甲基化状态（共7篇）
甲基化状态 篇1
宫颈癌目前发病率居女性恶性肿瘤第二位,仅次于乳腺癌,是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤。持续高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染被认为是发生宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈癌的主要生物学病因,因此HPV感染的检测成为筛查宫颈癌的主要措施之一[1,4]。然而,临床上HPV感染常常是一过性的,或者是亚临床的、短暂的,另外很多宫颈癌的病因学研究发现,除了HPV感染,还可能存在其他致病因素。研究发现,原癌基因和抑癌基因的表观遗传学异常改变可能是恶性肿瘤发生的关键机制之一。目前检测肿瘤相关基因启动子区异常甲基化情况已逐步成为早期筛查肿瘤的常用方法。近年来,国外有研究发现,配对盒家族基因1(paired boxed gene1,PAX1)的甲基化异常沉默与宫颈癌可能存在相关关系,但相关报道较少[2,3]。本研究通过甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)分析子宫颈癌组织中PAX1基因启动子区甲基化状态,结合定量PCR(RT-PCR)检测PAX1基因在正常宫颈组织、CIN及宫颈癌组织标本中的甲基化状态及水平,期望能为宫颈癌的早期诊断和筛查提供更有效的更敏感的特异的方法。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2007年1月-2013年7月在湖州妇幼保健院诊断的宫颈异常及宫颈癌的患者。所有患者行宫颈液基细胞学检查(TCT),阴道镜检查及宫颈活检。排除标准:既往有HPV相关的生殖器官病变妊娠、其他部位的恶性肿瘤史或免疫系统疾病史共纳入220例研究对象,其中健康对照者(慢性宫颈炎)20例、CINI、CINII、CINIII及宫颈癌各50例。所有标本均经病理组织学检查证实,宫颈癌临床分期:Ib期18例,Ⅱa期28例,IIIa期4例。组织学分级:低分化3例,中分化37例,高分化10例。研究对象年龄30~78岁,中位年龄48岁。肿瘤区域甲基化特征研究标本来源于行宫颈癌根治性手术的患者。
1.2 方法
1.2.1 DNA分离及预处理
从上述各种组织中提取基因组DNA,用亚硫酸氢钠将DNA序列中非甲基化胞嘧啶转变为尿嘧啶,以进行甲基化特异性PCR检测。方法如下:取约含2ug DNA的溶液50ul,沸水加热5分钟后立即置冰浴,加入30ul氢醌(10mmol/L)和520ul亚硫酸氢钠(3.0mol/L,pH=5.0)于50℃加热18小时。以Wizard DNA纯化系统(Zymo公司)回收处理的DNA,溶于50ul水后再加入终浓度为0.3mol/L的NaOH,室温放置5分钟。最后用乙醇沉淀回收DNA,溶于适量水于-20℃保存备用(主要试剂:RNAout试剂盒、M-MLV逆转录试剂盒、即用型PCR试剂盒均购白天泽基因生物有限公司。EZDNA Methylation Kit购自Zymo公司)。
1.2.2 PAX1基因甲基化特异性PCR(MSP)检测
以上述硫化处理的DNA为模板,引物合成见参考文献[7]。MS-PCR所需引物,甲基化引物MP1:5’-TATTTTGGGTTTGGGGTCGC-3’,MP2:5’-CCCGAAAACCGAAAACCG-3’;非甲基化引物UP1:5’-GTTTATTTTGGGTTTGGGGTTGTG-3’,UP2:5’-CACCCAAAAACCA AA AACCAC-3’。PCR反应条件为:95℃预变性10min;94℃3 0s,61℃30s,72℃30s,共35个循环;72℃延伸8min。反应产物用2%的琼脂糖凝胶电泳,紫外透射分析仪观察结果。
1.2.3 PAX1mRNA的表达检测
采用RT-PCR方法:①组织总RNA的提取:按照RNAout试剂盒说明提取各组样本总RNA,溶于20ul DEPC水中,用核酸蛋白检测仪进行定量;②RT-PCR扩增及结果分析:等量取各组样本总RNA1ug,用M-MLV逆转录试剂盒合成cDNA第一链。PAX1 mRNA引物:F5’-CGTGCGTCTTCTGAC-CAGAT-3’;R5’-GCTGTTCCAGTACTCGGCAT-3’,产物大小:339bp。内对照选用β-actin,引物:F5’GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’。R5’GGCGTCAGGTCTTTGCGGATG-3’,产物大小:216bp;按照即用型PC试剂盒说明进行P C R反应,依次加入PCR Mix 15ul,Taq DNA聚合酶0.2ul,上游引物和下游引物各0.5ul,加水补足至25ul。扩增退火温度分别为61℃、63℃、58℃。
1.3 数据分析处理
采用SAS统计软件进行数据处理,采用方差分析,各组间差异分析采用SNK-q检验;计数资料采用确切概率法,趋势检验采用χ2,检验水准a=0.05。
2 结果
PAX1相对定量PCR(RT-PCR)检测结果。非甲基化PAX1的目的条带在宫颈癌组织和对照组之均有出现,但其mRNA表达量在对照组织中明显高于宫颈癌组织(22.33VS12.56),且差异有显著性(P<0.05)。甲基化PAX1只在宫颈癌及CIN组织中表达,在20例对照组织中无表达(表1)。
50例宫颈癌组织中,47例表达甲基化PAX1,150例CIN组织中有88例表达PAX1甲基化。随着临床分期的增加,其宫颈癌组织中的PAX1甲基化率升高。I期88.89%,II期96.43%,III期100%,但三期差异无显著性(P>0.05)。不同组织学分化程度的宫颈癌组织PAX1甲基化表达率有显著性差异(P<0.05),高分化组织甲基化率为50%,中分化组织甲基化率为75.68%,低分化组织甲基化率为100%。趋势检验说明,组织分化程度与PAX1甲基化率呈负向关系(P<0.05)。见表2、表3。
不同甲基化程度的PAX1mRNA在宫颈癌及宫颈CIN组织中的表达检测显示,宫颈癌组织中PAX1mRNA甲基化程度高于CIN组;在不同临床分期的宫颈癌组织中,随着临床分期增加,其甲基化PAX1mRNA的表达水平逐渐升高,而随着宫颈癌组织分化程度降低,甲基化的PAX1mRNA的表达量也降低,各组数据均有显著性统计学差异(P<0.05)。见表4、表5、表6。
3 讨论
DNA甲基化是表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容,在调控基因表达及染色体结构方面发挥着重要作用。研究表明,基因组DNA抑癌基因的异常甲基化与肿瘤的发生、发展和预后密切相关。近年来,国内外对宫颈癌DNA甲基化的研究越来越多,研究发现多种基因在宫颈癌的发生发展中发生了甲基化修饰,且这种表观遗传学改变与宫颈病变程度有一定相关性。研究者采用多种方法分析了宫颈脱落细胞、宫颈活检组织和血浆标本等,还提出DNA甲基化可能用于宫颈癌筛查[1,2,3,4]。Lai等首次报道PAX1基因在宫颈癌中出现异常甲基化,PAX1基因在宫颈癌组织中甲基化异常频率可高达94.5%,揭示了PAX1基因在宫颈癌的早期发现中具有重要作用[3,4]。2010年Lai等研究再次指出定量PCR检测PAX1的甲基化用于宫颈癌筛查有巨大的潜力。ROC曲线分析证明,PAX1检测CINIII及以上病变的敏感性、特异性和准确性分别为0.78%、0.91%和0.89%[3]。PAX基因家族分为4类:1类和3类在维护组织特异度干细胞中发挥至关重要的作用,并已发现在多种恶性肿瘤的发展中过表达;1类和4类包括PAX1、PAX4、PAX6和PAX9,在恶性肿瘤中常表达受抑。文献报道,PAX6和PAX9常与肿瘤的良好预后相关。同时发现PAX6对胶质瘤细胞具有抑制功能,而PAX4则对人类黑色素瘤具有抑制作用[5,6,9,10]。本研究显示,PAX1在宫颈癌中出现甲基化沉默,提示在宫颈癌的发生中PAX1可能具有潜在的抑癌作用。
本研究对宫颈癌组织中PAX1基因甲基化状态进行检测,进一步研究抑癌基因甲基化在宫颈癌病因学的发生和发展中的相关关系,进而为宫颈癌的早期诊断探索了新的可能方法。本研究显示,甲基化PAX1只在宫颈癌和CIN组织中有表达,50例宫颈癌组织中,甲基化率达94%。而在宫颈癌和对照组织中非甲基化PAX1均有表达,明显不同于宫颈癌组织中的甲基化发生情况。这提示PAX1基因的甲基化在宫颈癌的发生过程中发挥着一定作用。其机制可能是,在PAX1发生甲基化后,PAX1不能发挥其正常的作用,导致癌基因的激活和抑癌基因失活,进一步发展引发肿瘤[7,8]。本研究发现,宫颈癌不同病变类型的PAX1甲基化率差异无显著性,而宫颈癌临床分期和组织分化程度不同,PAX1启动子甲基化程度不同。表现为随着临床分期的增加,PAX1甲基化率也随之升高;肿瘤恶性程度越高,分化程度越低,PAX1甲基化状态也越普遍。对50例甲基化宫颈癌组织中PAX1m RNA的表达进行检测,结果也证实在临床分期中,随着分期增加其mRNA的表达出现升高,而组织学分化分类表现为负向变化趋势,组织分化程度越低,PAX1 mRNA的表达量越高,说明宫颈癌组织中PAX1启动子甲基化发生率越高,PAX1含量越低,肿瘤恶性程度越高。这也说明PAX1基因甲基化的频率随着宫颈病变程度的增加而增加,甲基化基因的数目也随着宫颈临床分期程度的加重而增多。当然,还应注意PAX1是否存在甲基化周期性的问题,以免误判[10,11,12,13,14,15]。综上,PAX1甲基化与子宫颈癌之间存在着密切联系。同时,研究也提示,PAX1基因启动区高甲基化是子宫颈癌发生发展的早期事件,可作为新的肿瘤标记物,可能为宫颈癌的早期诊断提供另一特异敏感的生物标记。
摘要：目的:探讨定量测定配对盒家族基因1(PAX1)甲基化状态与宫颈组织病变的相关关系。方法:收集正常宫颈组织20例、宫颈上皮内瘤变CINI组织50例、CINII组织50例、CINIII组织50例和宫颈癌组织50例。采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR,MSP)分析宫颈病变组织中PAX1基因启动子区甲基化状态,结合定量PCR(real time-PCR)检测PAX1mRNA表达情况行综合分析。结果:宫颈癌组织中PAX1基因启动子甲基化率达94%(47/50),CINI组织中PAX1基因启动子甲基化率达40%(20/50),CINII 52%(26/50),CINIII 84%(42/50),而正常对照组织均无甲基化状态(P<0.05)。不同临床分期的宫颈癌组织PAX1甲基化率也不尽相同(P>0.05),病理组织学分化程度不同,PAX1甲基化率不同,呈负向相关性(P<0.05)。50例甲基化的宫颈癌组织中有PAX1mR N A表达,随着临床分期升级,PAX1mR N A表达增加,有统计学意义(P<0.05);而不同组织分化程度的PAX1mR N A表达量差异有统计学意义(P<0.05)。结论:DNA修复因子PAX1甲基化状态可能与子宫颈癌的病因学发生存在相关关系,在临床筛查和宫颈癌的早期诊断中可能具有潜在的应用价值。
关键词：配对盒家族基因1,DNA甲基化,宫颈癌
甲基化状态 篇2
MGMT为DNA损伤修复基因, 定位于人类染色体10q26, 全长170 kb, 由5个外显子, 4个内含子组成。 启动子富含GC碱基, 顺式作用元件有CpG岛中的6个Spl位点、2个糖皮质激素反应元件 (GRE) , AP-I元件等。 cDNA长约769 bp, 编码207个氨基酸组成的蛋白质。 MGMT序列具有相对稳定性, 从结肠杆菌到哺乳动物均含有结构一致的“-异亮氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-组氨酸-精氨酸-缬氨酸-” (IPCHRV) 活性基序列, 活性位点在145位半胱氨酸残基上[4]。 本研究通过MethyLight方法, 一方面分析锯齿状病变中MGMT基因启动子区CpG岛甲基化状态和免疫组化中MGMT蛋白的表达情况, 在基因层面和蛋白层面对MGMT进行初步探究, 另一方面分析锯齿状病变中MGMT基因启动子区CpG岛甲基化状态和年龄相关因素情况, 在甲基化和年龄上对MGMT进行初步探究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1标本收集北京军区总医院2007~2013年病理诊断为各类结直肠息肉和腺瘤切片4810例, 从中筛选出腺体具有锯齿状特征的息肉及腺瘤, 进行组织学诊断及分类。 由3名病理医师按WHO (2010) 消化系统肿瘤分类及文献标准[5,6,7,8,9]4~5轮回顾性阅片。 从中筛选出225例锯齿状病变 (96例HP、61例SSA/P和68例TSA) 作为实验组, 并以54例管状腺瘤 (tubular adenoma, TA) 、42例正常结直肠黏膜组织和69例CRC作为对照。
1.1.2主要试剂和仪器DNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司, 甲基化修饰试剂盒为美国ZYMO公司产品, 核酸蛋白质浓度测量仪B-500购自上海创萌生物科技有限公司, 甲基化阳性/阴性对照为美国ZYMO公司产品, qPCR反应试剂ROX购自TaKaRa公司, Mix购自上海辉睿生物科技有限公司, MGMT抗体购自中杉金桥公司 (1∶500稀释) , 内参基因 β-肌动蛋白 (β-actin) 引物和探针参照文献[10]设计, 甲基化引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成。 Mx3000P定量PCR扩增仪为美国Stratagene公司产品。
1.2方法
1.2.1甲基化引物和探针设计MGMT基因序列参照GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) , GenBank Ac- cession:NC_000010。 甲基化引物和探针由BeaconDesigner7.9软件设计, 设计标准:引物扩增片段大小在80~150 bp范围, 引物长度17~25 bp, GC含量在40%~70%, 两条引物的Tm值尽量接近。避免引物内部或之间形成3 bp以上的互补序列。探针长度20~30 bp, 探针的Tm值比引物高5~10℃, 探针内标或探针与引物之间避免形成3 bp以上的互补序列, 对其进行BLAST检查, 引物和探针符合要求, 并由上海辉睿生物科技有限公司合成。 见表1。
1.2.2 DNA提取采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒提取组织DNA, 将含有DNA组织的蜡块连切5张10 μm的厚蜡膜, 严格按照试剂盒说明步骤进行操作。 并测定其纯度和浓度备用。
1.2.3甲基化修饰采用EZ DNA Methylation-GoldTM Kit (D5005) 试剂盒, 严格按照试剂盒说明步骤进行操作。 经此步后, DNA序列中未甲基化的胞嘧啶 (C) 转变为尿嘧啶 (U) 。
1.2.4 MethyLight PCR反应体系 (20 μL) :2×Taq PCR Master Mix 10 μL;修饰后的DNA模板2 μL;上、 下游引物各1 μL (10 pmol) ;探针FAM 0.4 μL (10 pmol) ; ROX 0.3 μL。 反应条件:94℃预变性5 min;94℃ 30 s, 56℃ 45 s, 72℃ 45 s, 共50个循环;72℃延伸5 min, 4℃冷却5 min。 每例标本设两个复孔, 经亚硫酸氢盐修饰的Human Methylated & Non-methylated DNA Set作为阳性、阴性对照, 水为空白对照。
1.2.5测序法验证扩增序列PCR扩增产物送北京金唯智生物科技有限公司测序, 由于扩增序列 (94 bp) 过小, 连接到质粒作为载体后, 用通用引物的方法测序, 结果如图1所示, 测序目的片段和Beacon De- signer 7.9软件设计序列吻合。
1.2.6免疫组织化学染色所有标本常规石蜡包埋, 4μm厚连续切片, 60℃温箱烘烤90 min。采用EnVision二步法, 实验过程严格按照试剂盒说明书进行, 高温高压抗原修复, DAB显色, 磷酸盐缓冲液 (PBS) 代替一抗为阴性对照, 已知阳性的结肠腺体组织为阳性对照。
1.2.7结果判断标准MethyLight结果判断标准[11]:同时扩增目的基因 (MGMT) 和内参基因 (β-actin) , 根据标准曲线得到两者的原始拷贝数, 计算标准甲基化指数 (normalized index of methylation, NIM) 其定义为:NIM=[ (MGMT sample/MGMT positive) β-actin sample/β-actin positive) ]×100, 其中MGMT sample指样本中甲基化MGMT基因的拷贝数, MGMT positive指阳性对照中甲基化MGMT基因的拷贝数, β-actin sample和β-actin positve与上述相同。NIM≥4为甲基化, NIM<4为非甲基化。免疫组化判断标准[12]:MGMT阳性定位于细胞核;标记指数计算方法:每张切片低倍镜下选择组织结构良好、比较清晰的5个阳性细胞最为密集的区域, 每个区域在高倍镜下, 计数100个细胞中的阳性细胞指数 (不包括间质细胞和其他非肿瘤细胞) , 计算阳性细胞数平均值的百分率。标记指数计分:Ⅰ级10%~25%为1分, Ⅱ级>25%~50%为2分, Ⅲ级>50%~75%为3分, Ⅳ级>75%~100%为4分。染色强度计分:Ⅰ级淡黄色为1分, Ⅱ级棕黄色为2分, Ⅲ级棕褐色为3分。每张切片两种评分之乘积为该切片最后的表达强度:0分为 (-) , 1~3分为 (+) , 4~6分为 (++) , ≥7分为 (+++) 。
1.3统计学方法
所有数据采用SPSS 19.0统计软件, 正态分布计量资料以均数±标准差 (±s) 表示。甲基化结果运用χ2及Fisher确切概率法, 免疫组化结果使用多组有序秩和检验, 两组间比较运用Bonferroni检验, 甲基化和蛋白表达相关性及甲基化和年龄相关性运用Pearson相关法进行统计学处理, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1临床资料特征
225例锯齿状病变中HP 96例、SSA/P 61例、TSA 68例, 分别占锯齿状病变的42.67% 、27.11% 和30.22%, 96例HP中, 男63例, 女33例, 男性多见, 年龄31~88岁, 平均 (56.052±12.448) 岁;61例SSA/P中, 男43例, 女18例, 男性多见, 年龄23~84岁, 平均 (56.665± 14.976) 岁;68例TSA中, 男46例, 女22例, 男性多见, 年龄30~85岁, 平均 (59.470±12.506) 岁。
2.2 MGMT基因标准曲线分析
将阳性对照按10的倍数稀释成1~1×10-67个浓度梯度制作标准曲线 (其拷贝数为103~109/mL) , 各浓度梯度反应均做复孔。 MethyLight的线性范围为104~ 108拷贝/mL, R2为0.942。
2.3 MGMT基因启动子CpG岛甲基化状态
MGMT基因启动子CpG岛甲基化阳性表达率在正常组、TA组、HP组、SSA/P组、TSA组和CRC组分别为0.00% (0/42) 、46.30% (25/54) 、26.04% (25/96) 、 60.66% (37/61) 、76.47% (52/68) 和68.12% (47/69) , 各组差异有高度统计学意义 (χ2= 112.790, P = 0.000) 。 正常组与SSA/P、TSA、TA、CRC组之间差异有统计学意义 (P < 0.05) , HP组与SSA/P、TSA、CRC组之间差异有统计学意义 (P < 0.05) , 其余各组差异无统计学意义 (P > 0.05) 。 见表2、图2 (见封三) 。
注:与正常组比较, ▲P < 0.05;与HP组比较, △P < 0.05;HP:增生性息肉;TA:管状腺瘤;SSA/P:广基 (无蒂) 锯齿状腺瘤/息肉;TSA:传统型锯齿状腺瘤;CRC:结直肠癌
2.4 MGMT蛋白阳性表达率
MGMT蛋白阳性表达率在正常组、TA组、HP组、 SSA/P组、TSA组和CRC组分别为100.00% (24/24) 、 80.00% (16/20) 、98.08% (51/52) 、78.05% (32/41) 、69.57% (16/23) 和70.83% (17/24) , 差异有高度统计学意义 (χ2= 26.641, P = 0.000) 。 正常组与HP、SSA/P、TSA、 TA、CRC组之间差异有统计学意义 (P < 0.05) , HP组与SSA/P组、TSA组、TA组和CRC组之间差异有统计学意义 (P < 0.05) , 其余各组差异无统计学意义 (P > 0.05) 。 见表3、图3。
2.5 MGMT基因甲基化与MGMT蛋白相关性分析
经统计学分析显示, TA、SSA/P、TSA、CRC三组中MGMT甲基化与MGMT蛋白表达结果差异有统计学意义 (P < 0.05) , 且相关性为负相关, 相关系数分别为r = -0.500、-0.361、-0.437、-0.412;HP中MGMT甲基化与MGMT蛋白表达结果差异无统计学意义 (P>0.05) , 但相关性为负相关, 相关系数为r = -0.220。 见表4。
2.6 MGMT基因甲基化与年龄相关性分析
经统计学分析显示, TA、HP、SSA/P、TSA四组中MGMT基因甲基化与年龄差异均无统计学意义 (P > 0.05) 。 MGMT基因甲基化与年龄相关性为正相关, 与TA、 HP、SSA/P、TSA相关系数分别为0.042、0.009、0.087、 0.138。 见表5。
注:与正常组比较, ▲P < 0.05;与HP组比较, △P < 0.05;HP:增生性息肉;TA:管状腺瘤;SSA/P:广基 (无蒂) 锯齿状腺瘤/息肉;TSA:传统型锯齿状腺瘤;CRC:结直肠癌
3讨论
CRC是最常见的恶性消化道肿瘤之一, 全球CRC每年新发病例数达123万, 死亡约为发病率的1/2。近年研究表明, CRC发病率目前仍呈持续增长态势, 其原因之一就是对结直肠锯齿状病变认识不足[2, 13]。2010年WHO消化系统肿瘤病理学和遗传学分类中对锯齿状病变的分类比以往更为详细[9], HP在锯齿状病变中最常见, 占所有病变的75%以上, 根据组织学上的微小差别分为微泡性增生性息肉 (microvesicular hyperplastic polyp, MVHP) 、富于杯状细胞的增生性息肉 (goblet-cell rich hyperplastic polyp, GCHP) 、寡黏液型增生性息肉 (mucin-poor type, MPHP) [14]。SSA/P占锯齿状病变的15%~25%, 根据细胞异型性分为伴/不伴有细胞异性增生型[14-16]。TSA不常见占锯齿状病变的1%左右, 特征为具有整体复杂结构域纤维状生长方式, 常显示细胞异型特点, 与TA及伴细胞异型的SSA不同[14, 17]。TSA一般与高MSI癌无关, 可能与低MSI有关[6]。近年来从分子遗传学角度对锯齿状病变进行研究发现, 结直肠锯齿状病变通路是一个多因素、多阶段、多基因连续累积发生的过程, 在此演变过程中有众多CRC相关基因参与。锯齿状通路分为:①无蒂 (广基) 锯齿通路:以SSA/P和MVHP为代表, 癌变机制为BRAF突变, 引起错配修复基因h-MLH-1甲基化和高水平CpG岛甲基化现象, 导致腺体不同程度异型性增生直至癌变。②传统锯齿状通路:包括TSA和GCHP, 癌变机制为K-RAS基因突变, 引起DNA修复基因MGMT甲基化和低高水平CpG岛甲基化现象等。MGMT基因甲基化后, 引起一些基因沉默, 导致腺体异型性增加, 进一步发展为癌。锯齿状通路中有众多异常基因甲基化, 若能深入研究并加以利用, 不仅可以用于CRC的早期诊断、高危人群的监测、癌变风险评估等, 还可为CRC靶向治疗药物提供理论依据支持[1, 18]。
在本实验基因层面研究中发现正常黏膜组织、 TA、HP、SSA/P和TSA中均有MGMT基因启动子CpG岛甲基化, 实验组锯齿状病变HP、SSA/P和TSA甲基化率为26.04% (25/96) 、60.66% (37/61) 和76.47% (52/ 68) , 对照组正常黏膜组织、TA和CRC的甲基化率为0.00% (0/42) 、46.30% (25/54) 和68.12% (47/69) 。 Dhir等[18]在18例TA中检测到甲基化率为47.1%, 29例不伴异型性的SSA/P中检测到甲基化率为29.63%, 19例伴有异型性的SSA/P中检测到甲基化率为52.63%, 在9例HP中检测到甲基化率为14.29%, 本研究中对照组的TA和实验组的SSA/P的甲基化率与以上研究结果基本符合, 但实验组HP的甲基化率明显高于Dhir等[18]研究, 这可能与样本量、样本来源、引物在CpG岛的位置不同等因素引起系统误差有关。 本研究对照组与实验组组间比较过程中, 对照组正常黏膜组织与实验组SSA/P (P = 0.000) 和TSA (P = 0.000) 有显著性差异, 与实验组HP (P = 0.230) 差异性不显著; 对照组CRC与实验组HP (P = 0.000) , 与实验组SSA/P (P = 0.375) 和TSA (P = 0.275) 差异性不显著;对照组TA与实验组HP (P = 0.012) 和TSA (P = 0.001) 有显著性差异, 与实验组SSA/P (P = 0.123) 差异性不显著;实验组组组间比较过程中, HP和SSA/P (P = 0.000) , HP和TSA (P = 0.000) 组间有显著性差异, SSA/P和TSA (P = 0.053) 组间差异性不显著。 在本实验蛋白层面运用免疫组化方法研究中发现实验组HP、SSA/P和TSA蛋白表达阳性率为98.08% (51/52) 、78.05% (32/41) 和69.57% (16/23) , 对照组正常黏膜组织、TA和CRC中蛋白表达阳性率为100% (24/24) 、80.00% (16/20) 和70.83% (17/24) 。 与Sawyer等[19]对39例SA运用免疫组化方法发现MGMT阳性表达率为18% (7/39) 相比, 在本实验中, SSA/P蛋白阳性表达率[78.05% (32/41) ] 和TSA蛋白阳性表达率[69.57% (16/23) ] 明显高于Sawyer等[9]研究, 具体原因可能与甲基化引物设计、样本来源、样本量大小等因素有关。本研究对照组与实验组组间比较过程中, 对照组正常黏膜组织与实验组HP (P = 0.001) 、SSA/P (P = 0.000) 和TSA (P = 0.000) 有显著性差异;对照组CRC与实验组HP (P = 0.001) 有显著性差异, 但SSA/P (P = 0.515) 和TSA (P = 1.000) 差异性不显著;对照组TA与实验组HP (P = 0.029) 有显著性差异, 但与实验组SSA/P (P = 1.000) 和TSA (P = 0.434) 差异性均不显著;实验组与实验组组间比较过程中, HP和TSA (P = 0.001) , HP和SSA/P (P = 0.006) 中组间有显著性差异, 但在SSA/P和TSA (P = 0.452) 中组间差异性均不显著。 在本实验MGMT基因甲基化与蛋白表达相关性研究中, 发现在实验组HP、SSA/P和TSA中分别呈弱相关 (P = 0.117, r = - 0.220) 、弱相关 (P = 0.020, r = -0.361) 及中等程度相关 (P = 0.037, r = -0.437) , 对照组正常黏膜组织、TA和CRC中, 正常黏膜组织运用Pearson法无法计算相关性, TA中呈中等程度相关 (P = 0.025, r = -0.500) , CRC中呈中等程度相关 (P = 0.046, r = -0.412) 。 通过数据可以看出, 在实验组中HP、SSA/P和TSA基因甲基化和蛋白表达有显著性差异, 相关性分别为弱相关、弱相关和中等程度相关;在对照组中TA和CRC基因甲基化和蛋白表达有显著性差异, 相关性都为中等程度相关。通过基因层面和蛋白层面及两者相关性的探究, 推测在锯齿状病变通路中MGMT基因启动子甲基化有诱导MGMT蛋白表达下调, 在锯齿状通路的发生发展中起重要作用。在年龄相关性甲基化研究方面, 在基因目的序列 (-107~-200) 这部分的位点上实验组HP (P = 0.931, r = 0.009) 、SSA/P (P = 0.763, r = 0.042) 和TSA (P = 0.263, r = 0.138) 及对照组TA (P = 0.763, r = 0.042) 中差异性均不显著 (P > 0.05) , 且相关性为弱正相关。
注:HP:增生性息肉;SSA/P:广基 (无蒂) 锯齿状腺瘤/息肉;TSA:传统型锯齿状腺瘤
注:HP:增生性息肉;SSA/P:广基 (无蒂) 锯齿状腺瘤/息肉;TSA:传统型锯齿状腺瘤;TA:管状腺瘤
不同甘蔗品种DNA甲基化分析 篇3
DNA甲基化是一种表观遗传 (epigenetic) 现象。在发育过程中, 虽然基因表达调控发生改变, 但DNA的一级结构没有变化, 它可以遗传, 也可能发生逆转 (脱甲基化) [2]。在高等植物中, 胞嘧啶甲基化在基因表达调控中扮演了很重要的角色[3,4,5]。检测DNA甲基化的方法有多种, MSAP (Methylation Sensitive Amplification Polymorphism, 甲基化敏感扩增多态性) 技术, 是在AFLP技术基础上建立起来的, 之后被用于水稻基因组胞嘧啶甲基化的检测上[6], 现已广泛应用于棉花、苹果、拟南芥、香蕉、土豆、草莓等植物上, 评估胞嘧啶甲基化的程度和模式[7,8,9,10,11,12]。鉴于此, 研究从表观遗传学的角度出发, 采用MSAP技术检测不同甘蔗品种不同时期的甲基化多态性, 分析甘蔗生长过程中DNA甲基化水平、模式与变化, 为进一步开展相关研究奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
供试8个甘蔗品种信息列于表1。试验材料种植于广西农业院甘蔗研究所本部试验农场。
1.2总DNA提取与MSAP分析
选取生长正常的伸长期和成熟期单株, 取其1叶用于DNA提取。DNA提取及MSAP分析参照Xiong方法实施[13]。
1.3数据处理
标记MSAP扩增片段大小, 以0和1建立数据库。在相同迁移率位置上, 有带的记为1, 无带的记为0。参照DNA分子标记数据分析方法, 将MSAP标记作为等位基因进行多态性研究, 每1条扩增条带视为1个性状。
图1中1~8分别为柳城05-136、桂糖03-1438、桂糖05-3626、桂糖07-645、桂糖06-1001、桂引C1-2003、桂糖06-244、桂糖06-1721。
图2中1~5分别为柳城05-136、桂糖05-3626、桂糖07-645、桂引C1-2003、桂糖06-244。
2结果与分析
2.1 DNA质量检测
取1μL基因组DNA用Nano Drop ND-1000紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度, OD260/OD280比值在1.8~2.0范围内, 纯度较高, 取出2μL纯化的基因组DNA用0.8%琼脂糖凝胶检测结果如图1、图2所示, DNA主带清晰, 降解较少, 适合进行下一步分析。
2.2甘蔗品种甲基化分析
2.2.1甲基化模式
根据Hpa II和Msp I对CCGG序列甲基化是否敏感, 可将酶切结果分4种不同类型, 见表2、图3。
2.2.2伸长期甲基化分析
使用不同引物甲基化的差异见表3。
3对引物扩增结果表明, 不同引物间甲基化略有差异, 引物E7+H/M5甲基化多态性条带最多, 达14条, 甲基化率为30.43%;引物E5+H/M5甲基化多态性条带仅为8条, 甲基化率为27.59%, 在3对引物中甲基化率最低。
在甘蔗伸长期, 用3对MASP引物分析8个甘蔗品种甲基化程度, 共检测到590个位点, 见表4。总甲基化的位点数 (包括全甲基化和仅一条链甲基化的半甲基化) 分别为19、13、15、19、19、17、10和27, 甲基化率分别为18.63%、15.48%、15.96%、19.59%、21.11%、19.32%、12.35%和29.03%。其中, 全甲基化 (双链甲基化) 的条带数分别为10、8、10、14、11、8、7和18, 全甲基化比率分别为9.80%、9.52%、10.63%、14.43%、12.22%、9.09%、8.64%和19.35%。半甲基化的带数分别为9、5、5、5、8、9、3和9, 半甲基化率为8.82%、5.95%、5.31%、5.15%、8.89%、10.23%、3.70%和9.68%。从A、B、C 3种不同类型条带的总数来看, 全甲基化高于半甲基化。由此可见, 伸长期的甘蔗基因组CCGG位点发生甲基化的方式主要是以内部胞嘧啶 (Cm5CGG) 双链甲基化为主。
2.2.3成熟期甲基化分析
5个甘蔗品种成熟期甲基化水平分析表明 (表5) , 2对引物组合 (E3+H/M5, E5+H/M5) 共检测到394条带, 总甲基化条带数分别为13、6、13、8和10, 甲基化率分别为13%、6.98%、14.94%、10.39%和10.64%。其中, 全甲基化条带数分别为11、6、12、7和7, 全甲基率为11%、6.98%、13.79%、9.09%和7.45%;半甲基化的带数分别为2、0、1、1和3, 半甲基化率分别为2%、0、1.15%、1.30%和3.19%。从A、B、C 3种不同类型条带的总数来看, 全甲基化高于高半甲基化高。由此可见, 成熟期的甘蔗基因组CCGG位点发生甲基化的方式主要是以内部胞嘧啶 (Cm5CGG) 双链甲基化为主。
3小结与讨论
甘蔗甲基化分析表明, 伸长期甲基化率为15.47%~29.03%;成熟期甲基化率为6.98%~14.94%;全甲基化率高于半甲基化。
DNA甲基化是植物基因调控机制中不可缺少的一部分, 特别是对开花时间、胚乳发育等特殊组织的发育过程或发育状态进行调控。甘蔗甲基化分析表明, 在伸长期甘蔗的平均甲基化水平高于水稻[13]、香蕉[10]、栗树[14], 低于拟南芥[9]和休眠期间牡丹花芽[15]。成熟期的甲基化水平明显较低。在甘蔗生长发育过程中, 伸长期主要积累蔗茎产量, 而成熟期则主要积累糖分。成熟期甲基化水平明显低于伸长期, 可能与需要启动大量参与糖分合成、转运、积累的相关基因参与代谢有关。
浅谈DNA甲基化的分析技术 篇4
1 DNA甲基化非特异性分析
DNA甲基化非特异性分析可以测定全基因组的胞嘧啶甲基化水平, 是早期的DNA甲基化分析技术, 用于研究基因组中甲基化水平的总体改变。
1.1 高效液相色谱法 (HPLC)
DNA用盐酸或氢氟酸水解成碱基后, 通过色谱柱分离出各种碱基, 进而与标准品进行比较, 由波长260nm的紫外光测定其吸收峰并定量。
1.2 SssI甲基转移酶法
SssI甲基转移酶能催化DNA CpG位点从头甲基化。以3H-S-腺苷甲硫氨酸 (3H-SAM) 为甲基供体, 在SssI甲基转移酶的催化下, 其所含的甲基转移至基因组DNA的CpG位点的非甲基化的胞嘧啶上, 通过测量未参加反应的3H-SAM的量来检测基因组DNA甲基化水平, 这种方法又称甲基化酶温育法。
1.3 氯乙醛反应法
氯乙醛反应是一种应用荧光分析技术检测DNA甲基化水平的方法。基本原理是:首先用硫酸处理基因组DNA, 纯化后通过银或柱色谱去除DNA链上的嘌呤, 再用亚硫酸处理, 未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶不受影响, 最后将处理后的DNA样品与氯乙醛温育, 甲基化的胞嘧啶转变成具有很强荧光性的乙烯胞嘧啶。荧光的强度与DNA甲基化水平成正比。
2 DNA甲基化特异性分析
这是一类可分析特定基因或序列位点甲基化状态的分析技术, 也是近年来发展比较迅速的技术之一。根据其作用原理, 可将其分为依赖和不依赖于亚硫酸氢钠修饰的检测技术。
2.1 不依赖于亚硫酸氢钠修饰的检测技术
2.1.1 肼反应/高锰酸盐反应
肼处理后, DNA会在C和T残基发生肼解, 而5mC则不受影响。部分的肼解片段可以采用Maxam-Gilbert法测序定位C和T, 5mC因不出现在序列梯中而被识别。另一相关的过程是高锰酸盐氧化法, 5mC和T对高锰酸盐氧化敏感, 吡啶将在这些位点切割DNA, 从而给出5mC位置的阳性显示。
2.1.2 限制性内切酶法/SouthernBlot
限制性内切酶技术原理是基于甲基化敏感限制性核酸内切酶和甲基化不敏感限制性核酸内切酶在各自的识别位点, 对5mC有不同的敏感性, 在Southern Blot分析中可得到大小不同的信号, 使用分析大量DNA样品。目前至少已发现320种甲基化敏感限制性核酸内切酶。
2.2 依赖于亚硫酸氢钠修饰的检测技术
2.2.1 亚硫酸氢钠─基因组测序法
亚硫酸氢钠-基因组测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区, 对亚硫酸氢钠修饰后的模板进行亚硫酸氢钠PCR扩增, 能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列, 同时对ssPCR产物克隆测序和ssPCR产物直接测序, 比较分析CpG岛甲基化状态的准确信息。
2.2.2 亚硫酸氢钠─限制性酶切法
COBRA法引物设计与测序法相同, 可对任何DNA标本中特定位点的甲基化进行快速定量。首先用亚硫酸氢钠修饰待检测DNA, 未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。然后进行PCR扩增, 纯化PCR产物, 限制酶酶切, 聚丙烯胺凝胶电泳分离, 最后杂交检测。
2.2.3 甲基化特异性PCR法 (MSP)
目前已经成为使用最为广泛的甲基化检测方法。原理是根据两组关键性CpG位点, 分别设计甲基化引物对和非甲基化引物对, 甲基化引物对来自经处理后的甲基化DNA链, 若用该对引物能扩增出片段, 说明该检测位点发生了甲基化。
2.2.4 甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法
原理是:DNA经亚硫酸氢钠处理后, 用链特异性引物 (Strand-specific primer) 进行PCR扩增, 扩增反应会在待检测甲基化位点的前一个核苷酸处终止, 然后用凝胶电泳纯化PCR产物, 纯化后DNA片段与放射性dNTP孵育, 如有dCTP在延伸反应中掺入, 则证明此待测位点已发生甲基化了, 如果有dTTP在延伸反应中掺入, 则证明此待测位点未发生甲基化。
2.2.5 高效液相色谱法 (DHPLC)
1992年澳大利亚Oefner等首先将DHPLC应用于寡核苷酸和DNA分析。其原理是野生型和突变型双链DNA杂交时会形成2种不完全互补的杂合双链, 这种杂合双链的变性温度低于完全互补的纯合双链。
2.2.6 甲基化荧光检测 (Methy-light)
1999年Lo等建立了在对荧光PCR进程进行连续光学监控的实时定量PCR (Real-time quantitative PCR) 基础之上的检测DNA甲基化的方法, 进而实现了甲基化的实时定量分析。
甲基化状态 篇5
甲苯甲醇烷基化制对二甲苯的反应产物主要有甲苯、甲醇、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、苯、对苯乙烯及对二乙苯等。它们的物化性质十分相近,特别是同分异构体的对、间、邻二甲苯(对二甲苯沸点为138.4℃,间二甲苯沸点为139.1℃,邻二甲苯沸点为144.4℃),对二甲苯与间二甲苯的沸点相差仅0.7℃,采用一般的填充柱气相色谱法较难分离,且重现性差、分析时间长。为此,选用分离二甲苯异构体效果较好的有机膨润土与邻苯二甲酸二壬酯为复合固定液,通过调整配比,采用火焰离子化检测器(FID)进行了甲醇、甲苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯的定性、定量分析。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
GC-122型气相色谱仪,N-2000双通道色谱工作站(浙大智达信息中心),氢火焰检测器,氮气、氢气含量均为99.99%。 1 μL微量注射器(上海医用激光仪器厂)。
甲醇,甲苯,对二甲苯,间二甲苯,邻二甲苯,均为色谱级试剂。
1.2 色谱柱及色谱分析条件
1.2.1 固定液的选择
根据固定液的选择性,效果较好的为改性的有机皂土类化合物,选择性极强。在单独使用时,二甲苯异构体洗提次序是对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯。通过给有机皂土中添加适量的邻苯二甲酸二壬酯进行改性,当有机皂土与邻苯二甲酸二壬酯的质量比为m皂土 ∶m酯=3 ∶2.5时,可以使对、间、邻二甲苯异构体有更好的分离效果。
1.2.2 固定相配制
将固定液溶于无水乙醚,然后加入一定量载体,缓慢搅拌使其全部挥发,放入真空箱中,在室温下抽去溶剂,过筛后将固定相装入色谱柱。固定液和载体的质量比为m固定液 ∶m载体=20 ∶100。
1.2.3 色谱柱
色谱柱是整个气相色谱的核心部分,试样在此被分离为单个组分。选用3m×3mm不锈钢管,装填3%有机皂土+2.5%邻苯二甲酸二壬酯,并在140℃下进行老化以备实验使用。由于有机皂土是一种液晶,使用时柱温应保持在50～150℃之间,若高于150℃液晶相被破坏,低于50℃时柱效率会下降。
1.2.4 色谱分析条件
色谱柱:3%有机皂土+2.5%邻苯二甲酸二壬酯(3 m×⌀3 mm),柱 温:80℃, 汽化室温度:160℃,检测器温度:160℃, 衰 减:1/4,灵 敏 度:108,空气:400 mL/min,载气:15 mL/min ,氢气:70 mL/min。
2 .结果与讨论
2.1 柱温的选择
色谱分析条件的选择原则,应当是在保证最难分离"物质对"具有适当分离度的前提下,使分析时间尽可能地短。该分析中难分离的"物质对"是对二甲苯与间二甲苯,而对二甲苯含量分析又是判断催化剂性能的主要指标。为了使"物质对"得到完全分离,必须选择适当的柱温。经反复实验摸索,柱温高于85 ℃时,分离度减小,相对于难分离的“物质对”就更不易分离;柱温低于75℃时,分离度大,对难分离的"物质对"的分离有利。但柱温太低时,会使保留时间延长,峰宽变大,影响分离效果。故选择柱温80 ℃较为合适。
2.2 定性分析
在选定的实验条件下,分别进1 μL甲醇、甲苯、对二甲苯与间二甲苯、邻二甲苯色谱纯样品,得到相应标准物质的保留时间见表1。
由表1可知,在相同的色谱条件下,甲醇、甲苯、对二甲苯、间二甲苯与邻二甲苯的出峰情况重现性较好,峰形规则,保留时间相对稳定,可作为反应主要产物定性的依据。
2.3 定量分析
2.3.1 原料的配制与定量
配制色谱级甲醇甲苯标准溶液(m甲醇 ∶m甲苯=1 ∶6),在选定色谱条件下,平行进样1 μL 3次,选用其中比较接近的两个色谱图数据为标准。采用峰面积外标法计算出原料中甲醇和甲苯的含量。
2.3.2 反应产物的测定
根据反应原理将标准样模拟配制成与反应产物各组分接近的浓度(m甲醇 ∶m甲苯 ∶m对二甲苯 ∶m间二甲苯 ∶m邻二甲苯=2 ∶12 ∶4 ∶1 ∶1),在选定色谱条件下,平行进样1 μL 3次,选用其中比较接近的两个色谱图数据为标准。用峰面积外标法计算反应产物中各组分的含量。出峰情况见图1。
2.4 分析结果对比
反应产物1#与2#样品以上述方法测试(自测)并与西安近现代化学研究所(外检)的分析结果对比,结果如表2。
%
由表2可看出,外检分析的甲苯、对二甲苯、邻二甲苯与间二甲苯的数据,与自测的基本一致,因采用色谱柱不同(对方采用毛细管柱),甲醇与苯我们未检测到。
3 结论
(1) 试验表明:
采用有机皂土/邻苯二甲酸二壬酯作固定相填充柱, 氢火焰离子检测器分析甲苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯,具有选择性高、稳定性好、易于制作和分离时间短等特点。
(2) 最佳的分析条件是:
柱温80℃;汽化室温度160℃;检测器温度160℃;氢气流量70 mL/min;空气:400 mL/min。
(3)
甲基化状态 篇6
DNA甲基化被认为是第一表观遗传学标志[1]。DNA甲基化在机体发育、染色体稳定性以及维持基因表达水平方面扮演着关键的角色[2]。DNA甲基化是在基因的Cp G岛区域Cp G二核苷酸结构的胞嘧啶上加入了一个甲基集团, 从而引起染色体的关闭以及基因表达的沉默。Cp G岛是一段常常高频率出现于基因启动子序列中富含Cp G二核苷酸结构的区域。据报道, Cp G岛的超甲基化所引起的基因表达沉默参与各种细胞活动, 其中包括细胞周期调控、DNA修复、细胞粘附、信号转导、细胞凋亡以及细胞分化[3]。在哺乳动物细胞中, 大约60%的蛋白编码基因在启动子区都含有Cp G岛。这些Cp G岛在转录活性基因中通常是不发生甲基化的 (像持家基因) , 而在发育与组织特异性基因中通常发生DNA甲基化而在所分化成的组织中引起相应基因的表达沉默[4]。此外, 很多基因在正常组织中不发生甲基化, 却在肿瘤组织中出现异常的甲基化现象。自从首次发现肿瘤中发生超甲基化的基因, 成视网膜细胞瘤抑制基因 (RB1) 之后, 陆续发现很多抑癌基因, 与在正常的组织细胞中相比, 在肿瘤组织中发生超甲基化修饰, 如VHL、CDKN2A或者BRCA1[5]。
迄今为止, 在脊椎动物中已经识别出了6种甲基Cp G结合蛋白, 其中包括Me CP2、MBD1、MBD2a、MBD2b和MBD3[6,7]。这些蛋白普遍的功能特征是它们结合DNA分子中的甲基Cp G结构, 而且经常与HDAC家族成员的功能相关联[6], 彼此协作共同调控基因表达, 如多重的超甲基化基因 (MLH1、TIMP-3、CDKN2B以及CDKN2A等) , 在DNMT1和HDAC抑制剂的联合作用下, 能够有效地恢复基因表达活性, 说明DNMT1和HDAC在肿瘤细胞的基因沉默过程中都发挥着至关重要的作用[8]。Rountree等在最近的研究中也证实了上述的发现, 研究显示, DNMT1蛋白参与HDAC以及其他协阻抑物转录抑制复合物的形成[9]。
近年来, 越来越多的特异基因Cp G岛启动子区的DNA超甲基化所引起的基因表达沉默, 已经成为了很多肿瘤细胞关键的标志性特征[10]。但值得注意的是, 与DNA超甲基化一样, 全基因组水平的低甲基化现象也是肿瘤细胞非常重要的特性。基因组水平的DNA低甲基化现象能够引起染色体的不稳定性以及影响DNA重复序列和着丝粒卫星DNA的稳定性[11]。如全基因组水平的DNA低甲基化与局部DNA超甲基化修饰在乳腺癌中都已频繁地被发现[12]。
目前, 甲基化水平的研究方法主要分为基因组DNA甲基化分析方法以及特定DNA片段甲基化检测方法。基因组DNA甲基化分析方法主要包括甲基化敏感扩增多态性 (MSAP) 技术[13]、高效液相层析 (HPLC) 和高效毛细管电泳 (HPCE) [14];特定DNA片段甲基化检测方法主要包括基于亚硫酸氢钠处理的甲基化特异性PCR法[15]、甲基化敏感的限制性内切酶PCR (MSRE-PCR) [15]以及甲基化敏感的酶限制位点探针法与微阵列分子杂交法[16]。近年来, Min Hu等[17]开发的MSDK技术 (methylation-specific digital karyotyping) 在基因组水平甲基化的高通量分析中有了一定的应用, 在此基础上, Jian Li等[18]发展了该技术, 与DNA测序技术相结合的MMSDK技术在筛选未知的甲基化基因方面有了深度的应用。
鉴于此, 在本项研究中, 我们将利用无Cp G岛结构的p Cp Gfree载体, 在其多克隆位点的一侧或两侧插入CCGG序列, 同时利用HpaⅡ/MspⅠ限制性内切酶体系对甲基化敏感性的差异特点 (HpaⅡ只限于切割CCGG序列中第二个C非甲基化状态的DNA及MspⅠ能够同时切割CCGG序列第二个C甲基化和非甲基化状态的DNA) , 构建一种除了多克隆位点插入的CCGG序列之外, 其它地方不含有Cp G岛结构的甲基化研究载体。利用该载体, 可以将经亚硫酸氢钠处理的基因组DNA (甲基化的CCGG序列不变, 而非甲基化的CCGG中的C转化成T) 用MspⅠ酶切处理后克隆到所构建的甲基化载体p Cp Gfree, 从而获得含有CCGG中第二个C甲基化的基因组DNA文库。利用载体上的引物, 可以方便地对含有CCGG甲基化的基因片段或DNA区域进行扩增或测序, 既免除了根据每个插入片段设计引物的繁琐又避免了扩增基因组中相应片段DNA可能造成的非特异性扩增。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
质粒p MD®19-T Simple Vector (Takara®) 和p Cp Gfree-basic (Invivo Gen®) ;大肠杆菌菌株DH5α (天根®) 和GT115 (Invivo Gen®) 。
1.1.2 试剂
限制性内切酶HindⅢ、Bam HⅠ (Thermo®和NEB®10U/μl) 、HpaⅡ和MspⅠ (Takara®10U/μl) ;T4DNA连接酶 (NEB®和Takara®350U/μl) ;Easy Taq酶 (Trans Gen®5U/μl) ;氨苄青霉素 (Amp) , 博来霉素 (Zeocin) , X-Gal, IPTG。其他相关试剂:质粒提取试剂盒 (OMEGA®) , 胶回收试剂盒 (OMEGA®) 。PCR引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。
1.1.3 仪器
细菌培养与质粒制备相关仪器:电子天平 (上海菁海仪器有限公司) ;磁力搅拌器 (江苏荣华仪器制造有限公司) ;p H计;高压蒸汽灭菌锅 (日本Sanyo) ;超净工作台 (苏净安泰) ;制冰机 (德国Ziegra) ;恒温水浴锅 (上海科析试验仪器厂) ;恒温培养箱 (国华企业) ;温控摇床 (国华企业) ;分光光度计;高速冷冻离心机 (美国Thermo Scientific) 。
DNA检测:微波炉, 稳流稳压电泳仪 (北京六一仪器厂) ;紫外成像仪 (伯乐®) ;其他试验所用仪器:PCR仪 (美国伯乐®) 。
1.1.4 培养基
大肠杆菌培养LB液体培养基 (胰蛋白胨5g, 酵母提取物2.5g, 氯化钠2.5g, 蒸馏水定容至500ml, 调节p H至7.0) 。LB固体培养基 (胰蛋白胨5g, 酵母提取物2.5g, 氯化钠2.5g, 琼脂粉7.5g, 蒸馏水定容至500ml, 调节p H至7.0) 。
大肠杆菌培养TB培养基 (胰蛋白胨12g, 酵母提取物24g, 甘油4ml, 加水至900ml并高压灭菌, 加入100ml无菌的0.17mol/L KH2PO4和0.72 mol/L K2HPO4溶液) 。
1.2 方法
预想构建的优化载体p Cp Gfree-MspⅠ质粒与原材料载体p Cp Gfree-basic质粒如图1所示。
1.2.1 HpaⅡ/MspⅠ酶切体系对甲基化的敏感性分析
合成一段已知的DNA序列 (Takara®) , 双链DNA序列如下表1。其中包含一个C (5m C) GG位点。然后根据HpaⅡ/MspⅠ (Takara®) 酶切体系的甲基化敏感性验证其酶切效率。
1.2.2 p Cp Gfree-basic质粒的优化改造
1.2.2. 1 质粒优化改造引物设计及目的片段获得
由于p Cp Gfree-basic本身不含有CCGG位点, 且在大肠杆菌中克隆复制过程中不发生Cp G结构的甲基化修饰。为了构建具有已知CCGG位点的质粒载体, 以p Cp Gfree-basic质粒序列的富含AT碱基区域为模板设计引物, 引物序列如下表2。
在引物1中, 正向引物 (MSPⅠ-F1) 5’端加入Bam HⅠ (GGATCC) 和MSPⅠ (CCGG) 酶切位点, 反向引物 (MSPⅠ-R1) 5’端加入HindⅢ (AAGCTT) 和MSPⅠ (CCGG) 酶切位点;在引物2中, 正向引物 (MSPⅠ-F2) 5’端加入Bam HⅠ (GGATCC) 单酶切位点, 反向引物 (MSPⅠ-R2) 5’端加入HindⅢ (AAGCTT) 和MSPⅠ (CCGG) 酶切位点;在引物3中, 正向引物5’端加入Bam HⅠ (GGATCC) 和MSPⅠ (CCGG) 酶切位点, 反向引物5’端加入HindⅢ (AAGCTT) 单酶切位点。
1.2.2. 2 构建p MD19-T-CCGG克隆载体
以p Cp Gfree-basic质粒序列为模版, 用表2中3对引物分别PCR扩增出3段无实际功能的DNA片段, PCR反应程序:94℃2min;94℃30s, 58℃30s, 72℃30s, 30个循环;72℃10min。取2μl PCR扩增产物为模板, 进行1%琼脂糖凝胶电泳, 扩增片段大小约460bp, 与预期相符合。使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit试剂盒回收PCR产物。步骤按试剂盒说明书进行操作。PCR所得目的片段进行胶回收后与p MD19-T载体连接, 产物转化进入大肠杆菌DH5α, 蓝白斑筛选阳性克隆。使用OMEGAPlasmid Mini KitⅠ质粒提取试剂盒提取通过液体培养基扩大培养的阳性克隆质粒, 并以提取质粒为模板, PCR检测重组载体。PCR反应程序如上。取2μl扩增产物为底物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 扩增片段大小约460bp, 与预期相符合, 经测验证序列正确性后, 载体分别命名为p MD®19-T-CCGG-1、p MD®19-T-CCGG-2、p MD®19-T-CCGG-3。
1.2.2. 3 构建p Cp Gfree-MspⅠ重组质粒
p MD®19-T-CCGG-1、p MD®19-T-CCGG-2、p MD®19-T-CCGG-3载体分别再经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切所得片段与相同酶切载体p Cp Gfree-basic所得骨架连接获得的新载体即是改造优化之后的含有CCGG位点的载体, 命名为p Cp Gfree-MspⅠ-1、p Cp Gfree-MspⅠ-2、p Cp Gfree-MspⅠ-3。将连接后的载体转化大肠杆菌GT115感受态细胞, 液体培养基扩大培养阳性克隆。使用OMEGAPlasmid Mini KitⅠ质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒, 经MSPⅠ单酶切验证后, 测序验证序列准确性。
2 结果与分析
2.1 HpaⅡ/MspⅠ酶切体系的甲基化敏感性分析
注:M泳道代表DNA Marker;C泳道代表双链DNA对照;1泳道代表双链DNA经MspⅠ酶切产物;2泳道代表双链DNA经HpaⅡ酶切产物。Lane M:DNA marker;Lane C;Represents double strand DNA control;Lane 1:MspⅠrestriction enzyme digested double strand DNA;Lane 2:HpaⅡrestriction enzyme digested double strand DNA.
用HpaⅡ或/MspⅠ分别酶切人工合成CCGG序列 (即表1中双链合成DNA序列) 的第二个C甲基化的片段结果如 (图1) 所示。酶切反应结束后, 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果显示, 与未加任何限制性内切酶的DNA对照组相比, MspⅠ酶切组能够识别并切割C (5m C) GG点, 且所得电泳结果中片段大小与预期相符合;而HpaⅡ酶切组则不能完成切割, 说明MspⅠ能够特异识别并切割具有内部甲基化的C (5m C) GG位点, 而HpaⅡ不能特异切割酶切C (5m C) GG位点, 说明HpaⅡ/MspⅠ酶切体系可以敏感地识别并区分C (5m C) GG甲基化位点。
注:M泳道代表DNA Marker;1、2泳道代表第一对引物扩增产物;3、4泳道代表第二对引物扩增产物;5、6泳道代表第三对引物扩增产物。Lane M:DNA marker;Lane 1 and 2;PCR amplified DNA fragments use the first pair primers;Lane 3 and 4:PCR amplified DNA fragments use the second pair primers;Lane 5 and 6:PCR amplified DNA fragments use the third pair primers.
2.2 p Cp Gfree-basic质粒优化改造
以p Cp Gfree-basic质粒为模板用 (表2) 中的3对引物, PCR扩增后电泳检测PCR产物片段为460bp, 片段大小与预期相符如 (图3) 。上述PCR扩增成功的目的片段经Bam HⅠ/HindⅢ双酶切后与相同酶切的p MD19-T Simple Vector载体骨架连接后, 转化大肠杆菌和蓝白斑筛选、液体培养基扩大培养后, 获得的重组载体经琼脂糖凝胶电泳检测结果如 (图4) 所示。选取6组克隆进行PCR验证, 结果如 (图4) 所示扩增片段大小约460bp, 与预期相符合, 经测验证序列正确性后, 分别命名为p MD®19-T-CCGG-1、p MD®19-T-CCGG-2、p MD®19-T-CCGG-3。
Bam HⅠ和HindⅢ双酶切p MD®19-T-CCGG-1、p MD®19-T-CCGG-2、p MD®19-T-CCGG-3载体以及p Cp Gfree-basic质粒, 酶切结果如 (图2-5) 所示。酶切片段经凝胶回收连接、转化大肠杆菌GT115感受态细胞、液体培养基扩大培养并提取质粒后, 经测序验证获得改造优化之后的含有CCGG位点的载体, 命名为p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-1、p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-2、p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-3。
2.3 HpaⅡ或MspⅠ酶切验证
用HpaⅡ或MspⅠ对p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-1载体分别进行单酶切, 经琼脂糖凝胶电泳验证表结果如 (图3-7) 所示, 酶切所获得的片段均为460bp, 载体构建成功。但是用HpaⅡ或MspⅠ对p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-2、p Cp GfreeHpaⅡ/MspⅠ-3载体分别进行单酶切, 则酶切效果明显明显不如p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-1载体的酶切效果理想。
3 讨论
DNA甲基化与癌症等重大疾病的发生发展有着密切的联系。DNA的甲基化改变包括高甲基化 (hypermethylation) 和低甲基化 (hypomethylation) 两种态。一般来说, 基因启动子区DNA高甲基化意味着基因的沉默, 而低甲基化意味着基因的激活。抑癌基因等肿瘤相关基因的高甲基化和整个基因组水平的低甲基化在癌症的发生发展的过程中起着重要作用。近年来, 借助于高通量测序技术的发展, 高通量基因组甲基化测序技术应运而生。其中最基本的是基于亚硫酸氢钠转化的Golden Gate甲基化分析技术[19]和Infinium磁珠芯片分析技术[20,21], 以及基于DNA杂交技术和免疫共沉淀技术发展起来的DNA甲基化测序技术[20,21,22], 如染色质免疫共沉淀测序法 (CHIP) 、甲基化DNA免疫共沉淀测序法 (Me DIP) [23]。再有就是将亚硫酸氢钠转化技术与对甲基化胞嘧啶敏感 (Bst UI、HpaⅡ) 或不敏感 (MspⅠ) 限制性内切酶技术相结合的DNA甲基化测序技术[24]和与基因芯片技术结合形成的高通量甲基化测序技术。基于这些高通量测序技术, 发展出下一代高通量测序平台, 包括454焦磷酸测序技术[25]和Illumina (Solexa) 测序技术[26]等。然而, 基于DNA杂交技术的一个缺陷是当探针比较短时, 特异性会降低[25], 而基于免疫沉淀技术的甲基化测序技术的一个局限是对抗体的纯度及特异性要求较高[27]。
注:M泳道代表DNA Marker;1、2泳道代表p MD19-T-CCGG-1两个不同的T-A克隆载体;3、4泳道代表p MD19-T-CCGG-2两个不同的T-A克隆载体;5、6泳道代表p MD19-T-CCGG-3两个不同的T-A克隆载体。Lane M:DNA marker;Lane 1 and 2:Two different clones of plasmid p MD19-T-CCGG-1;Lane 3 and 4:Two different clones of plasmid p MD19-T-CCGG-2;Lane 5 and 6:Two different clones of plasmid p MD19-T-CCGG-3.
注:M泳道代表DNA Marker;C泳道代表DNA阴性对照;其他泳道代表图3~4中各质粒的PCR检测结果。Lane M:DNA marker;Lane C;Negtive control of DNA;other lanes represent the PCR confirmation results of the TA plasmids in Figure 4.
注:M泳道代表DNA Marker;1泳道代表p Cp Gfree-basic质粒DNA对照;2泳道代表p Cp Gfree-basic经Bam HⅠ单酶切对照;3、4泳道代表p Cp Gfree-basic经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切产物;5~8泳道为p MD®19-T-CCGG-1的酶切处理, 处理及电泳顺序与p Cp Gfree-basic组一致;9~12泳道为p MD®19-T-CCGG-2的酶切处理, 处理及电泳顺序与p Cp Gfree-basic组一致;13~16泳道为p MD®19-T-CCGG-3的酶切处理, 处理及电泳顺序与p Cp Gfree-basic组一致。Lane M:DNA marker;Lane 1:p Cp Gfree basic;Lane 2:Bam HⅠdigested p Cp Gfree basic;Lane 3 and 4:Bam HⅠand HindⅢdouble digested p Cp Gfree basic;Lane 5-8:Bam HⅠor Bam HⅠand HindⅢdigested p MD®19-T-CCGG-1;Lane 9-12:Bam HⅠor Bam HⅠand HindⅢdigested p MD®19-T-CCGG-2;Lane 13-16:Bam HⅠor Bam HⅠand HindⅢdigested p MD®19-T-CCGG-3.
注:M泳道代表DNA Marker;C泳道代表优化载体的阳性克隆质粒DNA对照;1泳道代表p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-1经MspⅠ酶切产物;2泳道代表p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-1经HpaⅡ酶切产物。Lane M:DNA marker;Lane C:modified p Cp Gfree basic plasmid control;Lane 1:HpaⅡ/MspⅠRestriction enzyme digested p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-1 plasmid;Lane 2:HpaⅡrestriction enzyme digested p Cp GfreeHpaⅡ/MspⅠ-1 plasmid.
甲基化状态 篇7
1 DNA甲基化的概念
DNA的甲基化修饰是真核细胞基因表达调控的特点之一。通过在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加甲基, 即可抑制或关闭基因表达。作为一种重要的表观遗传修饰, DNA甲基化参与机体的许多生物学过程。比如, 在胚胎发育过程中的DNA甲基化模式的改变是个体发生的关键, 其与基因转录抑制、基因组印迹、X染色体失活、染色质完整性的维持及细胞分化和发育的调控等都有密切的关系。在哺乳动物中, DNA甲基化多发生在对称的CpG二核苷酸上。CpG岛就是富含CpG序列的片段, 通常处在管家基因的转录起始点上。2008年, Cheng X和Blumenthal R M在研究中发现, 抑癌基因启动子CpG岛甲基化的发生所导致的抑癌基因的关闭可能与肿瘤的生成有关。
2 DNA甲基化的调控因素
DNA的甲基化是通过DNA甲基转移酶直接催化和维持, 但这并不是DNA甲基化唯一的调控因素。在基因沉默相关的各种组蛋白修饰中, 最典型的是组蛋白去乙酰化、H3K9甲基化。在各种生物体中, 这些修饰方式与DNA甲基化协同作用抑制转录。
2.1 DNA甲基转移酶与DNA甲基化的关系
1964年, Gold M等在Escherichia coli中鉴定出第一个DNA甲基转移酶。目前的DNA甲基化反应机制是在原核生物的DNA-C5甲基转移酶中首先发现的。当DNA甲基化酶结合DNA后, 将目标的胞嘧啶反转暴露于DNA双螺旋外, 并嵌入酶的催化结构域中。伴随着碱基对氢键的断裂及碱基堆积力的缺失, 半胱氨酸的亲和基团与胞嘧啶第六位碳 (C6) 共价结合。由于S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 的甲基基团结合于S原子上, 分子极不稳定, 在酶的作用下甲基从SAM转移至被激活的C5, 随着C5位上质子的释放与共价中间物的转变, 最终完成DNA甲基化修饰过程。
目前, 在哺乳动物中已经发现和确定了4种DNA甲基转移酶, Dnmt 1、Dnmt 2、Dnmt 3a和Dnmt 3b。它们的结构由N端调节区、C端催化区及中间连接区三部分组成 (Dnmt 2不含N端调节区) 。其中 Dnmt 1是DNA复制后负责维持子链甲基化的酶;Dnmt 2的功能目前尚不明确, 推测与氨酰tRNA甲基化相关;而 Dnmt 3a和 Dnmt 3b的功能是负责外源基因的甲基化, 催化 CpG从头甲基化。另外, 还有一个调节蛋白 Dnmt 3L, 是一种 Dnmt 3的类似蛋白, 它的N-末端只有类似植物同源结构域的基序 PHD 结构域, C-末端只延伸至保守基序Ⅷ, 缺乏有效的催化结构域。但它是DNA从头甲基化的调节因子, 通过与 Dnmt 3a和 Dnmt 3b的C 端结合, 可提高它们的催化活性, 正向调节DNA从头甲基化。
长期以来, 人们对于DNA甲基化和DNA甲基化酶的研究仅限于脊椎动物并大部分限于哺乳动物。2006年, Ying Wang等人发表了关于鉴定蜜蜂中甲基化相关基因表达的文章, 证明在无脊椎动物中同样存在完备的甲基化表观遗传修饰功能, 大大拓宽了甲基化研究的领域。
2.2 组蛋白去乙酰化与DNA甲基化的关系
在基因转录抑制过程中, 基因启动子DNA甲基化与组蛋白修饰相互作用。DNA甲基化可通过介导组蛋白去乙酰化酶 HDAC活性来抑制基因转录。研究表明, NGF诱导的 PC12 细胞分化过程中, Dnmt 3b的N端ATRX区域募集 HDAC2 到 T-Cad 基因启动子, 介导 T-Cad基因表达抑制[1]。2001年, Cervoni N等通过瞬时转染哺乳动物细胞, 发现组蛋白去乙酰化可能指导DNA甲基化。2005年, Santoro R等人的研究表明, HDAC对基因转录的抑制不具有普遍性, 而是选择性地抑制一些基因表达, 协同 Dnmt 发挥作用。他们发现HDAC抑制剂TSA (trichostation A) 会引起Neurospora特异的胞嘧啶超低甲基化, 抑制了哺乳动物rRNA编码基因的CpG甲基化。
2.3 组蛋白甲基化与DNA甲基化的关系
DNA甲基化和组蛋白甲基化之间的相互作用比较复杂。一般认为, 在基因转录抑制中, 组蛋白甲基化是主要事件。2003年, Lehnertz B等人在组蛋白 H3K9 甲基转移酶 SUV39H 敲除的胚胎干细胞的研究中发现, 组蛋白 H3K9 甲基化的丧失直接影响Dnmt 3b介导的DNA甲基化。紧接着Strannikova M等[2]在RASSF1A基因启动子甲基化失活的研究中也发现, 组蛋白H3K9的甲基化先于DNA甲基化。最近, Vire E等[3]在研究组蛋白 H3另一甲基化位点酪氨酸27 (K27) 甲基化的过程中也证实组蛋白甲基化在基因转录抑制中起主导作用。在此基础上, Li H等[4]的研究发现Dnmt 3a和Dnmt 3b的 PHD 区域可与组蛋白 H3K9 甲基转移酶SETDB1 的N端结合, 从生化的角度进一步将组蛋白甲基化和DNA甲基化联系起来。
2.4 DNA甲基化、组蛋白去乙酰化及组蛋白甲基化的协同作用
DNA甲基化、组蛋白去乙酰化和组蛋白甲基化是三种最典型的与染色质凝聚状态有关的共价修饰方式。一方面DNA甲基化影响组蛋白修饰模式;另一方面对真菌、植物和哺乳动物的研究结果表明, 组蛋白甲基化可能是指导DNA甲基化的一种常规信号。但是三者在基因沉默过程中的起始位置在不同的生物体中或不同的基因中可能不同。就目前的研究结果来看, 有种理论认为在部分生物体内甲基化 H3K9 可与接头蛋白HP1 结合并募集 Dnmt 1 导致 CpG 甲基化, 而mCpG可与其结合蛋白MBD募集组蛋白去乙酰基酶 ( HDACs) 使 H3K9 去乙酰化, 最后 mCpG 与其结合蛋白 MBD 通过接头分子HP1募集组蛋白甲基转移酶 (histone-lysine methyltransferas, HKMT) 再使H3K9甲基化。这样表观遗传信息就构成一个循环, 从组蛋白流向DNA再返回组蛋白。在该理论中, DNA甲基转移酶与HDAC相互作用, 可能为传递HDAC活性提供一个可能的选择性通道, 而HDAC活性又为H3K9再甲基化作好了准备。
外部的刺激通过原初信号传递后, 激活组蛋白甲基化转移酶, 从而诱发组蛋白的甲基化作用。这时HP1接头蛋白与甲基化的组蛋白结合, 激活Dnmt使得相关基因的CpG岛发生甲基化作用。CpG岛发生甲基化作用以后, 进一步激活HDACs组蛋白去乙酰化酶, 使其表达量上升[5]。组蛋白中赖氨酸和精氨酸上带有正电荷, 而DNA带有负电荷。通常情况下, 组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 和组蛋白乙酰化酶 (HATs) 调节着赖氨酸和精氨酸的乙酰化状态, 以保持基因的活性或失活状况。HAT活性强时, 组蛋白呈乙酰化状态, 赖氨酸和精氨酸中的正电荷被中和, 组蛋白与DNA结合的能力减低。此时, 基因转录因子容易进入启动子区域。反之, HDAC活性增强时, 基因转录因子就不容易进入启动子区域。因此当组蛋白去乙酰化酶表达量上升时, 基因有可能沉默。
3 DNA甲基化与亚端粒甲基化的关系
DNA甲基化转移酶在一系列信号传导后能选择性地将一些目标基因沉默。2006年, Nature Cell Biology杂志上的一篇文章引起了世人的关注, Gonzalo S等[6]人在小鼠中发现亚端粒高度甲基化现象, 而在Dnmt 1突变型中却发现亚端粒的甲基化被明显抑制, 从而引发了DNA甲基化转移酶与亚端粒低甲基化关系的研究热潮。所谓的亚端粒是指在染色体末端的复杂片段, 含有丰富的假基因和重复序列, 在非同源染色体之间享有相同的同族性, 它的重排改变与染色体末端的稳定性密切相关。2008年, Yehezkel S等在临床ICF病例中发现由于这些病人是 Dnmt 3b 缺陷型, 从而导致亚端粒甲基化的异常。2009年, Osman E等人在研究 Dnmt 多态性时发现Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3L的微小突变和DNA的低甲基化现象有关, 而进一步的免疫沉淀反应表明这个低甲基化的位点在亚端粒的基因组区域中。
目前, 大部分研究主要以MeDIP (免疫沉淀技术) 为基础构建DNA甲基化的微阵列芯片, 从而探索亚端粒的甲基化现象, 一般是培育 Dnmt 缺陷型的小鼠或者从ICF病人中抽取样本进行观察。
4 亚端粒甲基化和端粒长度的关系
染色体亚端粒的修饰现象很早就被科学家关注, 2004年Susanne S等人在Hela细胞中利用限制性内切酶研究端粒长度时锁定了一个命名为X-region 的亚端粒DNA片段。这段 2～4 kb 的亚端粒DNA不受限制性内切酶的作用, 研究发现它的序列变化与端粒的长度有密切关系, 从而揭开亚端粒DNA修饰效应与端粒长度关系研究的序幕。在进行表观遗传修饰的探索时, 人们很自然地将目光投向了DNA甲基化现象。以小鼠为生物模式的研究大量展开, 在去除端粒酶的小鼠内发现DNA甲基化水平下调导致的亚端粒低甲基化现象与端粒的延长有关。2008年, Roberta B等人在前人研究的基础上, 构建了新的DNA甲基化对端粒长度的调控途径并找到了转录调控的重要元件Rbl2。上游 miR-290 基因簇的下调表达激活了Rbl2, 它的产物将抑制 Dnmt 的作用, 并进而诱导端粒的变化。尽管如此, 对人体亚端粒甲基化与端粒长度的关联认知仍存在空白。在2006年, Gonzalo S指出, 由Dnmt缺陷引发的亚端粒DNA低甲基化和端粒长度增长的现象与在部分人类癌症细胞中亚端粒、端粒的变化情况很接近, 暗示人们对亚端粒低甲基化和端粒长度之间关系的研究可以从肿瘤细胞入手。令人沮丧的是, 2009年Myung E L等人将这方面的研究推进到人类肿瘤细胞, 却未能得到预期的结果。他们的研究表明, 人类的肿瘤细胞在亚端粒上有不同的甲基化模式, 而亚端粒甲基化作用前后并没有监测到端粒长度明显的变化, 所以他们认为在人体中DNA亚端粒的甲基化与端粒的长度并没有直接的关联。同时, Laura和Luke研究小组在端粒酶阳性细胞和ALT细胞的端粒重复RNA序列研究过程中, 也得出了相似的结论, 人类亚端粒甲基化与端粒长度关联的研究变得更加复杂。
5 小结
随着端粒研究的持续升温, 人们很自然地试图去寻找两者之间的关系。尽管当前人类对亚端粒DNA甲基化和端粒长度关系的研究遇到阻碍, 但相信随着研究的深入和组织样本量的扩大, 这个疑难问题最终会得到圆满的解释。当然, 也有一些研究者另辟蹊径将目光投向了无脊椎动物, 2009年Phalke S等人在果蝇中发现 Dnmt 2对果蝇体细胞中逆转录转座子沉默现象和端粒完整性的影响。他们构建Dnmt 2 突变型果蝇, 研究2R、3R染色体端粒相关序列的沉默及端粒的长度变化, 从而将Dnmt与端粒长度关系的研究推向新的领域。就应用的角度而言, 有人着眼于DNA甲基化与昆虫染色体端粒长度的研究, 从而为病虫害的防治提供了新的手段。也有人以哺乳动物为生物模式, 通过表观遗传学的研究揭示胚胎早期的发育与人类衰老的秘密, 希望研制出抗衰老药物。还有人着眼于肿瘤的发生机制, 希望通过DNA甲基化对肿瘤细胞的端粒长度进行负调控, 从而降低肿瘤细胞基因组的稳定性, 为肿瘤临床诊治提供新的思路。
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