溃疡性结肠炎相关癌（共3篇）
溃疡性结肠炎相关癌 篇1
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的病因及发病机制至今尚未明确,目前多认为是由多种因素共同作用的结果,与遗传、肠内微生态环境、机体免疫状态密切相关[1]。肠道淋巴细胞归巢作为免疫反应的一个关键环节,在UC的发病和复发中发挥着重要作用,成为近年来UC研究的热点之一。淋巴归巢在UC的发病机制中,究竟受何种分子或信号通路介导,尚不清楚。是什么参加了炎症的始动和激活,使得淋巴细胞被激活,并导致后续的归巢水平变化?目前尚未明确,故有必要在该方面进行进一步的研究。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物
50只6～8周龄SPF级BALB/c小鼠,雌雄各半,体质量(18±2)g,购自中山大学实验动物中心。
1.1.2 材料和仪器
DSS(5000)购于Sigma公司;PCR相关试剂购自Promega公司;Trizol购自Invitrogen公司;兔抗小鼠CCR2、CCR9、TLR4及羊抗兔二抗购自美国Sant Cruz公司;PVDF膜购自美国Pierce公司;CCR2、CCR9、TLR4引物购自北京鼎国生物技术有限公司;2700 PCR仪购自美国ABI公司。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组及处理
50只小鼠,随机分为5组,每组10只,雌雄各半,设第1组为正常对照,其余4组均予5%DSS溶液自由饮用造模。第1、2、3、4、5组小鼠分别于造模开始第0、3、6、9、12天被处死,取结肠组织用于分子生物学检测及病理切片。
1.2.2 CCR2、CCR9、TLR4在核酸水平表达上的检测
提取结肠组织RNA后用两步法RT-PCR检测CCR2、CCR9、TLR4的表达。95℃3 min,95℃40s,54℃50 s(β-actin、CCR2),59℃50 s(TLR4、CCR9),72℃50 s共30循环,72℃10 min,4℃保存备用。聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶图像分析系统计算积分光密度。CCR2、CCR9、TLR4、β-actin的引物见表1。
1.2.3 免疫印记法(Western-blotting)测定CCR2、CCR9、TLR4的表达
提取结肠组织蛋白后上样,86 V跑胶80 min,100～120 V转膜0.75～1.00 h,室温封闭1 h,移至4℃,100 r/min。加一抗,转入杂交袋中,室温,100 r/min,1 h。洗一抗,100 r/min,室温;0.1%Triton-封闭液15 min,100 r/min,室温。加二抗,转入杂交袋,室温,100 r/min,1 h。洗二抗,150 r/min。ECL液显色4 min后显影1 min,定影5 min,洗片晾干。凝胶图像分析系统计算积分光密度。
1.3 统计学方法
采用SPSS 15.0统计软件进行数据处理,所有实验数据均进行正态性检验,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,均数比较前先进行方差齐性检验(以α=0.1为检验水准,当P>0.1时,认为方差齐),多样本均数比较时,运用完全随机设计资料的方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析,各组间方差齐时用LSD法进行均数间的两两比较,各组方差不齐时用Dunnett-T3进行均数间的两两比较。计量资料之间的相关分析用Pearson分析,以P<0.05为明显相关。
2 结果
2.1 各种细胞因子在核酸水平的表达
第1、2、3、4、5组小鼠结肠组织中TLR4、CCR9的表达逐渐升高,组间有明显差异(P<0.05),CCR2的表达无明显差异(P>0.05)。第1组小鼠结肠组织中无TLR4表达(见图1和表2)。
2.2 各种细胞因子在蛋白水平的表达
第1、2、3、4、5组小鼠结肠组织中TLR4、CCR9的表达逐渐升高,组间有明显差异(P<0.05),CCR2的表达无明显差异(P>0.05)。第1组小鼠结肠组织中无TLR4表达。见图2和表3。
2.3 各组小鼠黏膜炎症水平
第1组小鼠结肠组织无炎症表现,第2～5组小鼠黏膜炎症评分逐渐升高,组间有明显差异(P<0.05)。见表4。
2.4 CCR2、CCR9与TLR4表达水平的相关性
CCR2与TLR4呈明显正相关(r=0.84,P<0.05)。CCR9与TLR4无相关性(r=0.13,P>0.05)。
注:1)各组间比较,P>0.05;2)与第1组比较,P<0.05;3)与第2组比较,P<0.05;4)与第3组比较,P<0.05;5)与第4组比较,P<0.05
注:1)各组间比较,P>0.05;2)与第1组比较,P<0.05;3)与第2组比较,P<0.05;4)与第3组比较,P<0.05;5)与第4组比较,P<0.05
注:1)与第1组比较,P<0.05;2)与第2组比较,P<0.05;3)与第3组比较,P<0.05;4)与第4组比较,P<0.05
3 讨论
溃疡性结肠炎是一种肠道持续性炎症疾病,其在欧洲和北美的发病率约为10～200/10万人,在发展中国家约为2/10万人,在快速发展的亚洲与南欧国家,发病率呈逐渐增多的趋势。UC不仅给患者带来极大的身心伤害,而且极大地耗费着社会的医疗资源。因此,寻找UC的发病原因,探究其发病机制,寻找有效的治疗手段,便成为了全世界共同研究的课题。
已有部分研究表明,肠道淋巴细胞归巢(lymphocyte homing,LH)作为免疫反应的一个关键环节,在UC的发病和复发中发挥着重要作用。淋巴细胞归巢是指成熟淋巴细胞离开中枢免疫器官后,经血液循环趋向性迁移并定居于外周免疫器官或组织特定区域的过程。其分子基础是淋巴细胞与内皮细胞黏附分子的相互作用[2]。介导LH的黏附分子称为淋巴细胞归巢受体(lymphocyte homing receptor),其相应配体为血管地址素(vscular addressin),在LH过程中起重要作用的还有趋化因子(chemotatic factor)。目前已有部分研究证实UC的动物模型中,LH处于被激活和上调的状态[3]。本研究亦发现,随着溃疡性结肠炎小鼠造模的进展,小鼠结肠组织的病理炎症评分逐渐升高,且组间差异显著,说明随着时间的变化,模型小鼠结肠炎症逐渐活跃,而与此同时淋巴细胞的归巢受体CCR9也逐渐升高,说明LH也逐渐激活。在UC的疾病进展中,LH增多是肠道炎症加剧的重要机制之一,LH可能与IBD的发病密切相关。这与已有的部分研究是一致的,THOMAS等人[4]用PCR及流式细胞计量术分析了IBD模型小鼠小肠组织中CCR9及其配体CCL25的表达,发现CCR9/CCL25可有效介导淋巴细胞的归巢,并与IBD尤其是UC发病部位密切相关,也证实了这一点。
而淋巴细胞归巢在UC的发病机制中,究竟受何种分子或信号通路介导,尚未明确。本研究中发现,Toll样受体4也随着造模时间的延长而逐渐升高,其与病理炎症的变化水平是一致的,这与TLR4的炎症信号传导通路有关[5,5]。有趣的是,本研究同时发现,TLR4的水平变化与CCR9呈正相关,亦即随着炎症的进展,二者的表达水平同步上调,这是否意味着二者在炎症的信号传导方面有着关联?已有的研究结果表明,肠道不同部位的Toll样受体对局部的微生物产生着不同的免疫应答,当处于免疫耐受的状态时并无炎症反应发生,当肠道环境发生变化,或机体免疫稳态发生变化时,局部的Toll样受体识别出相应的微生物抗原并产生应答,通过其信号通路将信号向下传导,继而通过TNF-α、IL-1、IFN-γ等分子介导激活淋巴细胞[6,6,7],更重要的是,此部位的淋巴细胞归巢相关分子表达亦增加,如淋巴细胞归巢受体、地址素、趋化因子等,这直接导致了归巢的淋巴细胞大量黏附并游出到此病变部位,淋巴细胞在病变部位的定点聚集最终导致了大量炎症因子的募集和病变的发生[8,9,9,10],这即成为炎症性肠病的发病机制。故炎症性肠病肠道组织中的炎症反应,很有可能为Toll样受体介导的淋巴细胞归巢所完成并维持,而且本研究中发现TLR4的水平变化与CCR9呈正相关,而与CCR2无关,故这一途经所依赖的因子为CCR9而不是CCR2。如果能在今后的研究中进一步阐明此通路参与的相关因子,则有望通过干预Toll样受体对淋巴细胞归巢的活化以达到治疗炎症性肠病的目的,并使寻找局部用药的治疗靶点成为可能。
摘要：目的 比较溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织中淋巴细胞归巢受体CCR2、CCR9与Toll样受体4(TLR4)随时间的变化及其相关性,以探讨TLR4介导归巢受体引起的结肠炎症在溃疡性结肠炎中的可能作用机制。方法 50只BALB/c小鼠随机分为5组,分别用于DSS造模的第0天、第3天、第6天、第9天、第12天取得各组小鼠的结肠标本,用RT-PCR和Western blotting的方法半定量检测CCR2、CCR9、TLR4在基因和蛋白水平上的表达。结果 ①正常小鼠结肠内无TLR4表达,CCR2、CCR9的表达均呈低水平。②随着造模时间的延长,UC模型小鼠结肠内TLR4、CCR9、黏膜炎症评分均呈进行性升高,CCR2则维持在较低水平。③各组小鼠TLR4与CCR9的表达呈正相关,TLR4与CCR2无相关。结论 TLR4介导的淋巴细胞归巢可能参与了溃疡性结肠炎的致病机制,其信号传导依赖于CCR9而不是CCR2。
关键词：TLR4,CCR2,CCR9,溃疡性结肠炎,致病机制
溃疡性结肠炎相关癌 篇2
U C是在基因易患基础上, 综合环境、免疫异常等多因素所致的肠道非特异性炎症, 是炎症性肠病的一种。UC在中国发病率为11.6/105[1]。UCAC发生与UC持续时间和病变范围密切有关, 病程小于8~10年时很少发生肠癌, 以后患癌的危险性每年上升0.5%~1.0%, 并有较高的累积癌变率, 15年为2.5%, 20年为13%, 30年34%。病变范围广泛者癌变危险性最高[2]。
目前, UCAC机制尚未完全明晰, 是涉及多基因、多信号复杂过程, 其中β-catenin磷酸化、EGF、EGFR以及DNA错配修复等在UCAC发生中占据重要地位[3]。近年来许多学者试图寻找在治疗UC同时, 能够对UCAC有预防作用的药物, 期望这些药物能够逆转、抑制、预防UCAC发生与发展。5-氨基水杨酸代表药物美沙拉嗪作为反应性氧自由基清除剂, 具有减少NF-κB活化, 阻断炎性因子的产生, 降低炎性反应;但美沙拉嗪价格昂贵、毒副作用较大, 大多数患者难以长期耐受, 故能否长期应用5-ASA化学预防UCAC作用仍存在争议。
2 EGF生物学特性与UCAC
EGF是类EGF家族中一种小肽, 是结构最早确立的生长因子, 基因组位于第4号染色体 (q25-q27) , 大约有120 kb, 对热稳定, 相对分子质量6045 Da, 是目前已知的最稳定的蛋白质之一。他是EGFR的配体之一, 由53个氨基酸残基组成的单链多肽, 有3个链内二硫键, 主要由颌下腺和十二指肠的Brunner腺及肾上腺等合成分泌。它是一种多功能的生长因子, 对各种组织细胞都有着强烈的促分裂作用, 与结肠黏膜上的EGFR结合后、细胞膜上的受体迅速集聚, EGF/EGFR复合物被吞饮入膜, 催化相应的底物, 分别产生第二信使, 参与细胞增殖、创面愈合、细胞的增殖分化及肿瘤细胞的浸润和转移[4]。
此外, 有研究表明, 结、直肠癌组织EGF表达高于癌旁组织, 提示EGF可能在结、直肠癌的发生、发展中起重要作用。另外, Luck[5等对比小鼠溃疡性结肠炎模型用EGF进行治疗, 在患溃疡性结肠炎后分别由直肠直接灌肠和体内注射EGF治疗7天, 结果发现体内注射EGF明显减轻了EGF通过与EGFR结合, 引起溃疡组织增殖, 又是溃疡性结肠炎恶性转化的重要诱因之一。因此, 及时有效阻断EGF/EGFR结合, 是抑制溃疡性结肠炎恶化的有效方法。
3 EGFR生物学特性与UCAC
EGFR是一种受体酪氨酸激酶, 属于Eerb-B的酪氨酸蛋白激酶家族, 在所有的表皮细胞、基质细胞、部分神经胶质细胞均有表达。人的EGFR受体位于第7号染色体, 编码约110 k D, 并且其有介导多条信号转导通路的作用, 通过将细胞外信号传递至细胞内, 调节核内基因的表达, 进一步调节细胞的生长和分化。
肠隐窝干细胞具有快速和持续更新的特点, 此类细胞对于维持肠上皮细胞正常代谢, 参与肠道损伤修复中起着重要的作用, 需要多条信号通路参与来维持其增殖和分化过程。EGF与其受体EGFR结合后, 激活p85募集p110在细胞膜附近使其活化, 进而催化膜内表面的磷酸肌醇二磷酸生成PI3P, 其作为第二信使, 激活Akt, 进而通过GSK3β与Wnt通路协同作用, 共同维持肠上皮细胞的生长和增殖[6]。它介导的信号通路中任一环节受到干扰或破坏, 都会是细胞的增殖、生长、分裂、分化从有控制状态转变为失控状态, 导致肿瘤的发生。
4 β-catenin核内转位介导溃疡性结肠炎相关癌变
β-catenin是一种多功能胞质蛋白, 含有781个氨基酸, 相对分子质量在92~95 k Da, 在细胞内可存在于细胞膜、细胞质及细胞核中, 其氨基末端含数个GSK-3β的磷酸化位点, 羟基末端有活化相应靶基因转录的功能, 中间区域形成α-螺旋和连接环结构, 含有Cadherin、APC蛋白及TCF结合的位点。通过改良DMH/DSS复合法成功制备UCAC模型, 初步发现UCAC小鼠存在结肠黏膜β-catenin表达缺失, 核内表达增加的病理变化, 该病理变化与UCAC变化齐同;表明炎症状态下, 肠上皮细胞处于不断增殖状态, 以达到修复组织损伤目的, 但由于组织修复过程中出现过度增殖、DNA损伤错配修复等, 最终导致恶性肿瘤发生[7]。因此, 可以推测“从异常隐窝病灶-肠腺瘤样改变-恶性肿瘤”这一进程与β-catenin密切相关;β-catenin突变→β-catenin复合物不被降解→β-catenin核内异常转位在上述变化中起着重要作用。总之, 调控β-catenin表达, 促进其泛素化降解和抑制核内异常转位, 降有望成为预防溃疡性结肠炎相关癌变的靶点。
5 结语
炎症尤其非可控性炎症, 将其感染因素或诱因去除后, 炎症并不能得到有效控制, 这在肿瘤发展中占据重要地位。反复的炎症刺激可能通过释放大量的反应性氧自由基、一氧化氮等炎性介质, 经由模式识别介导的固有免疫或获得性免疫, 将炎症放大, 加重组织损伤, 组织修复中出现DNA错配、基因位点突变等, 最终导致恶性肿瘤发生[8]。因此有效延缓、阻断UC发展进程, 对于UCAC防控是有益的。另外, EGF与EGFR参与激活多种细胞的信号通路, 其过度表达参与肿瘤的发生、增殖和转移[9]。同时EGF和EGFR具有参与细胞生长分化的调节功能, 是多种肿瘤的预后因子。近年来越来越多的研究表明β-catenin核内转位及、EGF与EGFR的过量表达在溃疡性结肠炎相关癌变中起重要作用。因此研究这3个指标, 及它们之间的相互关系, 在UCAC中的表达及意义, 有助于溃疡性结肠炎相关癌变的预防、诊断和治疗。
摘要：溃疡性结肠炎相关性结肠癌 (UCAC) 是溃疡性结肠炎 (UC) 患者重要死亡原因, 其癌变具体机制尚未完全明晰, 是涉及多基因、多信号复杂过程, 其中表皮细胞生长因子家族 (EGF) 、表皮生长因子受体 (EGFR) 及β-catenin磷酸化与核内转位在UCAC发生中占据关键地位。本文就近年来EGF、EGFR及β-cateni核内转位在溃疡性结肠炎相关癌变中作用的研究进展作一综述。
关键词：β-catenin核内转位,EGF,EGFR,UCAC
参考文献
[1]中国炎症性肠病协作组.3100例溃疡性结肠炎住院病例回顾分析[J].中华消化杂志, 2006, 26 (6) :368-373.
[2]Jess T.Prognosis of inflammatory bowel disease across time and countries.An epidemiological study of population-based patient cohorts[J].Dan Med Bull, 2008, 55 (2) :103-120.
[3]Saleh M.Trinchieri G.Innate immune mechanisms of colitis and colitis-associated colorectal cancer[J].Nat Rev Immunol, 2011, 11 (1) :9-20.
[4]King AC, Cuatrecasas P:Peptide hormone-induced receptor mobility, aggregation, and internalization[J].N Eng L J Med, 2000, 305 (2) :77-88.
[5]Luck MS, Bass P:Effect of epidermal growth factor on experimental colitis in the rat[J].Jpharmacol Exp Ther, 2001, 264 (2) :984-990.
[6]Spence JR, Mayhew CN, Rankin SA.Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro[J].Nature, 2011, 470 (7332) :105-109.
[7]张涛, 黄会云, 张志明, 等.DMH/DSS复合法诱导小鼠溃疡性结肠炎相关癌变的实验研究[J].时珍国医国药, 2011, 7 (22) :1744-1746.
[8]Chun KH, Seong SY.CD14 but not MD2 transmit signals from DAMP[J].Int Immunopharmacol, 2010, 10 (1) :98-106.
溃疡性结肠炎相关癌 篇3
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取我院2012年1月-2014年12月收治的UC患者100例作为观察组, 健康体检者60例作为对照组。观察组男53例, 女47例;年龄18~48岁, 中位年龄33岁。对照组男33例, 女27例;年龄20~46岁, 中位年龄33岁。UC患者均符合我国2012年炎症性肠病的诊断标准。排除慢性消耗性疾病、内分泌代谢性疾病及绝经期女性患者, 排除曾服用影响骨代谢的药物如糖皮质激素等患者。
1.2 检测方法
采集清晨空腹静脉血5ml, 室温下静置, 离心, 储存于-80℃, 采用酶联免疫吸附试验 (ELISA法) 检测2组血清TNF-α、IL-6及IL-8水平。超声检测2组L1~L4骨密度 (BMD) , 以g/m2表示, 计算T值, 骨量正常:T≥-1.0SD, 骨量减少:-2.5SD~-1.0SD, 骨质疏松:T≤-2.5SD。
1.3 统计学方法
应用SPSS 18.0统计软件进行数据处理。计量资料以±s表示, 组间比较采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 骨密度
观察组100例患者中骨密度降低47例 (47%) , 骨量减少46例 (46%) , 骨质疏松7例 (7%) 。观察组患者的骨密度及T值均低于对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
注:与对照组比较, *P<0.05
2.2 血清TNF-α、IL-6及IL-8水平观察组患者的血清TNF-α、
IL-6及IL-8水平均高于对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。
注:与对照组比较, *P<0.05
3 讨论
近年来UC并发骨质疏松等相关骨代谢紊乱疾病的患者人数逐渐增多, 其发病机制尚不明确, 目前认为与缺乏维生素D、炎性因子的激活、糖皮质激素治疗、低体重指数及遗传因素等有关。UC患者肠道的异常免疫反应, 一方面活化的T淋巴细胞通过RANKL影响骨代谢, 另一方面表达了多种促炎细胞因子导致肠道黏膜免疫损伤和炎性反应, 如IL-6、TNF-α、IL-8等[3]。
TNF-α主要由T细胞、巨噬细胞及单核细胞产生, 能刺激巨噬细胞、纤维母细胞、内皮细胞和上皮细胞平滑肌细胞分泌花生四烯酸代谢物、细胞因子和蛋白酶, 还能吞噬补体片段和细胞产物引起细胞坏死, 破坏间质中蛋白质, 发生水肿, 从而促进胃肠细胞的组织损害。TNF-α还在骨重建过程中起主要调节作用, TNF-α能抑制成骨细胞合成I型胶原, 诱导骨原细胞产生IL-6、IL-1, 与骨髓基质细胞产生的IL-11协同促进破骨细胞生长, 加速骨吸收[4]。
IL-6是一种多向性细胞因子, 由活化的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞分泌, IL-6过度表达可引起机体内环境及肠上皮细胞电解质分泌紊乱, 进一步导致肠黏膜损伤。IL-6也可刺激破骨细胞的增殖和功能的表达, 并抑制成骨细胞的功能, 是一个重要的破骨细胞调节因子[5]。IL-8是一种强而有力的中性粒细胞趋化和活化因子, 由单核细胞、上皮细胞、纤维母细胞、表皮细胞及T淋巴细胞在IL-1、TNF-α和外源性因子细菌多糖的刺激下产生[6]。
本文探讨UC患者血清TNF-α、IL-6及IL-8水平与骨质疏松的相关性, 结果显示, UC患者的骨密度低于健康体检者, 血清TNF-α、IL-6及IL-8水平均高于健康体检者, 证实血清TNF-α、IL-6及IL-8水平在UC患者骨质疏松发生中起重要作用, 检测UC患者血清TNF-α、IL-6及IL-8水平可用于诊断和预防骨质疏松。
参考文献
[1] 闫小燕, 李纬, 丁辉, 等.溃疡性结肠炎患者血清IL-6, RANKL/OPG水平与骨质疏松的关系[J].河南大学学报 (医学版) , 2014, 33 (1) :36-40.
[2] 杨涛.活动期炎症性肠病患者骨密度和血清1, 25- (OH) D3水平检测分析[J].全科医学临床与教育, 2014, 12 (1) :36-38.
[3] 吴倩倩, 张颖, 于晓峰.老年炎症性肠病患者的骨代谢和骨密度分析[J].老年医学与保健, 2014, 20 (5) :321-324.
[4] 邵丽华, 王强, 张维, 等.溃疡性结肠炎患者骨密度变化及其相关因素的研究[J].国际消化病杂志, 2014, 34 (4) :264-266.
[5] 张爽, 梅俏, 许建明, 等.溃疡性结肠炎患者骨代谢生化指标检测及其临床意义[J].中华消化杂志, 2012, 32 (4) :272-274.