戊聚糖酶（精选8篇）
戊聚糖酶 篇1
环葡聚糖水解酶是利用现代分子生物学的基因重组技术得到的菌种, 通过培养、菌体提取、超声波破碎菌体细胞、热处理、层析柱层析和透析等步骤得到的一种高温水解酶。它可以对环糊精、淀粉等进行降解, 生成麦芽寡糖, 其最终产物主要是麦芽糖, 还有少量的葡萄糖。它具有耐高温的特性, 这一特性可以解决传统酶制剂在食品、化工、制药和环保等方面应用的一些限制问题[1]。它为低聚麦芽寡糖、麦芽糖的生产提供了一种更新、更直接、更简便的方法。将对环葡聚糖水解酶生产麦芽糖等方面研究进行简述, 为其今后在制糖业中的应用提供参考依据。
1 材料与仪器
1.1 材料
环葡聚糖水解酶 (本实验室提供) 、可溶性淀粉、环糊精等。
1.2 主要仪器
HX-201恒温循环水槽、高效液相色谱、101-1电热恒温鼓风干燥箱等。
2 实验方法
2.1 生产高麦芽糖浆的工艺流程[2,3,4,5]
原料→调p H为5.5, 温度为90℃→加酶→水解产物→超滤膜→滤液→过树脂柱→交换液→真空浓缩→成品 (高麦芽糖浆)
2.2 酶活力定义
以1 m L酶液在90℃, p H 5.5条件下降解底物, 每分钟产生1μmol的麦芽糖为一个酶活力单位 (U) 。
2.3 葡萄糖、麦芽糖含量的测定[6]
2.4 麦芽糖的定性测定[7]
3 结果与分析
3.1 γ-环糊精生产高麦芽糖浆酶用量对产量的影响
将γ-CD用p H 5.5的醋酸钠缓冲液配制成浓度为1%的溶液, 放置于90℃下保温5min, 添加环葡聚糖水解酶, 用量分别为2、4、6、8 U/mg (γ-环糊精) , 反应10 h, 测定麦芽糖、葡萄糖含量, 结果麦芽糖的含量分别为58.75%, 67.44%, 71.03%, 71.23%;葡萄糖含量分别为0.47%, 0.52%, 0.53%, 0.78%。为了达到酶用量最少、麦芽糖含量较高、葡萄糖含量较低的目的, 选择6 U/mg (γ-环糊精) 作为环葡聚糖水解酶的添加量, 进行高麦芽糖浆的生产。
3.2 γ-CD生产高麦芽糖浆反应时间对产量的影响
取环葡聚糖水解酶用量6 U/mg (γ-环糊精) , 并分别在0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h和10 h, 取样, 测定麦芽糖含量, 结果分别为34.32%, 43.76%, 57.94%, 69.98%, 70.15%, 70.43%, 71.08%。当反应3 h时, 麦芽糖含量已达到69.98%, 已达到高麦芽糖浆的要求。因此, 我们在用环糊精生产高麦芽糖时, 选择3 h作为反应时间。
3.3 淀粉生产高麦芽糖浆酶用量对产量的影响
将可溶性淀粉用p H 5.5的醋酸钠缓冲液配制成浓度为5%的溶液, 放置于90℃下保温5min, 添加环葡聚糖水解酶, 用量分别为10、20、30、40、50、60 U/mg淀粉, 反应20 h, 测得麦芽糖含量。结果麦芽糖含量分别为53.57%, 56.53%, 62.44%, 70.03%, 71.21%, 71.89%;葡萄糖含量分别为0.47%, 0.56%, 0.63%, 0.65%, 0.85%, 0.97%。为了使麦芽糖含量尽量地多生成, 而葡萄糖尽量地少生成, 选择80 U/mg淀粉作为环葡聚糖水解酶的添加量, 进行高麦芽糖浆的生产。
3.4 淀粉生产高麦芽糖浆反应时间对产量的影响
取环葡聚糖水解酶用量80 U/mg淀粉, 并分别在1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14h、16 h、18 h和20 h取样, 测定麦芽糖含量, 结果分别为23.48%, 33.84%, 47.27%, 58.70%, 62.35%, 66.10%, 71.19%, 71.22%, 71.28%, 71.40%, 71.47%, 71.60%。按照反应时间短, 麦芽糖产率高的原则, 因此, 我们在用淀粉生产高麦芽糖时选择10 h作为反应时间。
3.5 环葡聚糖水解酶在其他方面的应用
以1%环糊精为原料, 在p H 5.5, 90℃条件下, 保温5 min, 添加用50m M p H7.5 Tris-HCl适当稀释的环葡聚糖水解酶液, 反应10 min、20 min和30 min, 反应液经硅胶板薄层色谱法进行定性测定。结果表明, 水解α-CD的反应液反应显色结果为只生成G6, 同时还有少量α-CD存在;水解β-CD的反应液反应显色结果为仅生成G7, 同时还有少量β-CD存在;水解γ-CD的反应液反应显色结果为仅生成G8, 同时还有少量γ-CD存在;因此, 我们可以利用环葡聚糖水解酶的这一反应特性来生产高纯度的G6、G7和G8。如延长反应时间, 显色结果表明, 还可以生成G1-G8, 利用这一特性, 我们还可以用它来生产低聚麦芽糖或G3等产品。利用它可以降解环糊精为麦芽寡糖这一特性, 我们可以将其加入到食品的面包的原料中, 来改善面包的品质, 延长面包的货架期等。在医药业中, 我们可以利用它降解淀粉或环糊精来生产高麦芽浆, 经分离纯化, 制得超高麦芽糖或无水结晶麦芽糖, 为医用麦芽糖注射剂产品的生产提供原料。
4 结论
以淀粉和环糊精为原料生产高麦芽糖浆, 最终确定其合理工艺参数, 达到了高麦芽糖生产要求。与以往生产高麦芽糖浆不同之处在于, 减少了液化过程, 整个过程只用到一种酶, 只需在加酶前调整一次p H值, 操作更加方便, 而且在较短的时间内即可得到麦芽糖含量很高的产品, 提高了生产效率。随着我们对环葡聚糖水解酶的特性的不断地认识和深入地研究, 它必将为食品、医药、制糖等行业的发展作出更大的贡献。
摘要：以环糊精和淀粉为原料, 采用环葡聚糖水解酶为酶制剂, 进行了高麦芽糖生产的研究。考察了环葡聚糖水解酶加入量及反应时间对高麦芽糖生成的影响。结果表明:在pH5.5, 90℃下, 以1%γ-环糊精为原料, 环葡聚糖水解酶加入量为6U/mg (γ-环糊精) , 反应时间为3h;以5%淀粉为原料, 环葡聚糖水解酶加入量为80U/mg淀粉, 反应时间为10h, 麦芽糖的产量均达到高麦芽糖生产要求。
关键词：环葡聚糖水解酶,环糊精,高麦芽糖浆
参考文献
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戊聚糖酶 篇2
一株具木聚糖酶活链霉菌的鉴定及其木聚糖降解酶系分析
分离得到一株具木聚糖酶活性的放线菌菌株pp2,该菌株具有典型链霉菌属的形态学特征.通过对其进行形态学、生理生化特性以及16S rRNA基因序列等方面的分类学研究,菌株pp2初步鉴定为链霉菌属的`一个潜在新种.通过对菌株pp2的酶系研究发现该菌株胞外发酵液具木聚糖酶活性,细胞破碎液中具α-L-阿拉伯糖苷酶活性和β-D-木糖苷酶活性.其中木聚糖酶酶活力为30.3U/mg,酶反应最适温度为65℃,最适pH为5.4;37℃下稳定性很好,60℃下酶活性衰减很快.α-L-阿拉伯糖苷酶酶活力为1.81 U/mg,酶反应最适温度为55℃,最适pH为6.0,55℃下稳定性能很好.β-D-木糖苷酶酶活力为0.04 U/mg.
作 者：彭汀汀 董宏平彭惠 裴建军 邵蔚蓝 Peng Tingting Dong Hongping Peng Hui Pei Jianjun Shao Weilan 作者单位：南京师范大学生命科学学院,江苏,南京,210097 刊 名：南京师大学报（自然科学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2006 29(4) 分类号：Q939.1 关键词：链霉菌 16S rRNA基因 木聚糖降解酶系桦剥管菌产木聚糖酶酶学性质研究 篇3
【摘要】本文测定了桦剥管菌（Piptoporus betulinus）在白桦木屑培养基中产木聚糖酶粗酶的部分酶学性质，测定结果为木聚糖酶最适反应温度为50℃，最适反pH值应为5.0。
【关鍵词】桦剥管菌；木聚糖酶；酶学性质
本文研究了桦剥管菌分泌木聚糖酶的部分酶学性质，希望能为木材腐朽菌降解半纤维素的机制研究提供有用数据。
1.材料与方法
1.1材料
桦剥管菌（P. betulinus），为非褶菌目多孔菌科剥管菌属。
1.2主要试剂
榉木聚糖、D-木糖、3，5-二硝基水杨酸（DNS）。
1.3实验方法
（1）D-甘露糖标准曲线的绘制。pH 5.0 的NaAC-HAC缓冲液中，用紫外分光光度计在波长540nm处，测D-木糖含量，绘制标准曲线如图1所示。
（2）粗酶液酶活测量方法。在无菌操作条件下，将木屑培养基中桦剥管菌菌丝接种到PDA培养基平板上，培养7-10d；在培养基上钻取2个相同大小菌饼，产酶固体培养基中，23℃培养数天，测定酶活前取出菌饼；向培养中加入5倍质量的蒸馏水，浸泡12h后过滤，滤液于4000 rpm离心10 min，上清液用于木聚糖酶酶活性测定。配制的6.67‰榉木聚糖溶液为底物，pH 5.0 的NaAC-HAC缓冲液中，以DNS为显色剂，用1cm比色皿在分光光度计540nn 处测木聚糖酶降解前后吸光度变化。用已绘制D-木糖标准曲线，计算反应液中粗酶液木聚糖酶的活力。（3）酶学性质测定。在pH 3.0-9.0不同缓冲液条件下，测定木聚糖酶反应最适pH。在4℃条件下，将粗酶液分别于pH 3.0-9.0不同缓冲液中放置1h和24h，测定木聚糖酶酶活，探究pH对酶活稳定性的影响。最适pH条件下，分别测定30℃-90℃不同反应温度时酶活，确定酶反应最适温度。将粗酶液在30℃-90℃不同温度下分别保温1h和24h，在最适pH条件下测定酶活，探究温度对酶活稳定性的影响。
2.结果与分析
2.1酶反应最适pH及pH稳定性
用产酶固体培养基，在人工气候箱中23℃培养桦剥管菌，取第18d菌样，以6.77‰榉木聚糖为底物，检测酶反应最适pH及pH稳定性，结果如图2，pH 4.5-6.0之间酶活力较高，相对酶活大于75%，其最适pH为5.0。在4℃条件下不同pH值缓冲液中，将粗酶液放置1h和24h后测定木聚糖酶残存酶活力，结果如图3，酶pH稳定范围在5.0-6.5之间；粗酶液在此pH范围内放置1h，相对酶活均能保持在80%以上；放置24h后相对酶活均能保持在60%以上，结果说明桦剥管菌木聚糖酶pH稳定性较好。
2.2酶反应最适温度及热稳定性
不同温度下酶活结果如图4所示，50℃时达到最大值酶活。当温度继续升高酶活逐渐下降，在45～65℃之间，桦剥管菌木聚糖酶酶相对较高，温度升到80℃时相对酶活降至20%。不同温浴中放置1h和24h，酶活变化结果如图5。在低于50℃的水浴保温1h后，60℃时残存酶活仍在90%，在低于60℃的水浴保温24h后，测得酶相对活性不低于60%，桦剥管菌木聚糖酶热稳定性较好。
3.结论
以6.77‰榉木聚糖为底物，桦剥管菌（P. betulinus）产其木聚糖酶最适pH为5.0，pH稳定范围在pH 5.0-6.5。木聚糖酶反应最适温度50℃，耐受温度低于60℃，热稳定性较好，适宜在常温条件下贮存。
参考文献
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产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化 篇4
壳聚糖酶具有多种应用价值,如在农业上可作为生物防治剂以及在生物技术中可用于原生质分离、细胞化学定位和生产单细胞蛋白等。但用其对壳聚糖进行酶解,生产具有独特的生理活性和功能性质的壳寡糖则是当前研究的热点[3,4]。
作者首次对该属种产壳聚糖酶的发酵条件进行优化,微生物产酶是一个复杂的生理生化过程,不同的培养条件直接影响菌体的代谢,从而影响酶的产量,因此对发酵产酶条件进行优化是提高酶产量的有效手段。在实验室通过简便、高效的筛选方法,从自然界环境中分离筛选到一株产壳聚糖酶活性较高的微生物菌株,确定该菌株产酶的最佳培养条件,以其为壳聚糖的研究和应用提供新的并且活性较高的壳聚糖酶来源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
作者实验室保存菌种C001。
1.1.2 试剂
①壳聚糖,上海如吉生物科技发展有限公司(脱乙酰度90%)。
不同脱乙酰度壳聚糖为实验室自制。
②胶体壳聚糖:
取壳聚糖3g,溶解于0.2mol/L的HCl 200ml中,溶液放在韦林搅拌器中搅拌,开始用1mol/L NaOH,最后用0.1mol/L NaOH,溶液被中和到碱性,pH 9.0。得到的沉淀在1 000r/min下离心20min,并用水重复洗涤,直到上清液的pH 呈中性。洗涤后的沉淀悬浮于蒸馏水中,且悬浮液的pH 调整到6.2,最后的浓度为1.0 (w/w)。
③DNS试剂:
91g酒石酸钾钠加入500ml热水中,搅拌溶解后依次加入3,5—二硝基水杨酸(DNS)31.5g和20g NaOH,然后加入结晶酚2.5g和无水亚硫酸钠2.5g,搅拌溶解,冷却后用蒸馏水定容到1 000ml,贮存在棕色瓶中放置1w后使用。
1.1.3 仪器
HZQ一F全温振荡培养箱,哈尔滨东联电子技术开发有限公司;隔水式恒温培养箱、紫外分光光度计、pH测试仪,上海精密科学仪器有限公司;电热恒温水浴锅,浙江余姚市检测仪器厂;电子天平,上海第二天平仪器厂;超净工作台,苏净集团安泰公司。
1.1.4 培养基
①液体种子培养基(g/l):
蛋白胨5,酵母提取物5,K2HPO4 0.7,KH2PO4 0.3,NaCl 5,MgSO4·7H2O 0.5,葡萄糖3,调节pH 5.5~6.5。
②斜面种子培养基(g/l):
(NH4)2SO4 5,K2HPO4·3H2O 2,NaCl 5,MgSO4·7H2O 1,胶体壳聚糖10,琼脂20,酵母粉1,调节pH 5.5~6.5;壳聚糖单独灭菌(115℃,10min)。
③发酵培养基(复筛培养基)(g/l):
粉末壳聚糖10,硝酸铵20,酵母提取物3, K2HPO4·3H2O 1.4,NaCl 5,MgSO4·7H2O 1.4,葡萄糖1.0,调节pH5.5。
④液体种子和发酵培养:
500 ml三角瓶中分别装100ml种子培养基和发酵培养基,将试管斜面菌体接入种子培养基后在140r/min、30℃摇床中培养18h,按5%的接种量(菌体浓度为5~6×107cell/ml种子培养基)将液体种子接入发酵培养基中,在140r/min、30℃的摇床中发酵96h。
1.2 方法
1.2.1 壳聚糖酶活力测定
参考Imoto等(1971)方法并作适当的修改。在酶活力测定实验中,如不加特别说明,都是以90%DDA的壳聚糖为底物,分别取0.1ml酶液于25ml的比色管中,加入0.9ml 1%的壳聚糖溶液和1ml 0.2mol/L pH 5.8的HAc-NaAc缓冲液,50℃保温15min后,立即加入1.5ml DNS终止酶反应,沸水浴中反应min,取出冷却至室温,定容至25ml,混合均匀取5ml于5 000r/min下离心10min去除沉淀,对照管以相同条件下加灭活的酶液在520nm处测定光吸收值OD,根据氨基葡萄糖标准曲线,求得还原糖量。一个酶活力单位(U)定义为50℃下每min催化生成相当于1μmol氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量(Cruz,et al.,2004)。
1.2.2 菌体的生长曲线的测定
从新鲜斜面种子挑取1环菌体接入液体种子培养基中,30℃、140r/min摇床培养,每隔4h去培养液测定650nm处OD值,24h后每隔8h测1次,绘制菌株C001生长曲线。
1.2.3 不同碳源对产酶影响
在发酵培养基中分别以胶体壳聚糖、粉末壳聚糖、羧甲基壳聚糖、几丁质、胶体几丁质、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、营养肉汤作为碳源,试验不同碳源对产酶的影响。
1.2.4 不同氮源对产酶影响
在发酵培养基其余组分不变的情况下,分别以1.0% NaNO3、1.0% NH4NO3、1%蛋白胨、1%牛肉膏、1.0% KNO3、1.0 %(NH4)2SO4 、1.0%尿素作为氮源,试验不同氮源对产酶的影响。
1.2.5 发酵时间对产酶影响
将活化好的菌液以5%接种量接入装有100mL摇瓶发酵培养基的摇瓶(500mL)中,分别以3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h和27h为发酵时间,研究不同发酵时间对发酵产壳聚糖酶的影响,在pH5.5、30℃、140r/min条件下发酵,发酵结束后测发酵上清酶液的酶活力。
1.2.6 培养温度对产酶影响[7]
在对发酵培养基进行优化的基础上,分别选择24℃、27℃、30℃、33℃、36℃为C001菌株的培养温度,研究不同培养温度对发酵产壳聚糖酶的影响,在pH5.5接种量5%、140r/min的条件下发酵18h,发酵结束后测发酵上清液的酶活力。
1.2.7 培养基起始pH值对产酶影响
在对发酵培养基进行优化的基础上,将培养基起始pH值分别调至3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0,按上述方法进行培养,发酵结束后测发酵上清液的酶活力,试验不同pH值对菌株产酶的影响。
1.2.8 不同接种量对产酶影响
在对发酵培养基进行优化的基础上,分别以1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%为不同接种量,研究不同接种量对发酵产壳聚糖酶的影响,在pH5.5、30℃、140r/min条件下发酵18h, 发酵结束后测发酵上清液的酶活力。
2 结果与分析
2.1 菌体的生长曲线
从图1可见,菌株在第8h时开始迅速生长,菌体密度以对数形式增加,到第30h左右进入稳定期,之后菌体密度不再随培养时间的延长而明显增加。因此,选择18h作为菌株种子液的培养时间。
2.2 不同碳源对产酶的影响
结果如表1所示:胶体壳聚糖最适合菌体产酶,粉末状壳聚糖其次,胶体几丁质中会产生少量的壳聚糖酶,因此可以认为C001壳聚糖酶是一种诱导酶。考虑到胶体壳聚糖和粉末壳聚糖对壳聚糖酶活力的差别影响不是很大,兼顾制作胶体壳聚糖的成本及各批次的重复性差,而且胶体壳聚糖在灭菌的过程中更易发生焦糖化,因此考虑用粉末壳聚糖作为碳源。
2.3 不同氮源对产酶的影响
由表2可见,不同氮源对产酶的影响在不同菌种间有较大的差异性。而在本实验中发现无机氮源比有机氮源更有利于产酶,在本实验采用的几种无机氮源中,又以NH4NO3最有利于产酶,所以选取1%的NH4NO3作为氮源时,酶活力最高,同时可以发现该菌株对尿素的利用率高于一般的有机氮源。
2.4 发酵时间对产酶的影响
由图2可知,菌株C001在发酵时间达到18h时,酶活力达到最大。酶活力的增减趋势与生长曲线基本一致,酶活力的最大值和生长曲线的最高峰同时出现。
2.5 培养温度对产酶的影响[7]
由图3可知,在30℃以下时,酶活力随温度升高而上升,有利于产壳聚糖酶,当超过30℃时,酶活力下降,当达到36℃以上时C001产酶量很少,到40℃时在整个发酵过程中几乎测不出壳聚糖酶的存在,因此选定产酶最适培养温度为30℃。
2.6 培养基起始pH值对产酶的影响
由图4可知,当培养基pH为5.5时,酶活力最大,随着pH升高,酶活力迅速下降,当pH为6.5以上时,下降趋势有所平缓,而当pH在4.0以下时,发酵液中几乎检测不到酶活力。
2.7 不同接种量对产酶的影响
接种量对发酵生产起着关键作用[8]。由图5可以看出,当接种量在5%以上时,发酵液酶活力最高,从节省接种量和产酶综合考虑,最适接种量为5%。
3 讨论
微生物产生的壳聚糖酶有组成型和诱导型之分,其中多数为诱导型(Rivas LA, et al. 2000;Shimosaka M, et al. 2000)[9,10]。本研究中通过不同诱导物对菌株C001产生壳聚糖酶能力的实验表明该菌株产生的壳聚糖酶也是典型的诱导酶,只有以壳聚糖或其结构类似物作为碳源时才能诱导产酶,单以葡萄糖或半乳糖、甘露糖等作为碳源,菌株虽能生长良好却不能产酶,这与国内外的报道基本一致。虽然胶体壳聚糖作为碳源时产酶效果最好,但考虑到胶体壳聚糖的制作成本,故选用粉末壳聚糖作为碳源。
氮源对产酶的影响在不同菌种间有较大的差异性。如葛正红和曾嘉(2002)报道青霉菌(Penicillium sp.)的最适产酶培养基中添加氮源为尿素与蛋白胨;方祥年等报道(2002)球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的最适产酶培养基中添加氮源为蛋白胨;李风平等(2003)报道腐皮镰孢菌(Fusarium solani)的最适产酶培养基中的氮源为蛋白胨与干酪素;王平平等(2004)报道假单胞菌(Pseudomonas sp.)在培养基中添加NH4NO3最有利于产酶。 而在本实验中发现无机氮源比有机氮源更有利于产酶,在本实验采用的几种无机氮源中,又以NH4NO3最有利于产酶,所以选取1%的NH4NO3作为氮源。
由于条件限制,在对菌株C001进行产酶条件的优化时,采用了较传统的单因子实验法,该方法虽然不能反映各种产酶因素的协同作用,但结果易于分析。最终确定菌株C001产壳聚糖酶的最佳发酵工艺条件为:培养温度30℃,培养基起始pH5.5,发酵时间18h,接种量为5%,发酵产酶培养条件进行优化后效果十分显著,发酵液酶活力由3.50提高到4.81,较优化前增长了37.4%。在酶法降解壳聚糖制备壳寡糖的研究,以及壳寡糖的规模化生产中有很高的应用前景,具有较大的工业生产潜力。
参考文献
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[8]陈小娥,夏文水,余晓斌.壳聚糖酶高产菌株选育及发酵条件研究[J].食品与发酵工业,2004,30(3):66-69.
[9]郝日光.产壳聚糖酶菌株的选育、发酵条件优化和酶学性质的研究[D].青岛:中国海洋大学硕士学位论文,2005.
戊聚糖酶 篇5
Pichia pastoris (P. pastoris) 营养要求不高;具有真核生物翻译后蛋白质的加工和修饰等功能;分泌很少自身的蛋白, 有利于重组蛋白的分离纯化[3]等特点, 尤其是P. pastoris具有受甲醇紧密调控的强启动子pAOX1[4]。近年来有研究用P. pastoris表达纤维素酶的报道, 但是仍然停留在摇瓶发酵表达的小量试验[5], 由于目前市场上对于纤维素酶的需求量甚大, 研究重组纤维素酶的生产是一项紧迫的任务。高密度发酵是微生物基因工程领域的一项新的技术, 是大规模生产重组蛋白的策略[6], 本文首先研究在生物反应器中高密度发酵P. pastoris表达重组CBHⅡ酶。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒
大肠杆菌DH5α为本室保存;毕赤酵母GS115及质粒pPIC9K质粒由中山大学罗进贤教授实验室提供;pMD18-T-cbhⅡ质粒由本实验室构建和保存, 其中的cbhⅡ基因克隆于里氏木霉QM9414 (菌株购自中科院微生物研究所) 。
1.1.2 酶和主要试剂
各种限制酶、修饰酶购自fermentas及Promega公司, G418为Sigma公司产品, PCR引物合成和DNA序列测定委托北京六合华大基因科技股份科技有限公司进行。
1.1.3 培养基
大肠杆菌培养用LB培养基, 酵母培养和筛选用的YP培养基配方见Invitrogen公司提供的操作手册。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取、酶切、连接和E.coli转化:
参照文献[7]方法。
1.2.2 酵母质粒的转化和重组子的筛选
酵母质粒的转化和阳性转化子的筛选 (PCR法) 按Invitrogen公司提供的操作手册进行[8]。高拷贝转化子的筛选参考Scorer的方法[9], 将电转法转化物涂布于含700μg/mL G418的YPD培养基上, 于30℃培养2～3d, 挑选高表达重组子作为工程菌。
1.2.3 发酵工程菌表达CBHⅡ
摇瓶发酵P. pastoris GS 115 (pPPIC9K-cbhⅡ) 表达外源基因按照Invitrogen公司的实验手册进行[8]。
生物反应器中发酵:将GS115 (pPIC9K-cbhⅡ) 接种于YPD培养基, 摇床培养至A600=1.5时取8mL接种于800 mL YPD培养基, 分装于8个500mL三角瓶分中, 每瓶100mL, 30℃、250r/min摇床培养至A600=10时, 将其转入50L容量己经装了20L发酵液的生物反应器中。发酵参数设设计:搅拌100～750r/min , 通气10～70L/min, 维持溶氧25%～30%, 30℃, 用NH4OH维持pH 5.0[10]。
1.2.4 纤维素酶酶活性分析
纤维素酶活性分析按照文献[11]方法进行。
2 结果与分析
2.1 构建含cbhⅡ基因的P. pastoris表达载体
应用PCR方法从pMD18-T-cbhⅡ中扩增cbhⅡ基因。通过PCR技术使基因序列的5’和3’末端分别含EcoRⅠ和NotⅠ位点。经过序列分析后, 应用EcoRⅠ和NotⅠ同时酶切PCR扩增的cbhⅡ基因序列和pPIC9K表达载体, 然后通过T4连接酶的作用, 将cbhⅡ基因重组于P. pastoris的多克隆位点构建含cbhⅡ基因的P.pastoris表达载体pPIC9K-cbhⅡ (图1) 。
2.2 含cbhⅡ基因的P. pastoris工程菌的构建
用电激法将重组质粒pPIC9K-cbhⅡ 转化GS115, 转化细胞直接涂布于G418抗性 (700μg/ml) 平板, 筛选高抗性重组子, 先用PCR检测证实这些菌落均含有cbhⅡ基因 (图2) , 进一步用摇瓶表达法筛选高表达的克隆作为工程菌。
M. protein marker;1. GS115 (pPIC9K-cbhⅡ) ;2.GS115 (pPIC9K) .
2.3 高密度发酵P. pastoris表达cbhⅡ基因
应用连续补料的方式进行, 按照1.2.3的方法进行发酵GS115 (pPIC9K-cbhⅡ) 表达CBHⅡ蛋白。经过甲醇诱导64h。由于连续的补料, 其发酵罐中的溶液量从20L增加至29.5L, 放罐时生物量为A600=180, 重组CBHⅡ表达量为80mg/L (图3, 4) 。从图4可见, 与不含目标基因的GS115对照菌株的分泌表达产物对比, 工程菌的表达产物出现一条符合目标大小约为51 kD的新的蛋白带, 并且, 随着诱导时间的增加, 其表达量呈递增之趋势。
2.4 重组CBHⅡ酶纯化及其酶活性分析
取经透析后的发酵液50μl 加于含羧甲基纤维素平板的牛津杯中, 40℃培养18h, 用刚果红显色30min后, 用1mol/L NaCl脱色。结果见图5, 负对照没有出现透明圈, 而实验组则出现直径约为2.6 cm的透明圈。
3 讨论
自20世纪70年代末, 由于分子生物学的快速发展, 纤维素酶基因的克隆也就随之成为研究的热点[12]。几乎所有已克隆的纤维素酶基因都已在大肠杆菌中得到表达, 但是这一体系表达率低, 产生的酶多数不能分泌到胞外。近些年来, 人们研究用酵母, 尤其是P. pastoris 表达重组纤维素酶, 证明纤维素酶能够在P. pastoris中表达[5]。在前人研究的基础上, 本项目研究用P. pastoris规模化生产重组CBHⅡ酶。本研究应用PCR方法从理氏木霉基因组中扩增cbhⅡ基因, 构建了整合型表达载体, 转化P. pastoris后整合至宿主染色体, 用G418筛选出高拷贝整合的转化子作为工程菌。应用Invitrogen公司推荐的无机盐培养基作为基础培养基在生物反应器中进行发酵。为了更好地探索发酵的较为完整的过程, 诱导表达的时间设计的较长, 但从目标蛋白的分泌表达曲线可见, 诱导48h后目标蛋白的增加量甚少, 所以, 诱导48h应该是理想的放罐时间。在发酵过程中采用了连续补料的策略和溶氧控制等策略[10], 使生物量达到高的密度并有效地分泌重组CBHⅡ酶, 并且, 其重组CBHⅡ具有较好的分解羟甲基纤维素的活性。
M:protein marker;0:GS115 (pPIC9K) ; 1-8:GS115 (pPIC9K- cbhⅡ) 8h, 16h, 24h, 32h, 40h, 48h, 56h, 64h.
1. GS115 (pPIC9K) ;2. GS115 (pPIC9K-cbhⅡ) .
本研究为用P. pastoris的pAOX1表达系统规模化生产重组CBHⅡ酶打下基础。
参考文献
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戊聚糖酶 篇6
玉米是我国第二大粮食作物,在可利用水资源不断匾乏的情况下,研究其耐旱性的重要性显得更加突出。近年来,有关玉米的生长、抗旱改良方式的研究取得了一些成果。如吕山花、王延峰等研究表明,适当浓度的壳聚糖包衣和浸种可促进玉米种子及幼苗的生长,有助于提高玉米的抗逆性能[7,8]。同时,近年来发现干旱胁迫下壳聚糖可增强小麦、蝴蝶兰等幼苗保护酶的活性[9]。本试验选择壳聚糖作为处理剂,探讨在干旱胁迫下不同浓度的壳聚糖溶液对玉米幼苗保护酶活性的影响,为壳聚糖溶液处理玉米幼苗抵抗干旱胁迫提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
玉米品种:供试玉米品种为“鲁丰”德农利988(纯度≥96%,净度≥99%,发芽率≥85%,水分≥13%),购自威海种子站。
供试土壤:供试土壤为细沙与园林土3∶1的混合物,细沙采自山东威海国际海水浴场,园林土采自山东大学(威海)校园。细沙取回后经混匀、冲洗、风干、过滤四步后,与园林土混匀配制成pH 7.0±0.2的供试土壤待用。
1.2 试验设计
盆栽试验时取粒大饱满、生长程度相似的种子375粒,然后随机分成25组,每组15粒,即每盆15粒,种在装有800g供试土壤的25个聚乙烯塑料盆内(盆高25cm、直径30cm),置于25℃、光照强度为4000LX的光照培养箱中培养,每天光照12h,植株每日定时浇透水,水份维持在田间持水量23%。待玉米长至三叶期时开始进行干旱处理,此时植株停止浇水。自玉米播种后的第12天开始自然干旱,每两天定时喷一次不同浓度的壳聚糖溶液。即每隔两天处理1次,共处理4次。试验分为A、B、C、D、E 5组,每组各5盆:B、C、D、E组为试验组,每次分别喷洒0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的壳聚糖溶液20mL;A组为对照组,喷洒等量的蒸馏水。喷洒过程中将花盆摆成正六边形,保证每盆玉米均匀受喷,喷施至叶面布满水珠而不滴水为宜。
1.3 测试项目与方法
保护酶活性测定:自玉米播种后的第14天开始,每隔两天测定相应酶活。采用氮蓝四唑法[10]测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用愈创木酚显色法[10]测定过氧化物酶(POD)活性,采用可见分光光度法[11]测定过氧化氢酶(CAT)活性。
数据处理:试验数据使用SPSS 17.0整理与统计分析。
2 结果与分析
2.1 壳聚糖对玉米幼苗保护酶CAT活性的影响
CAT作为生物体内的重要物质,具有非常重要的生理功能,其中最主要的就是参与活性氧代谢过程。CAT是植物机体在逆境中的保护性酶类蛋白之一,其活性与植物代谢活性、抗旱及抗病能力有一定关系,它可将H2O2分解成H2O和O2,从而减小活性氧对有机体的毒害,因此测定CAT活性可以反映出植物体内的代谢及对逆境的响应情况。从图1可见,使用不同浓度的壳聚糖溶液喷洒玉米幼苗,随着干旱时间的延长,总体上CAT活性先上升后下降,且波动平缓。从壳聚糖的喷洒效果来看,各浓度下CAT活性较对照组变化不明显,但在第20天时0.1%和0.2%浓度处理组的效果与对照组差异较显著(P<0.05)。
2.2 壳聚糖对玉米幼苗保护酶SOD活性的影响
SOD是抵御活性氧自由基介导的氧化损伤的第一道防线,可通过Haber-weiss反应清除植物体内多余的超氧根阴离子。SOD是保护酶体系中的关键酶之一[12],在植物细胞逆境胁迫防御机制中起到非常重要的作用。从图2可知,随着干旱程度的加强,SOD活性总体呈下降趋势,与张伟伟[13]等在玉米上、朱启忠等[9]在小麦上得到的结果相似。与对照组相比,0.2%和0.3%浓度的壳聚糖溶液处理玉米幼苗SOD活性较大。综合4次测定的结果可见,0.2%浓度下的处理效果最佳,SOD活性比对照组高58%,差异非常显著(P<0.05)。
2.3 壳聚糖对玉米幼苗保护酶POD活性的影响
POD是植物体内普遍存在的活力较高的一种酶,在植物生长发育过程中,其活力不断发生变化。它对逆境的反应较灵敏,是细胞内重要的内源性活性氧的清除剂,因此可作为植物体内抗性指标之一。不同浓度的壳聚糖溶液处理玉米幼苗后,测得的POD酶活力随时间的变化趋势结果见图3。从图3可见,随着干旱时间的延长,POD活性总体呈升高趋势。0.1%和0.4%浓度处理玉米幼苗的POD活性与对照组相比差异性极显著(P<0.05)。综合4次的测定结果可见,0.4%浓度下的处理效果最佳。
3 讨论
在正常生长条件下,活性氧的形成和清除保持一种动态平衡;在干旱胁迫下,植物体内活性氧会积累过多,从而造成活性氧代谢平衡被破坏,导致膜脂氧化,破坏这种平衡。CAT、POD、SOD等共同组成了生物体内活性氧防御系统,在清除超氧自由基、H2O2和过氧化物以及阻止或减少羟基自由基形成等方面发挥着重要的作用,其中SOD和CAT作用大于POD[14]。
本试验研究结果显示,随着干旱程度的增加,POD活性总体呈升高趋势,CAT活性先上升后下降,而SOD活性总体呈下降趋势,三者作用效果不同;壳聚糖处理的玉米幼苗的保护酶活性较对照组均有一定程度的提高,其中0.2%浓度下SOD活性最高。综合以上试验结果表明,喷洒一定浓度的壳聚糖溶液对玉米幼苗的保护酶活性具有增强作用,对今后玉米抗旱改良方式的研究有一定的借鉴意义。
摘要：干旱条件下,采用喷洒不同浓度的壳聚糖溶液处理玉米幼苗,测定其过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)保护酶活性。结果表明,壳聚糖溶液处理的玉米幼苗保护酶活性较对照组均有一定程度提高,说明干旱胁迫下壳聚糖溶液处理玉米幼苗有利于其生长,为壳聚糖溶液处理玉米幼苗抵抗干旱胁迫的影响提供了理论依据。
戊聚糖酶 篇7
广义上的木聚糖酶是指可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一组酶的总称,主要包括内切β-D-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶;狭义上的木聚糖酶是指β-1,4-内切木聚糖酶(E.C3.2.1.8)[2]。内切木聚糖酶随机水解木聚糖的β-D-1,4-木糖苷键(β-D-1,4-xylosidic linkages)[3]。据统计,世界上工业常用16种酶制剂所占市场份额排名中,木聚糖酶排在第7位[4]。木聚糖酶在食品、饲料、造纸等众多行业有着广阔的应用前景[5]。近年来,低聚木糖作为一种功能性食品而倍受瞩目,它以富含木聚糖的植物(如玉米芯、蔗渣、棉籽糖等)为原料,通过木聚糖酶水解,分离精制而得的一类非消化性低聚糖[6]。在动物饲料中加入木聚糖酶,可以起到降解其中半纤维素的作用,从而提高饲料利用率[7]。环境污染最大的来源之一是造纸工业中的废水排放,木聚糖酶作为一种生物漂白剂可以减少20%～40%的含氯化学漂白剂用量[8],大大减轻对环境的压力。
本研究报道了一株高产木聚糖酶短小芽胞杆菌HJ-04,在最佳发酵条件及最佳反应条件下,其酶活力高达942.4IU/mL,和已报道诸多细菌木聚糖酶活力相比,处于领先水平。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
土壤样品:采自长白山天池附近、武汉磨山景区及沈阳农业大学后山果园等10处土样;玉米芯、麸皮及甘蔗渣:采自农大农场及购自市郊。
1.1.2 试剂
桦木木聚糖,Sigma公司;DNA Marker DL2000,大连宝生物公司;化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器
PCR仪,TECHNE公司;凝胶成像系统,伯乐公司;HZQ-X100振荡培养箱,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
1.1.4 培养基
①富集培养基(%):
蔗渣木聚糖1.0,蛋白胨0.5,NaCl 0.5,pH 7.5。
②筛选培养基(%)A:
蔗渣木聚糖3.0,KNO3 0.1,MgSO4·7H2O 0.05,NaCl 0.5,K2HPO4 0.05,琼脂2,pH 7.5～8。
③筛选培养基(%)B:
商品木聚糖2.0,KNO3 0.1,MgSO4·7H2O 0.05,NaCl 0.5,K2HPO4 0.05,琼脂2,pH 7.5～8。
④种子培养基(%):
牛肉膏0.5,蛋白胨1,NaCl 0.5,pH 7.2～7.4。
⑤产酶培养基(%):
麸皮4,酵母膏0.5,蛋白胨1,KH2PO4 0.5,MgSO4·7H2O 0.1,自然pH。
1.2 方法
1.2.1 蔗渣木聚糖的提取:
按常规碱提法进行[9]。
1.2.2 木聚糖酶活力的测定
发酵液6 000r/min离心10min。在20mL的具塞刻度试管中加入2.3mL pH为6.5的PBS缓冲液及0.6mL浓度为1%的木聚糖溶液,并于50℃水浴中预热5分钟,再加入0.1mL经适当稀释后的酶液(使OD540nm值小于1),在50℃下反应10min,立即加入2mL DNS溶液终止反应,在沸水浴中煮沸10min,迅速冷却加入15mL蒸馏水,在540nm处测OD值,对照管的酶液先煮沸5min灭活,其余组分一样。以木糖作标准曲线,将1min水解生成1μmol还原糖(以木糖计)的酶量定义为一个酶活力单位(IU/mL)。
1.2.3 菌种的初筛
取10种土壤样品各1g放入装有玻璃珠及100mL无菌水的三角瓶中150r/min,30℃条件下振荡30min,吸取1mL土样溶液于富集培养基中,150r/min、30℃振荡培养48h。将富集培养液梯度稀释至10-8,吸0.2mL于筛选培养基A上涂平板。于30℃培养箱中倒置培养48h观察菌落生长情况。
1.2.4 复筛
将在筛选培养基A上产透明圈的菌株挑至筛选培养基B上,将仍能产透明圈的菌株进行发酵产酶实验。取10h种子培养液,按0.5%接种。
1.2.5 菌种鉴定
按参考文献[10,11]进行细菌形态学观察、革兰氏染色、芽胞染色及生理生化鉴定。16SrDNA分子水平鉴定送由Takara公司完成。
1.2.6 发酵条件的优化研究
1.2.6.1 单因素实验
(1)不同氮源对产酶的影响:选择不同氮源,有机氮源以1%计,无机氮源以0.2%计。
(2)表面活性剂对产酶的影响:分别加入0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的Tweeen-80。
(3)pH对产酶的影响:将发酵初始pH分别调为4、5、6、7、8、9、10、11,并测定发酵后pH。
(4)培养温度对产酶的影响:采用30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃及42℃七个不同温度进行发酵。
1.2.6.2 正交试验
选择碳源、Mg2+、KH2PO4及pH进行四因素三水平(L934)试验,每组设两个重复。由于木聚糖是木聚糖酶的诱导物,而玉米芯中木聚糖含量较高,因此在正交试验时将麸皮与玉米芯作为复合碳源,最佳氮源也采用复合氮源。
1.2.7 产酶曲线
按最优成分配制培养基,最佳条件培养。测定96h的产酶曲线,每6h测一次。
1.2.8 木聚糖酶作用条件及酶学性质的研究
1.2.8.1 酶作用的最适温度及热稳定性
选取30℃、40℃、50℃、60℃及70℃作为酶的反应温度;将用PBS稀释后的酶液分别放置4℃冰箱,40℃、50℃、60℃及70℃水浴1h测酶活,以4℃组为相对酶活100%。
1.2.8.2 酶作用的最适pH值及pH稳定性
将反应体系的pH用缓冲液调为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0;将原酶发酵液用pH为5、6、7、8、9、10的缓冲液稀释相同倍数后放置4℃冰箱中1.5h测酶活,以pH 7组为相对酶活100%。
1.2.8.3 酶作用的最适底物浓度
在反应体系中分别加入0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL的木聚糖溶液。
2 结果与分析
2.1 菌种筛选
经过两次筛选得到在两种筛选培养基上均能产透明圈的菌株7株,图1为HJ-04降解桦木木聚糖所产生的透明圈。经发酵培养,各菌株酶活力测定结果见表1。将酶活最高的HJ-04纯化保存。
2.2 菌种鉴定
2.2.1 形态观察及镜检
HJ-04在LB及PDA培养基上均能良好生长,菌落生长前期边缘整齐,后期出现褶皱,白色,后期微黄,不透明。革兰氏染色呈阳性,直杆状,两端稍圆,菌体大小为0.5～0.7μm×2.5～3.5μm。芽胞中生。
2.2.2 生理生化鉴定
鉴定指标及结果见表2。
2.2.3 16SrDNA分子水平鉴定
序列测定为1461bp。图2为PCR产物电泳图。在NCBI上进行序列比对,扩增序列与Bacillus pumilus的16SrDNA的同源性为99%。
M:DNAMarker:DL2000;1 and 2:PCR product.
综合形态观察、镜检、生理生化鉴定及16SrDNA同源性分析,鉴定产木聚糖酶菌株HJ-04为短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)。
2.3 单因素实验结果
2.3.1 不同氮源对产酶的影响
NH4NO3最利于产酶(图3),总体是无机氮源比有机氮源更利于HJ-04产酶。
2.3.2 Tween-80浓度对产酶的影响
添加较低浓度的表面活性剂能促进产酶,说明该菌产生的木聚糖酶是一种胞外酶,表面活性剂的添加增加了细胞膜的通透性,有利于酶的分泌(图4)。
2.3.3 pH对产酶的影响
pH的改变对产酶有很大影响,从图5可以看出HJ-04在碱性条件下比酸性环境更有利于产酶。pH在7、8、9、10条件下产酶几乎一样,说明该菌的产酶pH适应范围较大。初始pH为4～8的培养液在发酵后pH均有所上升,而初始pH为9～11的培养液在发酵后pH均有所下降,说明发酵pH向趋于中性的方向变化。
2.3.4 温度对产酶的影响
38℃是HJ-04的最适产酶温度(图6)。温度过低不利于菌的生长,温度过高导致菌迅速繁殖,短时间内耗尽营养物质,大大缩短产酶时间。
2.4 正交实验结果
正交实验结果见表3,从表3中可见HJ-04的最佳产酶条件为A3B2C3D3,即麸皮5%,玉米芯2%,KH2PO4 1%,MgSO4·7H2O 0.5%, 起始pH为9。极差分析显示,各因素对产酶的影响顺序为:A>D>B>C,即碳源>pH>磷源>Mg2+。
2.5 HJ-04的产酶曲线
从产酶曲线(图7)可以看出,前24h产酶量极低,从24h到36h产酶迅速增长,36h以后增速减缓,到60h为最大产酶量,其酶活力达358.8IU/mL,之后缓慢减弱。
2.6 酶作用条件及酶学性质
2.6.1 温度对酶作用的影响及酶的耐热性
60℃为所产木聚糖酶的最适温度,在50℃水浴中处理1h其酶活力仍保留59.9%(图8),说明该酶具有较好的耐热性。
2.6.2 pH对酶作用的影响及酶耐酸碱性
HJ-04所产木聚糖酶最适pH为6.5,说明该木聚糖酶是弱酸性酶,特别是在pH8.0时,其酶活只有pH6.5时的20.9%(图9),说明该酶极不适宜在碱性条件反应。HJ-04所产木聚糖酶的最适反应pH是6.5,但耐酸碱能力却很强,从图中可以看出酶液在pH5及pH10的缓冲溶液中放置1.5h其酶活力分别保留87.3%及91.4%。
2.6.3 底物加入量对酶活的影响
底物浓度对该酶活力有非常大的影响,酶液与2.0mL的底物作用时的酶活最高(图10)。在总反应体系3.0mL的溶液中,加入0.5mL底物时,其反应体系中的底物浓度只有2.0mL的1/4,酶活也只有其的40.2%,但是当底物浓度过高时,对酶促反应不再有促进作用甚至出现抑制作用。这也符合酶促反应动力学说中,Henri和Wurtz提出的酶底物中间络合物学说。
3 讨论
本研究利用蔗渣木聚糖进行初筛,有效地缩小了目的菌株的筛选范围,并减少了昂贵商品木聚糖的使用。对筛选到的产木聚糖酶菌株HJ-04进行形态学观察、生理生化鉴定及16SrDNA同源性分析,将其鉴定为Bacillus pumilus。
通过对产酶条件的优化,其酶活力从120.3IU/mL提高到358.8IU/mL,是优化前的2.98倍。对酶的作用条件(温度及pH)和反应体系(底物用量)的研究发现,底物浓度对酶活力有非常大的影响,在反应体系中加入2.0mL木聚糖溶液时,其酶活力高达942.4IU/mL,是加入0.5mL时酶活的2.52倍,之前包怡红[12]及白云玲[13]报道的细菌木聚糖酶活力较高,分别为553.4IU/ml及600IU/ml。但从目前有关木聚糖酶的研究来看,少有对酶作用底物这个关键因子进行探讨,木聚糖酶活力测定方法虽以DNS法为主,却没有一个统一标准,底物用量、木聚糖的种类与配置浓度也不尽相同[14,15],因此不同报道的酶活不能作一个精确的比较。但是根据酶活力的测定方法[1],认为酶活力测定应该在最优条件下进行,即包括最适底物浓度。在发酵条件优化后的酶活力测定过程中,作者仅用相当于1/2000mL原酶液(0.1mL离心后的上清液稀释至20mL,再取0.1mL作为反应酶液)作用于底物10min,其OD540nm达0.372,也进一说明HJ-04所产木聚糖酶的活力很高。
戊聚糖酶 篇8
壳聚糖是甲壳素部分或完全脱乙酰基的产物,是葡萄糖胺通过β-1,4糖苷键聚合而成的线性多糖聚合物[1]。由于壳聚糖的水溶性较差,其在工业上的应用受到了限制;而其降解产物壳寡糖,由于水溶性好,在多个领域具有相应的生物活性,如抑菌细菌与真菌的生长、充当免疫激活因子、抗肿瘤活性、提高机体对病原体的抗性、维持正负离子平衡、有效保护胚胎肝细胞的抗氧化性等[2]。
目前,壳聚糖降解制备壳寡糖有化学法与生物法。化学法易造成环境的影响及能源的高消耗,产物组分也不容易控制,产物得率低[3]。所以,国内外主要选择特异性的壳聚糖酶水解壳聚糖。壳聚糖酶主要来源于细菌与真菌[4,5],但在天然宿主中不能持续表达,需要诱导底物,并且宿主分泌量低,限制了在工业上的大规模应用。
因此,本文以枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因为对象,通过基因工程手段,将其克隆到大肠杆菌中进行重组表达;利用重组酶水解壳聚糖,制备壳寡糖,分析水解组分。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌XL-Gold与表达菌株BL21由作者实验室保存,表达载体pET23a(+)购于美国Invitrogen公司。
1.1.2 试剂
限制性内切酶、连接酶、IPTG购于大连宝生物公司;蛋白质标准购于上海碧云天生物公司;壳聚糖购于美国Sigma公司;壳寡糖标准品购于大连中科格莱克生物科技有限公司;引物由上海捷瑞生物公司合成;其它常用试剂购于国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 仪器:
基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪,美国布鲁克道尔顿公司。
1.1.4 培养基:
细菌用LB培养基(酵母抽提物0.5%,蛋白胨1%,氯化钠1%)。
1.2 方法
1.2.1 全长基因扩增
根据GenBank上公布的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶序列(登录号:AL009126.3)和原核表达载体pET23a(+)的多克隆位点,采用直接添加酶切位点的方法设计引物:上游为F:5’-catatgGCGGGACTGAATAAAGATCAAAA -3’,5’带有NdeⅠ识别位点;下游为R:5’-ctcgagTTTGATTACGAAATTACCGTACTC-3’,5’带有XhoⅠ识别位点。R不带终止密码子,以保证与His-Tag的正常衔接。基因扩增方法参考文献[6]。
1.2.2 表达载体的构建
pET23a(+)载体质粒和目的基因分别经NdeⅠ与XhoⅠ双酶切后,在连接酶的作用下于16℃连接。连接产物转化大肠杆菌XL-Gold,涂布于含有Amp抗性的LB平板。菌落PCR筛选重组子,抽提重组质粒pET23a(+)-CSN,送上海生工基因测序。
1.2.3 转化表达菌株
将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,涂布于含有Amp的LB平板,菌落PCR鉴定转化子。
1.2.4 重组蛋白的诱导表达
挑取含表达质粒的转化子接种于含Amp的液体LB中,37℃培养过夜,为种液。往10 ml新鲜LB培养基中加入1%的种液,培养OD600至0.6～0.8。取1 ml培养液离心收集菌体,作为未加IPTG的对照。在剩余的培养液中加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L,30℃诱导3～5 h。8 000r/min离心收集菌体。
1.2.5 SDS-PAGE电泳
用PBS(pH 7.0)洗涤菌体2次,再用600 μl PBS重悬菌体,进行超声破菌。将破碎后的菌液离心,分为沉淀和上清两个部分,沉淀中加入500 μl PBS重悬。分别吸取100 μl上清与沉淀悬液于SDS-PAGE上样缓冲液中,100℃处理5 min。吸取20 μl样品上样,进行SDS-PAGE电泳,电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色。
1.2.6 重组蛋白的纯化
采用His-Tag纯化试剂盒对重组蛋白进行纯化,实验过程参考文献[7]。纯化结束后,进行SDS-PAGE分析。
1.2.7 目的蛋白质谱鉴定
将目的蛋白条带从SDS-PAGE胶上割下,按文献[8]进行胶内消化与质谱鉴定分析。
1.2.8 壳聚糖酶酶活测定
壳聚糖酶活性测定采用DNS法测定还原糖含量,测定过程参考文献[9]。酶活定义为:每1min催化水解壳聚糖生成相当于1 μmol氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量为1个酶活单位(U)。
1.2.9 壳寡糖的制备
称取10 g壳聚糖溶于90 ml、0.2 mol/L的醋酸溶液中,用0.2 mol/L醋酸钠调节pH至5.5,配成10%的壳聚糖溶液,往该溶液中加入适量的酶(10 U/g壳聚糖),于50℃下过夜反应,次日100℃、10 min灭活。12 000 r/min离心10 min,收集上清,分析产物组分。
1.2.10 水解产物薄层层析(TLC)分析
取水解液上清1 μl点于硅胶平板上,以乙酸乙酯:乙醇:水:氨水(5:5:4:0.3,V/V)为展开剂,0.1%的茚三酮为显色剂,105℃、10 min显色。
2 结果与分析
2.1 CSN基因的扩增
以细菌总DNA为模板,利用特异性引物通过PCR扩增,得到条带与预计大小相符,大约在738 bp处有目标CSN片段(图1)。
2.2 CSN重组蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定
重组蛋白理论大小约31.5 kDa,大肠杆菌诱导表达后SDS-PAGE分析如图2。pET23a(+)-CSN经IPTG诱导后在31.5 kDa处有蛋白条带变粗,表明有目标蛋白表达,且在上清和沉淀中都存在,但以上清为主。凝胶扫描显示在上清中约占菌体总蛋白的45%。表达产物经质谱鉴定证明,重组产物为目的蛋白(图3)。
2.3 表达产物的纯化与活性
pET23a(+)载体上带有6×His标签,可用His-Tag亲合层析柱纯化表达产物,得到蛋白质浓度为900 mg/L,纯度为95%,纯化回收率达85%(图2);纯化后重组壳聚糖酶活力为10 000 U/mg。
2.4 壳寡糖分析
壳聚糖水解产物TLC分析如图4。结果表明,重组CSN水解壳聚糖的主要产物为壳二糖、壳三糖与壳四糖。
3 讨论
目前,国内外学者一方面继续从自然界中筛选产壳聚糖酶的菌株,优化其产酶条件;另一方面利用分子生物学手段构建基因工程菌株,以获得高产菌,实现壳聚糖酶的高效表达。如
Kobayashi T等从深海中分离产壳聚糖酶(43kDa)的苏云金芽孢杆菌JAM-GG01,通过优化条件,得到纯酶活性412U/mg,水解壳聚糖为二糖与三糖[4]。Liu YL等将芽孢杆菌壳聚糖酶(42kDa),在N端带上6×His标签,克隆大肠杆菌BL21中实现可溶性表达,表达量为500mg/L,酶活性约270～290U/mg,水解壳聚糖产物为二至四糖[10]。阳丽等将烟曲霉壳聚糖酶基因(25kDa)克隆到毕赤酵母GS115中,甲醇诱导14h,酶活为14.59U/mL[11]。刘怀伟等采用RT-PCR方法扩增腐皮镰孢菌壳聚糖酶(30kDa)的cDNA序列,克隆到大肠杆菌中,结果壳聚糖酶表达形成不溶性的包涵体,经变性复性后酶活为25U/mg,水解壳聚糖生成2～10的寡糖[12]。Johnsen MG等将紫杆菌壳聚糖酶(33kDa)在大肠杆菌中重组表达,酶表达量为60～70mg/L,酶活性为1 500U/mg,将壳六糖水解成二糖与三糖[13]。本研究将枯草芽孢杆菌壳聚糖酶(31.5kDa)克隆到大肠杆菌中,实现了可溶性表达,表达量为800mg/L,酶活性为10 000 U/mg,将壳聚糖水解成二糖至四糖,其在蛋白表达量与酶活性方面要优于上述壳聚糖酶相关报道,在壳寡糖的制备方面具有明显的优势,具有工业化规模潜力。
摘要：目的:克隆壳聚糖酶基因于大肠杆菌中实现高表达,制备壳寡糖。方法:以枯草芽孢杆菌总DNA为模板扩增壳聚糖酶基因(CSN),克隆至载体pET23a(+)上,转化菌株BL21(DE3)。重组子经0.5 mmol/L IPTG诱导后,SDS-PAGE和质谱检测与鉴定重组酶。酶纯化后水解壳聚糖,薄层色谱分析其水解产物。结果:质谱证明壳聚糖酶(31.5kDa)成功表达,表达量占菌体总蛋白的45%左右。纯化后重组酶浓度为900 mg/L,纯度95%、回收率85%,酶活力为10 000 U/mg。壳聚糖降解产物为壳二糖至壳四糖。结论:原核表达载体pET23a(+)-CSN构建正确,壳聚糖酶表达量与活性高,适用于水解壳聚糖制备壳寡糖。