超声辅助溶剂提取法

超声辅助溶剂提取法（共6篇）

超声辅助溶剂提取法 篇1

白桦(Betula platyphylla)为桦木科桦木属落叶阔叶树种,是黑龙江省重要的林木资源[1]。桦木的用途很多,主要包括生产胶合板、卫生筷、牙签,制浆造纸等。单宁又名鞣酸、鞣质、单宁酸,是一类广泛存在于植物体内的多酚类物质。植物单宁由于其自身的多酚羟基结构,具有较强的化学和生理活性,已被应用于医药、食品、制革工业、日用化学品等众多领域[2]。白桦树皮含有丰富的单宁,含量为10%左右[3]。

目前,工业上单宁的提取方法多采用溶剂提取法,以水为溶剂的煎煮法,操作简便和成本低,但容易造成多酚类成分的破坏。与水提法相比,水-乙醇提取法具有提取条件温和、提取物中多酚类成分含量高等优点[4]。超声波辅助提取既是对超声波进行利用,其可产生强烈的振动、较高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等,提高了有效成分进入溶剂中的速度,从而有效地促进提取效率的提高及提取时间的缩短,该方法的另一个优点是可有效地避免高温条件下对提取成分的影响[5]。本研究中的溶剂选择乙醇—水溶液,利用超声波辅助提取法对白桦树皮中的桦树单宁进行提取,并采用均匀设计方法,考核的指标主要选择单宁的收率,以对桦树单宁的超声波辅助提取工艺条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 供试材料与仪器

供试的原料为白桦树皮,采自大兴安岭塔河林业局。其采回后应进行一定的处理,即将白桦树皮晒干,粉碎后过筛。仪器:KQ-500DB超声波仪(江苏昆山超声仪器公司);AB104型电子天平(瑞士);752紫外-光栅分光光度计(上海振科有限公司);旋转蒸发仪RE-5(上海亚荣生化仪器);ZF-6030A真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)。试剂:没食子酸标准品(中国药品生物检定所);乙醇、浓硫酸、香草醛、碳酸钠等(均为分析纯)。

1.2 试验方法

1.2.1 桦树单宁提取方法。

(1)水提法。准确地称取重量为10.00 g的白桦树皮粉末,置于容量为250 mL的带回流冷凝管的圆底烧瓶中进行提取,提取前应加入150 mL蒸馏水。提取的温度控制在80℃,提取时间为4 h。待提取液冷却至室温,抽滤,将滤液在50℃下真空浓缩后,于60℃下真空干燥至质量恒定,得到桦树单宁提取物,称重待测。

(2)水—乙醇提取法。准确称取质量为10.00 g的白桦树皮粉末,置于容量为250 mL的带回流冷凝管的圆底烧瓶中进行提取,提取前应加入150 mL乙醇水溶液。提取的乙醇浓度控制在35%,提取的温度应达到80℃,提取的时间一般为1 h即可。待提取液冷却至室温,抽滤,将滤液在50℃下真空浓缩后,于60℃下真空干燥至质量恒定,得到桦树单宁提取物,称重待测。

(3)超声波辅助水—醇提取法。准确称取质量为10.00 g的白桦树皮粉末,置于容量为250 mL的带回流冷凝管的圆底烧瓶中按均匀设计的试验条件进行提取(表1),提取前应加入150 mL不同体积比的乙醇/水溶液。待提取液冷却至室温后抽滤,滤液50℃下真空浓缩后,60℃下真空干燥至质量恒定,得到桦树单宁提取物,称重待测。

1.2.2 单宁含量的测定。测量单宁含量的方法主要为Folin-Ciocalteau法[6]。

(1)标准曲线的绘制。精确称取质量为25.00 mg的没食子酸标准品进行溶解,溶解应选择蒸馏水进行,溶解后进行定容,使总体积达到250 m L,得到对照品标准溶液,浓度为0.10 mg/mL。精密吸取对照样品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 m L容量瓶中,再加入1 m L Folin-Ciocalteu显色剂,将之充分地摇匀后再加入浓度为15%的Na2CO3溶液2 mL,最后将混合液的体积定容至10 m L,在室温的条件下进行反应,一般2 h后即可进行吸光值A760的测定,每样重复测定3次,取平均值。以A760(x)为横坐标,没食子酸质量浓度(y,μg/mL)为纵坐标,绘制标准曲线。得回归线性方程为:y=0.105 8x+0.001 4,相关系数R=0.998 5,没食子酸含量在0.5～5.0μg/m L范围内具有很好的线性关系。

(2)桦树单宁提取物中单宁含量的测定。精密称取质量为25.00 mg的桦树单宁提取物,用一定量的蒸馏水进行溶解,过滤后将之最终体积定容至250 mL,充分摇匀后,精确吸取1.0 mL于10 m L容量瓶中,依次加入1 mL FolinCiocalteu显色剂及浓度为15%的Na2CO3溶液2 mL并定容,按上述标准曲线测定方法对吸光值进行测定,根据标准曲线计算没食子酸的含量。提取物中单宁的含量用没食子酸含量表示,计算单宁的收率与纯度。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助水—乙醇提取工艺优化

均匀设计试验结果见表1。自变量分别选择乙醇浓度(X1)、提取时间(X2)、提取温度(X3)、超声波功率(X4),因变量选择单宁收率(Y),用均匀设计软件(2.0版)对均匀设计的试验结果进行逐步回归分析,得到回归方程为:

各因素对桦树单宁收率影响的逐步回归分析结果表明,随着超声波功率的提高,单宁收率逐渐增加,而随着提取时间延长和乙醇浓度及提取温度的提高,单宁收率的收率呈下降的趋势。根据回归方程计算,最佳乙醇浓度为15%,提取时间为30 min,提取温度为35℃,超声波功率为500 W。利用此条件提取桦树单宁,单宁得率达到6.44%,纯度达到45.68%。

2.2 不同提取方法的比较

以均匀设计试验优选出的工艺条件为试验组,以水提法及水—乙醇提取法作为对照组,进行试验,结果见表2。由表2可以看出,超声波辅助提取法单宁的提取率明显优于水提法,也优于水-乙醇提取法。可见,超声波辅助提取法提取时间短且提取率高,具有较优越的应用前景。

3 结论

试验结果表明,选择白桦树皮作为原料,溶剂选择水—乙醇溶液,运用均匀设计法对桦树单宁的超声波辅助提取工艺条件进行了优化,确定了桦树单宁的超声波辅助提取的最佳工艺条件:最佳乙醇浓度为15%,提取时间为30 min,提取温度为35℃,超声波功率为500 W。利用此条件提取桦树单宁,单宁收率为6.44%,纯度达到45.68%。采用3种不同的提取方法进行比较,结果表明,超声波辅助提取法与水提法、水—乙醇等提取方法进行比较,其不仅提取时间短,且提取率高,应用前景较为广泛[6]。

参考文献

[1]郑万钧.中国树木志[M].北京:中国林业出版社,1998.

[2]孙达旺.植物单宁化学[M].北京:中国林业出版社,1992.

[3]陈业高,吕瑜平,丁中涛,等.植物成分化学[M].北京:化学工业出版社,2004.

[4]贾冬英,姚开,谭薇,等.石榴皮中多酚提取条件的优化[J].林产化学与工业,2006,26(3):123-126.

[5]王秋芬,宋湛谦,赵淑英,等.超声波用于强化有机溶剂提取印揀素[J].林产化学与工业,2004,24(1):25-28.

[6]何志勇,夏文水.Folin-Ciocalteu比色法测定橄榄中多酚含量的研究[J].林产化学与工业,2006,26(4):15-18.

超声辅助溶剂提取法 篇2

关键词：甘草渣；木质素；碱法；有机溶剂法

中图分类号： TQ028.9；R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0223-03

收稿日期：2013-06-24

基金项目：塔里木大学校长基金硕士项目（编号：TDZKSS1002）。

作者简介：赵俭波（1982—），男，重庆人，硕士，讲师，研究方向为农业废弃物的回收利用。E-mail：lain_1982@163.com。木质素又称木素（lignin），是植物体次生代谢过程中合成的一种天然有机高分子物质，在自然界中的含量仅次于纤维素[1]（1-2）。木质素结构中存在多种官能团，如甲氧基（—OCH3）、羟基（—OH）、羰基（—CO）等，它们在木质素中的含量除了与木质素的种类有关外，还与木质素的提取方法有关。木质素结构中的羟基主要有2种类型：一种是存在于木质素结构单元苯环上的酚羟基；另一种是木质素结构单元侧链上的脂肪族醇羟基；这些羟基既可以以游离的羟基存在，又可以与其他烷基或芳基连接成醚。正是由于多种官能团的存在，因此木质素能发生多种化学反应，目前国内外已经开发的木质素产品达千余种，主要有合成树脂、胶黏剂、土壤改良剂、农药缓释剂、橡胶补强剂、染料分散剂、水泥减水剂、自由基清除剂等[2-3]，因此木质素在化学化工生产中具有重要的应用价值。

甘草（Glycyrrhiza Linn.）属于豆科甘草属灌木状多年生草本植物，是重要的中草药，享有“中草药之王”的美誉。甘草广泛分布于40°N左右的干旱、半干旱区域，在我国集中分布于三北地区（东北、华北和西北），以新疆、甘肃、宁夏和内蒙古为中心产区[4]。目前对甘草的研究较多集中在药理方面，如提取甘草酸、甘草次酸等的研究或者关于甘草的药理活性机制等方面的研究[5-6]。

甘草渣是用甘草提取甘草酸或甘草浸膏后的剩余物，目前，甘草渣主要用作生物有机肥、饲料添加剂或者用来提取甘草黄酮[7]。如果能够利用甘草渣来提取木质素并加以开发利用，特别是用来替代石油化工产品以制备新材料，对于提高甘草渣的附加值有重大意义。本研究选用甘草渣作为原料，采用碱法和有机溶剂法，以氢氧化钠、氨水、丙酮和乙二醇为溶剂从甘草渣中提取木质素，进一步测定木质素官能团的含量、分子量及分子量分布。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

HLC-8320GPC凝胶渗透色谱仪；Cary 100紫外-可见分光光度计；FTIR-8400S傅里叶变换红外光谱仪；电子天平；W2-180SP 旋转蒸发仪；数显鼓风干燥箱；精密酸度计。

72%硫酸、盐酸、氢氧化钠、氨水均为化学纯，其余试剂均为分析纯；甘草渣由新农甘草有限责任公司提供。

1.2试验方法

1.2.1原料的预处理将甘草渣晾干、除杂、洗净后于60 ℃烘箱中干燥6 h，粉碎、过40目筛后将干燥的甘草渣在索氏提取器中用体积比2 ∶1的甲苯-乙醇溶液进行抽提，抽提时间为6～8 h，将剩余物在40 ℃烘干即得本试验所需的脱脂脱蜡样品，备用。

1.2.2甘草渣中木质素总含量的测定用Klason法[1]（98-99）测定甘草渣中的木质素含量。准确称取0.5 g脱脂脱蜡样品并移入100 mL烧杯中，再加入8 mL 72%硫酸，充分搅拌后在18～20 ℃下放置4 h，移入500 mL的圆底烧瓶中，用280 mL蒸馏水将洗涤烧杯后的溶液移入烧瓶中；安上回流冷凝管加热煮沸4 h，生成的不溶性残渣用已恒重的玻璃漏斗抽滤，再用热水洗涤几次，在105 ℃下干燥至恒重并称量；平行测定3次，平均值即为克拉森木质素的含量。

根据国标GB/T 2677.3—1993《造纸原料灰分的测定》测定甘草渣中的灰分含量。先准确称取0.5 g脱脂脱蜡的样品于干燥恒重的坩埚中，再于600 ℃箱式电阻炉中灰化直至恒重，平行测定3次，平均值即为灰分的百分含量，按下式计算样品中的木质素总含量：

木质素总含量（%）=克拉森木质素的含量-样品总灰分含量。

1.2.3一般的碱法提取工艺[8]称取5.000 0 g脱脂脱蜡的样品，在烧瓶中加入一定量的碱性水溶液，于60 ℃水浴加热提取2.5 h；过滤后用6 mol/L乙酸将滤液的pH值调至3，减压浓缩后将浓缩液倒入烧杯中，加入3倍体积的95%乙醇处理，静置，待沉淀完全后过滤；将滤液浓缩除去乙醇后，用 6 mol/L 的HCl将pH值调至1.5，静置，待沉淀完全后过滤，所得滤渣用pH值为2.0的HCl溶液洗涤，自然干燥后称重，所得产品即为甘草渣木质素。

1.2.4有机溶剂法提取工艺

1.2.4.1丙酮法[9]称取5.000 g脱脂脱蜡的样品移入圆底烧瓶中，依次加入8 mL 2%稀硫酸、50 mL 60%丙酮溶液，200 ℃冷凝回流2 h后蒸馏、回收溶剂，用温水洗涤样品后离心分离；重复3次，自然干燥并称重，所得产品即为甘草渣木质素。

1.2.4.2乙二醇法[10]称取5.000 0 g脱脂脱蜡的样品放入圆底烧瓶内，加入150 mL乙二醇蒸煮3 h后降温到100 ℃，过滤反应后的混合物，用温水洗涤3次，将洗涤液与滤液合并，在室温下加入3倍体积的水搅拌15 min，此时大量的乙二醇木质素析出；静置过夜，离心分离，滤饼用温水洗涤后自然干燥，称重，所得产品即为甘草渣木质素。减压蒸馏滤液回收溶剂。

nlc202309040728

1.3官能团含量的测定

碱法提取的木质素的总羟基含量采用电位滴定法测定；酚羟基含量采用差示光度法测定；醇羟基由总羟基与酚羟基之差间接测定[11]；甲氧基通过碘甲烷生成反应的容量分析法测定。

1.4FT-IR测定

红外光谱测定采用FTIR-8400S傅里叶红外光谱仪、KBr压片法。

1.5分子质量的测定

采用日本东曹株式会社HLC-8320GPC凝胶渗透色谱仪进行测定，2根色谱柱TSK-gel super HM-H串联（6.0 mm×150 mm），流动相THF，流速0.6 mL/min，温度 40 ℃，进样量10 μL，标准样品为聚苯乙烯，检测器为示差折光检测器。

2结果与讨论

2.1不同溶剂的提取率

测定得甘草渣木质素的总含量约为19.15%。提取率的计算公式为：

2.2不同溶剂提取木质素官能团的含量

通过电位滴定法、差示光度法及甲氧基测定仪测定出的甘草渣木质素官能团含量见表2。

2.3FI-IR分析

对4种不同溶剂提取的甘草渣木质素进行红外光谱测定，其FT-IR光谱图见图1。4种溶剂提取的甘草渣木质素的红外光谱都较为相似，其主要特征吸收峰有：3 400 cm-1左右为—OH伸缩振动吸收峰，峰面比较宽大；2 930 cm-1左右是甲基、亚甲基和次甲基中C—H 的伸缩振动峰；1 665 cm-1左右是共轭羰基CCO的振动峰；1 600 cm-1、1 508 cm-1左右是芳香环骨架振动峰；1 446 cm-1左右是甲基和亚甲基的 C—H弯曲振动峰；1 411 cm-1左右是酚羟基的伸缩振动峰；1 325 cm-1 左右为紫丁香核吸收带；1 220 cm-1左右是与紫丁香核有关的芳香核C—O 振动峰；1 020 cm-1左右是醚键的弯曲振动峰。该图谱与木质素的标准图谱[12]比较吻合。

2.4GPC分析

NaOH和丙酮提取的甘草渣木质素的GPC谱图见图2，用NaOH提取的木质素可直接溶于四氢呋喃中，用丙酮提取的木质素的溶解性稍差。由图2可以看出：NaOH提取的木质素分子量分布较宽。由表3可见：NaOH提取的木质素Mn、Mw、Mz均比丙酮提取的木质素Mn、Mw、Mz大得多，分散性也较大，但较碱提取的木质素分子量小[11]。

3结论

采用碱法、有机溶剂法2种分离方法，以氢氧化钠、氨水、

参考文献：

[1]蒋挺大. 木质素[M]. 北京：化学工业出版社，2008：1-2，98-99.

[2]Stewart D. Lignin as a base material for materials applications：Chemistry，application and economics[J]. Industrial Crops and Products，2008，27（2）：202-207.

[3]Bossuyt H，Six J，Hendrix P F. Interactive effects of functionally different earthworm species on aggregation and incorporation and decomposition of newly added residue carbon[J]. Geoderma，2006，130（1/2）：14-25.

[4]刘娅，韩新年，陈 玲.新疆甘草的开发利用[J]. 食品研究与开发，2012，33（1）：209-212.

[5]Eng A T W，Heng M Y，Ong E S. Evaluation of surfactant assisted pressurized liquid extraction for the determination of glycyrrhizin and ephedrine in medicinal plants[J]. Analytica Chimica Acta，2007，583（2）：289-295.

[6]Abe M，Akbar F，Hasebe A，et al. Glycyrrhizin enhances interleukin-10 production by liver dendritic cells in mice with hepatitis[J]. Journal of Gastroenterology，2003，38（10）：962-967.

[7]张志东，王玮，楚敏，等. 复合酶法提取甘草渣中黄酮类物质的研究[J]. 新疆农业科学，2008，45（4）：729-732.

[8]赵俭波，陈新萍，姜建辉. 甘草渣中碱木质素的提取工艺研究[J]. 塔里木大学学报，2011，23（3）：42-45.

[9]杨益琴，李忠正. 有机溶剂法纯化稻草碱木质素的研究[J]. 林产化学与工业，2000，20（4）：40-44.

[10]Cheng X S，Chen W J，Chen Y P，et al. A new method for making cellulose and lignin by using high boiling solvents[J]. Chemical Research in Chinese Universities，18（3）：175-176.

[11]叶结旺，方桂珍，金春德. Pd/C催化微波法合成氢化碱木质素[J]. 北京林业大学学报，2010，32（2）：171-176.

[12]Boeriu C G，Bravo D，Gosselink R J A，et al. Characterisation of structure-dependent functional properties of lignin with infrared spectroscopy[J]. Industrial Crops and Products，2004，20（2）：205-218.

超声辅助溶剂提取法 篇3

紫苏茎叶中挥发油含量丰富,用水蒸气蒸馏法得到的紫苏精油作为天然香料和风味剂广泛应用于食品、化妆品和医疗行业。紫苏除含多种维生素、矿物质外,还含有紫苏醛、丁香酚、苏烯酮、紫苏醇、柠檬烯、柠檬醛、多酚类等多种生物活性物质[2],具有广泛的抑菌、抑酶、抗氧化活性。

超声波破碎原理是利用超声技术特有的性质和原理进行提取的新工艺。超声对细胞的作用主要有热效应,空化效应和机械效应,当热效应在介质中传播时,摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动,使部分能量转化为局部高热,以破坏植物的细胞,使溶剂渗透到细胞中,以便使大量内容物溢出,具有速度快、效率高等优点。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

紫苏叶;福林酚试剂,上海如吉生物科技发展有限公司;乙醇、盐酸、氢氧化钠、碳酸钠、DPPH,均为分析纯。

1.2 仪器与设备

超声波细胞粉碎机JY92-ⅡN,宁波新芝生物科技股份有限公司;724 型分光光度计、低速离心机、电热鼓风干燥箱、HH-4数显恒温水浴锅,上海博泰实验设备有限公司。

2 实验方法

2.1 原料预处理

新鲜紫苏叶→剪碎→60 ℃烘约2天至恒重为止→放入可封口保鲜袋中并封口→置于冰箱中低温保存、备用。

2.2 紫苏中多酚类化合物的提取

称取1.000 g紫苏叶放入烧杯中,按一定料液和酒精浓度加入溶液,调节pH值为3,置于超声波细胞粉碎机中,于一定功率、温度下提取一定时间后,4500 rpm离心20 min,将上清液倒进量筒中测量其体积,然后取上清夜用于总酚含量的测定。按照2.3步骤进行。

2.2.1 单因素试验

以pH为3的乙醇水溶液为提取剂提取紫苏中多酚类物质,研究不同超声波功率(200 W、250 W、300 W、350 W、400 W)、超声波作用时间(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)、酒精浓度(0%、20%、40%、60%、80%)以及料液比(1:20、1:30、1:40、1:50、1:60)对其得率的影响。

备注:本实验的超声时间指工作时间和间歇时间的总和,其中工作时间为4 s,间歇时间为6 s。

2.2.2 正交试验

在单因素实验的基础上,采用L9(34)正交表,以总酚提取得率为参考指标,对超声波功率、超声时间、酒精浓度以及料液比4个主要因素进行正交实验。

2.3 总酚含量的测定(福林酚法)

取上清液0.2 mL稀释50倍,再用移液管取10 mL,加入到25 mL容量瓶中,加入5 mL浓度为0.2 mol/L的福林酚试剂,混匀后加入10 mL15%的碳酸钠溶液,混匀后放入25 ℃水浴锅中水浴60 min。然后再加蒸馏水定容至25 mL,于750 nm下测吸光值。空白为以10 mL稀释50倍的提取溶剂代替提取液按以上步骤反应所得的试样。福林酚法测定总酚[3],总酚含量用没食子酸当量(gallic acid equivalent,GAE)表示。

计算如下:

总酚含量$(\text{m}\text{g}/\text{g})=\frac{(\text{y}-0.0228)\times \text{稀}\text{释}\text{倍}\text{数}\times \text{提}\text{取}\text{液}\text{剩}\text{余}\text{体}\text{积}}{0.0821\times 10\times 1000\times \text{原}\text{料}\text{质}\text{量}}$

3 结果与讨论

3.1 单因素试验结果与讨论

3.1.1 超声波作用功率的影响

准确称取1.000 g 紫苏叶, 按料液比1:30加入浓度为40%的酒精,调节pH值为3, 分别在200 W、250 W、300 W、350 W、400 W功率下超声30 min,然后在4500 rpm离心20 min,取上清液,用福林酚法测其多酚含量。结果如图2所示。

从原理上来看,超声波功率越高越容易获得较大的声强,但超声功率对物质的提取率的影响不总是呈正比关系,这与超声波与介质相互作用的程度和提取物性质有关系,从图2可以看出,在功率为200～300 W的范围内,多酚类物质的提取率随功率的增加而增加,功率大于300 W的时候,提取率反而下降。可能的原因是过高的功率使分子运动加剧,紫苏叶细胞内的其他物质大量溶出,影响多酚类物质的提取,功率过高还会导致局部高温,破坏多酚类物质的稳定性,使其得率下降,故选择300 W为最佳提取功率。

3.1.2 超声波作用时间的影响

准确称取1.000 g 紫苏叶,按料液比1:30加入浓度为40%的酒精,调节pH值为3,在超声波功率为300 W的条件下,分别超声20 min、30 min、40 min、50 min、60 min,然后在4500 rpm离心20 min,取上清液,用福林酚法测其多酚含量。实验结果如图3。

由图3可知,总酚提取率在开始的40 min内呈明显上升趋势,,并且在超生作用为40 min时,总酚的提取率最高,达到23.67 mg/g,这是由于超声波的机械作用和空化作用增大了分子运动频率和速度增加了溶剂穿透能力,从而提高了多酚类物质的溶出速度和数量,但随着超声波作用时间的继续增加,提取率呈下降趋势。这是因为超声时间太长会导致其他物质大量溶出和局部温度过高,多酚类物质被部分破坏,且随着时间的增加破坏得越严重,当超声时间为60 min时,提取率降到为16.00 mg/g,故选择超声时间40 min为最佳超声时间。

3.1.3 酒精浓度的影响

准确称取1.000 g 紫苏叶,按料液比1:30加入分别加入浓度为0%、20%、40%、60%、80%的酒精,调节pH值为3,在超声波功率为300 W的条件下作用40 min,然后在4500 rpm离心20 min,取上清液,用福林酚法测其多酚含量。结果如图4所示。

乙醇体积分数变化会引起提取剂物理性质,如密度、粘度、介电常数等的变化,从而影响提取率。从图4中可以看出,多酚类物质的提取率随酒精浓度的升高而增加,在60%处得到最大值,总酚含量由8.97 mg/g增加到25.41 mg/g,这是因为加入一定量的乙醇与水形成复合体系更适合多酚的提取,但继续增加酒精浓度,提取率略有下降,其原因是高浓度的乙醇会引起蛋白质等大分子物质的沉淀,从而带动了多酚类物质的共同沉淀,导致总酚含量下降.故选择酒精浓度60%为最佳提取条件。

3.1.4 料液比的影响

准确称取1.000 g 紫苏叶,分别按料液比为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60加入浓度为60%、的酒精,调节pH值为3,在超声波功率为300 W的条件下作用40 min,然后在4500 rpm离心20 min,取上清液,用福林酚法测其多酚含量。结果如图5。

从图5可以看出,总酚的提取量随料液比的增加而增加。料液比的增加提高分子扩散速率、缩短浓度平衡时间,因而使溶解在溶剂中的酚类物质含量增大。图5表明,当料液比为1:50时,总酚提取率最高,达到21.33 mg/g,因而选择料液比为1:50。

3.2 正交试验结果与讨论

在单因素实验探讨的基础上, 利用正交试验设计研究超声波辅助提取紫苏叶酚类物质的最佳提取条件。利用L9(34)表进行正交试验设计, 并得到下表所示实验结果。

由表1可知,超声波辅助提取紫苏多酚类物质的最佳工艺条件为A2B3C1D3,即超声功率为300 W,超声时间为50 min,酒精浓度为40%,料液比为1:60。各因素对总酚提取率影响的主次顺序为B(超声波作用时间)>A(超声波功率)>D(料液比)>C(酒精浓度)。可见,超声时间对紫苏总酚提取率的影响最为显著,而酒精浓度的影响最小。

综合各因素、各指标可知较优超声波提取条件为:超声波功率为300 W,超声时间为50 min,乙醇为40%、料液比为1:60。在此条件下,总酚的提取含量为27.79 mg/g。

4 DPPH清除自由基实验测定抗氧化能力

准确称取1.000 g 紫苏叶,按料液比为1:60加入浓度为40%的酒精,调节pH值为3,在超声波功率为300 W的条件下作用50 min,然后在4500 rpm离心20 min,取上清液6 mL(约16.67 mg/mL),用蒸馏水定容于500 mL容量瓶中。分别配制浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL样品溶液,各取4 mL 于12支比色皿中,其中6支加入浓度为0.5 mmoL/mL的DPPH溶液1 mL作为实验组,另外6支加1 mL乙醇。在黑暗中37 ℃ 放置20 min。以乙醇为空白在517 nm测定Ai,Aj的吸光度。配制等浓度梯度的抗坏血酸,步骤与样品液测法一致,作为对照组。

自由基抑制率(%) =[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:A0——未加药DPPH溶液的空白吸光度

Ai——加药后DPPH溶液的吸光度

Aj——样品溶液自身的吸光度

将试验重复2次,求得平均抑制率(%)。

4.1 数据结果(图6)

由图6可以看出,样品液的抗氧化能力跟VC比较接近,在浓度为0.04 mg/mL时,样品液的抗氧化能力约为VC的0.94倍。

5 结 论

超声波提取紫苏叶中酚类物质的最佳条件是:超声波输出功率为300 W,超声时间为50 min,酒精浓度为40%,料液比为1:60。在此最佳工艺条件下,多酚提取得率为27.79 mg/g,提取液抗氧化能力与相同浓度下VC抗氧化能力接近。

摘要：以新鲜紫苏叶为原料,采用超声波辅助技术提取紫苏叶酚类物质,并通过正交试验确定紫苏叶多酚的最佳提取条件。实验结果表明:紫苏叶多酚的最佳提取工艺条件为:超声波输出功率为300 W,超声时间为50 min,酒精浓度为40%,料液比为1∶60。在此最佳工艺条件下,多酚提取得率为27.79 mg/g,提取液抗氧化能力是相同浓度下抗坏血酸的0.94倍。

关键词：紫苏叶,多酚,超声波提取,抗氧化能力

参考文献

[1]刘大川.紫苏植物的开发研究[J].中国油脂,2001,26(5):7-10.

[2]于长青,赵煜,朱刚,等.紫苏叶的药用研究[J].中国食物与营养,2008,10(1):52-53.

[3]刘清,李玉,姚惠源.Folin-Ciocalteu比色法测定大麦提取液中总多酚的含量[J].食品科技,2007,09(4):175-177.

[4]周平,吕晓玲,姚秀玲.超声波辅助提取紫苏中迷迭香酸条件的优化[J].天津科技大学学报,2007,22(2):72-75.

[5]丁利君,周圳辉,林燕如.芒萁中黄酮物质的提取及其抗氧化研究[J].食品科学,2005,26(8):77-82.

[6]朱洪梅,赵猛,超声波辅助提取紫甘薯花色苷工艺研究[J].陕西农业科学,2009,18(2):3-5.

[7]顾红梅,张新申,蒋小萍.紫薯中花青素的超声波提取工艺[J].化学研究与应用,2004,16(3):404-408.

[8]刘娟,雷焱霖,唐友红,等.紫苏的化学成分与生物活性研究进展[J].时珍国医国药,2010,21(7):1768-1769.

[9]黄恺婷,王根女.微波辅助提取紫苏叶中酚类成分的研究[J].现代食品科技,2010,26(5):515-518.

超声辅助溶剂提取法 篇4

1 材料

1. 1 仪器TU - 1901 型双光束紫外分光光度计: 北京普析通用有限责任公司; LX -07A多功能粉碎机: 上海江信科技有限公司; 电热鼓风干燥箱: 上海一恒科学仪器有限公司;AB135 - 分析天平: Made in Switzerland; BSA124S型电子天平:北京赛多利斯科学仪器有限公司; 旋转蒸发仪: 上海亚荣生化仪器厂; 循环水式多用真空泵: 郑州长城科工贸有限公司; 旋转蒸发仪: 郑州长城科工贸有限公司; 恒温水浴锅: 上海亚荣生化仪器厂; 电子恒温不锈钢水浴锅: 余姚市上通温控仪表厂; KH5200DE型高功率数控超声清洗器: 昆山禾创超声仪器有限公司; PHS -25 酸度计: 成都世纪方舟科技有限公司。

1. 2 药品与试剂瞿麦: 内蒙古天立药业, 经内蒙古医科大学药学院药用植物教研室乔俊缠教授鉴定为石竹科植物瞿麦Dianthus superbus L. 的带花地上部分; 薯蓣皂苷元对照品: 中国药品生物制品检定所提供, 批号: 111539 -200001。淀粉酶: 江苏无锡, 活性单位1 万U/g; 无水乙醇、冰乙酸、正丁醇、香草醛、高氯酸、石油醚: 均为分析纯。

2 方法

2. 1 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的薯蓣皂苷元对照品5.0mg, 用无水乙醇溶解, 定容至25 mL, 摇匀, 即得200μg·mL－ 1薯蓣皂苷元对照品溶液。

2. 2 供试品溶液的制备精密称取蒙药瞿麦粉末1. 0g, 加10mL石油醚于50℃ 水浴加热回流2 小时, 过滤, 干燥至无石油醚味, 将其置于锥形瓶中, 加入pH为6.0 的HAc -NaAc缓冲液, 浸泡30 分钟, 加入一定量的淀粉酶, 60℃［10］水浴加热30 分钟, 然后于95℃水浴灭酶10 分钟, 取出后放置至室温, 超声, 过滤, 滤液与水饱和正丁醇以等体积萃取, 萃取3 次, 合并滤液, 挥干, 用无水乙醇洗出, 定容至25 mL。在提取工艺研究中改变相应参数。

2. 3 测定波长的选择精密量取对照品和供试品溶液0. 5mL于10mL具塞试管中, 于60℃ 水浴挥干, 加入0. 2mL5%香草醛-冰醋酸溶液, 0.8mL高氯酸于60℃水浴加热20 分钟, 取出放置2 分钟, 加入冰醋酸定容至10mL摇匀, 放置15分钟, 在300 ~600nm范围内做波长扫描。结果显示对照品和供试品均在410nm处有最大吸收, 故选择410nm做为测定波长。

2. 4 标准曲线的制备精密量取对照品溶液0. 0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0 mL分别置于10 mL具塞试管中, 按2. 3 项下显色方法显色, 在410nm处测定吸光度, 以吸光度为横坐标, 浓度为纵坐标绘制标准曲线, 得回归方程Y =0.025X +0. 004, r = 0. 9999, 结果表明浓度在4. 176 ~ 20. 88μg·mL－ 1内与吸光度值呈良好线性关系。

2. 5 单因素试验按供试品溶液的制备方法进行不同酶用量、超声功率、超声时间、料液比的单因素试验, 得出总皂苷提取率与因素水平的关系。分别对淀粉酶［11］用量1、2、4、6、8、10mg因素进行考察, 结果发现增大淀粉酶用量会增大总皂苷提取率, 到达一定量后明显减少, 因此选择淀粉酶用量2、4、6mg 3 个较优水平进行正交实验; 分别对超声功率120、140、160、180、200W的因素进行考察, 结果发现超声功率变大会提高总皂苷提取率, 达到一定值后功率变大反而减少, 因此选择140、160、180W3 个较优水平进行正交实验; 分别对超声时间［12］15、20、25、30、35 分钟的因素进行考察, 结果发现提取时间增长会提高总皂苷提取率, 到达一定时间后明显下降, 因此选择提取时间15、20、25 分钟3 个较优水平进行正交实验; 分别对料液比1: 15、1: 20、1: 25、1: 30、1: 35 的因素进行考察, 结果发现随着比值增加总皂苷提取率逐渐上升, 在达到一定比例后反而降低, 因此选择料液比1: 25、1:30、1: 35 3 个较优水平进行正交实验。

2. 6 正交试验根据以上单因素实验结果, 采用L9 ( 34) 正交实验表以酶用量 ( A) 、超声功率 ( B) 、超声时间 ( C) 、料液比 ( D) 4 个因素, 选取各因素较优的3 个水平, 酶用量2、4、6mg, 超声功率140、160、180W, 超声时间15、20、25 分钟, 料液比1:25、1:30、1:35 做正交实验, 每个水平平行做3 份, 取平均值, 见表1 ~2。

2. 7 结果分析见表3。

由表3 极差分析结果可知, 在影响蒙药瞿麦总皂苷提取率的4 个因素中, 料液比影响最大, 超声时间影响最小。其影响总皂苷的提取率大小次序为D >B >A >C, 即料液比>超声功率> 酶用量> 超声时间。最佳工艺组合为A2B3C1D2, 即酶用量4.0 mg, 超声功率180W, 超声时间15分钟, 料液比1:30。

3 方法学考察

3. 1 稳定性精密量取供试品溶液0. 2mL, 按2. 3 项下进行显色, 在410nm处每隔15 分钟测定吸光度1 次, 测定3 小时, RSD为1.25%, 表明供试品溶液在3 小时内稳定性良好。

3. 2 精密度精密量取同一供试品溶液6 份, 每份0. 2mL, 按2.3 项下进行显色, 在410nm处测定吸光度, 计算总皂苷含量, RSD为0.82%, 表明精密度较好。

3. 3 重现性精密称取蒙药瞿麦粉末1. 0g, 6 份, 在最佳工艺条件下按2.2 项下进行提取, 分别精密量取0.2mL按2.3项下进行显色, 在410nm处测定吸光度, 计算总皂苷含量, 均值为2.367%, RSD为0.35%, 表明该方法重现性良好。

3.4加样回收试验精密称取蒙药瞿麦粉末0.5g, 6份, 分别加入80%、100%、120%的薯蓣皂苷元对照品各2份, 在最佳工艺条件下按2.2项下进行提取, 按2.3项下进行显色, 在410 nm处测定吸光度, 计算加样回收率, 平均回收率为98.39%, RSD为0.51%, 结果表明本实验的加样回收率良好, 结果见表4

4 含量测定 ( 工艺验证性试验)

精密称取蒙药瞿麦粉末1.0g, 加10 mL石油醚于50 ℃水浴加热回流2 小时, 过滤, 干燥至无石油醚味, 将其置于锥形瓶中, 加入pH为6.0 的HAc - NaAc缓冲液30 mL, 浸泡30 分钟, 按最佳工艺条件加入4mg淀粉酶, 60℃ 水浴加热30分钟, 然后于95℃水浴灭酶10 分钟, 取出后放置至室温, 超声功率180W, 超声15 分钟。过滤, 滤液与水饱和正丁醇以等体积萃取, 萃取3 次, 合并滤液, 挥干, 用无水乙醇洗出, 定容至25 mL, 精密量取供试品溶液0.2 mL于10 mL具塞试管中, 于60℃水浴挥干, 加入0.2 mL5%的香草醛- 冰醋酸溶液, 0.8 mL高氯酸于60℃水浴加热20 分钟, 取出放置2分钟, 加入冰醋酸定容至10 mL摇匀, 放置15 分钟, 在410nm处测其吸光度, 计算总皂苷含量, 平行做6 份, 总皂苷含量均值为2.367%, RSD为0.35%, 结果见表5。

5 工艺放大性试验

精密称取蒙药瞿麦粉末6 份, 每份20g, 按2.2 项下的方法在最佳工艺条件下 ( 酶用量4.0mg、超声功率180W、超声时间15 分钟、料液比1:30) 提取总皂苷, 按2.3 项下的显色方法显色, 在410nm处测定吸光度, 计算总皂苷含量分别为2. 382% 、2. 369% 、2. 397% 、2. 400% 、2. 378% 、2. 401% , 均值为2.388%, RSD为0.56%, 说明该方法适合于放大生产。

6 讨论

酶辅助超声法是一项较新的提取方法, 其原理是根据植物药材细胞壁的构成, 利用酶反应所具有的极高催化活性和高度专一性等特点, 选择相应的生物酶, 将细胞壁的组成成分水解, 从而使植物细胞内有效成分更容易溶解、扩散的一种提取方法。而超声［13］具有效率高、价格低、无污染、易获得等优点, 因此, 酶辅助超声法具有良好的应用前景。

实验过程综合考虑了节约成本、操作方法、时间效率、准确性等多方面因素, 选取了具有简便、灵敏、适应面广、容易掌握的紫外可见分光光度法进行含量测定。预实验证明, 经石油醚脱脂可提高总皂苷提取率, 这可能是由于脂类的消除及蜡质的破坏, 有利于极性提取剂的渗透和皂苷类物质的渗出, 故蒙药瞿麦需经石油醚脱脂。皂苷易溶于热水、含水乙醇、热甲醇、热乙醇, 几乎不溶或难溶于石油醚、乙醚、苯等极性较小的有机溶剂［14］。本实验经石油醚脱脂, 采用pH为6. 0 的HAc - NaAc缓冲液为提取液, 是可行的。香草醛-冰醋酸-高氯酸显色体系稳定性好, 准确性高, 但不稳定, 为使测量结果准确需临用现配。本实验首次采用酶辅助超声法从蒙药瞿麦中提取总皂苷并测定了其含量, 为建立该药材的质量标准提供了理论依据.

摘要：目的:优选出酶辅助超声法提取蒙药瞿麦总皂苷的最佳提取工艺, 并建立蒙药瞿麦总皂苷的含量测定方法。方法:以薯蓣皂苷元为对照品, 采用紫外分光光度法, 以香草醛-冰醋酸-高氯酸为显色剂, 在410 nm处测定吸光度, 计算瞿麦中总皂苷含量, 以总皂苷含量为评价指标, 先后通过单因素试验和正交试验, 对酶辅助超声提取法进行优化。结果:优化后的超声提取蒙药瞿麦总皂苷最佳工艺条件为酶用量4.0 mg, 超声功率180 W, 超声时间15分钟, 料液比1:30, 4因素影响顺序为料液比>超声功率>酶用量>超声时间, 测得蒙药瞿麦总皂苷含量为2.367%, 平均回收率为98.39%, RSD为0.51%。结论:该工艺为酶辅助超声提取蒙药瞿麦总皂苷的最佳工艺, 采用紫外分光光度法测定瞿麦总皂苷, 操作简便、灵敏度高、重现性好, 稳定性高, 可作为瞿麦药材总皂苷的含量测定方法。

超声辅助溶剂提取法 篇5

1.1 料液比 (酸菜:蒸馏水) 的确定。

将酸菜用多功能搅拌器粉碎备用 (以下简称将样品预处理) , 称取5.0g, 加入比例分别为1:20、1:30、1:40、l:50、1:60的蒸馏水, 采用频率为40k Hz的超声波设备进行提取, 提取的基础条件:提取功率为40%, 温度50℃, 时间10min, 取出冷却至室温, 静止过滤, 滤液根据国标GB/T5009.33-2003测定标准进行检测。

1.2 提取功率的确定。

将样品预处理, 称取5.0g, 加入比例为1:40的蒸馏水, 用超声波提取设备进行提取, 提取的功率分别设定为40%、50%、60%、70%、80%, 提取温度为50℃, 提取时间为10min取出冷却至室温, 静止过滤, 滤液根据国标GB/T5009.33-2003测定标准进行检测。

1.3 提取时间的确定。

将样品预处理, 称取5.0g, 加入比例为1:40的蒸馏水, 用超声波提取设备进行提取, 提取功率为60%, 提取的时间分别设定为5min、10min、15min、20min、25min, 提取温度为50℃, 取出冷却至室温, 静止过滤, 滤液根据国标GB/T5009.33-2003测定标准进行检测。

1.4 提取温度的确定。

将样品预处理, 称取5.0g, 加入比例为1:40的蒸馏水, 用超声波提取设备进行提取, 提取功率为60%, 提取时间为15min, 提取的温度分别设定为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃, 取出冷却至室温, 静止过滤, 滤液根据国标GB/T5009.33-2003测定标准进行检测。

1.5 超声提取最优条件的确定。

确定单因素条件后, 拟采用正交设计L9 (34) 确定最佳提取条件。

2 微波法辅助提取酸菜中硝酸盐、亚硝酸盐

2.1 料液比 (酸菜:蒸馏水) 的选择。

将酸菜用多功能搅拌器粉碎备用 (以下简称将样品预处理) , 称取1.0g, 加入比例分别为1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50的蒸馏水, 采用微波设备进行提取, 提取的基础条件为50℃, 5min, 取出冷却至室温, 静止过滤, 滤液根据国标GB/T5009.33-2003测定标准进行检测。

2.2 微波提取温度的选择。

将样品预处理, 称取1.0g, 加入比例为1:20的蒸馏水, 用微波萃取仪进行提取, 提取的温度分别设定为50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃, 提取时间为5min取出冷却至室温, 静止过滤, 滤液根据国标GB/T5009.33-2003测定标准进行检测。

2.3 微波提取时间的选择。

将样品预处理, 称取1.0g, 加入比例为1:20的蒸馏水, 用微波萃取仪进行提取, 提取温度为70℃, 提取时间分别设定为lmin, 3min, 5min, 7mim, 9min, 取出冷却至室温, 静止过滤, 滤液根据国标GB/T5009.33-2003测定标准进行检测。

2.4 微波提取最优条件的确定。

实验采用正交方法确定最优提取条件, 三因素三水平正交试验设计表安排如下。

3 结果与分析

3.1 亚硝酸盐标准曲线的绘制。

实验所得标准曲线如下图1所示:如图得到相应的回归方程为:Y=0.7426X+0.0014;R2=0.9993

3.2 国标法测定酸菜中的亚硝酸盐。

根据国标GB/T5009.33-2003测得的亚硝酸盐吸光度, 由上述的回归方程换算, 得到酸菜中亚硝酸盐含量为2.79mg/kg。

3.3 超声波法辅助提取酸菜中的硝酸盐、亚硝酸盐。

3.3.1 料液比的确定。

以亚硝酸盐提取量为指标考察料液比对酸菜样品提取效果的影响, 结果如图2所示, 随着料液比的增加, 提取的亚硝酸盐含量也随之增加, 当料也比达到1:40时, 提取量达到最大, 继续增加料液比, 亚硝酸盐的提取量变化不大。所以选择最佳的料液比为1:40。

3.3.2 提取功率的确定。

以亚硝酸盐的提取量为指标考察超声波提取功率对酸菜样品提取效果的影响。当提取功率小于60%时, 随着提取功率的增大, 亚硝酸盐的提取量逐渐增大。当提取功率大于60%时, 亚硝酸盐的提取量开始减小。这可能是由于超声波的作用不仅加速了酸菜中硝酸盐、亚硝酸盐的提取, 同样也加速了酸菜中其他成分的溶出, 如有机酸、Vc等, 破坏了亚硝酸盐导致检测值降低, 所以选择最佳的提取功率为60%。

3.3.3 提取时间的确定。

以亚硝酸盐的提取量为指标考察提取时间对酸菜样品提取效果的影响, 随着时间的延长, 亚硝酸盐的提取量逐渐增加, 当时间达到15min时, 提取量达到最大。继续延长时间, 提取量基本保持不变。所以选择最佳的提取时间为15min。

3.3.4 提取温度的确定。

以亚硝酸盐的提取量为指标考察提取温度对酸菜样品提取效果的影响, 随着温度的提高, 亚硝酸盐的提取量增加, 当温度达到50℃时, 提取量达到最大, 进一步提高温度, 亚硝酸盐的提取量开始减少。所以选择最佳的提取温度为50℃。

3.3.5 验证试验。

按正交试验确定的最佳提取条件, 提取酸菜中的亚硝酸盐, 测得酸菜中的亚硝酸盐含量为3.80mg/kg。比正交试验的最优组2.96mg/kg含量高。表明此正交实验得出的最优组是符合实际的。

小结

超声辅助大蒜多糖提取研究 篇6

大蒜为单子叶植物百合科葱属植物蒜的鳞茎, 含有多种营养物质, 具有药、食、保健等多种功效, 大蒜多糖是其主要活性成分之一[1]。相关研究表明, 大蒜多糖具有抗菌消炎、抗血凝、降血脂、防止动脉粥样硬化、保护肝功能、抗肿瘤和预防衰老等作用, 目前国内外对大蒜多糖的研究非常活跃[2,3,4]。大蒜中的大蒜多糖含量比大蒜素高一个数量级且更为稳定, 因此开发研究大蒜多糖更有优势和积极意义。

超声波技术因具有成本低、安全、操作简单、无污染等一系列优点[5], 近年来越来越多地被用于植物有效成分的提取。与传统提取方法相比, 其优势表现在缩短提取时间、提高提取效率、节约能源、环保等优势, 因此被看作是“绿色技术”, 美国环保局 (EPA) 已将超声波提取法作为基本分析方法[6]。利用超声波辐射使植物细胞内的极性物质尤其是水分子吸收电磁能产生大量的热量, 使细胞内温度迅速上升, 液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破, 形成微小的孔洞, 细胞壁和细胞内部水分减少, 细胞收缩, 表面出现裂纹, 使胞外溶剂易进入细胞内, 从而有利于对大蒜多糖的提取[7,8]。

2 大蒜多糖的提取

大蒜中富含蛋白质、碳水化含物、矿物质、维生素等营养元素。新鲜大蒜鳞茎每100g约含有水分70g、蛋自质4.4g、脂肪0.2g、碳水化合物23g、粗纤维0.7g、灰分1.3g、钙8mg、磷44mg、铁0.4mg、硫胺素0.24mg、核黄素0.03mg、尼克酸0.9mg、抗坏血酸3mg、生物素2.2mg, 以及微量的硒、铜、锌、锗、碘等。其中, 碳水化合物含量为22%—26%, 占其总干物质含量的80%以上, 碳水化合物主要为菊糖类多糖[9]。

2.1 主要试剂和仪器

试剂:纤维素酶、二次蒸馏水、无水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、葡萄糖、正丁醇、氯仿、丙酮、石油醚、正己烷、无水乙醇、浓硫酸、3, 5-二硝基水杨酸等, 均为国产分析纯。

仪器:打浆机、低速离心机、海尔冰箱、SHB-III型循环水真空泵、真空干燥箱和722N型可见光光度计 (上海精密科学仪器有限公司) 、UV751-GD型紫外/可见光分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司) 、HH.S21-Ni6型恒温水浴锅 (北京长安科学仪器厂) 、RE-5299型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂) 、KQ-500DE型数控超声波清洗器 (昆山超声仪器有限公司) 、DDS-307型数字式电导率仪 (上海精密科学仪器有限公司) 、PHS-3C型酸度计 (上海精密科学仪器有限公司) 、精密电子分析天平等。

2.2 实验方法

工艺流程:大蒜去皮清洗→粉碎→脱脂 (乙醚、丙酮、石油醚) →过滤→脱脂蒜泥→ 超声辅助酶解→加水、灭酶→提取→离心、分离、醇析→纯化得大蒜多糖。

主要操作过程:①大蒜脱脂。取去皮大蒜100g, 用打浆机打碎后用300mL 95%的乙醇回流两次, 除去大蒜中的脂肪, 每次60min, 过滤, 滤渣用乙醚、丙酮、石油醚洗涤, 收集滤渣即为大蒜泥。②大蒜多糖的超声辅助酶解。将脱脂大蒜泥置于洁净干燥的500mL烧杯中, 加入NaAc-HAc缓冲溶液调节pH值, 再加入一定量的纤维素酶搅拌均匀, 在一定温度下超声波辅助酶解反应一段时间, 再调节溶液pH为7.0, 在95—105℃下60min使纤维素酶失去活性[10,11]。③热水提取。在中性环境中以二次蒸馏水作为提取剂, 以一定的料液、时间和温度提取大蒜多糖。④离心、浓缩、醇沉、烘干得粗品。将提取液在3000—3500r/min下离心, 取上层清液置入旋转蒸发浓缩仪中, 使提取液浓缩至原体积的1/4, 取上层清液测定多糖含量;浓缩液加入95%乙醇, 使浓缩液中乙醇浓度达到70%—80%, 放入冰箱4℃中静置24 h醇沉, 再在3000—3500 r/min条件下离心20 min, 分离乙醇与沉淀, 冷冻干燥得淡黄色粉末即为大蒜多糖, 称重并记录。⑤纯化。提取之后, 用乙醇进行反复沉淀洗涤, 除去醇溶性蛋白质、色素、低聚糖等杂质, 然后用Sevage法脱游离蛋白质, 或用硅溶胶膨润土等除去蛋白, 即得大蒜多糖纯品[12]。

多糖含量与提取率测定:采用苯酚—硫酸法测定总糖含量, 采用3, 5-二硝基水杨酸 (3, 5-dinitro salicylic acid, DNS) 法测定还原糖含量, 以葡萄糖作为标准品[13,14,15], 总糖含量undefined, 还原糖含量undefined。式中, C1、C2分别为样品总糖浓度和还原糖浓度 (mg/mL) , D为测定总糖时的稀释倍数, V为定容体积, m为供试样品质量 (g) 。多糖含量 (g/g) =总糖含量 (g/g) -还原糖含量 (g/g) , 多糖提取率undefined。

3 结果与分析

前期试验采用纤维素酶提取大蒜多糖。研究表明, 在温度为50℃、pH=5时, 5%的纤维素酶活性最大, 此时大蒜多糖的提取率也将增大。因此, 在预先确定超声波酶解温度为50℃、pH=5, 5%的前期条件下进行提取研究。

3.1 单因素试验

超声酶解时间对多糖提取率的影响:超声波研究发现, 一定超声波条件能破坏植物组织的细胞结构但不破坏分子结构, 使提取物易于从组织中快速溶解到提取溶剂中, 同时能增强提取物的生物活性, 因此提高了提取效率。按照本文以上的方法, 分别取去皮大蒜100g, 在脱脂后加5%的纤维素酶超声波酶解, 分别设定超声酶解时间为20min、40min、60min、80min、100min, 之后调节pH=7灭酶, 在一定的料液比下进行水蒸气蒸馏, 测定提取液中大蒜多糖含量, 结果见图1。由图1可知, 在超声波40min之前大蒜多糖的提取率呈上升趋势。随着超声时间的推移, 大蒜多糖的提取率增加缓慢。这是由于超声波产生强烈震动, 高速、强烈的空化效应和搅拌作用加速了大蒜多糖的浸出速度, 增大了酶的接触面积, 但不破坏大蒜多糖的主要化学成分, 因此加速了反应, 约40min超声波就可打碎大蒜组织细胞, 使组织几乎完全溶解到溶剂中, 而且超声波有助于溶剂、酶与大蒜多糖充分均匀混合, 再延长时间其作用就非常有限。在实际提取过程中, 为了节约时间和能耗, 故选定40min为最佳超声时间。

料液比对多糖提取率的影响:由于酸碱提易破坏多糖的立体结构与活性, 而单纯水法提取时间长且效率低[16]。本试验采用水溶液加酶法提取多糖, 在温和条件下尽可能不引入杂质易, 提高大蒜多糖提取率。按照本文以上方法, 分别设定料液比 (m/V) 为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5进行水蒸气蒸馏, 测定大蒜多糖含量, 结果见图2。由图2可知, 料液比 (m/V) 在1∶3时提取率最大。如提取时加水过少, 大蒜不能完全润湿;加水越多, 溶液越稀越易沸, 损失也越多, 使大蒜多糖的提取率降低, 因此选用的料液比 (m/V) 为1∶3。

提取温度对多糖提取率的影响:按照本文以上方法, 分别设定提取温度为55℃、65℃、75℃、85℃、95℃进行水蒸气蒸馏, 取提取液测定大蒜多糖含量, 结果见图3。由图3可知, 随着提取温度的升高, 大蒜多糖提取率不断增加, 在85℃前提取率增加明显, 但升高温度使水分蒸发也增加, 随之损失的大蒜多糖增多, 提取率反而下降。此外, 考虑到高温可能对多糖的结构与活性有一定的影响, 因此选择最佳提取温度为85℃。

提取时间对多糖提取率的影响:按照本文以上方法, 分别设定提取时间为10min、30min、50min、70min、90min进行水蒸气蒸馏, 取提取液测定大蒜多糖含量, 结果见图4。由图4可知, 提取率随着提取时间的延长而增加, 但增幅趋于平缓, 在50min前提取率明显增大, 50min之后其增大率减小, 可以认为大蒜多糖基本被提取, 因此在实际提取中采用50min。

3.2 正交试验优化大蒜多糖提取工艺条件

正交试验设计:根据单因素结果, 以大蒜多糖提取率为评定指标, 选择大蒜的超声波酶解时间、料液比 (m/V) 、提取温度、提取时间为考察因素, 每个因素3个水平, 选择L9 (34) 正交表, 试验设计见表1。

正交试验结果:由表2中极差直观分析, 各因素主次顺序为A>C>D>B。表3的方差分析结果表明, 在A、B、C、D四个因素中, A、C的影响具有非常显著的意义 (P<0.05) , 最佳水平为A2B2C3D2, 即超声波酶解时间为40min、料液比 (m/V) 为1∶3、提取温度85℃、提取时间为50min。

3.3 验证试验

为了进一步验证正交试验结果的可靠性与重现性, 按正交法的最佳工艺条件进行3次平行试验, 大蒜多糖的提取率分别为72.25%、73.18%、72.49%, 平均含量为72.64%。

3.4 传统热水提取法与超声波辅助提取法比较

由表4可知, 与传统的热水浸提法相比, 超声波辅助提取可显著提高大蒜多糖得率, 而且能缩短提取时间, 降低能量消耗, 具有快速、节能、高效、绿色等优点。

注:F0.05 (2.2) =19.00, F0.01 (2.2) =99.00;表中**表示P<0.01, 有极显著统计学意义。

4 结论

通过单因素试验和正交试验方法, 确定了超声波酶解大蒜多糖的最佳条件。即先期在温度为50℃、pH=5时, 5%的纤维素酶条件下超声波辅助酶解40min、料液比 (m/V) 1∶3、温度85℃、提取50min, 提取率可达到72.64%。

摘要：大蒜多糖具有众多的生理功能, 有很高的经济价值。以大蒜为原料, 采用超声辅助酶解法提取大蒜多糖, 具有高速、高效、节能、环保等优点。在单因素试验的基础上, 通过正交试验进一步优化提取工艺条件, 确定影响提取率的主次因素分别为超声酶解时间、料液比、提取温度和提取时间。结果表明, 先期酶解条件为温度50℃、pH 5.0、酶用量5.0%, 最佳提取条件为超声波酶解时间40min、料液比 (m/V) 1∶3、提取温度85℃、提取时间50min, 多糖提取率达72.64%。