 h,当pH下降至1左右时,脱钙结束,测定脱钙率。
脱钙率的测定[5]:取5 mL处理后的样液于250 mL锥形瓶中,加入50 mL H2O2,5 mL NH3-NH4Cl缓冲液,4滴K-B指示剂,混匀。用EDTA溶液滴定,当溶液由紫红色变为蓝色即为滴定终点。脱钙率按下式计算:
脱钙率
式中:CEDTA——EDTA浓度,mol·L-1
VEDTA——滴定消耗EDTA体积,L
MCa——Ca摩尔浓度,g·moL-1
V——样品体积,L
m——蟹壳的质量,g
1.3.2 脱蛋白
脱钙结束后,过滤抽干,滤渣中加入一定量2%～14%氢氧化钠,85 ℃下反应4 h,以除去蛋白质,趁热过滤,测定脱蛋白率。碱液处理过的蟹壳水洗至中性,加入高锰酸钾脱色,水洗后干燥即可得到甲壳素产品。
脱蛋白率的测定[6]:将待测蛋白质溶液稀释n倍,用紫外分光光度计测定280 nm和260 nm处的吸光值A280和A260。当样品吸光值A280/A260约为1.8时,可用下式计算蛋白质含量:
蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45A280-0.74A260)×n
1.4 壳聚糖的制备方法
称取一定量的干燥甲壳素,加入20%～65%氢氧化钠,用量以1:5(g:mL)为适,搅拌加热至40～90 ℃,保温3～10 h。冷却后过滤,反应物水洗至中性,干燥后可得壳聚糖产品。测定脱乙酰度和粘度。
脱乙酰度的测定[7]:准确称取一定量的壳聚糖,室温下用25 mL 0.1 mol/L HCl溶解,加入甲基橙指示剂,用0.1 mol/L氢氧化钠滴定,溶液变为黄色即为滴定终点。 按质量计算酸脱乙酰度:
WNH2=(C1V1-C2V2)×MNH2×100%/m
脱乙酰度=203WNH2×100%/(16+42WNH2)
式中:C1——所用盐酸标准溶液浓度,mol·L-1
V1——所用盐酸体积,L
C2——所用氢氧化钠标准溶液浓度,mol·L-1
V2——所用氢氧化钠体积,L
m——壳聚糖质量,g
2 结果与讨论
2.1 甲壳素的提取
以蟹壳为原料提取甲壳素,盐酸浓度、脱钙时间、脱蛋白用氢氧化钠浓度、脱蛋白温度等对甲壳素的提取均有一定影响。以下内容主要考察这些因素对甲壳素提取率的影响。
2.1.1 盐酸浓度对脱钙率的影响
由图1可以看出,由蟹壳制备甲壳素时,随着盐酸浓度的升高脱钙率也上升。当盐酸浓度升至6%后,再提高盐酸浓度脱钙率上升也不明显。当盐酸浓度超过8%以后,随着盐酸浓度的升高,脱钙率反而有所下降,这可能是由于高浓度的盐酸会加速甲壳素的降解。故在保证充分脱钙的前提下,为了提高甲壳素的提取率,选择6%的盐酸进行脱钙较为合适。
2.1.2 盐酸浸泡时间对脱钙率的影响
取一定量经粉碎后的蟹壳,加入烧杯中,分别在常温和60 ℃ 下用6%的盐酸搅拌浸泡2～12 h,反应结束后测定脱钙率。盐酸浸泡时间对脱钙率的影响见图2。
由图2可知,盐酸浸泡时间越长,脱钙率越高,浸泡时间超过4 h后,随着浸泡时间的延长脱钙率变化不大。浸泡时间超过10 h会使甲壳素分子降解,从而降低壳聚糖的利用率。加热虽有利于蟹壳的脱钙,但是脱钙率提高不明显,从节约能源和缩短反应周期等方面综合考虑,选择常温脱钙6 h即可。
2.1.3 氢氧化钠浓度对脱蛋白率的影响
从图3可知,氢氧化钠浓度对脱蛋白率的影响并不大,氢氧化钠浓度上升至6%之后,脱蛋白率基本没有变化,从节约碱的用量方面考虑,选择6%的氢氧化钠脱蛋白较为合适。
2.1.3 反应温度对脱蛋白率的影响
取干燥的甲壳素,加入一定量6%的氢氧化钠在30～100 ℃下反应4 h,反应结束后测定脱蛋白率。由图4可知升高温度对脱蛋白有利。常温下甲壳素的脱蛋白率较低,当温度上升至80 ℃,脱蛋白率明显提高,当温度超过80 ℃后脱蛋白率提高不显著。提高温度可减少反应时间,综合考虑各方面因素选择可将加入碱液的甲壳素迅速升温至90 ℃,之后80 ℃保温4 h即可基本反应完全。
2.2 壳聚糖的制备
2.2.1 碱浓度对脱乙酰度及粘度的影响
由图5可知,在一定范围内,脱乙酰度随氢氧化钠浓度的增大而增大,但是当碱液浓度超过50%时,脱乙酰度反而有所下降。粘度随着氢氧化钠浓度的增大呈上升趋势,当碱液浓度超过60%后上升趋势不明显。故甲壳素脱乙酰操作中选用50%的氢氧化钠较为合适。
2.2.2 温度对脱乙酰度及粘度的影响
称取一定量的甲壳素用50%的氢氧化钠在一定温度下反应4 h,反应结束后测定脱乙酰度和粘度。从图6可以看出,反应温度对甲壳素的脱乙酰度有很大的影响,反应温度升高脱乙酰度也随之增大,也是由于升高温度可以使反应快速进行,故脱乙酰度也增大。虽然升高温度对脱乙酰度的增大有利,但是反应温度对产品的粘度也有很大的影响。温度小于70 ℃时,产品的粘度随温度的上升而增大,温度超过70 ℃后,随着温度的上升产品的粘度反而下降。这可能是因为温度升高会造成壳聚糖分子链的裂解,分子量下降,产品粘度降低。虽然脱乙酰度增大,产品粘度增大,但是增加的幅度小于裂解的幅度,故温度过高会使产品粘度下降,影响产品质量。考虑壳聚糖产品的质量,选择先将反应液加热至85 ℃,然后70 ℃保温4 h的工艺较为合适。
3 结 论
以干燥蟹壳为原料制备壳聚糖的最佳工艺条件为:
(1)甲壳素提取:干燥蟹壳中滴加3倍量体积的6%的盐酸,pH上升至4,当pH升至6,再补加2倍量的6%盐酸,常温下搅拌反应6 h。脱钙结束后加入4倍体积的6%氢氧化钠,可先将反应液迅速加热至95 ℃,80 ℃保温反应4 h,过滤后得到甲壳素产品。
(2)壳聚糖的制备:在得到的甲壳素中加入3倍体积的50%氢氧化钠溶液,迅速加热至85 ℃,70 ℃左右搅拌反应4 h,过滤,水洗至中性,干燥后得到壳聚糖产品。
参考文献
[1]卓双文,章汝平,林水东.虾、蟹壳制备甲壳素工艺探讨[J].龙岩学院学报,2009,27(5):61-64.
[2]汪多仁.甲壳素、壳聚糖的生产及应用[J].印染助剂,2000,17(4):1-4.
[3]温玉麟,赵萧涛.甲壳素及其衍生物在药物制剂中的应用[J].中国海洋药物,1989,8(1):33
[4]简慧兰.甲壳素/壳聚糖的制备及其在食品工业中的应用[J].南通职业大学学报.2003,17(1):56-58
[5]黄俊娴,杨建男.返滴定法测定处理蟹壳制备甲壳素过程中的脱钙率[J].化学分析计量,2007,16(6):49-51.
[6]郭颖娜,孙卫.蛋白质含量测定方法比较[J].河北化工,2008,31(4):36-38.
【木聚糖酶研究】推荐阅读：
定量研究与定性研究05-21
基础研究与应用研究08-31
研究生德育困境研究06-19
研究生党校建设研究08-01
文化研究与地区研究09-07
从研究范式看文化研究对当代翻译研究的影响07-05
在职研究生研究成果07-01
研究论文的具体研究方法08-29