DNA损伤修复（精选9篇）
DNA损伤修复 篇1
1 引言
铅和镉是常见的环境污染重金属, 对动植物具有较强的毒性。许多研究表明, 重金属胁迫不仅会影响植物的生长发育[1~5], 还会引起动物细胞DNA解链、交联以及期外DNA合成速率大幅度提高等[6~8]。但是到目前为止, 重金属对植物细胞DNA水平的损伤及修复机制研究得较少。
本文拟采用最常见的大蒜为材料, 探究重金属铅和镉对大蒜DNA的损伤作用以及常用的解毒物质绿豆浸出液对DNA损伤的修复, 为防治重金属污染对农作物的毒害提供一定的理论基础。
2 材料与方法
2.1 材料
大蒜。
2.2 试剂
Pb (NO3) 2、3CdSO4.8H2O、Tris、巯基乙醇、NaCl、EDTA、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、溴化乙锭、纯水、0.5*TBE缓冲液、上样缓冲液、绿豆浸出液 (按1g绿豆加水20mL的比例, 煮沸后再煮30s取上清液) 。
2.3 方法
(1) 材料培养。将未发芽的大蒜分组培养一周左右 (表1) , 每3d适当添加相应的溶液, 待大蒜发芽, 至芽大约5~10cm时停止培养。DNA提取前将每组大蒜的蒜瓣皮剥掉, 去除最上端的芽约2~3cm, 用解剖刀将蒜瓣切成小粒状, 置于4℃备用。
(2) DNA的提取:胁迫处理后, 采用CTAB法[9]分别提取大蒜的DNA, 4℃储存。
注:+表示添加溶液, -表示不添加
(3) DNA损伤修复检测:1%琼脂糖凝胶电泳检测。
(4) DNA增色效应测定。
每组DNA平行各取2份, 每份20μL, 1.98mL0.08mol/L的NaCl溶液稀释至2mL, 分别置于70℃和22℃, 温浴30min后, 用紫外可见分光光度计测定A260, 以[ (A260, 70℃-A260, 22℃) /A260, 22℃]×100%作为DNA增色效应指标。
3 结果与讨论
3.1 DNA损伤修复检测
将所提取的各组大蒜DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测, 实验结果表明:Pb2+和Cd2+处理后的大蒜DNA条带出现拖尾现象, 而且经Pb2+和Cd2+处理的大蒜提取的DNA量较高, 分子量也明显高于对照组 (图1) 。显然, 重金属离子的胁迫可能导致了大蒜DNA链的部分断裂, DNA相互交联程度增加且DNA合成量增加。而Pb2+、Cd2+分别与绿豆浸出液共处理后大蒜组织的DNA条带较为集中, 分子量及含量与对照组几乎一致 (图1) , 表明绿豆浸出液对大蒜组织中重金属污染现象有所缓解, 有良好的DNA损伤修复效果。
LaneM:DNA marker;Lane1:Pb2+处理组;Lane2:绿豆浸出液与Pb2+共处理组;Lane3:Cd2+处理组;Lane4:绿豆浸出液与Cd2+共处理组;Lane5:正常对照组;Lane6:绿豆浸出液处理组
3.2 DNA增色效应测定
将提取的每组DNA进行增色效应检测, 实验结果表明:在Pb2+和Cd2+胁迫下DNA的增色效应明显下降, 推测可能是因为在重金属作用下, DNA链发生了交联, 从而使DNA的解链温度显著提高, 导致在加热至70℃时DNA仍不能解链, 因而未见明显的DNA增色效应 (图2) 。但是采用绿豆浸出液与重金属共培养之后, DNA的增色效应与单独重金属处理组相比有明显的增加, 而且绿豆浸出液对Pb2+的作用效果更为明显 (图2) , 显然DNA增色效应检测结果与琼脂糖凝胶电泳检测结果基本一致。
4 结论
重金属离子Pb2+与Cd2+胁迫大蒜, 造成大蒜DNA一定程度的损伤, 表现在DNA交联程度上升;DNA合成量显著增加;部分DNA链降解, 形成小分子DNA。而传统的解毒物质绿豆浸出液对这两种重金属引起的DNA损伤均具有一定的修复能力, 且对Pb2引发的DNA损伤的修复效果更为显著, 但其具体的损伤修复机制仍需进一步研究。
摘要：以紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测了大蒜在重金属Pb2+和Cd2+胁迫处理后的DNA的损伤。结果表明:Pb2+和Cd2+都能够胁迫大蒜DNA解链、交联程度增加, 并引起部分DNA的降解;而绿豆浸出液对Pb2+和Cd2+引起的DNA损伤均能进行修复, 且对Pb2+引起的DNA损伤修复的效果更好。
关键词：Pb2+和Cd2+胁迫,绿豆浸出液,DNA损伤
参考文献
[1]田胜尼, 刘登义, 彭少麟.香根草和鹅观草对Cu, Pb, Zn及其复合金属的耐性研究[J].生物学杂志, 2004, 21 (3) :15~26.
[2]洪春来, 贾彦博, 王润屹.铅毒害对蔬菜生长影响的研究[J].现代农业科技, 2008, 43 (20) :27~28.
[3]高雪峰, 王铁娟.重金属污染对2种蔬菜种子萌发和总抗氧化活性的影响[J].种子, 2013, 32 (2) :32~34.
[4]宋勤飞, 龙迈.不同浓度铅处理对3种茄果类蔬菜种子萌发的影响[J].种子, 2009, 28 (11) :104~106.
[5]谢建春.应用根伸长实验研究禾木科和百合科杂草对重金属的耐性机制[J].中国农学通报, 2010, 26 (13) :174~178.
[6]彭莹, 李亚男, 黄原, 等.Pb和Cd对日本三角涡虫DNA损伤及损伤后修复的研究[J].实验动物科学报, 2012, 29 (2) :2~3.
[7]Corvetti G, Fornaro M, Geuna S, Poncino A, Giacobini-Robecchi MG.Unscheduled DNA synthesis in rat adult myenteric neurons:an immunohistochemical study[J].Neuroreport, 2001, 12:2165~2168.
[8]Zhitkovich A, Shrager S, Messer J.Reductive metabolism of Cr (VI) by cysteine leads to the formation of binary and ternary CrDNA adducts in the absence of oxidative DNA damage[J].Chem Res ToxicoZ, 2000, 13:l114~l124.
[9]杨大翔.遗传学实验[M].北京:科学出版社, 2004:179~184.
DNA损伤修复 篇2
人体在正常情况下是处于氧化-还原平衡状态的,当这种平衡被破坏,如因为体内或外界的原因引起体内自由基浓度升高,将导致生物大分子过氧化如DNA的氧化性损伤,进而引起各种疾病.
作 者：刘国安 杨燕 丁兰 杨庆明 杨红 LIU Guo-an YANG Yan DING Lan YANG Qing-ming YANG Hong 作者单位：刘国安,丁兰,杨庆明,杨红,LIU Guo-an,DING Lan,YANG Qing-ming,YANG Hong(西北师范大学生命科学学院,兰州,730070)
杨燕,YANG Yan(甘肃省肿瘤医院内窥镜室,兰州,730030)
DNA损伤修复 篇3
摘要：介绍了2015年的诺贝尔化学奖DNA修复机制的研究历程，包括其修复机理和修复途径方面的理论与实践研究以及DNA修复机制所展现的治癌新契机，给生物医学领域带来的新的发展方向，为人类的抗癌事业做出的巨大贡献。
关键词：诺贝尔化学奖；DNA修复机制；DNA修复途径；抗癌
文章编号：1005–6629（2016）7–0090–07 中图分类号：G633.8 文献标识码：B
2015年的诺贝尔化学奖授予托马斯·林达尔（瑞典）、保罗·莫德里奇（美）和阿奇兹·桑贾尔（土耳其）三位科学家，以表彰他们在DNA修复的细胞机制方面的研究。瑞典皇家科学学院在授予他们该荣誉的颁奖词中提到：三人在分子领域绘制出了细胞是如何完成DNA修复及保护其遗传信息的，他们的研究发现为活细胞功能的认知提供了基础知识，其研究成果在未来甚至可以为癌症治疗的发展提供极大的帮助。这一科学研究领域的成果有望为广大癌症患者带来福音。那么，这一科学研究是如何被一步步发现的？又为何会获得诺贝尔化学奖这一崇高荣誉？其科学意义和应用前景又会是怎样？对我们又有何启发？
1 DNA修复机制的发现
人们可能认为DNA像是布满灰尘的模板，DNA分子伴随着人类出生而出现，死亡时便消失。我们知道DNA（即脱氧核糖核酸）是由核苷酸重新排列的一类具有长键的生物高分子，它是由两条主链形成的双螺旋结构。在细胞核中，它是组成遗传基因信息的一类重要功能分子。然而DNA不仅如此，它还能够真实地作为一个细胞内部的计算机，直接培育形成，并对细胞自身修复受损部位。简言之，这是维持人类长寿的关键因子，DNA有能力改变和修复人体受损组织，如癌症和其他突变引起的损伤一样能够由DNA的自身修复功能来完成。
DNA是一种化学分子，必然在生物体内会发生各种化学反应，则发生化学反应的分子是如何修复的呢？基于此，科学家们一直对DNA的修复机制的研究充满了兴趣。
诺贝尔化学奖的得主托马斯·林达尔、保罗·莫德里奇和阿齐兹·桑贾尔各自独立地阐明了与人类相关的若干DNA修复过程。托马斯·林达尔一直从事癌症方面的研究，自然少不了对DNA修复机制的研究；保罗·莫德里奇早在杜克大学教授生物化学时，就专注于研究DNA的错配修复；而阿奇兹·桑贾尔专门从事DNA修复、细胞周期检查点和生物钟方面的研究，他花费了较长的时间研究光解和光激活的机制，直接观察到了光解酶修复胸腺嘧啶二聚体的过程（即下面即将提到的直接修复）。
“DNA到底有多稳定？”，托马斯·林达尔早在20世纪60年代末就对这个问题深感好奇。那时，科学界相信作为生命基础的DNA分子必须极度坚实，没有别的可能性。生物体要生长必然要经历演化的过程，而生物演化需要突变的存在，但每一代的突变都是有限的。如果遗传信息太过不稳定，多细胞生物就无法存在了。在美国普林斯顿大学当博士后的时候，林达尔研究RNA—一种与DNA相近的分子。研究很不顺利。在实验中，他必须加热RNA，但这个过程不可避免地会导致RNA快速降解。如果RNA在受热时都被毁灭得如此迅速，具有相似性的DNA真的能一辈子保持稳定吗？
几年后，林达尔进入瑞典斯德哥尔摩的卡罗林斯卡学院。一些实验验证了他的怀疑：DNA其实会发生缓慢但可观测的降解。据林达尔估计，基因组每天会发生数千起灾难性的潜在损伤，人类能在地球上得以延续，这些损伤显然不可能真的发生。他的结论是，肯定有分子机制负责对这些DNA缺陷进行修复。本着这个思路，托马斯·林达尔打开了通向崭新研究领域的大门。
和人的DNA一样，细菌DNA同样由核苷酸的四种碱基腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）组成[1]。托马斯·林达尔开始利用细菌DNA来寻找修复酶。DNA的化学弱点之一，它的胞嘧啶（C）很容易丢失一个氨基，这可能导致遗传信息改变。在DNA的双螺旋中，C总是与G配对，但当氨基丢失后，受损的碱基往往与A配对[2]。因此，如果允许这个缺陷继续存在，下一次DNA复制时就会发生一次突变。林达尔意识到，细胞对此必存在某种防范机制。随后，他成功发现，有一种细菌酶能去除DNA里受损的胞嘧啶。1974年，他发表了这一发现。
之后35年的成功工作就此展开，在此期间，托马斯·林达尔发现并研究了许多细胞用来修复DNA所用的工具蛋白。在20世纪80年代初，他因缘际会来到英国，在伦敦他接受了帝国癌症研究基金会（Imperial Cancer Research Fund）的一个职位。1986年，他成为了新成立的剑桥大学克莱尔学堂实验室（Clare Hall Laboratory）主任，这个实验室随后以其科学创造力而闻名遐迩。
一点一滴，林达尔拼起了“碱基切除修复（base excision repair）”是如何作用的分子图景，证实了糖基化酶（glycosylases）正是DNA修复过程中的第一步，这种酶很类似他在1974年发现的那个细菌的酶。碱基切除修复也发生在人类身上，1996年，托马斯·林达尔还在体外设法重建了人类的修复过程。
对于托马斯·林达尔而言，关键的一点是意识到了DNA不可避免地会发生变化，哪怕是当分子位于细胞的保护性环境中时也不例外。于是，他完成了“碱基切除修复”的拼图[4]。
但是，我们早已知道DNA会因环境因素如UV辐射而受到损伤。林达尔并没有发现并阐述这一受损过程是如何被修复的，而多数细胞用于修复紫外线伤害的机制“核苷酸切除修复”是被阿齐兹·桑贾尔阐明的。
桑贾尔出生于土耳其的萨武尔，活跃于美国研究界。他对于生命分子开发的痴迷是在伊斯坦布尔攻读医学学位的时候培养起来的。毕业之后，他在土耳其的乡下当了几年的外科医师，但1973年时，他决定学习生物化学。他的兴趣是被一个特别的现象所激发的：细菌暴露在致命的紫外线照射下之后，如果再用可见蓝光照射，它们突然就能死里逃生。桑贾尔对这近乎魔法的反应感到非常好奇，这是一种怎样的化学功能？
一位名叫克劳德·鲁珀特（Claud Rupert）的美国人当时在研究这一现象。于是阿齐兹·桑贾尔加入了他在达拉斯的德克萨斯州大学实验室。1976年，使用当时的粗糙工具，他成功地克隆出能修复被紫外线损伤的DNA的酶——光解酶的基因，并成功让细菌批量生产这种酶。这成为了他的博士论文，但在当时，并没有引起很多反响。他申请了三次博士后职位，却都遭到了驳回。对于光解酶的研究也被搁置了。为了继续对DNA修复进行研究，阿齐兹·桑贾尔在耶鲁大学医学院（这是业内领先地位的机构）找了个实验室技术员的工作。在这里，他的工作最终让他获得了诺贝尔化学奖。
当时，人们已经知道细菌有两套修复紫外线损伤的机制：一条系统是依赖光的作用的“光修复”，需要光解酶；另一个系统则可以在暗处发挥作用。阿齐兹·桑贾尔在耶鲁大学的新同事们从二十世纪六十年代中叶就开始研究暗修复系统，研究对象是三个对紫外线敏感的细菌突变系，这三个细菌系中分别有不同的基因发生了突变，分别被称为UVRa、UVRb与UVRc[5]。
就像此前对光修复的研究一样，桑贾尔开始探索暗修复的分子机制。只花了几年的时间，他就鉴定、分离与描述了这三个基因编码的酶。在突破性的体外实验中，他证明了这些酶可以发现紫外线伤害的位点，然后在DNA链上切开两个切口，分别发生在紫外线损害位点两侧。一段12～13个碱基对的片段，包括损伤位点，就这样被切掉了。
阿齐兹·桑贾尔从分子水平的细节中获取对这一途径认知的能力改变了整个研究领域。他在1983年发表了他的研究。这样的成就让他获得了北卡罗来纳大学教堂山分校的副教授职位。在那里，他又一次漂亮地完成了对核苷酸切除修复机制的下一阶段的研究工作。桑贾尔与其他研究人员——包括托马斯·林达尔——同时进行着人类中的核苷酸切除修复的研究。在人体中，紫外线损伤修复的机制远比细菌中的程序复杂，但是从化学上来说，所有有机体里的核苷酸切除修复都是类似的[7]。
然后，桑贾尔最初感兴趣的光修复又怎样了呢？最后他还是回到了光解酶，找到了它“复活”细菌的机制。另外，他还证明，人类体内相应的酶帮助我们建立了生物钟。
接下来就是保罗·莫德里奇的工作了。他也是从关于基因修复机制的模糊概念出发，从中雕琢出了美妙的分子细节。
保罗·莫德里奇在美国新墨西哥州北部的一个小城镇长大。当地多种多样的广袤风景激发了他对大自然的兴趣。但是有一天，他教生物的父亲说：“你应该研究一下DNA那套东西。”那是在1963年，詹姆斯·沃森和弗朗西斯·克里克因发现DNA结构而获得诺贝尔奖的第二年。
几年后，“DNA那套东西”真的成为了保罗·莫德里奇生活的中心。在他研究生涯的早期，在斯坦福大学做博士研究生、在哈佛大学做博士后以及在杜克大学做助理教授的时候，他检验了一系列作用于DNA的酶：DNA连接酶，DNA聚合酶和限制性内切酶。随后，当他在20世纪70年代末将注意力转移到Dam甲基化酶时候，他不小心碰到了另一件“DNA那套东西”上，占据了他科学生涯的一大部分。
Dam甲基化酶能够给DNA加上甲基基团。保罗·莫德里奇证明，这些甲基基团可以像路标一样起作用，帮助某个特定的限制性内切酶在正确的位置切断DNA链。但是，就在几年前，马修·梅塞尔森（Matthew Meselson），一位哈佛大学的分子生物学家，认为DNA甲基基团还有另一种信号作用。
利用一些分子生物学技巧，梅塞尔森改造出了一种噬菌体，它的DNA中有几个不匹配位点。譬如，A（腺嘌呤）对面可能是C（胞嘧啶），而不是它本来应该配对的T（胸腺嘧啶）。让这些噬菌体感染细菌，细菌就会修复错误的配对。没人知道细菌为什么有这个功能，但是在1976年，梅塞尔森提出，这可能是因为细菌自己本身存在的修复机制，来修复这些有时在DNA复制时出现的错误。如果推测是正确的，梅塞尔森继续推测，可能DNA上的甲基基团帮助细菌确认，纠正的时候哪个是原来的模板，哪个是后来的错误。带有错误的新DNA链还没有甲基化，可能这就是它被识别并修正的方式？
在DNA甲基化的过程中，保罗·莫德里奇和马修·梅塞尔森的道路相交了。两人合作构建了一个具有一系列DNA错配的病毒。这一次，莫德里奇的Dam甲基化酶也被用于在其中一条DNA链上添加甲基。当这些病毒感染细菌时，细菌持续地修正那些未经甲基化的、错配的DNA。莫德里奇和梅塞尔森的结论是，DNA的错配修复是一个天然的过程，在DNA复制过程中，以未甲基化为标志来识别出错的DNA链。
保罗·莫德里奇的这个发现引发了长达十年的系统性工作——克隆和测定错配修复过程中一个又一个酶。到20世纪80年代末，他已经可以体外重建这套复杂的分子修复机理，并且深入了解它的细节。这项工作在1989年发表[8]。
和托马斯·林达尔、阿齐兹·桑贾尔一样，保罗·莫德里奇也研究了人类版本的修复系统。今天我们知道，在人类基因组复制时产生的所有错误中，只有千分之一逃过了错配修复的法眼。但是，在人类错配修复中，我们仍然不能确切地知道怎么判断哪条链是原本的链。DNA甲基化在我们的基因组中有与微生物中不同的功能，所以，一定是什么别的东西在掌管究竟应该修复哪条链——这个东西是什么还有待查明。
除了碱基切除修复、核苷酸切除修复和DNA错配修复这三种，还有其他多种机制维护着我们的DNA。每天，它们修复几千起因为日照、吸烟或其他遗传毒性物质导致的DNA损伤；它们不断抵抗着DNA的自发改变。而且，每一次细胞分裂，错配修复都会纠正几千个错配。没有这些修复机制，我们的基因组将会崩溃。其中哪怕只有一个机制失灵了，遗传信息就会很快改变，致癌风险也会增加。比如，DNA错配修复如果存在缺陷，就会增加患遗传性结肠癌的风险。
事实上，在很多类癌症中，就是上述一到多个修复体系部分地或者全部地被关闭了。这使得癌细胞的DNA变得不稳定，这也是癌细胞经常突变且能够抵抗化疗的原因之一。
同时，这些生病的细胞会更加依赖还在正常工作的修复体系：没有剩下的这些修复体系，它们的DNA受到的损伤会过于严重，细胞也会死亡。研究者试图利用这种弱点来研发新的抗癌药物。通过抑制残留的修复体系，人们可以减缓或者完全阻止癌症的生长。譬如，奥拉帕尼（olaparib）就是一种可以抑制修复体系的抗癌药物。
我们人体的分子装置一直受到周围环境的攻击。活性化学物质使其腐败，高温使其折叠结构改变而变性。紫外线则会使其分解，多数情况下，它们被损坏而无法正常地发挥作用。细胞可以无情地抛弃受损的蛋白质，却承担不起抛弃DNA的代价。DNA必须维持完美的构型，因为它负载着遗传信息，指导着细胞的生命进程并遗传给下一代，为确保这一遗传信息不丢失，细胞具备了多种不同的方式保护DNA免于受损，并在其受损时修复它们[9]。
随着研究的推进，我们对修复机制和修复过程有了更为深入系统的了解。在包括人类在内的哺乳动物中，细胞内不同的DNA受损主要通过六种方式修复：①直接修复（direct repair，DR）：直接修复DNA的烷基化损伤；②碱基切除修复（base excision repair，BER）：主要修复内源性的氧化、烷基化和脱氨基的碱基损伤；③核苷酸的切除修复（nucleotide excision repair，NER）：主要修复外源性辐射、化学物质及蛋白质形成的DNA加成物；④错配修复（mismatch repair，MMR）：修复自发产生的和碱基脱氨基、碱基氧化及碱基甲基化等导致的碱基错配；⑤同源重组修复（homologous recombination repair，HR）和⑥非同源末端连接（non-homologous end-joining repair，NHEJ）：均修复DNA双链断裂。故而，要想研究细胞内的DNA修复机制是如何运行的，首先就要对DNA修复的六种途径进行分析[10]。
2 DNA修复途径
细胞的DNA不断遭受内源性和外源性物质的袭击：内源性物质引起的损害包括正常代谢中产生的活性氧引起的氧化作用；来自环境的外源性损伤物质包括化学物质、致癌物质、紫外线和化学治疗药物及电离辐射等。DNA损伤的类型决定DNA修复的途径，从图5的脉络中我们可以看到于DNA修复的六种途径，以下我们主要介绍两种。
2.1 直接修复
有时称为“直接逆转”，该修复途径是针对DNA由于外源性的损伤物质（比如紫外线）而引起的损伤修复机制。通过微电子显微镜可以观察到长期受紫外线照射会使得DNA中相邻的两个嘧啶碱基通过共价键桥接起来造成损伤，这样的双嘧啶键结构与DNA自身的双螺旋结构是不匹配的，如果不将其除去就无法完成遗传因子的复制。细胞的直接修复可移除DNA分子中受损碱基的改变部位，而非切除受损碱基。所以，该途径是通过DNA光解酶催化来完成的，将双嘧啶键解分为两个正常的单体，使DNA恢复原貌，恢复为正常的双螺旋。
在可见光（300～600nm）活化之下，由光复活酶催化胸腺嘧啶二聚体分解为单体的修复机制如图6显示，这也是阿奇兹·桑贾尔研究发现的。
2.2 碱基切除修复（BER）
构成DNA的腺嘌呤和胞嘧啶会发生自然的脱氨基化，生成次黄嘌呤和尿嘧啶，引起损伤。因此，碱基切除修复途径主要是修复单个碱基受损的情况，包括：N-烷基化嘌呤；5-羟基胞嘧啶；尿素及其他加合物。DNA糖基化酶能识别，并将它们与糖苷键切断，切除受损的碱基，脱氧核糖上留下无碱基位点，启动修复过程。出现无碱基位点时，利用核酸内切酶将空位的磷酸键移除，形成空缺，最后通过DNA聚合酶和酶的作用完成修复过程[12]。
3 DNA修复机制的前景
随着研究的深入，对于DNA修复机制的应用也越来越广泛。科学家用实际的探索向世界证实了：DNA修复并非空谈。在了解了DNA修复机制的修复过程后，针对DNA修复系统进行抗肿瘤药物的研发，近几年来发展迅速。
细胞中这么多DNA，全都是从一开始受精卵里那两米长的DNA复制来的。所有化学进程都是不精确的，这几十亿次的复制之后早就应该错得没边儿了，何况细胞还在每天承受活性分子和辐射带来的损伤。但是我们大部分人都活得还挺好，基因也没有变成一堆乱码。我们体内有一群蛋白质专门负责看管DNA。它们持续不断地校对基因组，发现损伤就立刻着手修复[14]。2015年的诺贝尔化学奖表彰的就是发现这一修复机制的化学家。生命要想存活下去，遗传物质必须相对稳定。最早时候，人们觉得DNA本身就特别结实，根本就不需要修护。林达尔发现，DNA其实没有人想象的那么结实，你要把DNA单独拿出来，它很容易坏，但是在人体内却没坏，就证明它肯定是有什么特殊的机制在起作用。从他才开始意识到我们需要这么一个机制。
事实上，许多类型的癌症就要归结于这些机制的失灵，但得是部分失灵。全部机制都完好的话，新的错误就很难产生，癌症就不容易发展；但如果所有机制都坏了，细胞就承受不了错误，会很快死掉。许多癌症药物都是以破坏癌细胞残存修复机制为目标的。因此，2015年诺贝尔化学奖不但增进了我们对细胞的了解，还可能成为许多拯救生命药物的来源。
准确地说，很多种癌症发病的一个重要因素就是某些修复机制坏了，为什么会有癌症？癌症是因为正常的细胞出现了突变，或DNA出了错，它不按照本来正常规定工作去运行，修复机制完好的时候，它也不是万能的，之前说一般它的修复率可能一千个里面会漏掉一个，它也会犯错误。但是在修复机制完好的时候，癌症是比较难出现的，一旦众多修复机制有一两个坏掉了，这时候犯错误的概率大大增加，即细胞失灵突变成癌细胞的概率大大增加了。修复机制也是随机突变导致的，但是现在我们知道，它坏了可以想办法修复它，或者是就反过来让它坏得更彻底，让癌细胞彻底死掉，这是对待癌症思路之一。由此可见，能够找到适用的DNA修复机制就是找到了修复“生命密码”，癌症不再是无法战胜的。
4 意义和启发
2015年诺贝尔化学奖的三位得主分别发现了三种DNA修复机制，这些基础研究不仅加深了我们对于自身运转方式的理解，而且有助于继续研发可以拯救生命的治疗方法。如果我们回过头来总结一下，就会发现，他们的身上都具有一些相同的特质，这就是好奇心、不迷信权威和坚持到底的精神。
与其同时代的研究人员都认为DNA如此稳定、如此强大，完全不需要任何修复。但托马斯·林达尔在做关于RNA的分子实验时，由于发现它特别不稳定，很容易分解，却能联想到它的近亲DNA是否也会具有相似的性质？秉持着这份有依据的好奇心，他开始了一次次的实验，终于检测到DNA也不像普遍认为的那样强大。而阿齐兹·桑贾尔的研究实际上也是从一个失败开始的，但他一旦决定了DNA的研究方向，就会对实验中的错误和失败展开锲而不舍的追问和探究，并最终取得了丰硕的研究成果，也获得了世人的肯定和激赏。
我们现在也已知，RNA和DNA的修复机制是多种多样的，这也是科学家们在前人研究的基础上不断摸索前行，开拓新领域的结果。或许，诺贝尔奖获得者，不论其研究领域属于哪个方向，他们的科研经历和共通的品质特性，或多或少，都会对我们的学习有所启迪！
参考文献：
[1][3][12] 柴国林，朱卫国. DNA的损伤与修复[J].中华肿瘤杂志，2005，（10）：577～580.
[2][5] P. Somnath， B. Nilanjana， C. Aditi， et al. Arsenicinduced Promoter Hypomethylation and Over-expression of ERCC2 Reduces DNA Repair Capacity in Humans by Nondisjunction of the ERCC2-Cdk7 Complex [J]. Metallomics，2014，（4）：864～873.
[4] T. Lindahl， R. D. Wood. Quality Control by DNA repair [J]. Science，1999，（286）：1897～1905.
[6][10][14] N. Shrivastav， D. Li， and J. M. Essigmann. Chemical Biology of Mutagenesis and DNA Repair： Cellular Responses to DNA Alkylation [J]. Carcinogenesis，2009，（31）：59～70.
[7] Dragony Fu， Jennifer A， Calvo， Leona D， Samson. Balancing Repair and Tolerance of DNA Damage Caused by Alkylating Agents [J]. Nature Reviews Cancer， 2012，（12）：104～120.
[8] A. Sancar， L. A. Lindsey-Boltz， K. Unsal-Kacmaz， S. Linn. Molecular Mechanisms of Mammalian DNA Repair the DNA Damage Checkpoints [J]. Annual Review of Biochemistry，2004，（73）：39～85.
[9][美]古德赛尔著.王新国译. 生命与死亡——《图解生命》[M].中国青年出版社，2013：121～129.
[11] A. Sancar. Structure and Function of DNA Photolyase and Cryptochrome Blue-light Photoreceptors [J]. Chemical Reviews，2003，（103）：2203～2237.
DNA损伤修复 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
人结肠癌细胞株HCT116,购于南京凯基生物公司。HCT116/L-OHP为本实验室自行诱导,对L-OHP耐药倍数达17.00倍。SD(Sprague-Dawley)大鼠30只,(4～6)周龄,清洁级,雌雄各半,体重为(190g±20)g,购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司(生产许可证号为SCXK (沪)2003-0002)。肠胃清方:由生黄芪、白术、猪苓等组成,1ml汤药含生药2.66g,由本院制剂室熬制。RPMI Medium1640、小牛血清培养基购于Gibico公司,MTT购于Sigma公司,Western blot显色液购于Promega Biotech公司,ERCC1、XPF一抗购于Labvision/NeoMarkers公司,XRCC1、XRCC2～抗购于millipore公司,内参一抗、二抗购于北京博奥森公司,AP位点检测试剂盒购于Cell Biolabs公司。
1.2 细胞培养
HCT116细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(含青霉素、链霉素各100 U/mL)中,HCT116/L-OHP培养在含4μmol/L L-OHP的上述培养液中,于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中常规培养。细胞呈单层贴壁生长。传代时用0.25%胰酶溶液消化。
1.3 药物血清的制备
SD大鼠30只,雌雄各半,随机分为2组,每组15只,A组:肠胃清药物血清组,将肠胃清复方按成人体重用药剂量将生药换算为50 g/kg的浓度给大鼠灌胃;B组:空白对照组,灌服等体积的生理盐水。连续给药5天,末次给药后禁食(12 h)不禁水2小时后,3%戊巴比妥钠(1.5mL/kg)腹腔麻醉,常规消毒后打开腹腔,在无菌条件下行腹主动脉采血,离心,分离血清,56℃水浴30 min灭活,使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌分装,-80℃冰箱保存备用。
1.4 药物血清联用浓度确定
确立HCT116和HCT116/L-OHP细胞株生长无毒性(细胞存活率在90%以上)的含药血清浓度,选择最大无毒剂量的药物血清作为联用浓度。分别取对数生长期细胞株调整细胞浓度至1×105/mL,以每孔100μL(即每孔1×104个细胞)接种于96孔细胞培养板中,背景组加入等体积的培养液,将药物血清按不同浓度分组为:空白血清,2.5%、5%、10%、20%药物血清,各自加入含不同浓度药物血清100μL,实验终止前4小时,每孔加入5mg/mL的MTT(Methyl thiazoly tetrazolium,四甲基偶氮唑盐)溶液20μL,37℃避光继续孵育4小时,加入二甲基亚砜(DMSO)150μL,震荡混匀于酶标仪检测570nm波长处吸光度OD值。计算细胞的存活率,并以药物血清的不同浓度和细胞的存活率作图,选择最大无毒剂量的药物血清作为联用浓度。以背景组平均值调零,按照以下公式计算其存活率:细胞存活率=[试验组OD平均值-背景组OD平均值]/[空白对照组OD平均值-背景组OD平均值]×100%。每个浓度平行4孔,分别设5个浓度级给予处理,实验重复三次。
1.5 药物血清逆转人结肠癌耐药细胞株
HCT116/L-OHP的多药耐药性分别联合含不同浓度化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、顺铂(Diamminedichloro platinum,DDP)、羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydrol Camptothecin,HCPT)、奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)的培养液作用于HCT116/L-OHP细胞株,每个浓度平行4孔,分别设5个浓度级,对照组和空白对照组加入等量体积的培养液,按MTT法实验(方法同上),计算肿瘤细胞的存活率,并以不同化疗药物的不同浓度和细胞的存活率作图,确定细胞的半数抑制浓度(IC50)、抗药因子(Resistance factor,RF)和逆转指数(reversal index,RI)。半数抑制浓度(IC50)=细胞存活率达到一半时的药物作用浓度,抑制率=1-存活率,抗药因子=某种药物针对抗药性细胞的IC50/某种药物针对敏感性细胞的IC50,逆转指数(RF)=不加逆转剂时某种药物针对抗药性细胞的IC50/加入逆转剂后某种药物针对抗药性细胞的IC50。
加入药物及浓度如下:
1.6 联用L-OHP浓度的确定
取对数生长期细胞,加入含不同浓度[(6.25、12.5、25、50、100和200)μg/ml]L-OHP的培养液,L-OHP+肠胃清组同上述药物浓度并加入7.5%的肠胃清药物血清,药物血清组以及空白血清组用等体积培养液,每浓度平行3孔,MTT法测细胞存活率(方法同上)。
1.7 Western blot法检测DNA损伤修复蛋白
取对数生长期的两种细胞稀释至1×105cell/ml接种于10cm平皿中。L-OHP组加入7.2μg/ml L-OHP的培养液,L-OHP+肠胃清组采用上述药物浓度并加入7.5%的药物血清,药物血清组以及空白血清组用等体积培养液,培养48 h后抽提细胞核蛋白。Bradford法测定蛋白质浓度,每孔50μg上样,12%SDS-PAGE凝胶电泳分离,通过电转移法将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜封闭液中室温下封闭1h,滴加1mL一抗溶液(说明书稀释相应倍数)4℃孵育过夜,PBST缓冲液充分漂洗(5min×3次),加入对应二抗(说明书稀释相应倍数),室温下结合2h,PBST缓冲液充分漂洗(5min×3次),5mL AP buffer(Alkaline Phosphatase)配置显影液NBT/BCIP,将膜置于显影液中,室温下温和摇动,直至条带清晰,置清水中洗5min,用凝胶成像系统记录结果。
1.8 AP位点的检测
两种细胞加药分组处理同上,抽提细胞总核酸,采用比色测定法测定AP位点[1],每个样本至少3孔。通过ARP(Aldehyde Reactive Probe)反应得标记AP位点的DNA。TE缓冲液稀上述样本至1μg/mL,每孔分别加50μL ARP DNA标准品和ARP标记DNA样本,及50μL DNA连接液,室温过夜,使标记的DNA结合在板表面。洗涤5次,每孔加100μL Streptavidin-Enzyme Conjugate结合,37℃,1小时,洗涤5次,每孔(包括空白组)加Substrate Solution 100μL,室温振动20分钟,加入100μL Stop Solution终止反应。450nm OD值的分光光度计读数。标准ARP-DNA溶液制作校正曲线,根据校准曲线,测定基因组DNA样本脱碱基位点的数目(每105bp)。对比处理样本和对照样本AP位点的数目,测定DNA损伤的水平。
1.9 统计方法
计量资料描述用均数±标准差表示。多个均数比较,先作方差齐性检验,方差齐者采用SNK-q检验(StudentNewman-Keuls法),方差不齐者用近似F值检验,两两比较Tamhane法。统计分析软件:SPSS 11.0。统计学处理IC50用线性回归法。耐药比较采用t检验。率的比较采用精确概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 药物血清联用浓度
本次实验选择药物血清作用48小时后细胞存活率>90%的药物剂量(最大无毒剂量)作为药物联用浓度,实验结果显示:0%～10%的药物血清为无毒使用范围,7.5%药物血清浓度时,HCT116及HCT116/L-OHP的细胞存活率分别为92.85%、95.86%(见图1),因此确定7.5%的药物血清浓度为联用浓度。
2.2 药物血清逆转人结肠癌耐药细胞株
HCT116/L-OHP的多药耐药性使用7.5%的肠胃清药物血清分别与L-OHP,5-FU,DDP,HCPT联合应用,结果显示:肠胃清药物血清联合化疗药物后,能逆转耐药细胞的耐药倍数,L-OHP对耐药细胞的IC50值从250.38μg/mL下降到32.45μg/mL,逆转倍数为7.15倍,对于其他不同结构的化疗药物也有逆转作用(P<0.01),见表1。
与HCT116比:△△P<0.01;与HCT116/LOHP比:**P<0.01
2.3 L-OHP浓度的确定
本次实验结果在48小时作用后,在7.2μg/ml L-OHP浓度的各组中,细胞存活率均大于50%。如图2:
*p<0.05,**p<0.01与对应HCT116细胞处理组相比;#p<0.05与L-OHP处理组相比。
2.4 DNA损伤修复相关蛋白的检测
本次实验显示,人结肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP中XRCC1、XRCC2、XPF、ERCC1的含量较HCT116均显著增多(P<0.05);结肠癌细胞HCT116经L-OHP作用后XRCC1、XRCC2、ERCC1蛋白含量显著减少(P<0.05),L-OHP与肠胃清药物血清联合作用后,XRCC1、XRCC2、XPF、ERCC1较L-OHP组均显著减少(P<0.05);耐药细胞株HCT116/L-OHP中XRCC1、XRCC2、XPF、ERCC1蛋白含量与对照组比较变化均无统计学意义,但L-OHP联合肠胃清药物血清组与对照组相比XRCC2、XPF、ERCC1蛋白含量有减少趋势。如图3、图4:
(A)XRCC1蛋白表达情况。*p<0.05与同株细胞对照组相比;#p<0.05与HCT116细胞株对应处理组;&p<0.05与同株细胞株L-OHP处理组。(B)XRCC2蛋白表达情况。*p<0.05与同株细胞对照组相比;#p<0.05与HCT116细胞株对应处理组;&p<0.05与同株细胞株L-OHP处理组。(C)XPF蛋白表达情况。*p<0.05与同株细胞对照组相比;#p<0.05与HCT116细胞株对应处理组;&p<0.05与同株细胞株L-OHP处理组。(D)ERCC1蛋白表达情况。*p<0.05与同株细胞对照组相比;#p<0.05与HCT116细胞株对应处理组;&p<0.05与同株细胞株L-OHP处理组
2.5 AP位点的检测
本次实验显示,人结肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP中AP位点表达较HCT116显著减少(P<0.05);结肠癌细胞HCT116经L-OHP、L-OHP与肠胃清药物血清联合作用后AP位点的表达均显著增加(P<0.05);人结肠癌耐药细胞株HCT116/L-OHP细胞AP位点表达经各组干预后,与对照组比较变化均无统计学意义。如图5:
*p<0.05与对应细胞空白对照组相比;#p<0.05与HCT116细胞对应处理组相比。
3 讨论
草酸铂(L-OHP)是近年来被推荐的Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌的一线治疗药物,它的特点是对顺铂、卡铂的耐药株均有显著的抑制作用[2]。铂类药物攻击的主要靶点是DNA,它与细胞核内基因DNA的结合决定了其抗癌活性,并且这种结合会干扰正常DNA复制,最终导致癌细胞死亡[3]。因此DNA损伤修复能力是癌细胞是否对铂类耐药的重要分子机制,而碱基切除修复(base excision repair,BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)是DNA损伤修复的重要形式[4]。在该损伤修复机制中,与铂类耐药相关研究最多的是ERCC1,其活性的高低可反映整个NER修复活性的水平,Lin K等[5]对91例Ⅲ-Ⅳ期的上皮性卵巢癌患者进行卵巢组织的免疫组化分析,发现耐药组ERCC1表达水平显著高于敏感组,接受新辅助化疗的患者,其表达水平比化疗前增高23%,提示ERCC1的表达增加与以铂类化疗为基础的化疗耐药的形成有关。实验研究证实Cetuximab、Fludarabine等可通过抑制ERCC1活性增强肿瘤细胞对铂类及作用于细胞DNA抗癌药物的敏感性[6]。XRCC研究较少,有报道其水平增高与癌细胞铂类耐药有关[7]。
本次研究表明,XRCC1、XRCC2在BER中发挥重要的作用,AP位点是最常见DNA损伤中的形式。XRCC1在BER修复途径中充当支架和不同活性的调节者的作用,提供了一个AP位点修复过程切除和修复步骤的联结作用,而且有效地刺激它和核酸内切酶活性。本次研究表明,耐药细胞HCT116/L-OHP中XRCC1、XRCC2、XPF、ERCC1的含量均明显增多(p<0.05),XRCC 1、XRCC2又可增加AP位点的修复功能,与本次研究耐药细胞株中AP位点明显减少相一致(p<0.05),由此我们可以推测耐药细胞株可能是增加了XRCC1、XRCC2的含量,减少AP位点,增加DNA的BER能力;增加的XPF、ERCC 1,则提高了DNA的NER水平,(对于另一途径DNA加合物表达量的研究我们在接下来的研究中将继续经行),从而减弱了L-OHP对耐药细胞株DNA的损伤,产生耐药性。
结肠癌细胞HCT116经L-OHP作用后可减少中XRCC1、XRCC2、ERCC1蛋白的含量(p<0.05),增加AP位点的表达,表明BER能力降低,DNA损伤加重,再次提示L-OHP对于结肠癌细胞的攻击点与DNA损伤修复有关,与文献资料相一致。而对于耐药细胞株HCT116/L-OHP细胞各蛋白及AP位点影响有相同趋势,无统计学意义,再次表明其耐药性与细胞DNA损伤修复相关。L-OHP与肠胃清药物血清联合作用HCT116后,XRCC1、XRCC2、XPF、ERCC1较L-OHP组均显著减少(p<0.05),AP位点亦有增加趋势,表明肠胃清药物血清能够增加L-OHP对结肠癌细胞HCT116的DNA损伤,从而达到增加化疗效果的治疗目的。
耐药细胞株HCT116/L-OHP中XRCC1、XRCC2、XPF、ERCC1蛋白含量,AP位点表达经各组干预后,与对照组比较变化均无统计学意义。但L-OHP联合肠胃清药物血清组与对照组相比XRCC2、XPF、ERCC1蛋白含量有减少趋势,表明肠胃清药物血清联合L-OHP对HCT116/L-OHP的BER作用不明显,对耐药细胞株DNA损伤较小,逆转耐药的效果较弱,提示我们之后可以通过DNA-加合物相关的NER进行研究。
综上所述,本次研究表明,结肠癌耐药细胞胞内的AP位点降低,进而增加细胞的修复能力,提高耐药性。L-OHP攻击结肠癌细胞,是通过降低BER、NER的能力,导致DNA损伤加重,干扰DNA复制,达到治疗目的。肠胃清能增加L-OHP的该项能力,但尚不能完全说明通过DNA损伤修复逆转耐药情况,提示可以对另一个相关指标铂-DNA加合物检测继续进行。
参考文献
[1] Prewett M,Deevi DS,Bassi R,et al.Tumors established with cell lines selected for oxaliplatin resistance respond to oxaliplatin if combined with cetuximab.Clin Cancer Res.,2007;13(24):7432-7440
[2] Samimi G,Manorek G,Castel R,et al.cDNA microarray-based identification of genes and pathways associated with oxaliplatin resistance.Cancer Chemother Pharmacol.,2005;55(1):1-11
[3] Boulikas T,Vougiouka M.Cisplatin and platinum drugs at the molecular level. (Review).Oncol Rep.,2003;10(6):1663-1682
[4] Saldivar JS,Wu X,Follen M,Gershenson D.Nucleotide excision repair pathway review I:implications in ovarian cancer and platinum sensitivity.Gynecol Oncol., 2007;107(1 Suppl 1):S56-S71
[5] Lin K,Ye D,Xie X.Protein expression levels of excision repair crosscomplementation group 1 and xeroderma pigmentosum D correlate with response to platinum-based chemotherapy in the patients with advanced epithelial ovarian cancer.Int J Gynecol Cancer.,2008;18(5):1007-1012
[6] Pepper C,Lowe H,Fegan C,et al.Fludarabine-mediated suppression of the excision repair enzyme ERCC1 contributes to the cytotoxic synergy with the DNA minor groove crosslinking agent SJG-136(NSC 694501) in chronic lymphocytic leukaemia cells.Br J Cancer,2007;97(2):253-259
DNA损伤修复 篇5
纤维性修复首先通过肉芽组织增生，溶解、吸收损伤局部的坏死组织及其它异物，并填补组织缺损，以后肉芽组织转化成以胶原纤维为主的瘢痕组织，这种修复便告完成。
一、肉芽组织
肉芽组织(granulation tissue)乃由旺盛增生的毛细血管及纤维结缔组织和各种炎性细胞组成，肉眼表现为鲜红色，颗粒状，柔软湿润，形似鲜嫩的肉芽故名。
镜下可见大量由内皮细胞增生形成的实性细胞索及扩张的毛细血管，向创面垂直生长，并以小动脉为轴心，在周围形成袢状弯曲的毛细血管网。在毛细血管周围有许多新生的纤维母细胞，此外常有大量渗出液及炎性细胞(图2-4)。炎性细胞中常以巨噬细胞为主，也有多少不等的中性粒细胞及淋巴细胞,因此肉芽组织具有抗感染功能。巨噬细胞能分泌pdgf、fgf、tgf-β、il-1及tnf，加上创面凝血时血小板释放的pdgf，进一步刺激纤维母细胞及毛细血管增生。巨噬细胞及中性粒细胞能吞噬细菌及组织碎片，这些细胞破坏后释放出各种蛋白水解酶，能分解坏死组织及纤维蛋白，肉芽组织中毛细血管内皮细胞亦有吞噬能力，并有强的纤维蛋白溶解作用。
肉芽组织中一些纤维母细胞的胞浆中含有肌细丝，有收缩功能，因此应称为肌纤维母细胞(myofibroblast)。纤维母细胞产生基质及胶原。早期基质较多，以后则胶原越来越多。
DNA损伤修复 篇6
组蛋白2A变异体 ( histone family 2A variant, H2AX) 是核心组蛋白H2A的一个亚型。有研究发现,DNA双链断裂后可诱导位于丝氨酸139位C端保守区域内的H2AX磷酸化,形成 γH2AX。利用激光共聚焦显微镜可直接观测到细胞核内 γH2AX焦点数,直观地了解DNA双链断裂的情况,并进行DSBs的定性、定位及定量。目前,采用 γH2AX特异性抗体进行的免疫荧光检测方法已成为衡量DSBs发生的金标准[5,6,7],γH2AX产生的数量可判断DNA双链断裂的程度[8,9]。J. A. Downs[10]的研究表明, DSBs修复后,γH2AX蛋白存在一个去磷酸化过程, γH2AX焦点逐渐消失,故可通过观察 γH2AX蛋白焦点数量的减少情况来检测DNA双链断裂损伤的修复情况。毛细血管共济失调突变基因( ataxiatelangiectasia mutated,ATM) 是一种在感应和传递DNA双链断裂损伤信号、启动损伤DNA修复中起重要作用的功能蛋白。DSBs诱导H2AX的磷酸化 主要是通 过ATM激酶来介导的,感应到损伤后,ATM丝氨酸1 981位发生自动磷酸化而激活,使ATM靶向下游底物H2AX、BRCA1、53BP1等[11]。有研究发现,其他类型的DNA损伤也可通过ATR和DNA - PK形成 γH2AX,但ATM所介导的 γH2AX的形成必定与DSBs的存在有关。因此,同一细胞内活化的ATM和 γH2AX同时出现是DSBs存在的强有力证据[12,13]。
H2O2是一种重要的化学性DNA诱裂剂,已成为生命科学研究细胞氧化损伤的重要工具[14]。为了研究DNA损伤修复相关基因在小鼠胚胎DNA损伤修复中的作用,本试验以H2O2为DNA损伤诱导剂构建小鼠胚胎DNA损伤模型,观察胚胎氧化应激后DNA损伤指标 γH2AX和磷酸化ATM ( Phosphorylation - ATM,ρATM) 蛋白的表达变化,以期为进一步了解胚胎DNA损伤修复机制奠定基础。
1材料
1.1试验动物
FVB小鼠,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室自繁,母鼠群养,公鼠独笼饲养,用颗粒饲料饲喂,自由采食、饮水,饲养室温为21 ~ 25 ℃,选用健康、3 ~ 5周龄的FVB母鼠进行超数排卵。
1.2主要试剂
PMSG,购自上海市计划生育研究所; HCG,购自宁波第二激素厂; 过氧化氢( 3% H2O2) 和Triton X 100,购自Sigma公司。
一抗Phospho - Histone H2A. X( ser139) ( 20E3) 兔单克隆抗体( Cell Signaling) ,配成10% 母液,使用时稀释度为1∶200; 一抗 ρATM( 10H11. E12) : SC 47739 ( SANTA CRUZ) ,配成10% 母液,使用时稀释度为1∶400。二抗荧光素标记羊抗兔Ig G抗体( Millipore) ,使用时稀释度为1 ∶1 000。荧光素标记羊抗鼠Ig G抗体( Cell Signaling) ,使用时稀释度为1 ∶ 200,二抗均避光保存于4 ℃冰箱。
小鼠胚胎体外操作液M2,参照《小鼠胚胎操作实验手册》( 第3版) 的方法进行配制; 透明质酸酶 ( HYT) ( 300 mg /L) ,将0. 3 g HYT溶于100 m L M2中配制而成; 小鼠胚胎培养液为KOSM和KOSM( - ) ( 去除KOSM配方中的L - 谷氨酞胺) ,以KOSM( - ) 为基础液,分别配制含有1. 5,1. 8,2. 1,2. 4 μmol/L H2O2的小鼠胚 胎培养液,标记为KOSM ( - ) + 1. 5 μmol / L H2O2、KOSM( - ) + 1. 8 μmol/L H2O2、KOSM ( - ) + 2. 1 μmol / L H2O2、KOSM ( - ) + 2. 4 μmol / L H2O2。
1.3主要仪器
实体显微镜( SMZ645) ,购自Nikon公司; 激光扫描共聚焦显微镜( LSM510 meta) ,购自Leica公司。
2方法
2. 1试验动物分组
按小鼠胚胎培养液所含的H2O2浓度梯度进行分组,分别为KOSM ( - ) + 1. 5 μmol/L H2O2组、 KOSM( - ) + 1. 8 μmol / L H2O2组、KOSM ( - ) + 2. 1 μmol / L H2O2组、KOSM( - ) + 2. 4 μmol/L H2O2组,以KOSM组及KOSM( - ) 为对照组。
2. 2小鼠的超数排卵
采用PMSG - HCG法进行超数排卵。取3 ~ 4周龄的雌性小鼠,12: 00注射5 IU的PMSG( 0. 1 m L) 到小鼠腹腔,48 h后再注射5 IU的HCG( 0. 1 m L) 。注射HCG后立即将母鼠放入公鼠笼中,公母鼠按1∶1比例交配过夜,公鼠为2 ~ 3月龄。
2. 3受精卵的体外培养
注射HCG 22 ~ 24 h后,脱颈椎处死小鼠,迅速剥离出输卵管,在实体显微镜下用一次性1 m L注射器在膨大部处撕开一个小口,受精卵团自动溢出,移入HYT( 300 μg / m L) 中静置2 ~ 3 min; 待颗粒细胞脱落后,收集形态正常的受精卵,用M2冲洗2 ~ 3遍,再用小鼠胚胎培养液冲洗2 ~ 3遍,移入预先平衡好的各试验组 的小鼠胚 胎培养盘 中,置于饱和 湿度、 37 ℃ 、5% CO2的培养箱中培养24 h; 于实体显微镜下观察记录各试验组2 - 细胞胚胎的发育情况,计算分裂率; 96 h后再观察并记录其囊胚的发育情况,计算囊胚率。
2. 4免疫荧光检测
分别收集各试验组体外培养的1 - 细胞和2 - 细胞期小鼠胚胎,放于含4% 多聚甲醛的PBS中室温固定30 min; 在1% Triton X - 100 ( 用D - PBS配制) 中透化处理10 min; 1% BSA室温孵育1 h; 加一抗Phospho - Histone H2A. X( ser139) ( 20E3) 单克隆抗体或一抗 ρATM( 10H11. E12) 于4 ℃ 孵育过夜; 次日, 37 ℃ 孵育20 min; 用对应的二抗荧光素标记羊抗兔Ig G或二抗荧光素标记羊抗鼠Ig G,于室温避光孵育1. 5 h; 制成片子,在激光共 聚焦显微 镜下观察 γH2AX或 ρATM的表达情况。每组试验至少重复3次,每次取小鼠胚胎20 ~ 30个。免疫组化试验设置空白组( 以1% BSA替代一抗和二抗) 、阴性对照组1 ( 以1% BSA替代一抗,二抗不变) 、阴性对照组2( 以1% BSA替代二抗,一抗不变) 。
2.5数据分析
试验数据采用SPSS18. 0软件进行差异显著性分析,P < 0. 05为差异显著。
3结果与分析
3.1H2O2对小鼠胚胎发育的影响
用含不同浓度H2O2的培养液体外培养小鼠胚胎,观察H2O2处理对小鼠胚胎发育能力的影响,结果表明: 与KOSM对照组相比,KOSM( - ) 组小鼠胚胎的分裂率下降,但无显著差异( P > 0. 05) ; 囊胚率显著下降( P < 0. 05) 。与KOSM( - ) 对照组相比,随着H2O2浓度的增加,小鼠胚胎的分裂率和囊胚率呈下降趋势。从1. 8 μmol/L H2O2浓度开始,小鼠胚胎的分裂率和囊胚率均显著下降 ( P < 0. 05) ; 2. 1, 2. 4 μmol / L H2O2处理组间胚胎的分裂率和囊胚率无显著差异,2. 4 μmol/L H2O2处理的胚胎不能发育到囊胚期。以上结果说明1. 5 ~ 2. 4 μmol/L H2O2处理对小鼠早期胚胎发育均有影响,见表1。
3.2小鼠胚胎γH2AX和ρATM表达的检测
分别收集KOSM、KOSM( - ) 和1. 5,1. 8,2. 1, 2. 4 μmol / L H2O2处理组体外培养的1 - 细胞、2 - 细胞期胚胎,采用免疫荧光技术检测 γH2AX和 ρATM的表达情况,结果表明,KOSM和KOSM( - ) 对照组中2 - 细胞期胚胎的 γH2AX焦点数多于1 - 细胞期胚胎,ρATM在两对照组的两个时期胚胎中均未检测到。1. 5,1. 8 μmol/L H2O2处理组1 - 细胞期胚胎中均未检测到 γH2AX和 ρATM; 两处理组的2 - 细胞期胚胎表达 γH2AX,未检测到 ρATM。2. 1,2. 4 μmol/L H2O2处理组的1 - 细胞和2 - 细胞期胚 胎均有 γH2AX和 ρATM表达,其中2. 4 μmol / L H2O2处理组的两个时期胚胎 γH2AX焦点数高于2. 1 μmol/L H2O2处理组,说明2. 1,2. 4 μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎产生明显的DSB现象( 见295页彩图1、 图2) 。
注: 同列数据肩标字母不同表示差异显著( P < 0. 05) ,含有相同( P > 0. 05) 。
4讨论
H2O2作为一种化学性DNA诱导剂,能直接攻击DNA使其断裂或降解,产生自由基HO·,故H2O2常被用于建立DNA氧化损伤模型。R. G. Allen等[15]认为纳摩尔水平的活性氧可促进细胞增生,微摩尔水平的活性氧可导致细胞凋亡,毫尔摩水平的活性氧可引起细胞损伤死亡。在用H2O2处理卵母细胞及早期胚胎时,常采用相对较低的浓度[16,17]。韩荣勋[18]在小鼠胚胎发育的不同阶段添加不同浓度H2O2( 1. 5, 1. 8,2. 1,2. 4,2. 6 μmol / L) 处理时发现,随着外源性H2O2浓度的增高,囊胚发育率显著降低,外源性H2O2诱发小鼠1 - 细胞期胚胎体外发育阻滞的最低浓度是2. 1 μmol/L。本研究结果表明: 随着H2O2处理浓度的增加,小鼠胚胎的分裂率和囊胚率均呈逐渐下降趋势。当H2O2浓度为2. 1 μmol/L时,胚胎的分裂率和囊胚率显著低于对照组( P < 0. 05) ; 当H2O2浓度为2. 4 μmol/L时,小鼠胚胎发育停滞于2 - 细胞期,这与韩荣勋[18]的报道相一致。
ROS引起的氧化损伤对胚胎发育的影响是多方面且机制极其复杂,对胚胎氧化应激性DNA损伤的耐受情况如何,目前所知甚少。DSBs的形成可诱导H2AX组蛋白C端丝氨酸139位大量而迅速的磷酸化形成 γH2AX,其可作为评估各种化学或压力作用诱导的DNA双链断裂的生物学标志物[17,18]。有研究发现,H2AX可在H2O2引起的成熟精子氧化应激性DNA损伤处发生磷酸化,并发现Rad50和53BP1同时出现在损伤处,对DNA损伤产生了应答反应; 与体细胞不同的是,这些修复蛋白并没有发挥有效的DNA修复功能,推测它们在DNA损伤修复的机制中可能发挥着其他重要的作用[19]。S. K. Adiga等[20]采用3 Gy照射小鼠1 - 细胞和2 - 细胞胚胎后发现,在2 - 细胞期以后的胚胎细胞内检测到 γH2AX焦点, 因而认为 γH2AX在2 - 细胞期以后才参与胚胎细胞的DNA修复。本研究发现,未处理的对照组小鼠胚胎在2 - 细胞期的 γH2AX焦点数多于1 - 细胞期胚胎,这与S. K. Adiga等[20]的发现相一致。
H2AX的磷酸化与PI3K家族成员ATM、ATR及DNA - PK有关,DSBs所诱导的 γH2AX的形成多是由ATM所介导的; 因此,同一细胞内活化的ATM和 γH2AX同时出现是DSBs存在的强有力证据[13,14], 相关研究中也均是采用免疫荧光方法检测H2AX和ATM的磷酸化来监测DNA的损伤情况[21,22,23,24,25,26,27]。本研究分析了不同H2O2处理组早期胚胎的 γH2AX及 ρATM表达情况,以作为DSB的判断指标,结果表明: γH2AX和 ρATM在1. 5,1. 8 μmol / L H2O2处理组的1 - 细胞期胚胎中均未检测到; 2 - 细胞期胚胎表达 γH2AX,未检测到 ρATM。 当H2O2浓度为2. 1, 2. 4 μmol / L时,小鼠1 - 细胞和2 - 细胞期胚胎中可检测到 γH2AX和 ρATM的表达,且 γH2AX焦点数较多,说明过高的H2O2处理会导致胚胎DSBs现象增多。以上结果说明,2. 1,2. 4 μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎产生明显的DSB现象,2. 1 μmol/L H2O2处理为较适宜的诱导条件。
注: 浅色图是常光下拍摄的,深色图是激光扫描后拍摄的。
摘要：为了研究胚胎DNA损伤修复机制,试验以H2O2为DNA损伤诱导剂,建立小鼠胚胎DNA氧化损伤模型,采用不同浓度H2O2培养小鼠受精卵,观察其对小鼠胚胎发育能力的影响;再通过免疫荧光方法检测γH2AX和ρATM蛋白的表达状况,以判断H2O2处理所导致的胚胎DNA损伤情况及较适宜的诱导条件。结果表明:1.5~2.4μmol/L H2O2处理对小鼠胚胎发育能力具有影响,与KOSM(-)对照组相比,H2O2处理组小鼠胚胎的分裂率、囊胚率呈下降趋势,其中1.8~2.4μmol/L H2O2处理组的胚胎分裂率、囊胚率呈显著下降趋势(P<0.05)。免疫荧光法检测发现KOSM(-)对照组中,2-细胞期胚胎的γH2AX焦点数多于1-细胞期胚胎,ρATM在两个时期的胚胎中未检测到。γH2AX和ρATM在1.5,1.8μmol/L H2O2处理组的1-细胞期胚胎中均未检测到;2-细胞期胚胎表达γH2AX,未检测到ρATM。2.1,2.4μmol/L H2O2处理组的1-细胞和2-细胞期胚胎均有γH2AX和ρATM表达,其中2.4μmol/L H2O2处理组两个时期胚胎的γH2AX焦点数多于2.1μmol/L H2O2处理组。说明1.5~2.4μmol/L H2O2处理会影响小鼠胚胎体外发育能力,2.1,2.4μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎发生DNA双链断裂现象。
DNA损伤修复 篇7
1PM2.5概述
PM2.5又称细颗粒物, 指空气动力学当量直径小于等于2.5 μm的颗粒物[4](Dp≤2.5 μm)。
1.1 PM2.5的生成来源
1.1.1自然源包括土壤扬尘、真菌孢子、植物花粉、 细菌、火山灰、宇宙陨星尘、沙尘暴、森林火灾和裸露煤原大火产生的细颗粒物等。
1.1.2人为源包括固定源和流动源。固定源包括各种燃料燃烧源:发电、冶金、石油、纺织印染等各种工业、 采矿、供热取暖、垃圾焚烧、烹调过程燃煤与燃气或燃油排放的烟尘。流动源主要是交通工具使用燃料时排放的尾气,随着机动车数量的剧增,已成为城市PM2.5的主要来源。
1.2 PM2.5的特征PM2.5是一种本身具有毒性作用的细粒子,又可通过强富集效应而成为多种有害物质的载体。PM2.5的有害成分与其来源密切相关,且具有随时间变化的特点[5],常见的成分为有机污染物、重金属、水溶性离子盐类、细菌、病毒等,对机体健康的损害主要为前三者,并以前二者为甚,其极大促进致畸、致癌、致突变等遗传变异的发生[6,7,8,9]。PM2.5的粒径大小影响其沉降行为,0.20~2.50 μm的细颗粒物因重力作用可沉降于支气管表面,小于0.50 μm左右的细颗粒物可沉积在细小支气管分支和肺泡抑或透过血气屏障直接进入血循环[10]。PM2.5在空气中可停留30~70 d之长,并且输送距离可达数万公里而造成广域污染,严重威胁人群健康,WHO推荐使用PM2.5的浓度作为检测空气质量的指标[11]。
2PM2.5对DNA的损伤机制
目前关于PM2.5的损伤作用机制存在多种假说,对DNA的损伤机制主要认为是氧化损伤机制和DNA加合物形成机制[12],有时候也将后者归于前者。
2.1自由基氧化损伤机制PM2.5通过自由基产生氧化损伤的途径主要有以下几种。1吸附的重金属元素→体内→释放转运金属离子→大量自由基生成。 2PM2.5→肺泡上皮细胞和巨噬细胞等机体各类吞噬细胞吞噬→大量活性氧簇生成。3PM2.5→自身表面化学效应→自由基生成。4颗粒物本身含有丰富的自由基, 每g浓度多为1×1016~1×1017个自旋。5PM2.5→细胞内Ca2+浓度升高或超载→Ca2+稳态失衡→DNA降解、 促进自由基生成。6PM2.5所含的多环芳烃(PAHs)→体内代谢→羟基自由基、超氧阴离子[13]。上述途径生成的自由基可引起DNA氧化应激损伤。
2.2 DNA加合物形成机制PM2.5富集有多种对人体极为有害的PAHs,如苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a] 芘、二苯并[a.h]蒽、苯并[g,h,i]芘等,这些物质有着不同程度的“致畸、致癌、致突变”效应。PAHs在体内生物转化为二氢二醇环氧苯并芘(7,8-dihydrodiol-9.10-epoxide benzo[a]pyrene BPDE)并与DNA亲和位点鸟嘌呤外环氨基端共价结合成BPDE-DNA加合物。PM2.5中的某些金属成分也可引起DNA形成加合物,如Fe2+介导8-OHd G加合物的形成。DNA加合物改变DNA的结构,如果不能及时修复或修复错误,则诱导基因突变[14]、 活化癌基因并抑制正常基因和肿瘤抑制基因的表达, 改变生物的遗传特性,增加罹患肺癌、皮肤癌、膀胱癌和胃癌等恶性肿瘤的风险。
3PM2.5对DNA的损伤作用表现
DNA在PM2.5所致的氧化应激以及相关有害组分的作用下,DNA可发生不同程度的损伤,DNA的损伤可表现为:DNA加合物形成、DNA单链断裂(SSB)、 DNA双链断裂(DSB)、碱基错配、脱碱基位点、碱基的插入或缺失、嘧啶联合、交联和甲基化等。不少学者认为PM2.5对DNA损伤的主要成分为PAHs等有机化合物、金属离子。
3.1 PM2.5的有机成分对DNA的损伤细颗粒物上有种类和数量繁多的有机化合物, 对DNA产生损伤作用的主要是PAHs,并以苯并[a]芘(Ba P)为代表[12]。李朋昆[12]的研究表明,PM2.5在夏季和冬季日均暴露每增1μg/m3, BPDE- DNA加合物阳性的OR值分别为1.03、1.04。 Topinka[15]的研究表明,PM2.5中芳烃可以和DNA共价结合形成DNA加合物(Adducts),并且其与DNA形成加合物占所有有机提取成分的75%~90%,DNA加合物的形成可以引起DNA发生碱基替换、插入、缺失等DNA损伤。Squadrito和xia等[16,17]的研究表明,PAHs经体内代谢后产生的超氧阴离子和羟基自由基可直接作用于DNA分子,导致DNA发生碱基修饰、DNA链断裂以及DNA- 蛋白质交联等氧化性DNA损伤, 最重要的致突变性损伤为胸腺嘧啶与C- 8上鸟嘌呤碱基的颠换性突变,形成8- 羟基脱氧鸟苷(8- OHd G)。车瑞俊[14]研究表明, 颗粒物所含的PAHs和非烃组分可致DNA单链断裂(SSB)、DNA双链断裂(DSB)及DNA- 蛋白质交联 (DPC)3种DNA损伤类型,PM2.5中的PAHs和非烃组分在很低浓度即呈现很强的DNA损伤作用,且随着剂量的增加Olive尾距增加,表现出明显的剂量 - 反应关系。
3.2 PM2.5的金属成分对DNA的损伤[18,19,20,21,22] 目前已有许多研究表明,PM2.5中的金属成分可致人DNA损伤。有研究认为,过渡金属是损伤DNA的主要因素,其中水溶性Zn2+ 被认为可能是引起DNA氧化损伤的主要过渡金属离子。不同的金属离子可通过介导DNA氧化损伤和(或)与DNA结合,导致DNA氧化形成8- OHd G加合物、DNA链断裂、DNA链交联等损伤。能够被氧化为高价态的金属离子如Fe2+、Cr3+、Cu2+ 通过参与Fenton反应生成活性氧(ROS),后者引起DNA碱基化学修饰、 DNA链断裂等氧化损伤。有些金属离子如Ni2+、V3+、Co2+ 可引起DNA链交联。过渡金属与DNA之间形成八面体配合物时,可氧化并断裂DNA的碱基。另有研究发现, 颗粒物中的金属元素之间可产生协同的DNA氧化损伤作用。
目前可通 过检测DNA的损伤产 物作为PM2 . 5暴露致DNA损伤的生物标志物[12]。检测外周血白细胞中BPDE-DNA加合物、尿中1-OHPyr和8-OHd G可作为无其他特殊因素引起暴露,PM2.5致DNA损伤的效应生物标志物。DNA损伤所形成的DNA断裂碎片亦可作为判断DNA损伤的生物标志物,通过彗星试验测定的尿嘧啶(OMT)可进行评价,但由于生活当中引起DNA损伤的因素较多,故其作为PM2.5暴露致DNA损伤的标志物的特异性较差。
4DNA损伤修复与遗传毒性损伤
细胞周期是指第1次分裂完成到下1次分裂结束所经历的整个过程,该周期分为间期和分裂期(M期), 包含DNA复制以及细胞分裂两个主要事件。细胞在间期完成了DNA的复制过程。见图1。
注:G0 期:细胞离开细胞周期,停止细胞分裂,在适当刺激下可重新,G1 期,DNA 合成前期。S 期,DNA 合成期,G2 期,DNA 合成。R 点,亦称校正点或阻止点,当 DNA 损伤等事件发生时,细胞周期 S 期,细胞周期被阻滞
PM2.5暴露损伤DNA时,损伤信号会启动一系列信号级联反应,引起细胞周期阻滞或者细胞凋亡[23]。 p53可介导产生DNA损伤关卡(DNA damage checkpoints) 包括G1/S期关卡、S期关卡、G2/M期关卡,可分别引起不同时相的细胞周期阻滞。DNA损伤发生在G1期时, G1/S期关卡可抑制DNA复制的启动,阻滞进入S期, 为细胞增殖的调控点;DNA损伤发生在S期或逃逸过G1/S期可产生S期关卡,阻止DNA复制;G2/M期关卡可阻止DNA受损细胞进入有丝分裂。细胞周期阻滞为DNA损伤修复提供较长的修复时间,细胞可通过p53介导启动以下7条修复通路应对不同类型的损伤[24]: 1直接修复通路;2碱基错配修复;3碱基切除修复; 4核苷酸切除修复;5同源重组修复;6非同源末端连接通路;7translesion DNA合成。细胞损伤较轻时,通过DNA损伤修复,维持基因组的完整性,使细胞继续生存;当细胞损伤较重时,细胞会启动p53依赖的凋亡或衰老反应以清除损伤的细胞。如果细胞DNA错误修复或未及时充分修复而进入细胞周期,可发生致畸、致癌遗传毒性损伤。Gualtieri等[25]研究发现,PM2.5暴露可引起DNA损伤和基因表达的改变,进而影响胎儿的组织器官形成,导致不良妊娠结局的发生。
5PM2.5致DNA损伤的检测
目前已建立的短期遗传毒性初筛方法有200多种,被广泛认可和应用的有10余种,关于DNA的损伤检测常用的有彗星试验、UDS试验、免疫学实验和32P标记法等。彗星试验可用于检测DNA断裂、交联、切除修复缺陷等损伤,免疫学试验及32P标记法可检测DNA加合损伤。
5.1定量评价PM2.5对DNA的损伤能力可采用质粒DNA评价法(Plasmid Scission Assay),由于PM2.5氧化损伤DNA可致其超螺旋结构松弛、线化,形成不同的DNA在电泳仪中的运动速度不同,使之在琼脂糖凝胶中分离开来,采用灵敏的显像测密术可分析损伤DNA占总DNA的比例。通过质粒DNA评价法可获得TD50和TD20值,可用于不同地区、不同类型PM2.5毒性强弱的分析比较。迪丽努尔采[26]用质粒DNA评价法,成功分析了不同季节PM2.5对DNA的氧化损伤能力,即冬季最强,春季和夏季次之,秋季最弱。
5.2彗星试验又称单细胞凝胶电泳分析(SCGE)。 DNA损伤产生的断裂碎片进入琼脂糖凝胶,在电场的作用下向阳极迁移,DNA碎片在迁移时形成一尾状带,DNA损伤越严重产生的碎片越多越小,电泳迁移的DNA量越大,迁移距离越长,通过测定DNA迁移距离 (即尾长)和尾部的荧光强度来评价DNA的损伤程度。 彗星试验可定量测定单个细胞DNA的损伤程度,且该方法灵敏、简便、快速、价廉、重复性好并适用于任何活的真核细胞。李利忠等[27]应用彗星实验证实汉阳和汉口地区PM2.5可致Beas- 2B细胞DNA损伤,PM2.5质量浓度为25 mg/L时,细胞核出现明显的彗星拖尾现象,且具有一定剂量 - 反应关系。
5.3 UDS试验(Unscheduled DNA Synthesis) 亦称程序外DNA合成试验或DNA修复合成试验。DNA的一条链或某个片段损伤时,互补的另一条链可修复该损伤, 使其恢复原来的结构,通过分析细胞修复的强弱大小可以评价PM2.5对DNA的损伤能力大小,还可进一步推测其致突变与致癌性[28]。
5.432P标记法即免疫亲和性层析色谱搭配32P标记技术(IC-32P),该方法是目前检测DNA加合物最灵敏的方法。采用放射性同位素32P标记的三磷酸腺苷和免疫亲和层析柱纯化的DNA水解产物结合,生成含32P标记的DNA加合物,然后经聚乙烯亚胺纤维膜纯化32P的放射强度,通过计算32P的放射强度可分析DNA加合物的含量。应用方法可以检测1010分子中的一个DNA加合物。
5.5检测PM2.5的致基因突变毒性或染色体畸变可进行Ames试验、SOS/umu试验、TK(胸苷激酶)基因检测、转基因哺乳动物突变试验、微核试验、姐妹染色单体交换试验(SCE试验)等。
6结语
PM2.5暴露可以引起DNA损伤,促进人群恶性肿瘤的发病以及不良妊娠结局的发生,而PM2.5的毒性效应因地区而异且与其成分密切相关,每种成分在PM2.5中所占比重不同,且随环境和时间变化。亦有研究表明PM2.5对DNA的损伤能力与环境平均温度、平均湿度、 平均风速、大气压强等相关[14]。因此加强研究不同地区PM2.5的成分对DNA的损伤效应以及PM2.5对DNA损伤的影响因素,如季节[26]、气象条件(环境平均温度、湿度、大气压强、风速等)人群居住条件等,综合评价PM2.5对DNA的损伤作用,可以为制定保护PM2.5暴露人群的健康策略和相关决策分析提供信息支持。
DNA损伤修复 篇8
1 对象与方法
1.1 对象
选择TCE作业工人50人为接触组, 其中男10人, 女40人;年龄19~60 (36.6±8.7) 岁;工龄0.3~6.3 (2.0±1.7) a;另选不接触任何职业病危害因素的作业工人78名为对照组, 其中男13人, 女65人;年龄18~57 (33.8±8.5岁) 。2组人员均不吸烟, 没有电离辐射、铅、过氧化氢、氯乙烯、苯等其他职业有害因素接触史, 同时近期无感冒、感染、发热史, 均无免疫系统疾病和血液病史;2组研究对象在性别、年龄等方面均具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 工作场所空气中TCE浓度监测
按照GBZ159-2004《工作场所空气中有害物质监测的采样规范》进行个体采样。用活性炭管采集空气样, 采样流量0.05 L/min, 采样时间为工人的1个工作日;用Thermo Trace GC Ultra气相色谱仪, 按GBZ/T 160.46-2004《工作场所空气有毒物质测定卤代不饱和烃类化合物》方法检测, 作业工人接触工作场所空气中TCE时间加权平均 (TWA) 浓度。
1.2.2 尿中三氯乙酸 (TCA) 浓度测定
用聚乙烯塑料瓶收集TCE作业工人工作班末尿50 ml, 测量尿比重, 按WS/T 96-1996《尿中三氯乙酸顶空气相色谱测定方法》测定尿中TCA浓度。留取尿样前1天应避免接触乙醇和服用水合氯醛类药物。
1.2.3 淋巴细胞DNA损伤的检测
1.2.3. 1 血样采集
采集各组工人外周静脉血2 ml, 肝素抗凝, 4℃低温保存送检, 24 h内完成SCGE和固定操作。
1.2.3. 2 主要试剂和仪器
(1) 试剂:低熔点琼脂糖凝胶 (LMA) 、PBS、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠 (Na2EDTA) 、三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 、氢氧化钠 (Na OH) 、二甲亚砜 (DMSO) 、Triton X-100、浓盐酸 (HCl) 、溴化乙锭、无水乙醇; (2) 仪器:双稳定时电泳仪、水平电泳槽、梅特勒-托利多 (FE20) 、Cometslide HT彗星玻片盒、实验用p H计、BSA223S电子天平、HWS12型电热恒温水浴锅、GL-315B磁力搅拌器、荧光倒置显微镜。
1.2.3. 3 实验步骤
对外周血样进行淋巴细胞分离、制片、裂解、解旋、电泳、中和及染色, 然后在荧光倒置显微镜下观察结果。每例拍摄20张无重复照片, 用CASP彗星图象分析软件随机选100个细胞进行分析, 将分析数据转入SPSS;应用CASP软件分析图像后有多种指标可以衡量淋巴细胞DNA损伤情况, 我们选用彗星尾部DNA百分含量 (tail DNA%) 、彗星尾距 (TM) 和olive TM作为分析指标, 分析DNA的损伤程度。
1.3 统计学分析
CASP彗星图象分析软件分析数据直接转入SPSS, 所得实验数据应用SPSS 17.0统计软件建立数据库并进行分析;对于调查对象一般数据进行描述性分析, 运用t检验、方差分析、logistic回归分析等对各变量进行相关分析。
2 结果
2.1 工作场所空气中TCE的TWA浓度
以接触TCE的作业工人作为接触组, 选择22位操作工为采样对象, 检测作业工人接触空气中TCE浓度, 作业工人接触TCE TWA浓度为108.9 mg/m3 (1.42~783 mg/m3) 。共有12位作业工人接触空气中的TCE TWA浓度超过国家职业卫生限值, 超标率为54.5%;另选同单位不接触有害因素的包装和组装工人为对照组, 对照组工作场所空气中未检出TCE。
2.2 工人尿中TCA浓度
TCE接触组和对照组作业工人尿中TCA浓度测定结果见表1。接触组50人中有4人 (8%) 尿中TCA浓度超过职业接触TCE的生物限值 (50 mg/L) , 对照组78名工人尿中TCA浓度均没有超过职业接触生物限值。接触组工人尿中TCA浓度高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;而且尿中TCA浓度与工作场所空气中TCE的TWA浓度存在明显正相关关系 (r=0.83, P<0.01) 。
注:与对照组比较, at=4.05, P<0.01。
2.3 SCGE结果
外周血淋巴细胞经SCGE后进行图片拍摄和分析, 使用荧光倒置显微镜拍摄照片, 每个样本拍摄20张无重复照片, 见图1和图2。
应用CASP彗星图象分析软件, 随机选择照片中清晰完整、独立无重叠的图像进行分析并记录数据, 每张照片分析五六个图像, 每个样本分析100个图像。分析后所得tail DNA%、TM和Olive TM数据见表2。接触组tail DNA%、TM和Olive TM指标均高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。根据logistic回归分析TCE作业工人尿中TCA浓度与Tail DNA%、TM和Olive TM指标均存在相关性 (r=0.79, P<0.01;r=0.24, P<0.01;r=0.21, P<0.01) 。
注:tail DNA%—彗星部DNA百分含量;TM—彗星尾距。
3 讨论
国际癌症研究机构 (IARC) 1995年已将TCE致癌性分类列入第2A类, 因此, 研究TCE对人体的致癌、致畸、致突变作用很有必要, 但目前有关这方面的研究并不多, 且多局限于动物实验。Hrelia等在TCE遗传毒性动物实验中, 观察到小鼠骨髓细胞微核发生率增高[2];Sujatha等[3]的实验也有类似结果, 并观察到TCE接触浓度与微核发生率存在剂量-效应关系;Luigi等[4]的研究结果也显示, TCE可导致小鼠肾细胞微核发生率增高;陈雯等[5]在TCE对接触工人外周血微核率影响的研究中发现:接触组工人外周血微核率高于对照组, 但不存在剂量-效应关系;黄海雄等[6]在TCE对精子的畸形试验中, 观察到TCE对雄性生殖细胞具有遗传毒性;而Rudolf等[7]在姐妹染色体交换实验研究中TCE遗传毒性效应未发现阳性结果;唐国慧等[8]用TCE诱发小鼠及人外周血有核细胞DNA链断裂的程度, 结果发现接触组与对照组无差异。因此, TCE对人体的遗传毒性目前仍是一个尚有争议的问题, 这有待于我们进一步的深入研究。
TCE职业接触主要经呼吸道吸收, 吸收后蓄积于肝脏、脑、心脏等器官。体内的TCE可以原形自呼出气中排出, 或在体内代谢为TCA后从尿中排出。本次研究的接触组50人均为使用TCE的清洗工, 工作场所空气中存在不同浓度的TCE, 该50名TCE作业工人班末尿中均检出TCA, 尿中TCA浓度与工作场所空气中TCE时间加权平均浓度存在明显的正相关关系。
TCE吸收进入体内其代谢产物可与DNA等大分子发生共价结合, 导致DNA分子的损伤, 在SCGE中出现彗星样图像。本研究应用SCGE检测TCE作业工人外周血淋巴细胞的DNA损伤情况, 分析TCE对作业工人的遗传毒性, 在SCGE中由于细胞裂解液的作用膜结构受到破坏, 胞内成分扩散到裂解液中, DNA由于相对分子质量大留在原位, 在碱性条件下, DNA解螺旋, DNA的断链和亲碱性片段释放, 在电场中移动形成彗星样图像, 通过测定DNA迁移部分的吸光度或迁移距离可以测定DNA的损伤程度[9]。因为Head Area和Tail Area等指标人为选择差异较大, 故以tail DNA%、TM和olive TM作为灵敏指标, 其中olive TM值排除了图片分析过程中的人为选择误差, 是DNA头部和尾部的综合指标, 最具参考价值。本研究结果显示接触TCE的作业工人Tail DNA%、TM和Olive TM指标均高于对照组, 与对照组相比, 差异具有统计学意义[ (Tail DNA (P<0.01) 、TM (P<0.05) 、Olive TM (P<0.01) ], 显示TCE可导致作业工人淋巴细胞DNA损伤, 对人体具有一定的遗传毒性。通过logistic回归分析显示TCE作业工人尿中TCA浓度与淋巴细胞DNA损伤水平呈一定的相关关系 (r值分别为0.79、0.24、0.21) , TCE接触浓度与淋巴细胞DNA损伤情况之间存在着剂量-效应关系。
摘要：目的 观察三氯乙烯作业工人的DNA损伤情况, 探讨三氯乙烯对作业工人的遗传毒性。方法 检测作业工人工作场所空气中三氯乙烯时间加权平均浓度, 测定作业工人班后尿中三氯乙酸浓度, 运用单细胞凝胶电泳 (SCGE) 检测50名三氯乙烯作业工人外周血淋巴细胞DNA损伤情况。结果 三氯乙烯作业工人班后尿中三氯乙酸浓度大于对照组 (P<0.01) , DNA损伤情况与对照组比, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 三氯乙烯作业工人尿中三氯乙酸浓度与淋巴细胞DNA损伤水平存在剂量-效应关系。结论 长期接触三氯乙烯可导致作业工人淋巴细胞DNA损伤。
关键词：三氯乙烯,单细胞凝胶电泳,DNA损伤
参考文献
[1]Motohashi N, Nagashima H, Molnar J, et al.Trichloroethyene.III.Perdiction of carcinogenicity of investigated compounds including trichloroethylene[J].In Vivo, 1999, 13:221-224.
[2]Hrelia PF, Maffei F, Vigagni, et al.Interactive effects between trichoroethylene and pesticides at metabolic and genetic level in mice[J].Environ Health Perspet, 1994, 102:31.
[3]Sujatha TV.Hegde MJ.C-mitotic effects of terchloroethylene (TCE) on bone marrow cells kf mice[J].Mutat Res, 1998, 413:151.
[4]Luigi R, Eugenio M, Andrea M.et a1.Increased frequency of micronucleated kidney cells in rats exposed to halogen Ned anesthetics[J].Mut at Res, 1998, 413:1.
[5]陈雯, 徐雷, 邓丽霞, 等.三氯乙烯对接触工人外周血微核率的影响[J].中国职业医学, 2000, 27 (5) :9-11.
[6]黄海雄, 张锦周, 黄钰, 等.三氯乙烯对精子的畸形试验研究[J].中国职业医学, 2002, 29 (4) :25-26.
[7]Rudolf R, Madle S, Baumann H.Genetic toxicology of trichloroethylene (TCE) [J].Mutat Res, 1995, 340:1.
[8]唐国慧, 庄志雄, 张锦周, 等.三氯乙烯诱发小鼠及人外周血有核细胞DNA链断裂[J].中华劳动卫生职业病杂志, 1997, 15 (3) :146.
DNA损伤修复 篇9
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性昆明小鼠26只, 体重18~20g, SPF级, 由上海实验动物中心提供。
1.2 饲养条件
SPF动物房中饲养。自由饮水、饮食, 室温 (20±2) ℃, 湿度 (50±10) %。
1.3 动物试验设计
适应性饲养5d后, 昆明小鼠26只随机分为三组, 分别为对照组和试验组。将丙烯酰胺溶解于生理盐水中, 按10m L/kg·bw给小鼠腹腔注射, 注射剂量分别为20mg/kg·bw (低剂量组) 、40mg/kg·bw (高剂量组) , 对照组注射生理盐水。每周五次, 连续30d。
1.4 单细胞凝胶电泳
最后一次给药24h后, 剪开腹腔, 摘取单侧辜丸并剥离附着的脂肪组织, 将睾丸和适量的PBS液放入玻璃匀浆器中研磨, 然后用300目尼龙网过滤, 得细胞悬液后进行单细胞凝胶电泳。
2 结果观察与分析
每个样品拍100个细胞。所拍照片用casp-1.2.2分析软件分析, 所分析的指标有尾长 (TL, tail length) 、尾部DNA% (DNAT, DNA tail%) 。
从图1、2可看出, 图片中细胞大小不一, 这些细胞分别为生精上皮细胞及各级生精细胞, 最小的细胞为精子细胞, 如图1、2中箭头所标示的地方, 可见精子DNA未受损伤。但生精上皮细胞及各级生精细胞受到了损伤。
由表1可知, 睾丸的拖尾率、尾长和尾部DNA百分含量在低剂量组和对照组之间、高剂量组与对照组之间有极显著的差异 (P<0.01) 。且低剂量组和高剂量组之间也有极显著的差异 (P<0.01) 。睾丸细胞DNA有拖尾, 说明AA诱导睾丸细胞DNA链的断裂, 拖尾率、尾长和尾部DNA百分含量的变化随染毒剂量的变化而变化, 说明随着AA剂量的加大, 睾丸细胞受到更大的损伤, 断片增多, 迁移率增高, 说明DNA的损伤有剂量关系。
彗星试验结果图
3 讨论
本实验观察到, 各染毒小鼠随染毒剂量递增, 睾丸细胞的DNA损伤加大, 这与一些报道中的AA可引起生殖细胞特定时期DNA断裂相一致, 本实验提示, 接触一定量的AA对生殖细胞DNA有损伤作用, 可降低雄性动物的生育能力, 在日常的实验过程中, 接触AA时要做好个人的防护。
注:在同一列上, 凡未标※者, 表示差异不显著, P>0.05, 凡标有※者, 表示差异显著, P<0.05, 凡标有※※者, 表示差异极显著, P<0.01。
摘要：丙烯酰胺是实验室常用的一种化学试剂, 本实验将丙烯酰胺溶解于生理盐水中, 按10mL/kg·bw给小鼠腹腔注射, 注射剂量分别为20mg/kg·bw (低剂量组) 、40mg/kg·bw (高剂量组) , 对照组注射生理盐水。实验结束后进行单细胞凝胶电泳, 以观察丙烯酰胺对小鼠生殖细胞的DNA损伤程度。
关键词：丙烯酰胺,生殖细胞,DNA损伤
参考文献
[1]Mendel Friedman.Chemistry, biochemistry, and safety of acrylamide a review[J].Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51:4504-4526.
[2]傅武胜译.WHO/FAO加强食品中可疑致癌物-丙烯酰胺的研究[J].海峡预防医学杂志, 2005, 9 (3) :67.