遗传多样性分析（精选12篇）
遗传多样性分析 篇1
糜子 (Panicum miliaceum L.) 起源于中国, 已经有7 000多年的栽培历史, 具有耐旱、耐瘠薄等特性[1]。种质资源是其遗传改良的重要基因库, 是培育优质、高产新品种的重要物质基础。为了有效地利用这些种质资源, 就必须了解其性状表现, 应对种质资源进行全面系统的鉴定。形态学水平上进行遗传多样性研究具有简单、易行、快速等特点, 已在大豆[2]、甜高粱[3]、小豆[4]等种质研究中得到应用。课题组在不断搜集糜子资源材料的同时, 着手对保存的资源材料进行形态学标记的研究, 以期为糜子种质资源利用及新品种选育提供一定的理论依据, 从而提高育种效率。
1 材料与方法
1.1 材料
参试材料包括26个品系, 1个育成品种。
1.2 试验设计及性状调查
试验于2009年春季在黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院试验地进行, 前茬为大豆。4月2日灭茬、旋耕、起垄, 4月21日灌水。5月10日采用机械开沟, 人工播种。用磷酸二铵做种肥, 用量为225 kg·hm-2, 播后镇压。试验采用随机区组设计, 3行区, 3次重复, 行长3.75 m, 行距0.65 m。从每小区选取5株有代表性的植株进行室内考种, 调查株高、穗长、生物产量、节数、穗重、穗粒重、千粒重7个农艺性状。
1.3 统计分析
利用DPS软件计算各性状平均值、标准差、变异系数、极大值、极小值、聚类分析。根据各性状的平均数、标准差将材料分为10级, 从第一级X i
2 结果与分析
2.1 糜子主要农艺性状的基本统计分析
由表1可知, 参试材料的变异系数存在较大差异, 在3.85%～17.09%, 按变异系数划分变异程度, 从0%～10%为较低、10%～20%为中等、20%以上为较高。其中, 节数、株高、穗长、千粒重的变异系数较低, 不到10%, 生物产量、穗重、穗粒重的变异系数中等;各农艺性状的多样性指数均较大且差异不大, 为1.66～2.02, 在考察的7个农艺性状中, 穗重的多样性指数最高, 为2.02, 其后依次是节数 (1.98) 、株高 (1.87 cm) 、穗长 (1.85 cm) 、穗粒重 (1.84 g) 、生物产量 (1.80 g) 、千粒重 (1.66 g) , 这表明26份糜子种质资源具有较丰富的遗传多样性, 是宝贵的育种资源。
2.2 基于农艺性状的聚类分析
尽管把形态特征做为表型性状受一定的环境影响, 但在随机区组试验条件下, 各材料所受环境影响基本是一致的。在这种情况下, 形态性状的变异在一定程度上仍能反映出不同材料在基因型上的变异。因此, 用形态性状进行聚类分析, 能粗略的反映出材料之间的亲缘关系。利用DPS 7.05软件按照类平均法 (UPGMA) 对27份参试材料的7个农艺性状进行聚类分析, 在欧氏遗传距离10.5处所有参试材料聚为4大组群 (见图1) , 各组群的主要农艺性状统计结果见表2。第一组群有1份种质, 即962-007, 其株高、穗长都处于所有参试材料的最大值, 但是其产量性状都表现一般, 属于营养生长旺盛的种质;第二组群包括2份种质, 即012-77和043-8, 这两份材料的穗重和穗粒重是所有参试材料中最高的, 属于丰产型种质;第三组群共包括6份材料, 它们营养生长性状较高, 仅次于第一组群, 产量性状表现一般。第四组群包括18份材料, 其各个性状基本是4个组群中最低的, 属于植株较为矮小, 产量较低的种质。
2 结论与讨论
充分分析种质资源的遗传多样性是作物育种和改良的基础和前提。遗传多样性的研究手段经历了形态水平、细胞水平、生化水平和分子水平4个阶段。从形态学或表型性状上来分析遗传变异具有简单直观的特点, 目前仍在遗传学研究中广泛应用, 但易受环境影响, 随着分子生物学和生物技术的迅猛发展, 分子标记已广泛应用于种质资源研究, 但利用非靶标分子标记方法研究遗传多样性, 难以与具体性状结合起来, 所以有必要将农艺性状与分子标记技术相结合, 以准确把握遗传多样性的本质。
该试验的研究结果中可以看出, 糜子种质的不同性状在不同材料中表现出了不同程度的多样性。参试材料各农艺性状的变异系数存在较大差异, 在3.85%～17.09%, 节数的变异系数 (5.59%) 最小, 穗粒重的变异系数 (17.09%) 较大, 可见参试材料在产量性状上有较高的变异潜力, 有较大的选择范围, 为提高产量提供了较大的可能性。7个农艺性状的多样性指数均较高, 在1.66～2.02, 穗重的多样性指数最高, 千粒重的多样性指数最低。
通过对参试材料的多样性指数和变异系数比较可以发现, 在同一个性状上二者表现得并不一致, 例如, 节数的变异系数都很低, 但是其多样性指数 (1.98) 却很高。说明了虽然形态多样性指数和变异系数都可以用来描述性状的变异情况, 但是, 它们反映变异情况的角度并不相同。形态多样性指数反映的是某一性状的不同表型等级的数量分布, 即多样性的丰度和均匀度, 而变异系数反映的是某一性状变异的范围, 所以, 两者在同一性状上表现得并不一致[7]。
摘要：对27份糜子种质资源的7个农艺性状的遗传多样性进行了分析。结果表明:糜子种质资源遗传变异丰富, 穗重的多样性指数最高, 为2.02, 千粒重的多样性指数最低, 为1.66。基于农艺性状的聚类分析把27份种质分为4大组群, 其中, 第二组群的012-77和043-8的穗重和穗粒重最高, 属于丰产型种质, 应作为糜子杂交育种的亲本加以重点利用。
关键词：糜子,农艺性状,遗传多样性
参考文献
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遗传多样性分析 篇2
长江下游鳊鱼遗传多样性的RAPD分析
应用RAPD技术对长江下游鳊鱼群体的`遗传多样性进行分析,从40个随机引物中筛选出28个引物对鳊鱼24个个体的基因组DNA进行扩增,共检测到178个位点,分子片段在0.2～2.0 kb之间,其中多态位点83个,占46.63%:个体间最大的遗传距离为0.1326,最小的遗传距离为0.047 6,平均遗传距离为0.088 5;群体的Nei基因多样性指数为0.259 3,Shannon多样性指值为0.098 6.与其他鱼类的遗传多样性研究结果相比,长江下游鳊鱼群体的遗传多样性处于中等水平.
作 者：李建林 俞菊华 唐永凯 LI Jian-lin YU Ju-hua TANG Yong-kai 作者单位：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室,江苏,无锡,214081 刊 名：广东海洋大学学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF GUANGDONG OCEAN UNIVERSITY 年，卷(期)： 28(1) 分类号：Q959.468 关键词：鳊鱼 遗传多样性 RAPD 长江遗传多样性分析 篇3
关键词：鲤鱼；RAPD；遗传多样性
中图分类号： S917.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0047-03
收稿日期：2014-03-12
基金项目：国家自然科学基金（编号：31360638）；云南省教育厅科学研究基金重大专项（编号：ZD2013009）；红河学院中青年学术带头人后备人才项目（编号：2014HB0203）；红河学院博士专项（编号：14BS11）。
作者简介：杜民（1974—），男，湖北枣阳人，博士，副教授，主要从事水生生物技术与资源研究。Tel：（0873）3799787；E-mail：du2005min@126.com。
通信作者：刘艳红，博士，教授，主要从事水域资源与环境管理政策研究。Tel：（0873）3698575；E-mail：kidliu1968@126.com。自从随机扩增多态性DNA技术（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）于1990年由美国科学家Williams等和Welsh等分别建立起来[1-2]以后，已在遗传多样性的检测、物种分类和演化、品种鉴定、种群的亲缘关系、构建鱼类遗传连锁图谱、鱼类育种和杂种优势等研究方面得到应用并且效果良好。陈国生应用RAPD技术分析了闽江中上游黑脊倒刺鲃和黄颡鱼遗传多样性[3]。赵凯利用RAPD技术对4种鲤科鱼类的基因组DNA进行了分析，结果表明鲤亚科2种鱼种间相似性明显高于青海湖裸鲤和草鱼种间的相似性，然而另外2个鲤亚科3种鱼与裂腹鱼亚科的青海湖裸鲤之间的差异显著高于鲤亚科鲤与雅罗鱼亚科草鱼、鲫鱼之间的差异[4]。
鲤鱼（Cyprinus carpio）属硬骨鱼纲（Osteichthyesu）辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤形总目（Cyprinomopha）鲤科（Cyprinidae），是一种最常见的淡水鱼，在各个淡水水域均有分布，也是我国淡水养殖的主要经济鱼之一。天然水域的污染和过度捕捞利用等原因造成鲤鱼栖息环境严重破坏，因此了解并保护鲤鱼种质资源显得极为迫切。本研究利用RAPD方法对云南省蒙自市响水河和草坝水体的2个鲤鱼群体进行分子遗传分析，探讨其遗传多样性，为鲤鱼资源的科学管理和合理开发提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
供试鱼来自于云南省蒙自市草坝水体和响水河水库，每个水体各采集6尾。取活鱼的尾鳍分别装入1.5 mL离心管中，加入无水乙醇并于4 ℃保存备用。
1.2方法
1.2.1试剂、仪器及基因组DNA提取Taq酶、dNTP、Marker 及10×Buffer（博迈德生物科技公司）；Tris酚（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；PCR仪：EDC-810（东胜创新生物科技有限公司）；紫外透射仪：DYY-11（北京六一仪器厂）；高速离心机：HC-2062（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。参照杜民等的方法[5]提取鲤鱼基因组总DNA并放于 -4 ℃ 冰箱。取5 μL DNA样品和适量溴酚蓝充分混匀后，利用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统进行检测，观察到鲤鱼基因组DNA条带比较清晰，符合RAPD实验要求（图1）。
1.2.2引物筛选及RAPD检测参照郭勇等三叶崖爬藤RAPD引物筛选[6]。以12尾鲤鱼的混合DNA为模板，从50条长度分别为10 bp的随机引物中（部分引物筛选的结果如图2所示），筛选出能扩增出清晰、条带数量适中的10条引物用于扩增（表1）。RAPD扩增反应程序： 94 ℃ 预变性2 min；然后35个循环（94℃变性30s，36℃退火 30s，72℃延伸
表110条随机引物的序列
引物 序列引物序列SBSA10GTGATCGCAGSBSC01TTCGAGCCAGSBSA16AGCCAGCGAASBSC02GTGAGGCGTCSBSB05TGCGCCCTTCSBSC04CCGCATCTACSBSB07GTGACGCAGSBSC07GTCCCGACGASBSB08GTCCACACGGSBSC08TGGACCGGTG
2 min）；最后72 ℃延伸5 min。取 5 μL 扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳，5 V/cm电压；用凝胶成像系统进行扫描和分析。
1.2.3数据统计分析记录清晰、明亮且重复性好的条带。将相同迁移距离的条带看作同一位点，统计总条带数与多态性条带数。根据产物的电泳带型，在相同迁移率上出现带的记为1，未出现带的记为0，只记录清晰且重复性好的DNA条带，并计算相关参数。根据Nei指数法[7]用Popgene1.32软件对2个鲤鱼群体的遗传多样性指数进行分析：（1）多态位点百分率=多态位点数/所测位点总数×100%；（2）遗传相似系数：F=2NXY/（NX+NY），其中NXY为2群体的共享位点数，NX为1群体的位点数，NY为2群体的位点数；遗传距离P：P=1-F；（3）基因流Nm=0.5（1-Gst）/Gst；（4）遗传分化指数Gst=（Ht-HPOP）/Ht，其中Ht为总群体的平均多样度，HPOP为各群体多样度的平均值。
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2结果与分析
2.1RAPD扩增结果
用筛选到的10条引物对2个鲤鱼群体的基因组DNA进行PCR扩增，表2列出了10条引物序列的扩增情况。本试验2个群体中共扩增出100个位点，其中响水河鲤鱼群体总条带数为47条，其中多态性条带有44条，平均多态位点比例为93.61%；草坝鲤鱼群体总条带数为53条，其中多态性条带有51条，平均多态位点比例为96.23%，表明该群体遗传资源丰富，具有较好的遗传多样性。
2.22个鲤鱼群体的遗传多样性
2个鲤鱼群体多样性指数见表3。响水河鲤鱼群体和草坝鲤鱼群体Shannon信息指数（I）分别为0.479 9和0.455 7；Neis基因多样性指数（H）分别为0.328 7和0.298 4；等位基因观察数（Na）分别为1.821 4和1.910 7，有效等位基因数（Ne）分别为1.584 3和1.487 9。响水河鲤鱼群体的Shannon信息指数（I）高于草坝鲤鱼群体的Shannon信息指数。表210条RAPD引物对2个鲤鱼群体的扩增结果
引物序列总条带数（条）多态性条带数（条）多态性频率（%）响水河草坝响水河草坝响水河草坝SBSA10GTGATCGCAG05050100SBSA16AGCCAGCGAA666510088.33SBSB05TGCGCCCTTC431375100SBSB07GGTGACGCAG6565100100SBSB08GTCCACACGG666510088.33SBSC01TTCGAGCCAG5656100100SBSC02GTGAGGCGTC5555100100SBSC04CCGCATCTAC5555100100SBSC07GTCCCGACGA6666100100SBSC08TGGACCGGTG4646100100合计4753445193.6196.23
表32个鲤鱼群体多样性指数
群体Shannon信息指数Neis基因多样性响水河0.479 9 0.328 7草坝0.455 7 0.298 4总的0.515 50.341 7
2.3群体间的遗传变异分析
根据总的基因多样性（Ht）和群体内基因多样性（Hs）可以推算出群体间分化水平（Gst）。本研究的2个鲤鱼群体间的遗传分化系数Gst为0.082 4，即群体间的遗传变异占总遗传变异的8.24%，群体内的遗传变异占总变异的91.76%，显示出2个群体间不存在明显的遗传变异（表4）。
表42个鲤鱼群体遗传分化与基因流
指标总的基因多
样性（Ht）群体内基因
多样性（Hs）遗传分化
系数（Gst） 基因流
（Nm）平均 0.341 70.313 5 0.082 4 5.569 0标准差 0.015 60.014 9
2.4群体间的遗传关系分析
依据10个有效引物进行PCR扩增的结果，计算出2种鲤鱼群体间的遗传相似性指数和遗传距离如表5所示。响水河和草坝2个群体的遗传相似性系数为0.958 1，遗传距离为0.041 9。
表52个鲤鱼群体间的相似性（右上角）和遗传距离（左下角）
群体 响水河草坝响水河 ****0.958 1草坝0.041 9 ****
3讨论
3.12个鲤鱼群体的遗传多样性
RAPD标记操作简单、方便、快速并且引物具有随机性[8-9]，现已广泛应用于水生经济动物的遗传多样性研究，如张涛等对汉江上游鲫鱼研究其多态位点比例为67.77%[10]；方耀林等对长江水系的3个青鱼群体进行研究，结果表明多态性位点比例为75%[11]；励迪平等报道曼氏无针乌贼的多态性位点比例为14.6%，平均杂合度Ho为0.032[12]，所得出的曼氏无针乌贼的遗传多样性是比较低的；朱学峰研究发现广西中华草龟的多态位点比例为66.29%，广西中华草龟的遗传多样性比较丰富，但是个体间的亲缘关系比较近，遗传变异程度很小[13]；张伟等对东南太平洋智利竹鱼研究发现多态位点比例为98.08%，Neis基因多样性指数为0.350 0±0144 0，群体的Shannon信息指数为0.520 2±0.181 3，遗传分化指数Gst为0.031 1，结果表明该海域智利竹鱼群体的遗传多态性比较高，但群体间不存在明显的遗传分化[14]；张学明等研究发现北海文昌鱼Shannon信息指数为 0.219 0[15]。本试验筛选出10条引物进行PCR扩增，利用RAPD技术对响水河和草坝鲤鱼群体进行遗传多样性分析，表明2个群体的平均多态位点比例分别为93.61%和9623%，Shannon信息指数分别为0.479 9 、0.455 7，表明响水河和草坝2个鲤鱼群体遗传多样性比长江铜鱼、武汉市场购回的普通鲫鱼、汉江上游鲫鱼、长江水系青鱼、曼氏无针乌贼、广西中华龟的遗传多样性丰富，但没有东南太平洋智利竹鱼遗传多样性丰富。
3.22个鲤鱼群体之间的遗传差异
Thorpe研究认为，同种不同群体间遗传距离D在0.03～0.2之间，遗传相似度（I）在0.80～0.97之间，不同物种间遗传相似度（I）在0.2～0.8之间[16]。本研究中，2个鲤鱼群体间的基因分化系数Gst为0.082 4，表明8.24%的遗传变异来自于群体间，群体内的遗传变异占总变异的91.76%，这说明这2个区域群体之间不存在显著的遗传分化，但不同群体间存在一定的遗传分化。响水河和草坝2个鲤鱼群体的遗传相似度较高（0.958 1），遗传距离D为0.042 9，大于0.03小于0.2，表明2个群体间存在一定的遗传分化。本研究获得的遗传多样性数据可以对今后红河州鲤鱼遗传变异水平及其变化趋势分析提供参考。
参考文献：
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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2015.01.015
遗传多样性分析 篇4
关键词：葛根,ISSR,遗传多样性,聚类分析
葛根 (Puerariae Radix) 为豆科葛属多年生落叶藤本植物, 是粉葛 (Pueraria thomsonii Benth) 、野葛 (Pueraria lobata (Willd.) Ohwi) 和食用葛 (Pueraria edulis Pamp) 的块根总称, 为药食两用植物。葛根素有“亚洲人参”, 其所含异黄酮类成分可用于防治心脑血管类疾病, 葛粉亦被誉为称“长寿粉”, 是一种新兴的绿色保健食品, 具有巨大的开发潜力。葛属植物全世界约20种, 我国葛属植物约11种 (9种2变种) (罗琼等, 2007;李臻等, 2011;李玉山, 2009;朱校奇, 2011) 。目前在葛根资源及其分布、有效成分及提取、保健功能、药理作用、栽培管理及综合利用价值方面的研究已有较多报道 (熊力夫等, 2010;刘云等, 2010) , 但有关葛根资源遗传多样性的研究较少, 景戌等人 (2010) 采用的RAPD方法对重庆地区葛根遗传多样性分析和葛根素含量聚类分析, 结果表明:RAPD分析葛根种质资源的遗传距离在0.00~0.36之间, 平均为0.19;葛根种质资源遗传相似系数按类平均法, 可聚为3类。ISSR标记技术是由Zietldewic等于1994年提出来的, 与RAPD相比, ISSR标记迅速简便, 重复性好, 具有更高的多态性, 已被广泛应用于多种作物种质资源的遗传多样性及亲缘关系研究 (沈颖等, 2005) , 利用ISSR-PCR技术分析葛根遗传多样性的研究尚未见报道。本研究利用ISSR标记技术, 对11个不同产地来源的葛根进行遗传多样性分析, 为葛根种质鉴别、品种选育、加工利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
分别采自云南、江西、广西、湖北四省, 共11份种质资源, 种植于广西大学现代农业教学科研基地, 具体来源见表1。
注:以下材料代码与此相同
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA提取及检测
采集葛根的幼嫩叶片, 采用李荣华等 (2009) 的CTAB方法并稍加修改提取基因组DNA, 用紫外分光光度计测定DNA质量及浓度, 稀释为50ng/μL, 于-20℃冰箱保存备用。
1.2.2 引物筛选
PCR扩增采用20μL反应体系 (参照2x Taq Master Mix说明书) :含2x Taq Master Mix10μL、50ng/μL模板DNA 1μL、10μmol/L随机引物1μL、无菌水8μL。反应程序依次为:94℃预变性5 min、94℃变性50s、不同退火温度退火1min、72℃延伸2min, 38个循环, 72℃延伸6min, 4℃保存。取5μLPCR产物, 用1%琼脂糖凝胶跑电泳, 在成像系统观察并成像分析, 从中筛选出条带清晰稳定、多态性高的引物。
1.2.3 数据统计及分析
利用人工数带的方法在同一迁移位置, 有带记为1, 无带记为0, 电泳产物中清晰可辨的条带全部以0、1统计, 建立数据库。采用NTSYS 2.1软件中DICE法计算不同种质间的遗传相似系数, UPGMA法进行聚类分析, 绘制聚类图 (李荣华等, 2009;赵桂琴等, 2011;刘旭颖等, 2010;陈新起等, 2011;黄捷等, 2008) 。
2 结果与分析
2.1 DNA提取及检测
利用改良CTAB法提取了11个不同产地来源的葛根基因组DNA (图1) , DNA条带清晰、完整性较好, 无拖带降解现象。所有样品A260/A280的值都在1.73~1.85之间 (表2) , 满足后续实验要求。
2.2 ISSR多态性分析
从11份种质资源中共扩增得到98条带, 不同引物扩增出来的片段数不同, 其中UBC835条带最多, UBC815条带最少。平均每条引物可扩增出8.17条带, 其中多态性条带有68条, 多态性条带的比率为69.39%, 平均每个引物可扩增多态性条带为5.67 (表3) 。其中引物UBC808和UBC880的扩增产物多态性最丰富 (图2) 。
2.3 聚类分析
利用NTSYS软件, 根据SM相似系数法计算11份种质资源间的遗传相似性矩阵, 从表3可以看出, G1与G2这2份种质之间的遗传相似系数均为最大, 为0.97, 表明亲缘关系最近;而G10与G3, G10与G5这两组种质之间的遗传相似系数小, 为0.65, 表明亲缘关系最远。再用UPGMA法对其进行聚类分析, 生成聚类图 (图3) 。从图2中可以看出, 在阀值为0.69时11份葛根资源分为A和B两个大组。A组包括:G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9;B组包括:G10、G11。
在阀值为0.76时又可将A组分为A1和A2两个亚组。A1亚组包括:G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G9, A2亚组包括:G8;B组中G10、G11分别分为B1和B2两个亚组。A与B两大组之间的遗传差异不明显, 在4个亚组之间A1与A2两个亚组遗传差异较大, B1和B2两个亚组的遗传差异较小, 这与进行SM相似系数法所得的亲缘关系结果相一致。
3 讨论
葛根块根中含有丰富的淀粉、蛋白质、多糖、异黄酮及酚类等物质, 获得高质量的基因组DNA有一定难度。本研究利用改良CTAB法提取了11个不同产地葛的基因组DNA, 在反复多次抽提后, 得到了高质量的DNA。表明改良CTAB法为提取葛根基因组DNA适宜方法。结果与肖鲲等 (2007) 一致。
从90个ISSR引物中筛选出12个多态性好的引物 (表3) , 其中 (GA) n、 (CA) n、 (AC) n各有3条, (AG) n有2条, (CT) n只有1条, 说明葛根基因组中存在大量的CT/GT/TG/TC二核苷酸重复序列。对11个不同产地的葛根资源的ISSR标记分析, 共扩增出98条带, 其中多态性带有68条, 多态性比率为69.39%, 遗传相似性系数范围为0.65-1.00, 遗传相似性较高, 多态性不丰富, 遗传变异小。从遗传相似系数矩阵表及构建的聚类树状图可以看出, 广西的G1、G2、G5、G6、云南的G4、江西的G3、G7、G9归为A1亚组, 广西的G8材料归为A2亚组, 说明葛根种质间的的遗传关系与地域关系不大, 这很可能是有引种造成的。
遗传多样性分析 篇5
利用微卫星标记技术,分析了山西黎城大青羊、吕粱黑山羊、波尔山羊、南江黄羊(黑)、南江黄羊(黄)五个山羊群体的分子水平上的.遗传多样性,结果表明:7个微卫星住点均为高度多态位点,可以用于山羊群体遗传多样性的评估;平均多态信息含量(PIC)达0.8341～0.9026;5个山羊群体平均观察杂合度(0.6258～0.8629)均低于平均期望杂合度(0.8594～0.9115),证明5个山羊种群具有丰富的遗传多样性和广泛的遗传基础,但品种内存在着一定程度的近交,尤其波尔山羊近交较严重.以Nei氏标准遗传距离为基础的UPGMA和N-J聚类结果表明:吕粱黑山羊与南江黄羊(黑)首先聚为一类,而没和黎城大青羊先聚;国内四个山羊群体与国外品种波尔山羊亲缘关系较远.
作 者：常新建 任有蛇 岳文斌 姚继广 杨子森 王慧生 赵兴财 白海全 CHANG Xin-jian REN You-she YUE Wen-bin YAO Ji-guang YANG Zi-sen WANG Hui-sheng ZHAO Xi-cai BAI Hai-quan 作者单位：常新建,任有蛇,岳文斌,CHANG Xin-jian,REN You-she,YUE Wen-bin(山西农业大学动物科技学院,山西,太谷,030801)
姚继广,杨子森,YAO Ji-guang,YANG Zi-sen(山西省生态畜牧产业管理站,山西,太原,030001)
王慧生,赵兴财,WANG Hui-sheng,ZHAO Xi-cai(山西省岢岚县畜牧兽医局,山西,岢岚,036300)
白海全,BAI Hai-quan(山西省岢岚县绒山羊种羊场,山西,岢岚,036300)
遗传多样性分析 篇6
关键词：冷蒿种群 改进CTAB RAPD 遗传多样性
蒙药冷蒿Atremisia frigida(蒙语：阿给)，又名小白蒿、菟毛蒿，菊科蒿属的小灌木，是蒙医的常用药，主要分布在内蒙古[1～3]。近年来，随着中药材标准化进一步深入，为提高中药质量和临床效果，中药材的道地性的研究越来越受到重视[4～6]。但对民族药的道地性研究甚少。长期以来，蒙药冷蒿一直在民间用于出血疾病的治疗[7]。研究发现，不同产地来源的蒙药冷蒿制炭后止血效果差异显著，而且来自荒漠草原的蒙药冷蒿制炭后活性成分的含量偏高。目前，冷蒿药材来源为野生冷蒿，随着荒漠化的进程，以及药材的大量开采，将使冷蒿变成濒危物种。为了避免野生药用植物的枯竭，势必要进行药材的规范化栽培种植(GAP)，对冷蒿遗传背景的分析，不但可以从遗传学角度观察引起冷蒿质量变异的原因，也可以为冷蒿栽培种植提供理论指导。
一、通辽居群内部遗传多样性分析本课题组采用通辽31株冷蒿样本的DNA作为通辽地区冷蒿居群内RAPD扩增的样本。
1. 居群内RAPD扩增带的多态性分析13个引物在通辽31株冷蒿样本中共扩增条带数为209，多态性条带数为180，多态位点比率为86.12%，平均每个引物扩增的DNA带数为13.8条，位点分子量范围均在200～2 000 bp之间。
2.居群内样本的聚類分析遗传相似度在0.22～0.76之间，其能够在一定程度上反应个体间DNA的差异，根据相似度计算遗传距离(本研究中各个体间遗传距离未列出)，从而利用UPMGA法进行聚类分析，得到个体间亲缘关系分枝树系图。
二、居群间遗传多样性分析呼和浩特、锡林郭勒冷蒿干药材混合均匀，随机取样进行DNA的提取，选取DNA完整性好、含盐量少，RAPD扩增结果稳定的3个不同批次的DNA样本，代表其所在居群进行遗传多样性检测和分析。鉴于居群遗传多样性指数与居群样本数相关，随机从通辽31个DNA样本中选取5个样本，进行居群间遗传多样性分析。通过对通辽居群5个样本的Nei'' s指数、Shannon指数两个准确反映遗传多样性的数据进行t检验，所得到的t值均小于2.78(df=4,α=0.05双尾检测)，说明随机选取的样本和总样本无差异，能代表通辽地区的遗传多样性。
三、本实验是在前人对不同地区冷蒿药效差异分析的基础上，利用RAPD，探究冷蒿的遗传多样性。根据邹喻苹等对165属499种植物等位酶数据统计的结果，物种水平的多态性应在50%左右，居群水平的多样性应为40%左右，Gst应在0.17左右。崔光红等在药用肉苁蓉的遗传多样性RAPD分析中根据肉苁蓉平均多态位点百分率47.37%，2个居群多态位点分别为39.47%，35.53%，Gst=0.2545，得出荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉的遗传多样性降低，已经处于极度低下状态的结论。而本研究中物种水平的多态性在96.17%，居群水平所得多态性水平通辽(T)为76.08%、锡林郭勒(L)为52.63%、呼和浩特(H)为37.32%，Gst为0.212 9均高于这些平均值，所以，冷蒿在物种水平和居群水平上都有着丰富的遗传多样性。
冷蒿在北温带广泛分布;多年生小半灌木;风媒异花受粉;存在于演替的各个阶段。冷蒿有如此广泛的分布，所面临的环境差异大，个体和居群数目多，适应幅度大，基因交流频繁，因此维持遗传变异的能力强，产生新的遗传变异的机会也多，这都有利于其增加遗传多样性水平，并使之保持较高的水平，高于高等植物平均遗传多样性水平(约70%)。 由于地理位置的不同，各种环境因子各有差异，这必然会影响不同地区居群的遗传多样性水平。用Nei'' s 指数、Shannon指数分析，通辽遗传多样性最丰富，锡林郭勒盟次之，呼和浩特最少。这与植株所在的环境有关。通辽地区41%的土地为沙沼，而且所用药材新鲜，样本量大，所以遗传多样性丰富。冷蒿作为一种风媒异花授粉的植物、在多水条件下不生存、在干燥的条件下，遗传多样性较丰富。锡林郭勒盟，常年大风，年均降雨少，因而遗传多样性丰富。呼和浩特地区因为降水量是3个地区中最高的，遗传多样性水平降低。
目前，药材遗传多样性的研究多采用新鲜植株。但考虑到进行药效分析和人们使用药材时多用干药材，因而本研究对呼和浩特和锡林郭勒两个地区的干药材进行遗传多样性分析。初步建立了较为合适的DNA提取、RAPD-PCR反应体系，并分析了3个地区冷蒿的遗传多样性水平，为进一步研究蒙药冷蒿的药效和遗传多样性的关系以及找到药效差异的分子遗传机制奠定基础，从而为今后冷蒿栽培，品种改良提供正确的方向。
参考文献:
[1]占布拉, 陈世璜, 张昊,等. 冷蒿的特性和生态地理分布的研究[J]. 内蒙古农牧学院学报, 1999, 20(1): 1.
[2]刘越, 刘敬阁,唐丽,等, 蒙药材阿给的研究现状[J].微量元素与健康研究, 2008, 25(2): 55.
[3]奥·乌力吉, 布日额, 吴秋实. 蒙药材阿给的民族植物学研究[J].中药材, 2001, 24(6): 394.
利用微卫星分析家禽的遗传多样性 篇7
1 采取样本
1.1 取样方式
在实验中的采取样本是实验的基础, 而最常见的就是采集血样进行研究。但是采样是否含有代表性直接的影响到实验的结果。我国牲畜养殖业历史悠久, 由于每个地方性的气候类型不一样, 再加上人们的生活习惯有着明显的差异, 是我国的牲畜业也体现出来复杂, 品种多样, 特征不同的各种家禽[2]。据我国数据统计现存的牲畜品种数量大约就有576种, 其中的地方品种就有426个, 还有经过改良培育的品种有73个。在这些牲畜品种由于人们的饲养习惯的不一样, 各地区环境差异, 这些品种完全处于人们自发、粗放的养殖方式。然后就不可避免地造成种族杂交乱配、同种异名和同名异名的现象。所以面对采样就有着选择性难题, 首先就必须要选择地区代表性的牲畜品种代表以及保种效果较好的牲畜类型[3]。
1.2 选择和控制采样的数量
由于家禽的多样性, 再加上物种遗传的多样性, 分异性, 基因的不同而造成每个个体之间表现的差异, 所以采样必须要达到一定的数量以后才会包含所有的基因类型, 这样才具有实验的意义, 才能够真实地反应整个群体的遗传结构[4]。例如, 在对河南斗鸡进行试验时, 就可以反映出这个问题来, 河南斗鸡试验采样了2次, 而且都来自同一个群体, A采样数量60个, B采样数量30个, 别的条件均相符合, 在进行微卫星分析时结果就不一样。
从表1中看出, 由于采集的样本数量不同, A实验体和B实验体微卫星实验出的的基因杂含度及多态性的信息含量就不一样, 从而造成这2个群体有着明显的遗传距离的假象, 而在群体分类中就不能将它们划分到一种物种里面去, 所以一般在家禽遗传多样化的研究中应该科学的选取样本的数量来进行实验和研究, 来实现研究结果的真实性。
2 引物设计选择
根据家禽基因的图谱来进行引物设计, 由某一段的碱基因序列而设计, 所以不同的引物, 它们的染色体片段不同, 即在选择进行PCR扩增时候, 引物的选择就面对种类类型和个数数量的问题。引物的种类的区分可以根据引物所扩增出的基因片段及不同的染色体, 根据基因的区别来选择丰富多态性的引物, 其体现着群体的变异程度, 多样性, 类型差异等可以最大程度地体现所检测群体中比较高的杂合度及多态信息含量。相反, 如果选择的引物多态性差, 所检测引物的杂合度、多态信息含量就低[5]。
在利用微卫星进行实际的实验研究中表明, 标本的数量对于研究家禽品种的遗传多样性、杂合度及品种间的遗传距离等对实验结果的准确性、精密性有着非常重要的影响。在利用微卫星资料来进行的计算机模拟中证明, 标记的数目甚至比所研究物种的数量还重要。在实验中引物的个数越多, 其包含的基因数量就越多, 从而就可以明显体现出品种遗传的多样性特征。
3 数据分析
通过微卫星实验得出的数据, 能体现家禽遗传的多样性, 而如何进行数据的分析, 一般凝胶条带分析是最为常见的一种统计方法。其不一样的条带就反映出不一样的基因类型, 从而得出的基因频率是进行遗传参数计算的基础。由于DNA的不纯就会使凝胶上存在着很多的杂带。杂带一旦出现, 使用微卫星所检测的基因丰富, 给目的带和判断带来挑战, 微卫星的共显性是不管是显性或是隐形都会在凝胶上表现出来, 影响了结果的判定。
4 统计软件不统一
近些年, 随着科技和信息技术的发展, 生物实验依赖科技的成果来进行分析使得实验的结论更具有权威和准确性。所以, 很多生物学研究的软件也应运而生。同时, 有些已经被运用到生物试验中去, 微卫星为家禽遗产多样性研究中体现着重要的意义。但不同的生物学软件计算出来的数据可能就会有所不同, 得到的遗传参数也就不一致。所以, 在运用微卫星来分析家禽遗产多样性的研究中, 掌握好微卫星的复杂性和特性以便更好地位生物实验服务。
5 结语
在近几年微卫星研究的分析, 通过微卫星对家禽种类遗传的多样性时, 在实验过程中影响数据计算的结果的因素很多, 外部环境也很受制约。所以如果要保证实验结果的准确性、精密性及有效性, 就要尽量的去保证样本的选择及数量要有地区的代表性, 保种工作做的比较好的实验群体。再有就是引物的选取要分散在不同的染色体中, 其所包括着不同的基因片段而有着不同, 引物个数的选取更为重要, 所以对引物个数的控制也很必要。在保证实验条件充分的情况下, 科学的运用生物学软件进行统计分析而得出的实验数据, 如果能够保证以上几种条件, 利用微卫星分析家禽品种的遗传多样性就会更有可信度和说服力。如何更好地让微卫星技术为家禽的遗传学研究做出更大的贡献, 去研究和发现微卫星更多的使用价值, 值得大家为之努力。
摘要：当前, 微卫星技术研究为我国的家禽饲养方面提供了科学保障, 在研究家禽分子生物学的领域得到社会各界的关注, 也是微卫星为家禽分子生物学领域的热点。为了研究分析广东地区饲养家禽的品种分类的进化、种群遗传的多样性, 利用微卫星来进行分析, 能够有效进行基因鉴定和系谱分析, 并评估鸡群之间的遗传距离。微卫星通过卫星标记, 计算每个等位基因的频率, 然后再以等位基因的频率为基础来研究鸡群品种内的遗传变异及家禽品种间的遗传距离。
关键词：微卫星,家禽,分子生物学,遗传多样性
参考文献
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[2]屠云洁, 陈宽维, 沈见成, 等.利用微卫星标记分析四川8个地方鸡品种遗传多样性[J].遗传, 2005 (5) :724-728.
[3]关佳佳.浦东鸡微卫星DNA遗传多态性及其与部分生产性能的关联分析[D].扬州:扬州大学, 2010.
[4]曾盛诚.利用20个微卫星标记分析国内外11个鸡群体的遗传多样性[D].北京:中国农业科学院, 2009.
遗传多样性分析 篇8
家系选育是一种常用的选择策略
微卫星分子标记具有多态性丰富、分布广、共显性、符合孟德尔遗传、易检测等特点,可用于水产动物种质鉴定和遗传结构分析
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验样品来自于2012年3月和6月构建的合浦珠母贝第三和第四批家系。家系构建的方式为完全双列杂交,每个家系用1雌1雄进行交配。第三批家系的亲本来自海南三亚(S3)、广东大亚湾(D3)和越南(Y3),第四批家系的亲本来自广东大亚湾(D4)、广西北海(B4)和广东雷州(L4)。2013年8月随机选取第三批选育家系中的Y3Y31、D3D313和S3S326以及第四批选育家系中的L4B46、L4B47、L4B48、B4D426、B4D427、D4B445等共9个家系(编码中第一个字母为雌性,第二个字母为雄性,下标数字代表家系批次,数字代表家系编号),每个家系随机选取40个个体,剪取闭壳肌组织,置于95%乙醇中保存。
用动物基因组DNA小量提取试剂盒(普博欣)提取样品DNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000检测DNA的完整性和浓度。DNA质量浓度调至50 ng·μL-1。
选取6对自行开发的具有多态性位点的微卫星引物用于家系的遗传多样性分析
表1 微卫星引物序列及扩增情况Tab.1 Sequence and amplification of microsatellite loci
1.2 PCR扩增及电泳检测
PCR反应体系为20μL:10×PCR buffer(Mg2+free)2μL,Mg2+(25 mmol·L-1)1.6μL,d NTP(10mmol·L-1)1.6μL,正、反向引物(10μmol·L-1)各0.8μL,r Taq酶(Ta KaRa)0.2μL,基因组DNA0.8μL,dd H2O 12.2μL。PCR扩增程序为94℃预变性5 min后30个循环:94℃变性30 s,退火温度30 s,72℃延伸30 s;最后72℃延伸7 min。PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行检测,银染,扫描后保存图像,用于基因型分析。
1.3 数据分析
根据聚丙烯酰胺凝胶图谱上扩增条带的位置判读个体的基因型。用Popgen 1.31
2 结果
2.1 微卫星位点遗传多样性分析
各个位点的遗传多样性参数见表2。6个微卫星位点在9个家系中共检测到32个等位基因,各位点的Na为3~8个,平均Na为5个;Ne为1.758 7~3.586 5,平均Ne为2.662 3。Ho为0.144 4~0.488 9,He为0.432 0~0.722 2,I为0.691 9~1.507 4,其中scd3.1-3的I最大。
使用MEGA软件UPGMA法对合浦珠母贝9个家系进行聚类分析,结果显示9个家系共分为3支,其中L4B48单独成一支,B4D426和B4D427聚集在一起,再与D4B445聚成一支,其余家系聚成一支(图1)。
表2 6个微卫星位点在9个合浦珠母贝家系的多样性指数Tab.2 Genetic diversity index analysis of six microsatellite loci in nine P.fucata families
图1 合浦珠母贝9个家系亲缘关系UPGMA聚类图Fig.1 UPGMA dendrogram of nine families of P.fucata
2.2 家系间遗传多样性分析
各个家系的遗传信息见表3。每个家系都有单态,共有单态16个(占29.63%),其中家系Y3Y31的单态位点最多(4个),其次为家系S3S326(3个)。9个家系的平均Ho为0.129 2~0.466 7,平均He为0.155 0~0.439 6,平均I为0.248 5~0.712 2。Hardy-Weinberg平衡检验(卡方检验)结果表明,在检测得到的54个数据结果中,有19个(占35.19%)极显著地偏离了Hardy-Weinberg遗传平衡。
2.3 遗传距离及聚类分析
9个家系之间的遗传距离和遗传相似系数见表4。各家系之间的遗传距离为0.109 0~1.137 2,遗传相似性系数为0.320 7~0.896 8。家系L4B46与L4B48的遗传距离最大(1.137 2),遗传相似性系数最低(0.320 7);家系D3D313与L4B46的遗传距离最小(0.109 0),遗传相似性系数最高(0.896 8)。
表3 9个合浦珠母贝家系的遗传多样性分析Tab.3 Genetic diversity of nine families of P.fucata
注:Na.等位基因数;Ne.有效等位基因数;Ho.观测杂合度;He.期望杂合度;I.Shannon多样性指数;P.Hardy-Weinberg平衡的卡方检验;*.P<0.05/6=0.008 3;**.P<0.01/6=0.001 7Note:Na.allele number;Ne.effective allele;Ho.observed heterozygosity;He.expected heterozygosity;I.Shannon diversity index;P.HardyWeinberg equilibrium test
表4 9个家系间的遗传相似系数(上三角)和遗传距离(下三角)Tab.4 Genetic identity(above diagonal)and genetic distances(below diagonal)of nine families of P.fucata
3 讨论
遗传多样性是评价种质资源状况的重要指标。对合浦珠母贝进行遗传选育必须首先了解其遗传多样性。迄今为止,合浦珠母贝野生群体和养殖群体的遗传多样性都有研究报道,而且所采用的分子标记有微卫星、AFLP、RAPD、ISSR和SRAP等
杂合度是衡量群体遗传变异大小的指标,杂合度值越大,群体的遗传变异就越大,遗传多样性就越高,群体的稳定性也就越大。I越大,群体的离散性越高,即多样性越丰富。汤健等
在一个随机交配的、足够大的群体中,等位基因频率和基因型频率在不同世代保持不变,即处于Hardy-Weinberg平衡。在该研究中检测到有19个位点(占35.19%)极显著地偏离了Hardy-Weinberg平衡,说明在合浦珠母贝家系中的基因型频率发生了改变。在其他贝类中也存在类似现象
遗传多样性分析 篇9
木耳Auricularia aruicula-judae (Bull.) Quél.[1]在我国已有1 400多年的栽培历史, 是世界上最早栽培的一种食用菌。木耳质地滑嫩、清脆可口、营养丰富, 且具有很多药用价值。黑龙江省由于气温低、昼夜温差大等独特的气候特点使生产的木耳色黑肉厚、品质好[2]。作为木耳主产区, 黑龙江省木耳产量居全国首位。
随着黑龙江省木耳产业的发展, 栽培量的增加, 对于木耳菌种的需求越来越大。但是, 目前木耳品种市场管理混乱, 由于菌种生产者之间相互频繁引种, 并擅自命名销售, 导致木耳菌种市场普遍存在“同物异名、同名异物”现象, 给菌种质量管理和使用及新品种的审定、知识产权保护带来了很大的困难[3]。
为了保护优良的木耳种质资源, 需要对木耳品种进行鉴定和保藏。马庆芳等以子实体农艺特征及出耳时间长短为依据, 对27株东北木耳品种进行了分类鉴定[4]。但是, 由于木耳子实体形态结构简单, 生产过程中受到气候条件、栽培模式、管理方法等条件影响, 相同品种的子实体的产量、形态、色泽、厚度等特征存在较大差异, 且子实体形态描述没有统一标准, 部分性状的鉴定易受人为因素影响[3]。
随着分子生物技术的发展, 很多分子标记方法被运用到木耳品种的遗传分析中。赵丽等[5]利用RAPD分子标记技术研究了40个木耳菌株的亲缘关系。但是RAPD标记的重复性较差, 而ISSR分子标记克服了RAPD的不足。李辉平等[6]也利用ISSR技术研究了21株木耳菌株的遗传多样性。刘华晶等[7]利用ISSR分子标记研究了黑龙江省33个野生木耳菌株和8个栽培菌株的遗传多样性。
黑龙江省从2008年开始实施木耳品种的审定, 受省种子局委托, 笔者所在团队承担了审定品种的区别性鉴定工作, 以黑龙江省近年申报省级审定的木耳品种为试验材料, 采用IS-SR分子标记进一步研究黑龙江省木耳主栽品种的遗传多样性, 客观评价黑龙江省木耳主栽品种种质资源, 为木耳新品种审定提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
黑龙江省木耳主栽品种 (见表1) , 保藏于黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏中心。
1.2 ISSR分析
1.2.1 DNA提取
接种到PD培养基中, 25℃摇瓶培养7d, 收集菌丝体, 采用试剂盒 (DP305-03, 天根生化) 提取菌丝总DNA。琼脂糖 (1.0%) 凝胶电泳检测, 紫外分光光度计 (UV757, 上海精科) 检测总DNA浓度, 样品-20℃保存备用。
1.2.2 PCR扩增
选用笔者研究室在木耳遗传多样性研究中应用较好的ISSR引物 (表2) 进行PCR扩增, 引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。反应体系:10μL 2×Taq Master Mix (含染料, 创奇) , 1μL模板DNA (50 ng/μL) , dd H2O补至20μL。
反应程序:参照张介驰等[9]方法, 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
筛选出多态性高、重复性好的引物重复扩增3次, 用于数据分析。
1.2.3 数据分析
ISSR扩增产物的电泳结果比对分析, 无条带记为“0”, 有条带记为“1”, 构建0/1初始数据矩阵。用POPGENE计算每个位点的观察等位基因数 (Na) 、有效等位基因数 (Ne) 、Shannon's信息指数 (I) 和Nei's基因多样性 (h) 。用NTsys_2.02软件计算样品之间的遗传相似系数, 用UPGMA法进行遗传相似性聚类。用NTsys_2.02进行主坐标分析, 构建主坐标图。
2 结果与分析
2.1 DNA提取结果
琼脂糖凝胶电泳检测木耳品种总DNA, M为DL10, 000DNA Marker, 如图1所示, 提取的总DNA电泳条带清晰, 浓度较大。用TE缓冲液将样品稀释50倍, 紫外分光光度法检测总DNA质量, 测定A260值和A280值。A280/A260约为1.85, 因此, 提取到的总DNA可用于后续试验操作。
2.2 ISSR-PCR结果
选用10条ISSR引物进行PCR试验, 结果引物1、引物4、引物6、引物7和引物9扩增多态性较好, 扩增出的条带稳定型性好、重复性好。扩增产物片段在300~4 000bp之间。5条引物共产生28种条带, 其中21种具有多态性, 多态性比例为75%。引物9扩增产物电泳结果如图2所示, M为DL10 000DNA Marker。
用POPGENE计算得到平均每个位点的观察等位基因数 (Na) 为1.7143 (STDEV=0.4600) 、平均每个位点的有效等位基因数 (Ne) 为1.5641 (STDEV=0.4083) 、Nei's平均基因多样性 (h) 为0.3084 (STDEV=0.2099) 、Shannon's信息指数 (I) 为0.4433 (STDEV=0.2950) 。
用NTsys_2.02软件对27株木耳品种进行UPGMA聚类分析, 如图3所示。27株木耳品种的遗传差异较大, 遗传相似系数在0.63~0.97之间。在相似系数为0.72处将供试样本分为5大类群。因此, 27株木耳菌株同源关系较远, 具有丰富的遗传多样性。
用NTsys_2.02进行主坐标分析, 构建主坐标图, 如图4所示。主成分分析中, 牡耳一号、兴安1号、新世纪3号、雪梅1号、林科3号、S2、延丰1号、大里1号聚为一起, 这与UPGMA聚类结果一致。UPGMA聚类中农06、宏大2009、黑莲和9202聚为Ⅰ类, 但是在主成分分析中黑莲与其他品种距离较远;主成分分析中, 绥化2号、龙斌、林科6号、DH1和兴安2号聚为一起, 这与UPGMA聚类结果一致, 但是兴安2号与其他4个品种距离较远;主成分分析中, 特产2号、黑29、兴安4号、DH2、黑威15号、981、兴安3号、绿丰007、黑威10号和牡耳-08-19聚为一起, 这与UPGMA聚类结果一致, 但是黑威15号和绿丰007与其他品种距离较远;
主成分分析中, 可将木耳品种分为四大类群, UPGMA聚类中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类结果与主成分分析结果基本一致, 但是Ⅳ和Ⅴ在主成分分析中中较分散。
3 讨论
木耳在我国分布广泛, 目前只有青海、内蒙古、宁夏未有野生分布的记载[8], 我国木耳主栽品种几乎完全来自野生样本的分离驯化。东北地区由于其独特的气候特点, 适宜木耳栽培种植, 是木耳主产区, 其中以黑龙江省木耳产量最高。
随着木耳产业发展壮大, 菌种的使用量也逐年增加。市场上木耳品种繁多, 鱼龙混杂, 致使栽培者选种困难, 菌种的使用不当也会给生产带来巨大损失。因此, 亟需制订法律法规对木耳栽培品种进行规范, 这就需要一种实用的鉴定木耳栽培品种的方法。
传统的以子实体形态特征、农艺性状为依据的木耳品种鉴别方法, 易受栽培生理状况、环境因素影响, 周期长。而IS-SR分子标记技术, 可以利用菌丝体直接从DNA水平检测基因组DNA多态性, 受环境条件的影响小, 快速, 重复性好, 可有效鉴定不同木耳栽培品种[9]。
此研究是在笔者研究室前期研究工作基础上选择的ISSR引物, 研究黑龙江省审定的木耳栽培品种的遗传多样性。赵梦然等[10]利用SCo T研究中国新疆野生白灵菇 (Pleurotus eryngii var.tuoliensis) 的基因多样性指数为0.261。一般显性分子标记在某一位点上的理论等位基因数最多为2, 因此Nei’s基因多样性指数的最大值为0.5[10]。本研究结果显示Nei's平均基因多样性 (h) 为0.3084, 表明黑龙江省木耳栽培品种的遗传多样性水平较高。
近年来采用主坐标分析方法来处理分子标记获得的数据, 研究种质的亲缘关系。本研究采用主坐标分析和聚类分析两种方法, 研究黑龙江地区木耳主产品种的遗传多样性, 都能将供试样本区分开, 结果基本相当, 但是存在差异。因此, 在研究亲缘关系时, 需要综合使用两种方法, 相互验证, 相互补充, 使研究结果更加准确可靠。
参考文献
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遗传多样性分析 篇10
关键词：罗布羊,遗传多样性,系统进化,mtDNA D-Loop,微卫星DNA
新疆罗布羊是生存在塔里木盆地中心的罗布泊地区,极适宜荒漠草场、极端干旱气候、耐粗饲、强抗逆的独特地方羊种。罗布羊因世代生活在塔克拉玛干沙漠深处依罗布泊而居的土著民族“罗布人”而得名,2009年被批准列入国家畜禽遗传资源名录。现主要分布在新疆南部尉犁县沿塔里木河下行直到若羌县境内,包括尉犁县的塔里木乡、墩阔坦乡、兴平乡、古勒巴格乡及若羌县的吾塔木乡等地,存栏数2余万只。
罗布羊被毛白色,有少数羊脸颊、嘴巴和耳朵甚至整个脸部为黑色。其头较小,鼻梁拱起,两眼突出,耳大下垂,脂尾。一般公羊有螺旋形大角,个别母羊有小角。成年公羊体重50.36 kg,母羊47.20kg,性成熟年龄12~18月龄,产羔率约120%。表现多胎的性状,肉膻味小、鲜嫩[1]。
罗布羊是在我国西部极端生态环境形成的珍贵地方品种,目前对其遗传资源的评价仅有表型性状的初步研究结果[1,2]。王慧华等利用X染色体上20 334个单核苷酸标记(SNP)对10个中国绵羊群体遗传关系进行了分析,认为罗布羊与多浪羊、哈萨克羊遗传关系较近聚成一类[3],2016年袁泽湖等利用Illumina ovine SNP 50k芯片数据分析了中国11个地方绵羊品种的遗传结构,发现罗布羊与乌珠穆沁羊有间接的遗传关系,与哈萨克系绵羊有较近的遗传关系[1]。但有关新疆罗布羊的群体遗传多样性及形成历史没有相关研究报道。
本研究选择新疆尉犁县罗布羊和新疆南部地方羊种:卡拉库尔羊、多浪羊、策勒黑羊、和田羊及巴音布鲁克羊,利用经典的绵羊微卫星标记和mt DNA D-loop序列研究罗布羊群体遗传多样性及种间系统发育关系,一方面为揭示罗布羊的品种起源与形成及品种的保护利用提供依据,另一方面罗布羊微卫星位点的研究与开发为罗布羊种质特性研究提供基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
采集新疆尉犁县罗布羊种羊场种羊120只(公羊9头,母羊111头)全血样本,用于分析罗布羊群体遗传多样性,及采集阿克苏地区的卡拉库尔羊(Karakul)、喀什麦盖提县的多浪羊(Dolang)、和田策勒县的策勒黑羊(Cele)、和田于阗县的和田羊(Hotan)和库尔勒地区222团的巴音布鲁克羊(Binbuluk)公母各3只全血样本用于克隆测序,分析罗布羊与新疆地方羊种间遗传关系。采样分布见图1。
1.1.2 试剂
全血DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;2×EasytaqPCR Super Mix购自法国Trans Gen公司;p MD19-T载体、DH5α菌株感受态、DNA纯化试剂盒与DNA连接试剂盒购自日本Takara公司;胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉与氨苄青霉素购自德国Sigma公司。
1.1.3 仪器设备
梯度PCR仪TC-5000(TECHNE公司,英国);电泳仪JY-ECPT3000(北京君意东方电泳设备有限公司);凝胶成像系统Gel Doc XR+(伯乐BIO-RAD公司,美国);核酸测定仪3730xl(ABI公司,美国);超净工作台SW-CT-2F(上海博讯实业有限公司);微量移液枪4910(Eppendorf公司,德国);电热恒温水浴锅HH-S(江苏金坛市医疗机械厂);台式高速冷冻离心机Sigma30(Sigma公司,德国);电子分析天平FA2004(上海精密科学仪器公司)。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA制备
每个样本取0.5 m L全血按试剂盒说明提取基因组DNA,提取结果通过琼脂糖凝胶和核酸测定仪检测。
1.2.2 罗布羊遗传多样性分析
选取了位于绵羊6号染色体上的OARHH35、OARJMP8、BMS648、BM143和AE101,26号染色体上的BM6526,25号染色体上的BMS1714,共7个多态性较丰富微卫星位点,其Uni STS ID分别为279513、25407、279531、9461、28213、81341和251381。PCR扩增引物及条件见表1。120只罗布羊基因组DNA 7对微卫星的PCR产物用3730xl基因分析仪毛细管电泳检测基因分型。
1.2.3 mt DNA D-loop克隆与测序
根据Gen Bank羊科动物mt DNA全长序列(登录号:AF010406.1),利用Primers5.0设计罗布羊D-loop全序列引物,扩增片段大小为1 326 bp。引物及扩增条件如下:
上游引物为:5'-TCATCTAGGCATTTTCAGTG-3',下游引物为:5'-CTCACCATCAAC-CCCCAAAGC-3';扩增条件:94℃5 min,(94℃30 s,50℃30 s,72℃60 s)×35,72℃10 min。
卡拉库尔羊(Karakul)、多浪羊(Dolang)、策勒黑羊(Cele)、和田羊(Hotan)和巴音布鲁克羊(Binbuluk)和罗布羊(Lopnur),共150个DNA样本的PCR产物利用DNA纯化回收试剂盒纯化后,连接到p MD19-T Easy载体,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株,PCR鉴定后,阳性克隆菌株送到上海生工测序。
1.3 统计分析
1.3.1 遗传参数的计算
微卫星标记的基因型频率和等位基因频率及等位基因数(N)可根据电泳结果统计得到。利用GE-NEPOP 1.2软件进行统计分析,计算罗布羊群体微卫星位点的平均等位基因数(K)、观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)、多态信息含量(polymorphism information content,PIC)。
1.3.2 系统进化分析
采用MEGA6.06软件分析卡拉库尔羊、多浪羊、策勒黑羊、和田羊、巴音布鲁克羊、罗布羊,另从Gen Bank数据库中获得绵羊的线粒体DNA D-loop区全序列(见表1,藏羊、蒙古羊和哈萨克羊为我国绵羊的三个母系[2]),构建Neighbor-Joining Tree,对罗布羊的系统发育进行分析。
Network 4.1.1.2软件(来自http://www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm网站)用于分析罗布羊单倍型群体网络关系。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA提取
利用全血DNA提取试剂盒提取罗布羊120头和卡拉库尔羊、多浪羊、策勒黑羊、和田羊、巴音布鲁克羊各6头基因组DNA,经凝胶电泳检测结果符合SSR检测要求(图2)。
2.2 7个SSR标记的基因分型
将120只罗布羊基因组DNA 7对微卫星的PCR产物用3730xl基因分析仪毛细管电泳检测基因分型。(图3)。
2.3 mt DNA D-loop克隆与测序
以卡拉库尔羊、多浪羊、策勒黑羊、和田羊、巴音布鲁克羊和罗布羊基因组DNA为模板,用羊D-loop全序列引物,PCR扩增获得1 326 bp的目的片段。(图4)。经克隆测序,获得6个品种羊的D-loop全序列150个。
注:M为DL2000 DNA marker;1~24为基因组PCR产物。Note:M:DL2000 DNA marker;1-24 for products of genome DNA.
注:M为DL2000 DNA marker;1~24为基因组PCR产物。Note:M:DL2000 DNA marker;1-24 for PCR products of mt DNA D-loop.
2.4 罗布羊遗传多样性分析
罗布羊群体遗传多样性丰富,其平均等位基因数(K)、观察杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、多态信息含量(PIC)分别为8.86、0.711、0.791和0.769。7个微卫星位点,除了BM143,其它位点的HO与HE值均很相近。其中位点OARHH35与BM6526的杂合度与PIC值较高(表3)。
在120头罗布羊中发现BM143位点有9个等位基因,其中7个基因位点均呈纯合子状态,其比例达到55.70%。其HO值与HE值相差0.403,HW检测呈显著差异,这一结果说明该位点检测罗布羊遗传多样性存在HW不平衡,不适合作为罗布羊群体遗传特性进行检测位点。
2.5 罗布羊等新疆南部绵羊mt DNA D-loop序列及遗传距离分析
通过克隆测序和PCR结果测序获得罗布羊120头、和田羊等其它5个新疆南部地方羊种D-loop环序列,完整序列长为1 181 bp或1 182 bp。120个罗布羊D-loop环序列比对,发现共有208个核苷酸突变位点,共69个单倍型,利用NETWORK软件分析其群体网络关系,发现群体形成A、B、C 3个进化支系,支系间分布清晰,见图5。利用MEGA6.06软件,分析罗布羊3个分支的代表单倍型,和田羊、卡拉库尔羊、巴音布鲁克羊、策勒黑羊、多浪羊和Gen Bank上公布的塔什库尔干羊、巴什拜羊、叶城羊、蒙古羊、哈萨克羊和藏羊,三个野羊:羱羊、摩佛伦羊、盘羊,亚洲型A型和欧洲型B型共17个群体间的遗传距离。发现17个群体间的遗传距离在0.154~0.003之间。中国绵羊的三大母系:藏羊、哈萨克羊和蒙古羊间的遗传距离在0.003~0.005之间;三大母系与新疆地区和田羊、卡拉库尔羊、策勒黑羊、卡拉库尔羊、塔什库尔干羊、巴什拜羊和叶城羊的遗传关系较近(0.003~0.009)。罗布羊的A支系与三大母系及新疆地方羊种的遗传关系较B、C支系近(0.012~0.016);B支系与欧洲型B型和多浪羊关系较近(0.012~0.015),较盘羊、羱羊和三个支系中B支系与摩佛伦羊(O.musmon)的关系较近;C支系则与其它18个单倍型距离均较远。3个支系间的距离较远,见图6。
2.6 17个绵羊种系统进化分析
MEGA6.06聚类分析利用选择丁Kimura双参数模型,忽略插入、缺失位点,自举检验1 000次,函数为伽马分布,构建了17个绵羊种N-J聚类图(图7)。结果发现,两个野羊种摩佛伦羊(O.musmon)与盘羊(O.vignei)聚为一支,然后与新疆地方羊种、三个母系品种聚在一起。罗布羊的B进化支与欧洲B型和多浪羊汇成一支。罗布羊C进化支先与巴音布鲁克羊聚为一支,然后和A进化支聚成一类,再与新疆其它地方羊种及蒙古羊、藏羊及亚洲型A型聚在一起。从聚类关系,两个野羊种摩佛伦羊(O.musmon)与盘羊(O.vignei)对新疆地方羊品种有贡献。
3 讨论
这是首次对罗布羊遗传多样性研究的试验。绵羊SSR标记的研究一方面可以较准确地评价绵羊群体遗传多样性,另一方面可以开发绵羊生产性状辅助选择的有力工具。从罗布羊7个SSR标记的平均多态信息含量结果,认为尽管罗布羊的生活生存的地域环境相对封闭,其遗传多样性丰富。但低于张烨华等检测的策勒黑羊、多浪羊、巴音布鲁克羊、巴什拜羊、阿勒泰羊的遗传多样性(PIC≥0.8350)[5]。这可能与当地传统放牧管理、自然交配方式、种群长期闭锁繁育有关。由此也可以确定:罗布羊群体遗传结构相对稳定,并且受自然和人工选择压力较小,这有利于罗布羊今后的选种育种工作,事实上罗布羊已被发现有遗传稳定的多胎和抗干旱类群,这是罗布羊多胎系或抗干旱系选育的良好基础。
罗布羊SSR分析发现位点BM143位点存在罗布羊群体HW不平衡现象。BM143是位于绵羊第6号染色体上与多胎基因(Fec B)紧密连锁的一个位点,与湖羊的产羔性状有极显著的相关性[6],该基因位点在罗布羊群体中有9个等位基因,纯合子数占55.73%,但整个群体在该位点上等位基因频率存在显著的HW不平衡。群体HW不平衡有多种因素造成,对于该位点在罗布羊群体的等位基因数初步判断(在滩羊中有6.1210个等位基因),很有可能由于该位点的突变,使突变位点基因频率较小[7,8]。因此该位点不宜作为罗布羊生产性能等标记辅助选择位点。
罗布羊的系统进化分析结果显示,罗布羊的一个B支系较为古老,与新疆多浪羊与欧洲型B型关系较近,受新疆其它地方羊种的影响较小,该结果与王慧华利用N-J树分析中国绵羊群体遗传结构的结果相同[3],而C支系与巴音布鲁克羊的进化关系结果与袁泽湖等对中国地方绵羊遗传关系的分析结果相近[4]。A支系则与新疆塔克拉玛干沙漠南缘的地方羊种间关系相对较近。
从古至今家绵羊一直是新疆居民的主要生活资料之一。而绵羊的进化与当地居民的生活方式、文化及社会历史变迁有着不可分割的关系。因此罗布羊的起源进化与罗布人有着密切的关系。从文献资料分析,罗布人的生活习俗完全不同于维吾尔族,是罗布泊地区古老的土著民族,也是楼兰王国中主要居民之一。拥有自己的语言,主要以捕鱼为生,不食粮食不牧家畜。18世纪中叶后由于罗布泊逐渐干涸,迫使罗布人一部分由阿不旦庄南迁至现在的若羌县米兰地区;另一部分向北迁至尉犁县的喀尔曲克村,逐渐与当地维吾尔民族的生活融合在一起,开始了放牧生活[9,10]。多浪羊是在1919年,麦盖提县宗教人士艾克热汗吐逊从阿富汗引进与当地土种羊杂交形成的一个绵羊地方品种[11,12]。由此推断罗布羊品种形成早于多浪羊,与上述文献资料基本可以相互印证。从罗布羊、多浪羊、欧洲型B与巴音布鲁克羊的聚类进化关系,多浪羊主要分布在喀什地区,巴音布鲁克羊是13世纪时,蒙古民族西征欧洲带到巴音布鲁克地区的欧俄羊种[13,14],从地域上库尔勒地区尉犁县靠近蒙古地区,而喀什地区是古丝绸之路重要的枢纽,由此可以初步推测最早的罗布羊应来自绵羊发源地中东,经蒙古高原到达新疆的较古老地方羊种[15]。相比之下新疆其它地方品种形成时间相对较晚。由于交通与经济往来逐渐频繁,罗布最终与新疆其它羊种相互杂合,形成一个新的进化支系A。
野羊种摩佛伦羊(O.musmon)与新疆地方羊品种间的进化关系与Glazko V I等国内外学者对家绵羊起源研究的结果一致[8,[16,17,18,19]]。
对于罗布羊的起源还需要通过对分布在若羌地区的罗布羊遗传信息进一步分析研究加以证明。
4 结论
遗传多样性分析 篇11
关键词：蛇莓；克隆生长；遗传多样性；简单重复序列；基因型多样性；遗传分化
中图分类号： Q945.79文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0215-06
收稿日期：2015-01-16
基金项目：国家自然科学基金（编号：31200314、31470475）；高等学校博士学科点专项科研基金新教师类资助（编号：20120014120001）。
作者简介：刘春香（1990—），女，湖南邵阳人，硕士研究生，主要从事克隆植物生态学研究。E-mail：chunxiangliu_1990@163.com。
通信作者：罗芳丽，女，四川都江堰人，博士，副教授，主要从事湿地生态学研究。E-mail：ecoluofangli@bjfu.edu.cn。遗传结构、遗传多样性和生活史特征等影响物种与其所在环境间的相互作用，也决定物种的进化潜势[1]。繁育系统是决定植物种群遗传结构的重要因素之一，而克隆植物一般兼具有性和无性2种繁殖方式，且这2种繁殖策略在一定程度上有权衡作用[2-3]。因此，研究克隆植物的遗传结构对深入了解植物种群遗传多样性的形成及进化机制具有重要意义[4-5]。
克隆生长是克隆植物所特有的生活史过程[6]。很多克隆植物通过形成根状茎、匍匐茎、鳞茎、珠芽、块茎等，能够迅速产生大量的无性后代个体即分株[7]。除少数分株可能存在概率极低的遗传突变以外，绝大多数分株的遗传组成与亲体分株（母株）完全相同[8]。由于母株可通过克隆整合向后代分株提供光合产物、水分和养分的支持[9-12]，使得这些后代分株能够顺利地度过建立期，并迅速占据局部空间，进而可能形成由1个或几个基因型占优势的分株种群[13-15]。这些生态过程对克隆植物种群遗传结构和遗传多样性均可产生十分显著的影响[16]。
在自然界中，大多数克隆植物除了通过克隆生长进行无性繁殖之外，还能够通过产生种子等进行有性繁殖[8]。在1个或几个基因型占优势的分株种群中，由于相同基因型分株的大量存在，使得相同基因型个体自交的概率极高，从而影响其遗传多样性水平[8-16]。由于克隆植物的这些特性，人们最初普遍认为克隆植物种群的遗传多样性水平很低，遗传结构简单[17]。有研究表明，一些克隆植物的遗传多样性的确很低[17-18]。例如，在全球范围内，凤眼莲（Eichhornia crassipes）在非原产地的个体中约80%属于同一个基因型[14，19-21]。中国南方地区的空心莲子草（Alternanthera philoxeroides）很可能只存在1个基因型[22]。然而，很多克隆物种具有与非克隆植物相当的遗传多样性如甜樱桃（Prunus avium）、红球姜（Zingiber zerumbet）、大苦草（Vallisneria americana）和羊柴（Hedysarum laeve）等[23-27]。這是因为与非克隆植物相比，克隆植物生命周期长，所以即使非常少量的实生苗（即种子萌发所产生的幼苗）更新也能使克隆种群维持较高的遗传多样性[28]。蛇莓（Duchesnea indica Focke）为蔷薇科（Rosaceae）蛇莓属的多年生草本植物，主要分布在我国辽宁以南各省（市、区），常生长在山坡、河岸、草地及潮湿的地方[29]。该物种通过产生较长的地上匍匐茎表现出旺盛的克隆生长习性。该物种也可通过有性生殖产生种子，并进一步萌发形成实生苗。蛇莓是一种典型的游击型克隆植物，能够快速形成单一基因型的大种群。该物种还具有较强的花展示，即能通过产生花蜜来吸引传粉者，以增强有性繁殖[30]。近年来，对蛇莓的研究主要集中在化学活性成分、药理，克隆构型对环境的可塑性反应和小尺度克隆结构等方面[31-33]。本研究采用简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）分子标记技术对全国范围内的33个蛇莓野生种群的353株个体的遗传多样性水平和遗传结构进行分析，旨在了解兼性克隆植物蛇莓的种群遗传多样性与遗传分化，探讨其遗传结构的特点，具体回答以下科学问题：克隆植物蛇莓种群的遗传多样性水平；蛇莓种群的遗传多样性主要发生在种群内还是种群间；蛇莓种群间遗传距离与其地理距离的相关关系。
1材料与方法
1.1植物采集
33个蛇莓野生种群分别采自广西、浙江、江西、湖南、贵州、河南、北京和陕西等10个省（市、区），具体信息见表1和图1。每个种群根据面积大小各采集5～17个样本，共353个，采集的植株在北京林业大学科技股份有限公司的温室中进行培养备用。
1.2DNA提取和PCR扩增
根据CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒（艾德莱生物，DN1401，北京）的说明方法提取幼嫩蛇莓叶片中的总DNA，采用NAS-99分光光度计（ACTGene，美国）确定总DNA的质量和浓度，并稀释至10 ng/μL备用。
蛇莓SSR引物的开发由北京阅微基因技术有限公司完成，从中筛选出8对清晰多态引物用于所有个体的PCR扩增，引物序列见表2。PCR反应体系为：8 μL 2.5 × Multiplex Buffer（MRP17，北京阅微基因技术有限公司，北京），0.4 μL 15 μmol/L TP-M13荧光接头（北京阅微基因技术有限公司），2 μL引物（5 μmol/L），0.2 μL 5 U/μL Fast Taq DNA聚合酶，2 μL DNA模板，7.6 μL无菌双蒸水。PCR扩增程序为：95 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；94 ℃变性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸 45 s，10个循环；72 ℃延伸12 min。PCR扩增在9 600 PCR扩增仪（美国应用生物系统公司）上完成，PCR扩增产物在3 730 xl DNA分析仪（美国应用生物系统公司）上进行基因分型分析。
1.3数据分析
人工判读PCR扩增产物的基因分型结果，记录目的条带的片段大小以构成SSR分子标记数据矩阵。使用Popgen 32软件[34]计算以下遗传多样性指数：每个位点的平均等位基因数（A）、预期杂合度（He）、Neis基因多样性指数（h）及Neis遗传一致度和遗传距离。计算实际基因型（即基株或克隆，所有位点基因型相同的植株为1个基株）总数（G）、平均克隆大小（N/G，基因型数/取样个体数）、局部基因型（只存在于1个群体中的基因型）比例（GL）、广布基因型（存在于75%以上群体中的基因型）比例（GW）。种群遗传多样性指数采用Simpson指数（D），其计算公式为：D=1-∑{[ni（ni-1）]/[N（N-1）]}。种群遗传均匀性指数采用Fager指数（E）来表示，计算公式为E=（D-Dmin）/（Dmax-Dmin），其中Dmin =（G-1）（2 N-G）/N（N-1），Dmax=（G-1）N/G（N-1）。式中N为取样个体总数，G为基因型（基株）总数，ni为第i基因型的个体数[27]。
使用GenAlEx 6.5软件[35]计算种群间遗传分化系数Fst，并进行分子方差分析（AMOVA，analysis of molecular variance analysis），计算种群内和种群间遗传方差分量。遗传方差分量和成对种群遗传分化系数的统计显著性均采用9 999次置换评价。
为了检测参试的蛇莓种群遗传结构，采用STRUCTURE[36]分析参试样本的遗传结构。将MCMC （markov chain monte carlo） 不作数迭代（length of burn-in period）设为1万次，不作数迭代后的MCMC也设为1万次，组群数（K）设定为2～33（参试种群数目），评价K值运行20次。依据每次测试过程中计算的后验概率lnP（D）值计算ΔK值，绘制ΔK曲线图。散点曲线最大值对应的K值视为最合理的组群数[37]。
使用NTSYS 2.1软件[38]对种群间Neis遗传多样性指数表2蛇莓SSR引物序列
引物序列（5′→3′）重复碱基片段大小
统计量距离进行非加权平均配组（unweighted pair group method with arithmetic-means，UPGMA）聚类分析，绘制树状聚类图。利用GenAlEx 6.5软件中的Distance计算33个蛇莓野生种群间地理距离，Mantel统计学分别检验分析种群间的地理距离和遗传距离相关性，并进行显著性检测（9 999次置换）。
2结果与分析
2.1种群遗传变异和克隆多样性
选用8对能扩增出稳定、清晰条带的SSR引物，对33个蛇莓种群353株个体进行PCR扩增，共扩增出94个等位基因，每个位点的等位基因数为7～23。蛇莓各種群的平均每个位点的等位基因数（A）为1.5～5，平均2.841；期待杂合度（He）为0.213～0.682，平均0.494；Neis基因多样性指数（h）为0.465～0.640，平均0.468（表3）。蛇莓种群平均遗传多样性较高（A=2.841，He=0.494，h=0.468），其中，北京小龙门种群（XLM）的遗传多样性最高（A=4.55，He=0.682，h=0.640），而江西九江种群（JJ）的遗传多样性最低（A=1.5，He=0.213，h=0.199，表3）。蛇莓物种水平的遗传多样性也较高（A=13.000，He=0.657，h=0.656）。
所有种群均为多克隆（基因型）种群，克隆（基因型）总数为223，各种群的基因型数为2～15，平均6.758；克隆大小为1.0～7.5，平均2.063；局部基因型比例为82.6%；广布基因型比例为0；平均基因型多样性指数Simpson指数为0.769（表3）。
2.2种群遗传结构
遗传多样性分析 篇12
近年来ISSR分子标记技术广泛用于检测植物种的基因多样性和遗传关系[5,6]。本研究采用ISSR分子标记技术比较分析了雀麦材料间和各种间的遗传亲缘关系, 首次鉴别如此多雀麦种间材料, 旨在揭示雀麦种间遗传多样性。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
雀麦材料种植于中国农业科学院草原研究所 (沙尔沁牧草资源野外科学观测试验站) , 每份材料采集10个不同植株的鲜嫩叶片, 等量混合后置于低温保存。雀麦材料来源及编号见表1。
1.1.2 试剂
2.5mol/L NaCl溶液、0.2mol/L EDTA溶液、1mol/L Tris-HCl溶液、氯仿/异氯仿 (24:1) 溶液、70%乙醇溶液、β巯基乙醇、0.5×TBE缓冲液、Taq DNA聚合酶 (TaKaRa公司) 、CTAB、琼脂粉。
1.1.3 仪器
Eppendorf 5417R低温高速离心机 (德国) ;Biometra PCR仪 (北京华粤公司) ;BG-power 3500型稳压稳流电泳仪 (北京百晶生物技术有限公司) ;伯乐BIO-RAD凝胶成像分析系统 (美国) 。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
采用CTAB法提取植物基因组总DNA, 提取过程重复一遍用于DNA纯化。利用紫外分光光度检测总DNA在260nm和280nm的OD值, 根据OD260/OD280的值判断其纯度;用0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳, 判别DNA分子的大小和一致性[7]。
1.2.2 引物筛选与PCR扩增
参照加拿大哥伦比亚大学 (UBC) 所设计的ISSR引物序列, 选取其中的62个在上海生物工程技术服务有限公司合成。选取4个材料的DNA样品混合后进行扩增筛选, 得到19条扩增重复性好、条带清晰的引物 (见表2) , 用于全部样本的扩增。PCR扩增为25μl体系:包括10～30ng DNA模板;3μl的10×buffer;4μl的MgCl2 (25mmol/L) ;1.0μl引物 (10pmol/ml) ;2μl dNTP (2.5mmol/L) ;0.25μl Taq DNA polymerase (5U/μl) ;无菌双蒸水补充体系至25μl。PCR扩增程序为;94℃预变性10min, 一个循环。94℃、1min;52～59℃、1min;72℃、2min;总共44个循环。72℃延伸10min、4℃保存。
1.2.3 PCR产物检测
PCR扩增产物在加入绿色荧光染料的1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离。电泳结束后在凝胶成像系统下拍照。条带大小由DL2000 Marker估计。
注:R:A/G。Note: R:A/G.
1.2.4 数据处理
根据电泳图谱中DNA条带在同一位置上的有无, 有记为“1”, 无记为“0”, 根据软件要求的格式输入计算机, 进行数据分析。用POPGENE软件进行遗传参数的分析[8];用SLT_NTsys2.1e软件进行UPGMA聚类分析和主坐标分析 (PCOORDA) [9];用Arlequin3.1软件包中AMOVA分析, 对种间和种内遗传变异进行分析[10]。
2 结果与分析
2.1 12个雀麦种基因组ISSR遗传多态性
12个雀麦种的ISSR产物有丰富的多态性, 扩增的DNA片段大小从150bp到2 000bp均有分布。19个ISSR引物总共扩增出109条稳定、清晰的谱带, 平均每个引物产生1到10个条带不等。引物Primer 7在部分雀麦材料上的ISSR电泳图谱见图1。12个雀麦种的总位点数、多态位点数、多态位点百分率见表3。
Note:M is the DL 2000 Marker.
2.2 12个雀麦种的遗传多样性分析
由表3可知, 不同雀麦种遗传多样性有差异。Nei’s指数计算的各种群遗传多样性比Shannon多样性指数计算的值偏低, 虽然二者估算的遗传多样性程度有所差异, 但二者估计的各种群内平均遗传多样性的变化趋势基本一致。22份雀麦材料总的Nei's (1973) 基因多样性指[16]数为0.2784, Shannon信息指数为0.4235, 雀麦总的遗传多样性水平较高。
Nei’s指数估算的19个引物扩增所得位点的种内和种间的基因多样性见表4。平均总基因多样性为0.2513, 种内基因多样性为0.1541, 61.32%的遗传变异存在于种内, 38.68%的遗传变异存在于种间;遗传分化系数为0.3867, 基因流 (Nm) 为0.7928<1, 种间的基因交流有限。
12个雀麦种的AMOVA分析结果见表5, 在总的遗传变异中有78.26%的变异存在于种内, 21.74%的变异存在于种间, 雀麦遗传多样性可能主要来源于种内变异。
2.3 12个雀麦种的聚类分析和主坐标分析
2.3.1 12个雀麦种的聚类分析
根据19个ISSR引物的PCR扩增条带数据, 使用Jaccard's coefficient计算22份雀麦材料的遗传相似度矩阵, 经UPGMA聚类分析构建亲缘关系树状图 (图2) 。在相似系数coefficient=0.50处22份雀麦材料分为5个类群:
第Ⅰ类群中包括了11份雀麦材料, 主要以无芒雀麦和缘毛雀麦为主。在相似系数coefficient=0.64处又把此类分成6组:第一组包括3份雀麦材料, 为A10、A50、F1;第二组包括4份雀麦材料, 为A41、A56、B10、B5;第三、四、五、六组各包括了1份雀麦材料, 分别是B9、D1、H1、B8。第Ⅱ类群包括1份雀麦材料, 为贵州的J1疏花雀麦。第Ⅲ类群包括8份雀麦材料, 主要以草地雀麦为主。在相似系数coefficient=0.52处又把此类分成2组:第一组包括5份雀麦材料, 为C3、C5、C6、E1、K1;第二组包括3份雀麦材料, 为C4、D2、I1。第Ⅳ类群包括1份雀麦材料, 为美国的G1大麦状雀麦。第Ⅴ类群包括1份雀麦材料, 为正蓝旗的SD沙地雀麦。
根据POPGENE计算所得的Nei’s无偏一致度, 通过UPGMA法进行12个雀麦种的聚类分析 (见图3) , 无芒雀麦与缘毛雀麦亲缘关系最近聚为一支;草地雀麦和雀麦也较近聚为另一支, 这四个种亲缘关系很近, 形成3级聚类;红雀麦与前4个雀麦种大类相聚, 然后河边雀麦、杂色雀麦、硬雀麦、密丛雀麦、大麦状雀麦、疏花雀麦、沙地雀麦分别与其前面的雀麦类群依次相聚。由图中所示沙地雀麦与其他雀麦种的遗传分化较大, 亲缘关系与其他雀麦种较远, 这与沙地雀麦的表形和生活型与其他种雀麦差异十分显著相一致。
注:显著度检测为对ISSR扩增产物带进行1 000次随机重复所得的显著性检测。
Note: p-values are the probabilities of having a more extreme variance component than the observed values alone. Probabilities were calculated by 1 000 random permutations of individuals across populations.
2.3.2 12个雀麦种的主坐标分析
根据12个雀麦种的Nei’s无偏一致度矩阵进行主坐标分析。前3个主坐标解释的变异分别为20.13%、17.79% 和13.87%, 总变异为51.79%。对12个雀麦种前三个主坐标三维图的排序 (图4) , 结果表明12个种的远近关系基本支持聚类分析的结果。
3 讨论
利用Nei’s指数分析基因多样性时, 总遗传多样性 (HT) 分解为各种内多样性 (HS) 和各种间的遗传多样性 (DST) , 即HT=HS+DST, 基于种内基因多样性和种间的基因多样性得出的种内遗传变异为61.32%, 种间的遗传变异为38.68%。AMOVA分析得出在总的遗传变异中有78.26%的变异发生在种内, 有21.74%的变异发生在种间。二者数值的不一致可能是统计计算的理论基础不同, 但二者说明的大致趋势一致, 即种内变异是雀麦遗传多样性的主要来源。
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