DNA损伤（共10篇）
DNA损伤 篇1
动物胚胎在发育过程中对外界刺激非常敏感,其中氧化应激 是导致早 期胚胎发 育损伤的 机制之一[1,2]。细胞内活 性氧 ( Reactive Oxygen Species, ROS) 的大量生成被认为是DNA氧化损伤的关键诱因,ROS诱发的氧化应激可造成胚胎线粒体的改变、 DNA损伤、细胞凋亡,导致胚胎发育延迟或阻滞等多种类型的损伤[3,4]。DNA双链断裂( DNA double strand breaks,DSBs) 作为最严重的损伤形式,会影响细胞正常生命活动的维持,甚至严重威胁胚胎的生存。因此,研究ROS引起的胚胎DSBs产生、阐明相关分子机制具有重要意义。
组蛋白2A变异体 ( histone family 2A variant, H2AX) 是核心组蛋白H2A的一个亚型。有研究发现,DNA双链断裂后可诱导位于丝氨酸139位C端保守区域内的H2AX磷酸化,形成 γH2AX。利用激光共聚焦显微镜可直接观测到细胞核内 γH2AX焦点数,直观地了解DNA双链断裂的情况,并进行DSBs的定性、定位及定量。目前,采用 γH2AX特异性抗体进行的免疫荧光检测方法已成为衡量DSBs发生的金标准[5,6,7],γH2AX产生的数量可判断DNA双链断裂的程度[8,9]。J. A. Downs[10]的研究表明, DSBs修复后,γH2AX蛋白存在一个去磷酸化过程, γH2AX焦点逐渐消失,故可通过观察 γH2AX蛋白焦点数量的减少情况来检测DNA双链断裂损伤的修复情况。毛细血管共济失调突变基因( ataxiatelangiectasia mutated,ATM) 是一种在感应和传递DNA双链断裂损伤信号、启动损伤DNA修复中起重要作用的功能蛋白。DSBs诱导H2AX的磷酸化 主要是通 过ATM激酶来介导的,感应到损伤后,ATM丝氨酸1 981位发生自动磷酸化而激活,使ATM靶向下游底物H2AX、BRCA1、53BP1等[11]。有研究发现,其他类型的DNA损伤也可通过ATR和DNA - PK形成 γH2AX,但ATM所介导的 γH2AX的形成必定与DSBs的存在有关。因此,同一细胞内活化的ATM和 γH2AX同时出现是DSBs存在的强有力证据[12,13]。
H2O2是一种重要的化学性DNA诱裂剂,已成为生命科学研究细胞氧化损伤的重要工具[14]。为了研究DNA损伤修复相关基因在小鼠胚胎DNA损伤修复中的作用,本试验以H2O2为DNA损伤诱导剂构建小鼠胚胎DNA损伤模型,观察胚胎氧化应激后DNA损伤指标 γH2AX和磷酸化ATM ( Phosphorylation - ATM,ρATM) 蛋白的表达变化,以期为进一步了解胚胎DNA损伤修复机制奠定基础。
1材料
1.1试验动物
FVB小鼠,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室自繁,母鼠群养,公鼠独笼饲养,用颗粒饲料饲喂,自由采食、饮水,饲养室温为21 ~ 25 ℃,选用健康、3 ~ 5周龄的FVB母鼠进行超数排卵。
1.2主要试剂
PMSG,购自上海市计划生育研究所; HCG,购自宁波第二激素厂; 过氧化氢( 3% H2O2) 和Triton X 100,购自Sigma公司。
一抗Phospho - Histone H2A. X( ser139) ( 20E3) 兔单克隆抗体( Cell Signaling) ,配成10% 母液,使用时稀释度为1∶200; 一抗 ρATM( 10H11. E12) : SC 47739 ( SANTA CRUZ) ,配成10% 母液,使用时稀释度为1∶400。二抗荧光素标记羊抗兔Ig G抗体( Millipore) ,使用时稀释度为1 ∶1 000。荧光素标记羊抗鼠Ig G抗体( Cell Signaling) ,使用时稀释度为1 ∶ 200,二抗均避光保存于4 ℃冰箱。
小鼠胚胎体外操作液M2,参照《小鼠胚胎操作实验手册》( 第3版) 的方法进行配制; 透明质酸酶 ( HYT) ( 300 mg /L) ,将0. 3 g HYT溶于100 m L M2中配制而成; 小鼠胚胎培养液为KOSM和KOSM( - ) ( 去除KOSM配方中的L - 谷氨酞胺) ,以KOSM( - ) 为基础液,分别配制含有1. 5,1. 8,2. 1,2. 4 μmol/L H2O2的小鼠胚 胎培养液,标记为KOSM ( - ) + 1. 5 μmol / L H2O2、KOSM( - ) + 1. 8 μmol/L H2O2、KOSM ( - ) + 2. 1 μmol / L H2O2、KOSM ( - ) + 2. 4 μmol / L H2O2。
1.3主要仪器
实体显微镜( SMZ645) ,购自Nikon公司; 激光扫描共聚焦显微镜( LSM510 meta) ,购自Leica公司。
2方法
2. 1试验动物分组
按小鼠胚胎培养液所含的H2O2浓度梯度进行分组,分别为KOSM ( - ) + 1. 5 μmol/L H2O2组、 KOSM( - ) + 1. 8 μmol / L H2O2组、KOSM ( - ) + 2. 1 μmol / L H2O2组、KOSM( - ) + 2. 4 μmol/L H2O2组,以KOSM组及KOSM( - ) 为对照组。
2. 2小鼠的超数排卵
采用PMSG - HCG法进行超数排卵。取3 ~ 4周龄的雌性小鼠,12: 00注射5 IU的PMSG( 0. 1 m L) 到小鼠腹腔,48 h后再注射5 IU的HCG( 0. 1 m L) 。注射HCG后立即将母鼠放入公鼠笼中,公母鼠按1∶1比例交配过夜,公鼠为2 ~ 3月龄。
2. 3受精卵的体外培养
注射HCG 22 ~ 24 h后,脱颈椎处死小鼠,迅速剥离出输卵管,在实体显微镜下用一次性1 m L注射器在膨大部处撕开一个小口,受精卵团自动溢出,移入HYT( 300 μg / m L) 中静置2 ~ 3 min; 待颗粒细胞脱落后,收集形态正常的受精卵,用M2冲洗2 ~ 3遍,再用小鼠胚胎培养液冲洗2 ~ 3遍,移入预先平衡好的各试验组 的小鼠胚 胎培养盘 中,置于饱和 湿度、 37 ℃ 、5% CO2的培养箱中培养24 h; 于实体显微镜下观察记录各试验组2 - 细胞胚胎的发育情况,计算分裂率; 96 h后再观察并记录其囊胚的发育情况,计算囊胚率。
2. 4免疫荧光检测
分别收集各试验组体外培养的1 - 细胞和2 - 细胞期小鼠胚胎,放于含4% 多聚甲醛的PBS中室温固定30 min; 在1% Triton X - 100 ( 用D - PBS配制) 中透化处理10 min; 1% BSA室温孵育1 h; 加一抗Phospho - Histone H2A. X( ser139) ( 20E3) 单克隆抗体或一抗 ρATM( 10H11. E12) 于4 ℃ 孵育过夜; 次日, 37 ℃ 孵育20 min; 用对应的二抗荧光素标记羊抗兔Ig G或二抗荧光素标记羊抗鼠Ig G,于室温避光孵育1. 5 h; 制成片子,在激光共 聚焦显微 镜下观察 γH2AX或 ρATM的表达情况。每组试验至少重复3次,每次取小鼠胚胎20 ~ 30个。免疫组化试验设置空白组( 以1% BSA替代一抗和二抗) 、阴性对照组1 ( 以1% BSA替代一抗,二抗不变) 、阴性对照组2( 以1% BSA替代二抗,一抗不变) 。
2.5数据分析
试验数据采用SPSS18. 0软件进行差异显著性分析,P < 0. 05为差异显著。
3结果与分析
3.1H2O2对小鼠胚胎发育的影响
用含不同浓度H2O2的培养液体外培养小鼠胚胎,观察H2O2处理对小鼠胚胎发育能力的影响,结果表明: 与KOSM对照组相比,KOSM( - ) 组小鼠胚胎的分裂率下降,但无显著差异( P > 0. 05) ; 囊胚率显著下降( P < 0. 05) 。与KOSM( - ) 对照组相比,随着H2O2浓度的增加,小鼠胚胎的分裂率和囊胚率呈下降趋势。从1. 8 μmol/L H2O2浓度开始,小鼠胚胎的分裂率和囊胚率均显著下降 ( P < 0. 05) ; 2. 1, 2. 4 μmol / L H2O2处理组间胚胎的分裂率和囊胚率无显著差异,2. 4 μmol/L H2O2处理的胚胎不能发育到囊胚期。以上结果说明1. 5 ~ 2. 4 μmol/L H2O2处理对小鼠早期胚胎发育均有影响,见表1。
3.2小鼠胚胎γH2AX和ρATM表达的检测
分别收集KOSM、KOSM( - ) 和1. 5,1. 8,2. 1, 2. 4 μmol / L H2O2处理组体外培养的1 - 细胞、2 - 细胞期胚胎,采用免疫荧光技术检测 γH2AX和 ρATM的表达情况,结果表明,KOSM和KOSM( - ) 对照组中2 - 细胞期胚胎的 γH2AX焦点数多于1 - 细胞期胚胎,ρATM在两对照组的两个时期胚胎中均未检测到。1. 5,1. 8 μmol/L H2O2处理组1 - 细胞期胚胎中均未检测到 γH2AX和 ρATM; 两处理组的2 - 细胞期胚胎表达 γH2AX,未检测到 ρATM。2. 1,2. 4 μmol/L H2O2处理组的1 - 细胞和2 - 细胞期胚 胎均有 γH2AX和 ρATM表达,其中2. 4 μmol / L H2O2处理组的两个时期胚胎 γH2AX焦点数高于2. 1 μmol/L H2O2处理组,说明2. 1,2. 4 μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎产生明显的DSB现象( 见295页彩图1、 图2) 。
注: 同列数据肩标字母不同表示差异显著( P < 0. 05) ,含有相同( P > 0. 05) 。
4讨论
H2O2作为一种化学性DNA诱导剂,能直接攻击DNA使其断裂或降解,产生自由基HO·,故H2O2常被用于建立DNA氧化损伤模型。R. G. Allen等[15]认为纳摩尔水平的活性氧可促进细胞增生,微摩尔水平的活性氧可导致细胞凋亡,毫尔摩水平的活性氧可引起细胞损伤死亡。在用H2O2处理卵母细胞及早期胚胎时,常采用相对较低的浓度[16,17]。韩荣勋[18]在小鼠胚胎发育的不同阶段添加不同浓度H2O2( 1. 5, 1. 8,2. 1,2. 4,2. 6 μmol / L) 处理时发现,随着外源性H2O2浓度的增高,囊胚发育率显著降低,外源性H2O2诱发小鼠1 - 细胞期胚胎体外发育阻滞的最低浓度是2. 1 μmol/L。本研究结果表明: 随着H2O2处理浓度的增加,小鼠胚胎的分裂率和囊胚率均呈逐渐下降趋势。当H2O2浓度为2. 1 μmol/L时,胚胎的分裂率和囊胚率显著低于对照组( P < 0. 05) ; 当H2O2浓度为2. 4 μmol/L时,小鼠胚胎发育停滞于2 - 细胞期,这与韩荣勋[18]的报道相一致。
ROS引起的氧化损伤对胚胎发育的影响是多方面且机制极其复杂,对胚胎氧化应激性DNA损伤的耐受情况如何,目前所知甚少。DSBs的形成可诱导H2AX组蛋白C端丝氨酸139位大量而迅速的磷酸化形成 γH2AX,其可作为评估各种化学或压力作用诱导的DNA双链断裂的生物学标志物[17,18]。有研究发现,H2AX可在H2O2引起的成熟精子氧化应激性DNA损伤处发生磷酸化,并发现Rad50和53BP1同时出现在损伤处,对DNA损伤产生了应答反应; 与体细胞不同的是,这些修复蛋白并没有发挥有效的DNA修复功能,推测它们在DNA损伤修复的机制中可能发挥着其他重要的作用[19]。S. K. Adiga等[20]采用3 Gy照射小鼠1 - 细胞和2 - 细胞胚胎后发现,在2 - 细胞期以后的胚胎细胞内检测到 γH2AX焦点, 因而认为 γH2AX在2 - 细胞期以后才参与胚胎细胞的DNA修复。本研究发现,未处理的对照组小鼠胚胎在2 - 细胞期的 γH2AX焦点数多于1 - 细胞期胚胎,这与S. K. Adiga等[20]的发现相一致。
H2AX的磷酸化与PI3K家族成员ATM、ATR及DNA - PK有关,DSBs所诱导的 γH2AX的形成多是由ATM所介导的; 因此,同一细胞内活化的ATM和 γH2AX同时出现是DSBs存在的强有力证据[13,14], 相关研究中也均是采用免疫荧光方法检测H2AX和ATM的磷酸化来监测DNA的损伤情况[21,22,23,24,25,26,27]。本研究分析了不同H2O2处理组早期胚胎的 γH2AX及 ρATM表达情况,以作为DSB的判断指标,结果表明: γH2AX和 ρATM在1. 5,1. 8 μmol / L H2O2处理组的1 - 细胞期胚胎中均未检测到; 2 - 细胞期胚胎表达 γH2AX,未检测到 ρATM。 当H2O2浓度为2. 1, 2. 4 μmol / L时,小鼠1 - 细胞和2 - 细胞期胚胎中可检测到 γH2AX和 ρATM的表达,且 γH2AX焦点数较多,说明过高的H2O2处理会导致胚胎DSBs现象增多。以上结果说明,2. 1,2. 4 μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎产生明显的DSB现象,2. 1 μmol/L H2O2处理为较适宜的诱导条件。
注: 浅色图是常光下拍摄的,深色图是激光扫描后拍摄的。
摘要：为了研究胚胎DNA损伤修复机制,试验以H2O2为DNA损伤诱导剂,建立小鼠胚胎DNA氧化损伤模型,采用不同浓度H2O2培养小鼠受精卵,观察其对小鼠胚胎发育能力的影响;再通过免疫荧光方法检测γH2AX和ρATM蛋白的表达状况,以判断H2O2处理所导致的胚胎DNA损伤情况及较适宜的诱导条件。结果表明:1.5~2.4μmol/L H2O2处理对小鼠胚胎发育能力具有影响,与KOSM(-)对照组相比,H2O2处理组小鼠胚胎的分裂率、囊胚率呈下降趋势,其中1.8~2.4μmol/L H2O2处理组的胚胎分裂率、囊胚率呈显著下降趋势(P<0.05)。免疫荧光法检测发现KOSM(-)对照组中,2-细胞期胚胎的γH2AX焦点数多于1-细胞期胚胎,ρATM在两个时期的胚胎中未检测到。γH2AX和ρATM在1.5,1.8μmol/L H2O2处理组的1-细胞期胚胎中均未检测到;2-细胞期胚胎表达γH2AX,未检测到ρATM。2.1,2.4μmol/L H2O2处理组的1-细胞和2-细胞期胚胎均有γH2AX和ρATM表达,其中2.4μmol/L H2O2处理组两个时期胚胎的γH2AX焦点数多于2.1μmol/L H2O2处理组。说明1.5~2.4μmol/L H2O2处理会影响小鼠胚胎体外发育能力,2.1,2.4μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎发生DNA双链断裂现象。
关键词：小鼠胚胎,DNA氧化损伤,H2O2,模型,γH2AX,ρATM
DNA损伤 篇2
本研究旨在探索Al3+、Cd2+对小麦幼苗生长的影响及其DNA损伤效应.结果表明:(1)所试浓度Al3+、Cd2+不仅不同程度抑制2 d龄和12 d龄幼苗根系和地上部分的生长,而且表现明显的.DNA损伤效应;(2)除Al3+对幼苗地上部分鲜重、干重的影响及Cd2+对幼苗根系生长速率的影响外,其余生长指标显示2 d龄幼苗比12 d龄幼苗对Al3+、Cd1+更敏感,这与导致2 d龄幼苗DNA损伤的Al3+、Cd2+浓度明显低于12 d龄幼苗的结果一致.研究结果表明,DNA损伤可能是Al3+、Cd2+抑制2 d龄和12 d龄小麦幼苗生长的重要原因之一.
作 者：马引利 佘小平MA Yin-li SHE Xiao-ping 作者单位：马引利,MA Yin-li(陕西师范大学,生命科学学院,西安,710062;山西师范大学,生命科学学院,山西,临汾,041004)
佘小平,SHE Xiao-ping(陕西师范大学,生命科学学院,西安,710062)
DNA损伤 篇3
关键词：锦鲤；镉；肾脏；DNA损伤；氧化应激
中图分类号： S941.91文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0272-02
收稿日期：2015-06-08
基金项目：江苏省自然科学基金（编号：BK20141147）；江苏省徐州市科技計划（编号：XF11C051）；江苏省化学生物学优势学科基金（编号：PAPD）。
作者简介：刘思思（1988—），女，江苏徐州人，硕士研究生，主要从事生态学研究。E-mail：liusisi644@163.com。镉（Cd）是一种毒性很大的重金属，主要作为锌矿、硫化物矿、铅矿、铜矿等的副产物，在矿的开采、冶炼、精炼过程中进入环境，并对环境造成危害。镉一旦进入水中，会对水体生态系统造成严重污染，危害水生生物的生命[1-2]。
锦鲤（Carassius auratus L.）是鲤科（Cyprinidae）鲤属（Carassius）的一种观赏鱼，颜色艳丽，形态优美，同时也是水生环境监测的一种试验鱼种类[3]。氧化应激是重金属对鱼类造成损伤的常见方式，很多重金属都会诱导氧化应激损伤[2-3]。谷胱甘肽抗氧化酶系统由还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCL）组成，在动物机体抗氧化损伤中承担重要作用[4]。研究表明，镉能够引起淡水鲇鱼（Channa punctatus）[2]、广东鲂（Megalobrama terminalis）[5]、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）[6]等鱼的氧化损伤。本研究以锦鲤为试验对象，探讨镉暴露对锦鲤肾脏DNA损伤、谷胱甘肽抗氧化系统的影响，以期为环境监测及镉害防治提供依据。
1材料与方法
1.1材料
供试红白锦鲤购自徐州市佳顺锦鲤养殖基地，体长5～7 cm、质量4～7 g/尾。试验采用静水生物养殖法。试验用水为曝气3 d的自来水，每组20 L，24 h不间断充氧，溶氧量 6 mg/L，pH值6.8，水温（23±1） ℃。先将锦鲤置于室内水族箱进行为期7 d的预试验。锦鲤暂养期间活动正常、无病，死亡率低于5%。于试验前24 h停止饲喂，选择品相较好、健康的红锦鲤40尾，随机分为4组，3个处理组的CdCl2浓度分别为5、10、20 mg/L。试验期间不饲喂、 不换水，每天观察其行为。于96 h后处死，取其肾脏，冰浴生理盐水匀浆，以 3 000 r/min 冷冻离心10 min制备组织上清液，测定其生化指标。
1.2 鱼行为观察
按照Sveceviius的方法[7]将鱼的行为活性分为5级（0、1、2、3、4级）。每天观察记录鱼的行为并对其分级。
1.3氧化应激及谷胱甘肽抗氧化系统指标测定
丙二醛（MDA）水平、还原型谷胱甘肽（GSH）水平、蛋白含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活性、谷胱甘肽还原酶（GR）活性均采用试剂盒（南京市建成生物工程研究所）进行测定，谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）采用苏州市科名生化指标试剂盒测定，所用仪器为UV-722型紫外可见分光光度计。
1.4DNA损伤测定
根据已有研究的方法[8]，采用商品试剂盒（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.），按说明书进行操作。采用带有检测器的高效液相色谱（Agilent Technologies，USA）进行测定，8-OHdG 的表示方法为8-OHdG/10-5 deoxyguanosine。
2 结果与分析
2.1镉对鱼行为的影响
观察鱼的行为并测定其行为活性。由图1可知，不同浓度镉暴露对鱼的行为具有不同影响。与对照组相比，中低浓度镉暴露抑制鱼的行为活性，而高浓度镉暴露则呈1 d时抑制、之后强烈激发的现象。以不同时间比较，各处理组均呈 1 d 行为活性不高、2～3 d活性增强、4 d活性下降的趋势，但仍高于对照组。
2.2镉对鱼肾脏的氧化应激及DNA损伤
MDA含量、8-OHdG水平常作为氧化应激的指标，由测定结果（表1）可知，镉暴露导致锦鲤肾脏MDA含量、8-OHdG水平明显升高。与对照组相比，5、10、20 mg/L镉暴露下MDA含量分别增大15.2%、169.4%、398.0%，8-OHdG水平分别增大16.1%、32.3%、64.5%。可见，镉暴露引起了锦鲤肾脏氧化应激损伤及DNA损伤。
2.3镉对锦鲤肾脏谷胱甘肽抗氧化系统的影响
由锦鲤肾脏谷胱甘肽抗氧化系统指标的测定结果（表2）可知，96 h镉暴露使系统活性明显升高。与对照组相比，5、10、20 mg/L镉暴露下GSH含量分别增加8.7%、20.2%、27.0%，GPX活性分别提高10.4%、15.7%、24.2%，GST活性分别提高16.3%、33.1%、57.8%，GR活性分别提高 16.0%、30.3%、46.3%，GCL活性分别提高18.1%、28.2%、32.7%。可见，镉暴露导致锦鲤肾脏谷胱甘肽抗氧化系统发生改变。
nlc202309040407
3结论与讨论
镉会对水生生态系统造成很大影响。本研究表明，不同体积分数的镉暴露对锦鲤行为活性具有不同影响，呈低抑制、高激发的现象。在5、10 mg/L的镉暴露浓度下，行为活性均明显低于对照；20 mg/L的镉暴露浓度则明显激发行为活性，表明高浓度镉暴露对锦鲤具有明显刺激作用。行为活性随时间的推移呈早期激发、后期抑制的趋势，表明锦鲤刚接触镉刺激时活性变强，疲惫后活动行为变慢。
脂质过氧化产物指机体中脂质被氧化后的产物，是反映氧化应激的重要指标。研究表明，镉能够强烈抑制线粒体电子传递链，导致电子无法正常传递至接受体，而是传递至氧原子，从而产生大量氧自由基，引起机体氧化损伤[2-9]。氧自由基也可通过多种途径造成DNA损伤，如引起单链DNA断裂、DNA与蛋白质交联、构成DNA的基础物质发生改变。8-OHdG是氧自由基诱导鸟嘌呤C-8发生羟基改变的产物，因此8-OHdG常作为氧化性DNA损伤的标志[4]。本试验中，脂质过氧化产物MDA含量、8-OhdG水平均明显升高，表明镉暴露引起了锦鲤肾脏氧化损伤。
谷胱甘肽是一种非酶抗氧化物质，在调节脂质过氧化产物的产生、减少氧化反应发生中起重要作用。已有研究表明，镉暴露能够诱导GSH含量的升高，可能是由于对抗其引起的氧化应激损伤[10]。本试验发现96 h镉暴露同样引起了GSH含量的升高。GR、GCL是维持GSH含量的重要酶，GR能夠催化氧化型谷胱甘肽转化为GSH，GCL是GSH生物合成的限速酶。GST是谷胱甘肽结合反应的关键酶，催化该反应的起始步骤。GPx是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GST、GPx、GR、GCL、GSH在机体抗氧化中发挥重要作用。镉暴露引起GSH水平升高，以及GR、GCL、GST、GPX活性上升，提示机体在尽力调动谷胱甘肽抗氧化系统以对抗镉引起的氧化损伤。本试验结果为研究镉引起动物组织损伤的机制提供依据。
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DNA损伤 篇4
1PM2.5概述
PM2.5又称细颗粒物, 指空气动力学当量直径小于等于2.5 μm的颗粒物[4](Dp≤2.5 μm)。
1.1 PM2.5的生成来源
1.1.1自然源包括土壤扬尘、真菌孢子、植物花粉、 细菌、火山灰、宇宙陨星尘、沙尘暴、森林火灾和裸露煤原大火产生的细颗粒物等。
1.1.2人为源包括固定源和流动源。固定源包括各种燃料燃烧源:发电、冶金、石油、纺织印染等各种工业、 采矿、供热取暖、垃圾焚烧、烹调过程燃煤与燃气或燃油排放的烟尘。流动源主要是交通工具使用燃料时排放的尾气,随着机动车数量的剧增,已成为城市PM2.5的主要来源。
1.2 PM2.5的特征PM2.5是一种本身具有毒性作用的细粒子,又可通过强富集效应而成为多种有害物质的载体。PM2.5的有害成分与其来源密切相关,且具有随时间变化的特点[5],常见的成分为有机污染物、重金属、水溶性离子盐类、细菌、病毒等,对机体健康的损害主要为前三者,并以前二者为甚,其极大促进致畸、致癌、致突变等遗传变异的发生[6,7,8,9]。PM2.5的粒径大小影响其沉降行为,0.20~2.50 μm的细颗粒物因重力作用可沉降于支气管表面,小于0.50 μm左右的细颗粒物可沉积在细小支气管分支和肺泡抑或透过血气屏障直接进入血循环[10]。PM2.5在空气中可停留30~70 d之长,并且输送距离可达数万公里而造成广域污染,严重威胁人群健康,WHO推荐使用PM2.5的浓度作为检测空气质量的指标[11]。
2PM2.5对DNA的损伤机制
目前关于PM2.5的损伤作用机制存在多种假说,对DNA的损伤机制主要认为是氧化损伤机制和DNA加合物形成机制[12],有时候也将后者归于前者。
2.1自由基氧化损伤机制PM2.5通过自由基产生氧化损伤的途径主要有以下几种。1吸附的重金属元素→体内→释放转运金属离子→大量自由基生成。 2PM2.5→肺泡上皮细胞和巨噬细胞等机体各类吞噬细胞吞噬→大量活性氧簇生成。3PM2.5→自身表面化学效应→自由基生成。4颗粒物本身含有丰富的自由基, 每g浓度多为1×1016~1×1017个自旋。5PM2.5→细胞内Ca2+浓度升高或超载→Ca2+稳态失衡→DNA降解、 促进自由基生成。6PM2.5所含的多环芳烃(PAHs)→体内代谢→羟基自由基、超氧阴离子[13]。上述途径生成的自由基可引起DNA氧化应激损伤。
2.2 DNA加合物形成机制PM2.5富集有多种对人体极为有害的PAHs,如苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a] 芘、二苯并[a.h]蒽、苯并[g,h,i]芘等,这些物质有着不同程度的“致畸、致癌、致突变”效应。PAHs在体内生物转化为二氢二醇环氧苯并芘(7,8-dihydrodiol-9.10-epoxide benzo[a]pyrene BPDE)并与DNA亲和位点鸟嘌呤外环氨基端共价结合成BPDE-DNA加合物。PM2.5中的某些金属成分也可引起DNA形成加合物,如Fe2+介导8-OHd G加合物的形成。DNA加合物改变DNA的结构,如果不能及时修复或修复错误,则诱导基因突变[14]、 活化癌基因并抑制正常基因和肿瘤抑制基因的表达, 改变生物的遗传特性,增加罹患肺癌、皮肤癌、膀胱癌和胃癌等恶性肿瘤的风险。
3PM2.5对DNA的损伤作用表现
DNA在PM2.5所致的氧化应激以及相关有害组分的作用下,DNA可发生不同程度的损伤,DNA的损伤可表现为:DNA加合物形成、DNA单链断裂(SSB)、 DNA双链断裂(DSB)、碱基错配、脱碱基位点、碱基的插入或缺失、嘧啶联合、交联和甲基化等。不少学者认为PM2.5对DNA损伤的主要成分为PAHs等有机化合物、金属离子。
3.1 PM2.5的有机成分对DNA的损伤细颗粒物上有种类和数量繁多的有机化合物, 对DNA产生损伤作用的主要是PAHs,并以苯并[a]芘(Ba P)为代表[12]。李朋昆[12]的研究表明,PM2.5在夏季和冬季日均暴露每增1μg/m3, BPDE- DNA加合物阳性的OR值分别为1.03、1.04。 Topinka[15]的研究表明,PM2.5中芳烃可以和DNA共价结合形成DNA加合物(Adducts),并且其与DNA形成加合物占所有有机提取成分的75%~90%,DNA加合物的形成可以引起DNA发生碱基替换、插入、缺失等DNA损伤。Squadrito和xia等[16,17]的研究表明,PAHs经体内代谢后产生的超氧阴离子和羟基自由基可直接作用于DNA分子,导致DNA发生碱基修饰、DNA链断裂以及DNA- 蛋白质交联等氧化性DNA损伤, 最重要的致突变性损伤为胸腺嘧啶与C- 8上鸟嘌呤碱基的颠换性突变,形成8- 羟基脱氧鸟苷(8- OHd G)。车瑞俊[14]研究表明, 颗粒物所含的PAHs和非烃组分可致DNA单链断裂(SSB)、DNA双链断裂(DSB)及DNA- 蛋白质交联 (DPC)3种DNA损伤类型,PM2.5中的PAHs和非烃组分在很低浓度即呈现很强的DNA损伤作用,且随着剂量的增加Olive尾距增加,表现出明显的剂量 - 反应关系。
3.2 PM2.5的金属成分对DNA的损伤[18,19,20,21,22] 目前已有许多研究表明,PM2.5中的金属成分可致人DNA损伤。有研究认为,过渡金属是损伤DNA的主要因素,其中水溶性Zn2+ 被认为可能是引起DNA氧化损伤的主要过渡金属离子。不同的金属离子可通过介导DNA氧化损伤和(或)与DNA结合,导致DNA氧化形成8- OHd G加合物、DNA链断裂、DNA链交联等损伤。能够被氧化为高价态的金属离子如Fe2+、Cr3+、Cu2+ 通过参与Fenton反应生成活性氧(ROS),后者引起DNA碱基化学修饰、 DNA链断裂等氧化损伤。有些金属离子如Ni2+、V3+、Co2+ 可引起DNA链交联。过渡金属与DNA之间形成八面体配合物时,可氧化并断裂DNA的碱基。另有研究发现, 颗粒物中的金属元素之间可产生协同的DNA氧化损伤作用。
目前可通 过检测DNA的损伤产 物作为PM2 . 5暴露致DNA损伤的生物标志物[12]。检测外周血白细胞中BPDE-DNA加合物、尿中1-OHPyr和8-OHd G可作为无其他特殊因素引起暴露,PM2.5致DNA损伤的效应生物标志物。DNA损伤所形成的DNA断裂碎片亦可作为判断DNA损伤的生物标志物,通过彗星试验测定的尿嘧啶(OMT)可进行评价,但由于生活当中引起DNA损伤的因素较多,故其作为PM2.5暴露致DNA损伤的标志物的特异性较差。
4DNA损伤修复与遗传毒性损伤
细胞周期是指第1次分裂完成到下1次分裂结束所经历的整个过程,该周期分为间期和分裂期(M期), 包含DNA复制以及细胞分裂两个主要事件。细胞在间期完成了DNA的复制过程。见图1。
注:G0 期:细胞离开细胞周期,停止细胞分裂,在适当刺激下可重新,G1 期,DNA 合成前期。S 期,DNA 合成期,G2 期,DNA 合成。R 点,亦称校正点或阻止点,当 DNA 损伤等事件发生时,细胞周期 S 期,细胞周期被阻滞
PM2.5暴露损伤DNA时,损伤信号会启动一系列信号级联反应,引起细胞周期阻滞或者细胞凋亡[23]。 p53可介导产生DNA损伤关卡(DNA damage checkpoints) 包括G1/S期关卡、S期关卡、G2/M期关卡,可分别引起不同时相的细胞周期阻滞。DNA损伤发生在G1期时, G1/S期关卡可抑制DNA复制的启动,阻滞进入S期, 为细胞增殖的调控点;DNA损伤发生在S期或逃逸过G1/S期可产生S期关卡,阻止DNA复制;G2/M期关卡可阻止DNA受损细胞进入有丝分裂。细胞周期阻滞为DNA损伤修复提供较长的修复时间,细胞可通过p53介导启动以下7条修复通路应对不同类型的损伤[24]: 1直接修复通路;2碱基错配修复;3碱基切除修复; 4核苷酸切除修复;5同源重组修复;6非同源末端连接通路;7translesion DNA合成。细胞损伤较轻时,通过DNA损伤修复,维持基因组的完整性,使细胞继续生存;当细胞损伤较重时,细胞会启动p53依赖的凋亡或衰老反应以清除损伤的细胞。如果细胞DNA错误修复或未及时充分修复而进入细胞周期,可发生致畸、致癌遗传毒性损伤。Gualtieri等[25]研究发现,PM2.5暴露可引起DNA损伤和基因表达的改变,进而影响胎儿的组织器官形成,导致不良妊娠结局的发生。
5PM2.5致DNA损伤的检测
目前已建立的短期遗传毒性初筛方法有200多种,被广泛认可和应用的有10余种,关于DNA的损伤检测常用的有彗星试验、UDS试验、免疫学实验和32P标记法等。彗星试验可用于检测DNA断裂、交联、切除修复缺陷等损伤,免疫学试验及32P标记法可检测DNA加合损伤。
5.1定量评价PM2.5对DNA的损伤能力可采用质粒DNA评价法(Plasmid Scission Assay),由于PM2.5氧化损伤DNA可致其超螺旋结构松弛、线化,形成不同的DNA在电泳仪中的运动速度不同,使之在琼脂糖凝胶中分离开来,采用灵敏的显像测密术可分析损伤DNA占总DNA的比例。通过质粒DNA评价法可获得TD50和TD20值,可用于不同地区、不同类型PM2.5毒性强弱的分析比较。迪丽努尔采[26]用质粒DNA评价法,成功分析了不同季节PM2.5对DNA的氧化损伤能力,即冬季最强,春季和夏季次之,秋季最弱。
5.2彗星试验又称单细胞凝胶电泳分析(SCGE)。 DNA损伤产生的断裂碎片进入琼脂糖凝胶,在电场的作用下向阳极迁移,DNA碎片在迁移时形成一尾状带,DNA损伤越严重产生的碎片越多越小,电泳迁移的DNA量越大,迁移距离越长,通过测定DNA迁移距离 (即尾长)和尾部的荧光强度来评价DNA的损伤程度。 彗星试验可定量测定单个细胞DNA的损伤程度,且该方法灵敏、简便、快速、价廉、重复性好并适用于任何活的真核细胞。李利忠等[27]应用彗星实验证实汉阳和汉口地区PM2.5可致Beas- 2B细胞DNA损伤,PM2.5质量浓度为25 mg/L时,细胞核出现明显的彗星拖尾现象,且具有一定剂量 - 反应关系。
5.3 UDS试验(Unscheduled DNA Synthesis) 亦称程序外DNA合成试验或DNA修复合成试验。DNA的一条链或某个片段损伤时,互补的另一条链可修复该损伤, 使其恢复原来的结构,通过分析细胞修复的强弱大小可以评价PM2.5对DNA的损伤能力大小,还可进一步推测其致突变与致癌性[28]。
5.432P标记法即免疫亲和性层析色谱搭配32P标记技术(IC-32P),该方法是目前检测DNA加合物最灵敏的方法。采用放射性同位素32P标记的三磷酸腺苷和免疫亲和层析柱纯化的DNA水解产物结合,生成含32P标记的DNA加合物,然后经聚乙烯亚胺纤维膜纯化32P的放射强度,通过计算32P的放射强度可分析DNA加合物的含量。应用方法可以检测1010分子中的一个DNA加合物。
5.5检测PM2.5的致基因突变毒性或染色体畸变可进行Ames试验、SOS/umu试验、TK(胸苷激酶)基因检测、转基因哺乳动物突变试验、微核试验、姐妹染色单体交换试验(SCE试验)等。
6结语
PM2.5暴露可以引起DNA损伤,促进人群恶性肿瘤的发病以及不良妊娠结局的发生,而PM2.5的毒性效应因地区而异且与其成分密切相关,每种成分在PM2.5中所占比重不同,且随环境和时间变化。亦有研究表明PM2.5对DNA的损伤能力与环境平均温度、平均湿度、 平均风速、大气压强等相关[14]。因此加强研究不同地区PM2.5的成分对DNA的损伤效应以及PM2.5对DNA损伤的影响因素,如季节[26]、气象条件(环境平均温度、湿度、大气压强、风速等)人群居住条件等,综合评价PM2.5对DNA的损伤作用,可以为制定保护PM2.5暴露人群的健康策略和相关决策分析提供信息支持。
DNA损伤 篇5
吸烟者CYP1A1和GSTM1基因多态性与DNA损伤关系
[目的]探讨吸烟者I相代谢酶CYP1A1和Ⅱ相代谢酶GSTM1基因多态性与DNA损伤的`关系.[方法]选择吸烟量、性别、年龄、生活方式基本相同的吸烟者123例,应用Pyrosequencing技术进行个体基因型测定,彗星试验测定外周血淋巴细胞DNA损伤程度.[结果]在123名吸烟者中,CYP1A1突变型(CYP1A1 Va1/Val)占CYP1A1等位基因型的28.5%,GSTM1缺失型(GSTM1 null)占GSTM1等位基因型的56.1%.具有CYP1A1 Val/Val和GSTM1null基因型的个体有19名,占吸烟者总数的15.4%.同时具CYP1A1突变型和GSTM1缺失型纯合个体,淋巴细胞的拖尾形成率为97.5%,尾长达120.9 μm,尾矩为42.4μm,显著高于野生型个体(P＜0.05),且尾部DNA的荧光强度明显升高,而突变杂合型个体DNA损伤无明显加重.[结论]CYP1A1突变型与GSTM1缺失型共同携带者对DNA损伤敏感,多个突变基因对DNA损伤可能具有协同作用.
作 者：潘喜华 仲伟鉴 肖萍 杨隽 郑勇英 郑卫东 PAN Xi-hua ZHONG Wei-jian XIAO Ping YANG Jun ZHENG Yong-ying ZHENG Wei-dong 作者单位：上海市疾病预防控制中心,上海,200336 刊 名：环境与职业医学 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ENVIRONMENTAL AND OCCUPATIONAL MEDICINE 年，卷(期)：2006 23(3) 分类号：Q3 关键词：基因多态性 CYP1A1基因 GSTM1基因 彗星试验★ 转录调节因子核因子κB参与调控的急性肺损伤相关的细胞因子基因
DNA损伤 篇6
1 材料与方法
1.1 试剂
1 640培养基购自美国Gibico公司,胰酶(Trypsin)购自北京邦定生物医学公司,胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司,13和50 nm、10 μm氧化铝颗粒、丝裂霉素C均购于美国Sigma公司,cy 5.5荧光标记氧化铝颗粒由大连理工大学孙世国教授惠赠,谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)购于南京建成生物工程公司。
1.2 仪器
二氧化碳培养箱由德国Heraeus公司生产,SW-CJ-2F型超净工作台由苏州安泰空气技术有限公司生产,KY-I 型微型空气压缩机由绍兴市卫星医疗设备制造有限公司生产,80-2B型离心沉淀机由盐城市科学仪器厂生产,LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器由江阴滨江医疗设备厂生产,AB104-N电子天平由上海电子仪器厂生产,OLYMPUS BX51荧光显微镜由日本OLYMPUS公司生产,nano-ZS90纳米粒度仪由英国Malvern公司生产。
1.3 实验方法
1.3.1 纳米颗粒的表征
用双蒸水配制纳米氧化铝悬液,超声处理10 min后,用nano-ZS90纳米粒度仪(Malvern)检测纳米颗粒的尺寸及电位。
1.3.2 CHL细胞培养及染毒
1.3.2.1 CHL细胞培养
CHL细胞由中国辐射防治研究院安评中心惠赠,将CHL细胞以1×105/ml的密度接种在细胞培养瓶中,然后于培养箱(37 ℃、5%CO2、95%湿度)中培养。
1.3.2.2 染毒
选取生长良好的同批次CHL细胞,待其铺满瓶底70%～80%时染毒。分别用13和50 nm氧化铝和 10 nm氧化铝颗粒对CHL细胞染毒。设剂量组为空白对照组、低剂量组(15 μg/ml)、中剂量组(30 μg/ml)、高剂量组(60 μg/ml),阳性对照组(丝裂霉素C 0.5 μg/ml),继续培养24 h以收集细胞进行各项指标检测。不同粒径的氧化铝颗粒染毒前超声处理10 min。
1.3.3 碱性SCGE试验
1.3.3.1 单细胞悬液的制备及电泳
CHL细胞染毒24 h后弃去培养基,用0.25%胰酶消化,弃胰酶,用PBS洗脱细胞,1 000 r/min,离心4 min,收集各组细胞并分散成单个细胞,制备成1×106/ml细胞悬液 。细胞悬液与低熔点琼脂糖(LMPA)混合,滴在正常熔点琼脂糖(NMPA)涂片上;细胞裂解液使细胞膜破裂,碱性缓冲液使DNA解螺旋,室温下置恒压25 V,电流300 mA,电泳25 min。切断电源,用中和缓冲液浸洗3次×5 min。EB染色,荧光显微镜下观察。拍摄×400倍照片,每个样品至少随机挑选100个细胞测定。
1.3.3.2 分析
用CometIMI 11.0软件分析,测量Olive尾矩,即尾部DNA百分含量×(尾光密度中心-头光密度中心)。
1.3.4 氧化应激指标的检测
染毒24 h后的CHL细胞,用胰酶消化、洗涤、离心、收集细胞同上,再用生理盐水清洗2次,细胞悬液用超声粉碎器粉碎,离心收集上清液进行氧化应激指标的检测。试验过程按照谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒的说明书进行。
1.3.5 荧光标记纳米颗粒进入细胞情况
取cy 5.5荧光标记的纳米氧化铝颗粒(13 nm)、纳米氧化铝颗粒(50 nm)、微米氧化铝颗粒(10 μm)染毒细胞,染毒终浓度为30 μg/ml,染毒3 h时用Hoechst荧光染液加入细胞培养液中,终浓度为5 μg/ml,15 min后用D-Hanks液清洗2次,在荧光显微镜下观察不同粒径氧化铝颗粒进入细胞情况并摄片。
1.3.6 统计分析
采用SPSS 13.0统计软件对各项指标的实验数据进行处理,用undefined表示,采用析因设计方差分析进行不同因素、不同水平间的比较,多重比较用LSD检验。
2 结果
2.1 纳米氧化铝的表征
不同粒径的纳米氧化铝颗粒表征具体数值见表1。
2.2 SCGE检测结果
试验所得的彗星图像见图1。空白对照组彗星头部DNA致密,无明显尾部或尾部很短。各染毒组头部DNA集中,亮度较强,尾部由DNA断片组成呈扫帚状,荧光强度不及头部。利用CometIMI 11.0软件进行数据分析,各组的Olive尾矩数据见表2。不同粒径组Olive尾矩之间差异没有统计学意义。但不同粒径组随着染毒剂量增加,Olive尾矩与空白对照组相比,有增加趋势,高剂量组增加明显,中、高剂量组与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
60 μg/ml组 阳性对照组
注:a与空白对照组相比,aP<0.05,bP<0.01。
2.3 荧光显微镜下观察氧化铝颗粒进入细胞情况
Hoechst染色可见CHL细胞的细胞核呈现均匀蓝染的荧光。cy5.5荧光标记氧化铝颗粒为红色颗粒(白色箭头)。融合图为Hoechst染色图和荧光标记氧化铝图组合,图中显示纳米氧化铝颗粒染毒组可见较多的荧光标记的纳米颗粒进入胞质,微米氧化铝颗粒组较少。见图2。
2.4 氧化应激指标
CHL细胞中GSH含量,在不同粒径组之间差异无统计学意义(P>0.05)。但各粒径组随着染毒剂量增加,细胞GSH呈逐渐下降趋势,中、高剂量与空白对照组比,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞中SOD活力,在不同粒径组之间差异无统计学意义(P>0.05)。但各粒径组随染毒剂量增加,SOD活力有降低的趋势,高剂量与空白对照组比,差异有统计学意义(P<0.05)。纳米氧化铝颗粒(50 nm)组的低、中剂量引起细胞的SOD活力短暂上升,与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);高剂量组SOD活力明显降低,与空白对照组比,差异有统计学意义(P<0.01)。微米氧化铝颗粒(10μm)中剂量引起细胞的SOD活力短暂上升,与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);高剂量组,明显下降,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞中MDA含量,在不同粒径组之间差异有统计学意义(P<0.05),纳米氧化铝颗粒(50 nm)组的MDA含量比纳米氧化铝颗粒(13 nm)组、微米氧化铝颗粒(10 μm)组含量高。不同粒径组各剂量的细胞MDA随着染毒剂量的增加有逐渐升高的趋势,纳米氧化铝颗粒(13 nm)组的MDA含量在高剂量时最明显,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);纳米氧化铝颗粒(50 nm)组及微米氧化铝颗粒(10 μm)组MDA含量逐渐升高,在中、高剂量时,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。
注:GSH—谷胱甘肽;SOD—超氧化物歧化酶;MDA—丙二醛。与空白对照组相比,aP<0.05,bP<0.01。
3 讨论
遗传毒理的评价终点主要是染色体、DNA、基因3个水平。SCGE是一种在细胞水平检测DNA损伤的方法,通过计算各组细胞彗星的Olive尾矩,判断DNA损伤程度。目前最常用的是碱性彗星实验,能够检测单链DNA断裂、双链DNA断裂及碱性不稳定点[5]。遗传毒理的评价常用的哺乳动物细胞为CHL细胞及中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1细胞)等,本实验以CHL细胞为研究对象,了解不同粒径纳米氧化铝颗粒对CHL细胞DNA的影响,为其遗传毒性综合评价提供参考。
本次彗星实验中,随着染毒剂量增加,不同粒径组的各剂量组的细胞Olive尾矩,相对于空白对照组,有增加趋势,中、高剂量组升高明显,表明纳米、微米氧化铝颗粒均可以引起细胞DNA损伤,且随着染毒剂量增加,DNA的损伤加重。但不同粒径氧化铝颗粒的相同染毒剂量组之间的DNA损伤差异没有统计学意义。另外,阳性对照组平均细胞Olive尾矩是不同粒径组的最高剂量组的三四倍,提示纳米、微米氧化铝颗粒对细胞DNA的损伤作用相对阳性对照组比较弱。
目前研究表明,纳米颗粒可以对细胞产生氧化应激损害。本实验中我们首先观察纳米、微米氧化铝颗粒进入细胞情况。通过使用荧光标记的纳米及微米氧化铝颗粒和Hoechst染色发现,纳米氧化铝颗粒染毒组可见较多的荧光标记的纳米颗粒进入细胞质,围绕细胞核周围,微米氧化铝颗粒组较少,表明CHL细胞可以摄取纳米及微米氧化铝颗粒。研究表明,其他的一些纳米颗粒也可以被细胞摄取。Woodruff 等[6]2012年通过透射电子显示微镜(TEM)及能量色散X-射线光谱(EDS)观察到用纳米TiO2染毒后的TK6细胞内有纳米TiO2,但没有观察到细胞DNA的损害。另外,我们对细胞的GSH、SOD、MDA等氧化应激指标进行测定。本次试验数据表明,随着染毒剂量的增加,各染毒剂量组细胞GSH含量逐渐降低。SOD含量在纳米氧化铝(13 nm)组有降低的趋势,纳米氧化铝(50 nm)组及微米氧化铝(10 μm)组引起细胞的SOD活力短暂上升,推测为低、中剂量的刺激后的代偿。细胞MDA的含量,随着染毒剂量的增加各组的MDA含量呈现升高趋势。综合上述结果显示,随着染毒剂量的增加,细胞的氧化应激反应指标SOD、GSH活力下降,MDA含量上升,表明纳米颗粒进入细胞后,不仅导致CHL细胞膜的损害,同时破坏细胞内抗氧化酶体系的平衡,而且对细胞膜的损伤高于对细胞内大分子物质作用,纳米氧化铝(50 nm)组对于细胞膜的损害比纳米氧化铝(13 nm)组及微米氧化铝(10 μm)组严重。氧化应激各指标的变化与细胞DNA损伤变化,即随着染毒剂量的增加而氧化应激、DNA损伤明显,推测纳米氧化铝颗粒及微米氧化铝颗粒引起细胞氧化损伤可能是其导致细胞DNA损伤的原因,但具体机制有待进一步研究。
综上所述,纳米、微米氧化铝颗粒可以进入细胞,并引起细胞的氧化应激反应,造成膜的脂质过氧化,引起细胞内遗传物质DNA的损伤,并有浓度依赖效应。
摘要：目的 通过研究不同粒径及不同浓度纳米氧化铝颗粒对中国仓鼠肺细胞(CHL细胞)DNA损伤及氧化应激的影响,探索纳米氧化铝颗粒遗传毒性及作用机制。方法 选用13、50 nm和10μm 3种粒径的氧化铝颗粒为3个粒径组,每种粒径氧化铝又分别设低剂量(15μg/ml)、中剂量(30μg/ml)、高剂量(60μg/ml)组,另设空白对照组和阳性对照组。染毒24h后处理细胞。用荧光显微镜观察cy 5.5荧光标记纳米颗粒进入细胞的情况。用单细胞琼脂糖凝胶电泳(SCGE)检测DNA损伤,谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)评估氧化应激反应的指标。结果 荧光标记的纳米颗粒在细胞核周围分布。SCGE结果显示,与空白对照组相比,各染毒剂量组Olive尾矩有增加趋势,中、高剂量组Olive尾矩均明显增加(P<0.05)。氧化应激指标结果显示,随着染毒剂量的增加各种氧化应激指标明显变化,高剂量组与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 纳米氧化铝颗粒可以引起CHL细胞DNA损伤和氧化应激反应,氧化应激反应可能是导致遗传毒性的机制之一。
关键词：纳米氧化铝颗粒,单细胞琼脂糖凝胶电泳,DNA损伤,氧化应激
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DNA损伤 篇7
1 对象与方法
1.1 对象
选择TCE作业工人50人为接触组, 其中男10人, 女40人;年龄19~60 (36.6±8.7) 岁;工龄0.3~6.3 (2.0±1.7) a;另选不接触任何职业病危害因素的作业工人78名为对照组, 其中男13人, 女65人;年龄18~57 (33.8±8.5岁) 。2组人员均不吸烟, 没有电离辐射、铅、过氧化氢、氯乙烯、苯等其他职业有害因素接触史, 同时近期无感冒、感染、发热史, 均无免疫系统疾病和血液病史;2组研究对象在性别、年龄等方面均具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 工作场所空气中TCE浓度监测
按照GBZ159-2004《工作场所空气中有害物质监测的采样规范》进行个体采样。用活性炭管采集空气样, 采样流量0.05 L/min, 采样时间为工人的1个工作日;用Thermo Trace GC Ultra气相色谱仪, 按GBZ/T 160.46-2004《工作场所空气有毒物质测定卤代不饱和烃类化合物》方法检测, 作业工人接触工作场所空气中TCE时间加权平均 (TWA) 浓度。
1.2.2 尿中三氯乙酸 (TCA) 浓度测定
用聚乙烯塑料瓶收集TCE作业工人工作班末尿50 ml, 测量尿比重, 按WS/T 96-1996《尿中三氯乙酸顶空气相色谱测定方法》测定尿中TCA浓度。留取尿样前1天应避免接触乙醇和服用水合氯醛类药物。
1.2.3 淋巴细胞DNA损伤的检测
1.2.3. 1 血样采集
采集各组工人外周静脉血2 ml, 肝素抗凝, 4℃低温保存送检, 24 h内完成SCGE和固定操作。
1.2.3. 2 主要试剂和仪器
(1) 试剂:低熔点琼脂糖凝胶 (LMA) 、PBS、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠 (Na2EDTA) 、三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 、氢氧化钠 (Na OH) 、二甲亚砜 (DMSO) 、Triton X-100、浓盐酸 (HCl) 、溴化乙锭、无水乙醇; (2) 仪器:双稳定时电泳仪、水平电泳槽、梅特勒-托利多 (FE20) 、Cometslide HT彗星玻片盒、实验用p H计、BSA223S电子天平、HWS12型电热恒温水浴锅、GL-315B磁力搅拌器、荧光倒置显微镜。
1.2.3. 3 实验步骤
对外周血样进行淋巴细胞分离、制片、裂解、解旋、电泳、中和及染色, 然后在荧光倒置显微镜下观察结果。每例拍摄20张无重复照片, 用CASP彗星图象分析软件随机选100个细胞进行分析, 将分析数据转入SPSS;应用CASP软件分析图像后有多种指标可以衡量淋巴细胞DNA损伤情况, 我们选用彗星尾部DNA百分含量 (tail DNA%) 、彗星尾距 (TM) 和olive TM作为分析指标, 分析DNA的损伤程度。
1.3 统计学分析
CASP彗星图象分析软件分析数据直接转入SPSS, 所得实验数据应用SPSS 17.0统计软件建立数据库并进行分析;对于调查对象一般数据进行描述性分析, 运用t检验、方差分析、logistic回归分析等对各变量进行相关分析。
2 结果
2.1 工作场所空气中TCE的TWA浓度
以接触TCE的作业工人作为接触组, 选择22位操作工为采样对象, 检测作业工人接触空气中TCE浓度, 作业工人接触TCE TWA浓度为108.9 mg/m3 (1.42~783 mg/m3) 。共有12位作业工人接触空气中的TCE TWA浓度超过国家职业卫生限值, 超标率为54.5%;另选同单位不接触有害因素的包装和组装工人为对照组, 对照组工作场所空气中未检出TCE。
2.2 工人尿中TCA浓度
TCE接触组和对照组作业工人尿中TCA浓度测定结果见表1。接触组50人中有4人 (8%) 尿中TCA浓度超过职业接触TCE的生物限值 (50 mg/L) , 对照组78名工人尿中TCA浓度均没有超过职业接触生物限值。接触组工人尿中TCA浓度高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;而且尿中TCA浓度与工作场所空气中TCE的TWA浓度存在明显正相关关系 (r=0.83, P<0.01) 。
注:与对照组比较, at=4.05, P<0.01。
2.3 SCGE结果
外周血淋巴细胞经SCGE后进行图片拍摄和分析, 使用荧光倒置显微镜拍摄照片, 每个样本拍摄20张无重复照片, 见图1和图2。
应用CASP彗星图象分析软件, 随机选择照片中清晰完整、独立无重叠的图像进行分析并记录数据, 每张照片分析五六个图像, 每个样本分析100个图像。分析后所得tail DNA%、TM和Olive TM数据见表2。接触组tail DNA%、TM和Olive TM指标均高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。根据logistic回归分析TCE作业工人尿中TCA浓度与Tail DNA%、TM和Olive TM指标均存在相关性 (r=0.79, P<0.01;r=0.24, P<0.01;r=0.21, P<0.01) 。
注:tail DNA%—彗星部DNA百分含量;TM—彗星尾距。
3 讨论
国际癌症研究机构 (IARC) 1995年已将TCE致癌性分类列入第2A类, 因此, 研究TCE对人体的致癌、致畸、致突变作用很有必要, 但目前有关这方面的研究并不多, 且多局限于动物实验。Hrelia等在TCE遗传毒性动物实验中, 观察到小鼠骨髓细胞微核发生率增高[2];Sujatha等[3]的实验也有类似结果, 并观察到TCE接触浓度与微核发生率存在剂量-效应关系;Luigi等[4]的研究结果也显示, TCE可导致小鼠肾细胞微核发生率增高;陈雯等[5]在TCE对接触工人外周血微核率影响的研究中发现:接触组工人外周血微核率高于对照组, 但不存在剂量-效应关系;黄海雄等[6]在TCE对精子的畸形试验中, 观察到TCE对雄性生殖细胞具有遗传毒性;而Rudolf等[7]在姐妹染色体交换实验研究中TCE遗传毒性效应未发现阳性结果;唐国慧等[8]用TCE诱发小鼠及人外周血有核细胞DNA链断裂的程度, 结果发现接触组与对照组无差异。因此, TCE对人体的遗传毒性目前仍是一个尚有争议的问题, 这有待于我们进一步的深入研究。
TCE职业接触主要经呼吸道吸收, 吸收后蓄积于肝脏、脑、心脏等器官。体内的TCE可以原形自呼出气中排出, 或在体内代谢为TCA后从尿中排出。本次研究的接触组50人均为使用TCE的清洗工, 工作场所空气中存在不同浓度的TCE, 该50名TCE作业工人班末尿中均检出TCA, 尿中TCA浓度与工作场所空气中TCE时间加权平均浓度存在明显的正相关关系。
TCE吸收进入体内其代谢产物可与DNA等大分子发生共价结合, 导致DNA分子的损伤, 在SCGE中出现彗星样图像。本研究应用SCGE检测TCE作业工人外周血淋巴细胞的DNA损伤情况, 分析TCE对作业工人的遗传毒性, 在SCGE中由于细胞裂解液的作用膜结构受到破坏, 胞内成分扩散到裂解液中, DNA由于相对分子质量大留在原位, 在碱性条件下, DNA解螺旋, DNA的断链和亲碱性片段释放, 在电场中移动形成彗星样图像, 通过测定DNA迁移部分的吸光度或迁移距离可以测定DNA的损伤程度[9]。因为Head Area和Tail Area等指标人为选择差异较大, 故以tail DNA%、TM和olive TM作为灵敏指标, 其中olive TM值排除了图片分析过程中的人为选择误差, 是DNA头部和尾部的综合指标, 最具参考价值。本研究结果显示接触TCE的作业工人Tail DNA%、TM和Olive TM指标均高于对照组, 与对照组相比, 差异具有统计学意义[ (Tail DNA (P<0.01) 、TM (P<0.05) 、Olive TM (P<0.01) ], 显示TCE可导致作业工人淋巴细胞DNA损伤, 对人体具有一定的遗传毒性。通过logistic回归分析显示TCE作业工人尿中TCA浓度与淋巴细胞DNA损伤水平呈一定的相关关系 (r值分别为0.79、0.24、0.21) , TCE接触浓度与淋巴细胞DNA损伤情况之间存在着剂量-效应关系。
摘要：目的 观察三氯乙烯作业工人的DNA损伤情况, 探讨三氯乙烯对作业工人的遗传毒性。方法 检测作业工人工作场所空气中三氯乙烯时间加权平均浓度, 测定作业工人班后尿中三氯乙酸浓度, 运用单细胞凝胶电泳 (SCGE) 检测50名三氯乙烯作业工人外周血淋巴细胞DNA损伤情况。结果 三氯乙烯作业工人班后尿中三氯乙酸浓度大于对照组 (P<0.01) , DNA损伤情况与对照组比, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 三氯乙烯作业工人尿中三氯乙酸浓度与淋巴细胞DNA损伤水平存在剂量-效应关系。结论 长期接触三氯乙烯可导致作业工人淋巴细胞DNA损伤。
关键词：三氯乙烯,单细胞凝胶电泳,DNA损伤
参考文献
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DNA损伤 篇8
1 材料与方法
1.1 材料
人结肠癌细胞株HCT116,购于南京凯基生物公司。HCT116/L-OHP为本实验室自行诱导,对L-OHP耐药倍数达17.00倍。SD(Sprague-Dawley)大鼠30只,(4～6)周龄,清洁级,雌雄各半,体重为(190g±20)g,购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司(生产许可证号为SCXK (沪)2003-0002)。肠胃清方:由生黄芪、白术、猪苓等组成,1ml汤药含生药2.66g,由本院制剂室熬制。RPMI Medium1640、小牛血清培养基购于Gibico公司,MTT购于Sigma公司,Western blot显色液购于Promega Biotech公司,ERCC1、XPF一抗购于Labvision/NeoMarkers公司,XRCC1、XRCC2～抗购于millipore公司,内参一抗、二抗购于北京博奥森公司,AP位点检测试剂盒购于Cell Biolabs公司。
1.2 细胞培养
HCT116细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(含青霉素、链霉素各100 U/mL)中,HCT116/L-OHP培养在含4μmol/L L-OHP的上述培养液中,于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中常规培养。细胞呈单层贴壁生长。传代时用0.25%胰酶溶液消化。
1.3 药物血清的制备
SD大鼠30只,雌雄各半,随机分为2组,每组15只,A组:肠胃清药物血清组,将肠胃清复方按成人体重用药剂量将生药换算为50 g/kg的浓度给大鼠灌胃;B组:空白对照组,灌服等体积的生理盐水。连续给药5天,末次给药后禁食(12 h)不禁水2小时后,3%戊巴比妥钠(1.5mL/kg)腹腔麻醉,常规消毒后打开腹腔,在无菌条件下行腹主动脉采血,离心,分离血清,56℃水浴30 min灭活,使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌分装,-80℃冰箱保存备用。
1.4 药物血清联用浓度确定
确立HCT116和HCT116/L-OHP细胞株生长无毒性(细胞存活率在90%以上)的含药血清浓度,选择最大无毒剂量的药物血清作为联用浓度。分别取对数生长期细胞株调整细胞浓度至1×105/mL,以每孔100μL(即每孔1×104个细胞)接种于96孔细胞培养板中,背景组加入等体积的培养液,将药物血清按不同浓度分组为:空白血清,2.5%、5%、10%、20%药物血清,各自加入含不同浓度药物血清100μL,实验终止前4小时,每孔加入5mg/mL的MTT(Methyl thiazoly tetrazolium,四甲基偶氮唑盐)溶液20μL,37℃避光继续孵育4小时,加入二甲基亚砜(DMSO)150μL,震荡混匀于酶标仪检测570nm波长处吸光度OD值。计算细胞的存活率,并以药物血清的不同浓度和细胞的存活率作图,选择最大无毒剂量的药物血清作为联用浓度。以背景组平均值调零,按照以下公式计算其存活率:细胞存活率=[试验组OD平均值-背景组OD平均值]/[空白对照组OD平均值-背景组OD平均值]×100%。每个浓度平行4孔,分别设5个浓度级给予处理,实验重复三次。
1.5 药物血清逆转人结肠癌耐药细胞株
HCT116/L-OHP的多药耐药性分别联合含不同浓度化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、顺铂(Diamminedichloro platinum,DDP)、羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydrol Camptothecin,HCPT)、奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)的培养液作用于HCT116/L-OHP细胞株,每个浓度平行4孔,分别设5个浓度级,对照组和空白对照组加入等量体积的培养液,按MTT法实验(方法同上),计算肿瘤细胞的存活率,并以不同化疗药物的不同浓度和细胞的存活率作图,确定细胞的半数抑制浓度(IC50)、抗药因子(Resistance factor,RF)和逆转指数(reversal index,RI)。半数抑制浓度(IC50)=细胞存活率达到一半时的药物作用浓度,抑制率=1-存活率,抗药因子=某种药物针对抗药性细胞的IC50/某种药物针对敏感性细胞的IC50,逆转指数(RF)=不加逆转剂时某种药物针对抗药性细胞的IC50/加入逆转剂后某种药物针对抗药性细胞的IC50。
加入药物及浓度如下:
1.6 联用L-OHP浓度的确定
取对数生长期细胞,加入含不同浓度[(6.25、12.5、25、50、100和200)μg/ml]L-OHP的培养液,L-OHP+肠胃清组同上述药物浓度并加入7.5%的肠胃清药物血清,药物血清组以及空白血清组用等体积培养液,每浓度平行3孔,MTT法测细胞存活率(方法同上)。
1.7 Western blot法检测DNA损伤修复蛋白
取对数生长期的两种细胞稀释至1×105cell/ml接种于10cm平皿中。L-OHP组加入7.2μg/ml L-OHP的培养液,L-OHP+肠胃清组采用上述药物浓度并加入7.5%的药物血清,药物血清组以及空白血清组用等体积培养液,培养48 h后抽提细胞核蛋白。Bradford法测定蛋白质浓度,每孔50μg上样,12%SDS-PAGE凝胶电泳分离,通过电转移法将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜封闭液中室温下封闭1h,滴加1mL一抗溶液(说明书稀释相应倍数)4℃孵育过夜,PBST缓冲液充分漂洗(5min×3次),加入对应二抗(说明书稀释相应倍数),室温下结合2h,PBST缓冲液充分漂洗(5min×3次),5mL AP buffer(Alkaline Phosphatase)配置显影液NBT/BCIP,将膜置于显影液中,室温下温和摇动,直至条带清晰,置清水中洗5min,用凝胶成像系统记录结果。
1.8 AP位点的检测
两种细胞加药分组处理同上,抽提细胞总核酸,采用比色测定法测定AP位点[1],每个样本至少3孔。通过ARP(Aldehyde Reactive Probe)反应得标记AP位点的DNA。TE缓冲液稀上述样本至1μg/mL,每孔分别加50μL ARP DNA标准品和ARP标记DNA样本,及50μL DNA连接液,室温过夜,使标记的DNA结合在板表面。洗涤5次,每孔加100μL Streptavidin-Enzyme Conjugate结合,37℃,1小时,洗涤5次,每孔(包括空白组)加Substrate Solution 100μL,室温振动20分钟,加入100μL Stop Solution终止反应。450nm OD值的分光光度计读数。标准ARP-DNA溶液制作校正曲线,根据校准曲线,测定基因组DNA样本脱碱基位点的数目(每105bp)。对比处理样本和对照样本AP位点的数目,测定DNA损伤的水平。
1.9 统计方法
计量资料描述用均数±标准差表示。多个均数比较,先作方差齐性检验,方差齐者采用SNK-q检验(StudentNewman-Keuls法),方差不齐者用近似F值检验,两两比较Tamhane法。统计分析软件:SPSS 11.0。统计学处理IC50用线性回归法。耐药比较采用t检验。率的比较采用精确概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 药物血清联用浓度
本次实验选择药物血清作用48小时后细胞存活率>90%的药物剂量(最大无毒剂量)作为药物联用浓度,实验结果显示:0%～10%的药物血清为无毒使用范围,7.5%药物血清浓度时,HCT116及HCT116/L-OHP的细胞存活率分别为92.85%、95.86%(见图1),因此确定7.5%的药物血清浓度为联用浓度。
2.2 药物血清逆转人结肠癌耐药细胞株
HCT116/L-OHP的多药耐药性使用7.5%的肠胃清药物血清分别与L-OHP,5-FU,DDP,HCPT联合应用,结果显示:肠胃清药物血清联合化疗药物后,能逆转耐药细胞的耐药倍数,L-OHP对耐药细胞的IC50值从250.38μg/mL下降到32.45μg/mL,逆转倍数为7.15倍,对于其他不同结构的化疗药物也有逆转作用(P<0.01),见表1。
与HCT116比:△△P<0.01;与HCT116/LOHP比:**P<0.01
2.3 L-OHP浓度的确定
本次实验结果在48小时作用后,在7.2μg/ml L-OHP浓度的各组中,细胞存活率均大于50%。如图2:
*p<0.05,**p<0.01与对应HCT116细胞处理组相比;#p<0.05与L-OHP处理组相比。
2.4 DNA损伤修复相关蛋白的检测
本次实验显示,人结肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP中XRCC1、XRCC2、XPF、ERCC1的含量较HCT116均显著增多(P<0.05);结肠癌细胞HCT116经L-OHP作用后XRCC1、XRCC2、ERCC1蛋白含量显著减少(P<0.05),L-OHP与肠胃清药物血清联合作用后,XRCC1、XRCC2、XPF、ERCC1较L-OHP组均显著减少(P<0.05);耐药细胞株HCT116/L-OHP中XRCC1、XRCC2、XPF、ERCC1蛋白含量与对照组比较变化均无统计学意义,但L-OHP联合肠胃清药物血清组与对照组相比XRCC2、XPF、ERCC1蛋白含量有减少趋势。如图3、图4:
(A)XRCC1蛋白表达情况。*p<0.05与同株细胞对照组相比;#p<0.05与HCT116细胞株对应处理组;&p<0.05与同株细胞株L-OHP处理组。(B)XRCC2蛋白表达情况。*p<0.05与同株细胞对照组相比;#p<0.05与HCT116细胞株对应处理组;&p<0.05与同株细胞株L-OHP处理组。(C)XPF蛋白表达情况。*p<0.05与同株细胞对照组相比;#p<0.05与HCT116细胞株对应处理组;&p<0.05与同株细胞株L-OHP处理组。(D)ERCC1蛋白表达情况。*p<0.05与同株细胞对照组相比;#p<0.05与HCT116细胞株对应处理组;&p<0.05与同株细胞株L-OHP处理组
2.5 AP位点的检测
本次实验显示,人结肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP中AP位点表达较HCT116显著减少(P<0.05);结肠癌细胞HCT116经L-OHP、L-OHP与肠胃清药物血清联合作用后AP位点的表达均显著增加(P<0.05);人结肠癌耐药细胞株HCT116/L-OHP细胞AP位点表达经各组干预后,与对照组比较变化均无统计学意义。如图5:
*p<0.05与对应细胞空白对照组相比;#p<0.05与HCT116细胞对应处理组相比。
3 讨论
草酸铂(L-OHP)是近年来被推荐的Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌的一线治疗药物,它的特点是对顺铂、卡铂的耐药株均有显著的抑制作用[2]。铂类药物攻击的主要靶点是DNA,它与细胞核内基因DNA的结合决定了其抗癌活性,并且这种结合会干扰正常DNA复制,最终导致癌细胞死亡[3]。因此DNA损伤修复能力是癌细胞是否对铂类耐药的重要分子机制,而碱基切除修复(base excision repair,BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)是DNA损伤修复的重要形式[4]。在该损伤修复机制中,与铂类耐药相关研究最多的是ERCC1,其活性的高低可反映整个NER修复活性的水平,Lin K等[5]对91例Ⅲ-Ⅳ期的上皮性卵巢癌患者进行卵巢组织的免疫组化分析,发现耐药组ERCC1表达水平显著高于敏感组,接受新辅助化疗的患者,其表达水平比化疗前增高23%,提示ERCC1的表达增加与以铂类化疗为基础的化疗耐药的形成有关。实验研究证实Cetuximab、Fludarabine等可通过抑制ERCC1活性增强肿瘤细胞对铂类及作用于细胞DNA抗癌药物的敏感性[6]。XRCC研究较少,有报道其水平增高与癌细胞铂类耐药有关[7]。
本次研究表明,XRCC1、XRCC2在BER中发挥重要的作用,AP位点是最常见DNA损伤中的形式。XRCC1在BER修复途径中充当支架和不同活性的调节者的作用,提供了一个AP位点修复过程切除和修复步骤的联结作用,而且有效地刺激它和核酸内切酶活性。本次研究表明,耐药细胞HCT116/L-OHP中XRCC1、XRCC2、XPF、ERCC1的含量均明显增多(p<0.05),XRCC 1、XRCC2又可增加AP位点的修复功能,与本次研究耐药细胞株中AP位点明显减少相一致(p<0.05),由此我们可以推测耐药细胞株可能是增加了XRCC1、XRCC2的含量,减少AP位点,增加DNA的BER能力;增加的XPF、ERCC 1,则提高了DNA的NER水平,(对于另一途径DNA加合物表达量的研究我们在接下来的研究中将继续经行),从而减弱了L-OHP对耐药细胞株DNA的损伤,产生耐药性。
结肠癌细胞HCT116经L-OHP作用后可减少中XRCC1、XRCC2、ERCC1蛋白的含量(p<0.05),增加AP位点的表达,表明BER能力降低,DNA损伤加重,再次提示L-OHP对于结肠癌细胞的攻击点与DNA损伤修复有关,与文献资料相一致。而对于耐药细胞株HCT116/L-OHP细胞各蛋白及AP位点影响有相同趋势,无统计学意义,再次表明其耐药性与细胞DNA损伤修复相关。L-OHP与肠胃清药物血清联合作用HCT116后,XRCC1、XRCC2、XPF、ERCC1较L-OHP组均显著减少(p<0.05),AP位点亦有增加趋势,表明肠胃清药物血清能够增加L-OHP对结肠癌细胞HCT116的DNA损伤,从而达到增加化疗效果的治疗目的。
耐药细胞株HCT116/L-OHP中XRCC1、XRCC2、XPF、ERCC1蛋白含量,AP位点表达经各组干预后,与对照组比较变化均无统计学意义。但L-OHP联合肠胃清药物血清组与对照组相比XRCC2、XPF、ERCC1蛋白含量有减少趋势,表明肠胃清药物血清联合L-OHP对HCT116/L-OHP的BER作用不明显,对耐药细胞株DNA损伤较小,逆转耐药的效果较弱,提示我们之后可以通过DNA-加合物相关的NER进行研究。
综上所述,本次研究表明,结肠癌耐药细胞胞内的AP位点降低,进而增加细胞的修复能力,提高耐药性。L-OHP攻击结肠癌细胞,是通过降低BER、NER的能力,导致DNA损伤加重,干扰DNA复制,达到治疗目的。肠胃清能增加L-OHP的该项能力,但尚不能完全说明通过DNA损伤修复逆转耐药情况,提示可以对另一个相关指标铂-DNA加合物检测继续进行。
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DNA损伤 篇9
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物
健康离乳Wistar大鼠21只, 体重50 g左右, 活动能力相近, 由山西医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 饲料
低碘饲料是以来自低碘地区山西省安泽县魏家湾村的小麦、玉米、大豆为原料制成的, 碘含量为0.085 8 μg/g, 氟含量为26.51 mg/kg;正常饲料由山西医科大学实验动物中心提供, 碘含量为0.354 3 μg/g, 氟含量为25.57 mg/kg。氟、碘的测定分别采用氟离子电极法和硫氰酸铁-亚硝酸催化动力学法。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的建立
取离乳Wistar大鼠21只, 随机分为4组:对照组 (5只) 大鼠饲喂大鼠标准饲料, 饮自来水;高氟组 (5只) 大鼠饲喂大鼠正常饲料, 饮100 mg/L氟化钠去离子水;低碘组 (5只) 大鼠饲喂低碘饲料 (定做) , 饮去离子水;高氟低碘组 (6只) 大鼠饲喂低碘饲料, 饮100 mg/L氟化钠去离子水。饲喂3个月, 收集一昼夜尿液, 测其碘含量 (对照组为1 627.9 μg/L, 高氟组为1 314.5 μg/L, 低碘组为651.1 μg/L, 高氟低碘组为1 401.7 μg/L) , 根据尿碘含量可确定动物模型的建立。在此条件下共饲喂19个月。
大鼠在20月龄时脱颈处死, 立即取出甲状腺组织, 用冰冷的PBS漂洗3次至无血液存留, 再用不锈钢剪刀将其剪碎, 加适量PBS到玻璃匀浆器中, 研磨, 并过300目筛得到单细胞悬液, 台盼兰染色、镜检细胞存活率, 如细胞存活率达90%以上立即进行单细胞凝胶电泳。
1.2.2 胶板的制备
①第1层胶的制备:
将预热56 ℃的0.5%正常熔点琼脂糖 (NMA, 溶于无Ca2+、Mg2+的磷酸缓冲液PBS中) 80 μL滴到同样预热的载玻片的磨砂面上, 迅速盖上干净的盖玻片, 4 ℃放置10 min使其凝固。
②第2层胶的制备:
取含1 000个细胞的PBS 10 μL和0.5%低熔点琼脂糖 (LMA, 溶于无Ca2+、Mg2+的磷酸缓冲液PBS) 75 μL在37 ℃混匀, 然后轻轻揭去盖玻片, 将含细胞的LMA滴到第1层胶板上, 立即盖上干净的盖玻片, 4 ℃放置10 min使其凝固。
③第3层胶的制备:
在凝固的LMA层上滴加预热37 ℃的0.5% LMA 85 μL, 盖上盖玻片, 使其凝固。第1层胶的主要目的是使第2层胶平整和附着紧密, 第3层胶的目的是对第2层胶的细胞起保护作用。
1.2.3 细胞裂解
移去盖玻片, 将载玻片浸入新配制的细胞裂解液 (NaCl 2.5 mol/L, Na2EDTA 100 mmol/L, Tris 10 mmol/L, N-十二烷基肌氨酸钠1%, pH值为10) 中保存, 用前加1%体积的Triton-X-100、10%的DMSO) 至少裂解1 h。此步骤的目的是溶解细胞膜及核膜, 除去蛋白质、RNA等, 仅存留核骨架。
1.2.4 DNA碱解旋
裂解1 h后取出载玻片, 用PBS冲洗2次以去掉载玻片表面高浓度的盐, 然后将载玻片置于水平电泳槽中, 倒入新配制的碱性电泳缓冲液 (Na2EDTA 1 mmol/L, NaOH 300 mmol/L, pH值为13) 中, 约覆过胶面0.25 cm, 碱解旋20 min, 以便使DNA在碱性条件下解螺旋形成单链DNA, 使DNA断链在电泳场中易于迁移。在预试验中观察到碱解旋的时间延长可使DNA迁移长度增加。
1.2.5 电泳、中和与染色
在25 V、300 mA的条件下电泳20 min;将载玻片取出, 用吸水纸吸干电泳缓冲液, 用Tris-HCl (pH值为7.5) 中和15 min;然后在每片载玻片上滴加30 μg/mL溴化乙锭 (EB) 水溶液50 μL, 盖上盖玻片, 染色20 min后即可观察。
1.2.6 观察与数据处理
EB染色后的样本应尽快在荧光显微镜下观察电泳图谱。每张载玻片随机拍摄25个细胞, 计算拖尾率并用游标卡尺测量细胞头长和尾长, 以此评估细胞DNA受损情况并对大鼠甲状腺组织细胞的损伤进行分级 (本研究将DNA链断裂分为三级:Ⅰ级, 彗星尾长/彗星头长<1;Ⅱ级, 1<彗星尾长/彗星头长<2;Ⅲ级, 彗星尾长/彗星头长≥2。Ⅰ级、Ⅱ级为一般型DNA链断裂, 其中Ⅰ级为轻微型DNA链断裂。Ⅲ级DNA链断裂表现为很小的彗星头, 大而圆的彗星尾, 像一把大扫帚, 又称为凋亡型DNA链断裂) 。运用SPSS软件对数据进行统计分析。
2 结果
2.1 高氟低碘对老年大鼠甲状腺细胞拖尾率的影响
每只大鼠的甲状腺制一张片子, 每张片子随机选择100个细胞, 计数拖尾细胞数并计算拖尾细胞百分率。结果表明:高氟组、低碘组和高氟低碘组的老年大鼠甲状腺细胞拖尾率极显著高于对照组 (P<0.01) ;高氟低碘组老年大鼠甲状腺细胞拖尾率比高氟组和低碘组稍有增加, 但高氟组、低碘组和高氟低碘组组间差异不显著 (P>0.05) (见表1) 。
注:与对照组相比, 数据肩标**表示差异极显著 (P<0.01) 。
2.2 高氟低碘对老年大鼠甲状腺细胞拖尾长度的影响
每只大鼠的甲状腺制一张片子, 随机选择25个细胞测量彗星尾长。结果表明:高氟组、低碘组和高氟低碘组的老年大鼠甲状腺细胞的拖尾长度与对照组相比差异显著或极显著 (P<0.05或P<0.01) , 并且高氟低碘组甲状腺细胞的拖尾长度比高氟组和低碘组明显增长 (P<0.05) (见表2、图1～4) 。
注:与对照组相比, 数据肩标*表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。
2.3 高氟低碘对老年大鼠甲状腺细胞DNA损伤程度分级
甲状腺细胞DNA损伤分级结果表明:高氟组老年大鼠甲状腺细胞DNA损伤主要是Ⅱ级、Ⅲ级 (Ⅱ级为39.13%、Ⅲ级为47.83%) ;而低碘组的甲状腺细胞DNA损伤的3个级别所占比率几乎平均, Ⅱ级损伤较高;高氟低碘组的细胞损伤以Ⅲ级损伤为主, 高达69.23% (见表3) 。
3 讨论
3.1 年龄对动物机体各系统的影响
试验中, 老年大鼠甲状腺细胞的DNA损伤较大。陈军等[1]报道, 青年SD大鼠的大脑细胞总损伤率仅为7.75%。贺凌飞等[2]检测青年SD大鼠的肝细胞DNA损伤时发现, 其总损伤率仅为9.40%。在甲状腺未检索到相关DNA损伤的资料, 但从中可看出老年大鼠比青年大鼠损伤严重的趋势。由此推断, 衰老可以造成各组织细胞DNA损伤。随着年龄的增长, 机体组织结构和功能退化, 体内自由基水平呈增长趋势, 同时自由基清除机制却呈退化趋势, 结果造成体内自由基大量聚集。自由基增多可使细胞中的多种物质发生氧化, 影响生物酶活性, 细胞凋亡率增加, 导致细胞DNA损伤。
3.2 高氟低碘对老年大鼠甲状腺细胞DNA损伤的影响
甲状腺是对氟最敏感的器官, 氟可引起甲状腺结构和功能的损害。甲状腺具有较强的摄取和蓄积氟的能力, 在非骨组织中, 甲状腺含氟量仅低于主动脉中蓄积的氟量[3]。进入机体中的氟可直接作用于甲状腺, 破坏甲状腺滤泡的组织结构, 造成甲状腺滤泡上皮细胞细胞质减少, 核固缩, 上皮顶端微绒毛减少, 甲状腺滤泡上皮细胞线粒体内外膜、嵴膜、基质不完全甚至完全消失, 出现普遍的空泡样变, 进一步干扰甲状腺激素的合成和分泌, 抑制催化甲状腺球蛋白分解出甲状腺素 (T4) 和三碘甲状腺原氨酸 (T3) 的蛋白水解酶的活性, 使血清T3、T4水平发生异常改变。此外, 高氟还干扰甲状腺-垂体-下丘脑这条反馈途径, 使甲状腺素合成和分泌的调节紊乱, 促甲状腺激素 (TSH) 代谢异常。如果在碘充足的情况下, 甲状腺通过增生、机化等途径还可有效地颉颃氟的侵害, 甲状腺滤泡增生, 增加甲状腺激素的合成与分泌, 通过甲状腺-垂体-下丘脑轴反馈系统调节机体各组织器官功能, 抵抗氟的损害。但在碘不足的情况下, 碘缺乏的本身就影响甲状腺功能和机体的发育, 造成全身各组织的损伤, 缺碘更增加了氟的毒性损害。
参考文献
[1]陈军, 陈学敏, 杨克敌, 等.氟对大鼠脑细胞DNA的损伤及诱导凋亡的作用[J].中华预防医学杂志, 2002, 36 (4) :222-224.
[2]贺凌飞, 陈建刚.氟中毒对大鼠口腔黏膜细胞和肝细胞DNA损伤的影响[J].中国地方病防治杂志, 2003, 18 (5) :272-274.
DNA损伤 篇10
1 材料与方法
1.1 试剂
10%小牛血清的RPMI-1640培养液, 淋巴细胞分离液由Sigma公司提供, 低熔点和正常熔点琼脂糖均由Gibco BRL公司提供, DAPI染料由Boehringer Mannheim公司提供, 冰冻玻片来自Curtis Matheson科技公司。其他试剂来自哈尔滨德美生物技术有限公司。
1.2 对象
选择50~59岁女性200人, 无癌症、心脏病、糖尿病等病史, 服用利尿剂也除外。所选对象随机分为两组, 一组为实验组 (服药) , 另一组为对照组 (未服药) , 每组各100人。实验组每人每天中午服用1丸 (每丸25mg) β胡萝卜素、维生素药片 (每片100mg) 。对照组服用外观相同的安慰剂。实验期为24周, 到试验结束为止, 同时采集实验组和对照组的全血2m L, 分离淋巴细胞, 然后进行DNA自发损伤和用H2O2处理后DNA损伤程度的分析, H2O2剂量分别为50、100、200μmol/L 3个剂量组。
1.3 血清维生素C和β胡萝卜素水平分析
取受试者全血10m L、2000g、4℃离心15min, 收集血清并分装于1.5 m L的离心管中立即浸入液氮中冷冻, 然后存放于-80℃冰箱内待测。血清中维生素C的测定[1]和β胡萝卜素的测定[2]均采用高效液相色谱法分析。
1.4 DNA损伤分析
单细胞凝胶电泳是一种敏感快速的DNA断裂损伤检测技术[3]。实验分析时, 每种处理观察600个细胞, 并计算细胞DNA损伤率。
2 结果
2.1 受试人群体内维生素和β胡萝卜水平的变化情况
机体营养水平分析结果显示经过24周连续补充较高剂量的维生素C和β胡萝卜素后, 实验组人群血清中维生素的水平比对照组提高了63.97%, β胡萝卜素水平比对照组提高了4.9倍 (P值均<0.05) , 见表1。
2.2 DNA损伤分析
两组人群DNA自发性损伤均较低, 实验组和对照组外周血淋巴细胞DNA损伤率分别为6.21%和6.70%, 差异无明显性 (P>0.05) 。当实验组和对照组人群外周血淋巴细胞同时给予同等剂量H2O2处理后, 可以看到H2O2剂量在50、100、200μmol/L时, 两组淋巴细胞DNA损伤均明显增加;而实验组人群DNA损伤率明显低于对照组, 经统计学检验, 两组人群DNA损伤差异存在明显性 (P<0.05) , 见表2。
3 讨论
研究证实, 维生素C和β胡萝卜素是人体所需的营养物质和重要的抗氧化剂。在体内作为第二道防御体系发挥重要的抗氧化功能。β胡萝卜素是一种极有效的脂质抗氧化剂[4], 它与NADH可以使氧自由基化学活性丧失并可减轻有机自由基的损伤作用。维生素C由于其还原性质, 可使双硫键还原为巯基, 在体内与其他抗氧化剂一起清除自由基。维生素虽不直接参于抗氧化作用, 但它对维持维生素E在体内的含量起着重要的作用, 它可以把维生素E自由基转变成维生素E, 从而提高维生素E的水平[5]。本研究通过补充维生素C和β胡萝卜素后使实验组人群与对照组人群相比血清中这两种营养素达到较高水平, 使组织和细胞中得到满足并发挥正常的生理和抗氧化功能, 从而有效地清除氧自由基, 降低H2O2所致的DNA损伤。由此提示膳食中摄入足量的或额外的补充适量的维生素C和β胡萝卜素将可能有效地清除体内氧自由基、各种过氧化物及致癌因子[6], 降低DNA的氧化损伤, 减少和预防癌症及慢性疾病的发生。
(n=600)
参考文献
[1]Ross MA.Determination of ascorbic acid and uric acid in plasma by high performance liquid chromatography[J].J Chromatog, 1994, 657 (1) :179-200.
[2]Hess D, Keller HE, Oberlin B, et al.Simutaneous determination of retinal, tocopherols, carotenes and lycopene in plasma by means of high performance liquid chromatography on reversed phase[J].Internat J Vitam Nutr Res, 1991, 61 (2) :232-238.
[3]马爱国, 韩秀霞, 刘四朝, 等.两种DNA断裂损伤检测方法敏感性的比较[J].遗传, 1997, 19 (1) :32-34.
[4]Knekt P, Aromma RA., Matela J, et al.Vitamin E and cancer prevention[J].Am J Clin Nutr, 1991, 53 (2) :283-286.
[5]Micozzi MS, Brown ED, Edwards BK, et al.Plasma carotenoid response to chronic intake of selected foods andβcarotene supplements[J].Am J Clin Nutr, 1992, 55 (9) :1120-1125.