遗传毒性(通用8篇)
遗传毒性 篇1
摘要:目的 评价红花的急性毒性和遗传毒性, 为临床提供毒理学依据。方法 Ames试验:设9、4.5、2.25、1.125、0.5625g/血剂量, 观察加或不加S9混合物对TA97、TA98、TA100、TA102菌株的影响。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验:设18、9、4.5g/kg三个剂量组, 2次灌胃后, 24h制片, 镜检。结果 Ames试验为阴性。结论 红花毒性较低, 本次试验未发现有遗传毒性。
关键词:红花,遗传毒性,急性毒性
红花为菊科植物红花的筒状花冠,主产于河南、湖北等地。本品性味辛,温,具有活血通经,散瘀止痛的功效,可用于经闭,痛经,恶露不行,症瘕痞块,跌扑损伤,疮疡肿痛[1]。现代药理学研究表明具有抑制心脏的作用、能减轻脑水肿,起到降压、抗炎、镇静的功效[2]。红花对人类是否具有遗传毒性,目前相关报道甚少,为此我们进行了遗传毒性相关研究,为其临床安全应用提供数据。
1 材料
1.1 实验动物
ICR小鼠35-38g;由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供[实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2011-0016]。动物购入后,均饲养在清洁级动物实验室内,温度控制在20~25℃,湿度控制在40-70%。动物自由摄食、饮水,1周换1~2次垫料。
1.2 主要仪器及试剂
1.2.1 Motic BA400
生物显微镜。
1.2.2 主要试剂
红花,产地河南,由河南省复康药材有限公司提供,批号为H2009052401。羧甲基纤维素钠(CMC-Na)批号F20090508;环磷酰胺,批号9J596A;Giemsa染液及其他试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 实验方法
2.1.1 小鼠骨髓微核试验
ICR小鼠30只,体重35~38g,将小鼠分为5组,给药组剂量分别为4.5、9、18g/kg,阳性对照组为环磷酰胺80mg/kg,阴性对照组为等量生理盐水,分2次灌胃,给药后24 h处死小鼠,取两侧股骨骨髓材料制片、染色、镜检阅片,每片检测2000个嗜多染红细胞,计数微核数,求出各组微核率 (MNF) ,并进行显著性检验[3]。
2.1.2 Ames试验
鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变菌株TA 97、TA 98、TA 100、TA 102,菌株性状和S 9活性经鉴定,符合要求,采用平皿掺入法,加S 9与不加S 9进行两次独立试验,设5个剂量,每组做3个皿。
2.2 统计分析
采用SPSS13.0统计软件进行分析。计数数据用卡方检验,计量数据用方差分析进行比较。以P<0.05为差异有显著意义,以P<0.01为差异有极显著意义。
3 结果
3.1 小鼠骨髓微核试验
红花各剂量组的微核率与空白对照组比较,均无显著性差异 (P>0.05) 。阳性对照组的微核发生率明显增加 (P<0.01) ,见表1。
3.2 Ames
试验各剂量组中无论加或不加S 9混合物,平均回变菌落均未超过自然回变菌落数的2倍,反而红花煎液对细菌有抑制生长的作用。未发现红花有直接或间接的致突变作用,而阳性组平均回变菌落均超过自然回变菌落数的2倍以上。见表2。
注:+S9用2-AF作为阳性药为10μg/皿,-S9用MMC作为阳性药为4.0μg/皿
4 讨论
现在遗传学的检测根据其检测的遗传学终点可分为4种类型:检测基因突变,检测染色体畸变,检测染色体组畸变,检测DNA原始损伤。本研究用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、Ames试验对红花的遗传毒性进行检测。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验主要是对染色体结构完整性改变进行评估,其作为体内遗传毒性检测的首选方法广泛用于评价药物的潜在遗传毒性[5]。结果显示,红花在试验剂量4.5~18 g/kg范围内,未发现对试验小鼠骨髓嗜多染红细胞有致突变作用。Ames试验可对DNA碱基序列是否改变进行评估,本试验各剂量组无论加或不加S9混合物,回变菌落均未超过自然回变菌落数的2倍。相反有抑制细菌生长的功能,提示红花有抑菌的功效并在体外试验中未发现有直接或间接致致突变作用[6]。两种方法结合进行检测,有利于增加检测的敏感性与可靠性,掌握更多的遗传损伤特性,从而更全面、准确地反映受试物的遗传毒性。综上所述,红花未发现遗传毒性。
参考文献
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遗传毒性 篇2
太湖梅梁湾水体和沉积物中有机污染物的遗传毒性
采用SOS/umu方法测试了太湖梅梁湾表层水和沉积物有机提取物的直接和间接遗传毒性,并与同期进行的化学分析数据进行了相关分析.结果表明,当暴露体积为40mL水样/孔时,绝大多数样点没有检出遗传毒性;而各样点的沉积物有机提取物表现出间接遗传毒性和显著剂量-效应关系.化学分析结果表明,梅梁湾沉积物中多环芳烃含量与间接遗传毒性之间存在相关性.因此,推测沉积物中存在间接致突变物质的`积累,而多环芳烃可能是导致梅梁湾沉积物遗传毒性的主要风险因子之一.
作 者:乔敏 王春霞 黄圣彪 王子健 QIAO Min WANG Chun-xia HUANG Sheng-biao WANG Zi-jian 作者单位:中国科学院生态环境研究中心,环境水质学国家重点实验室,北京,100085刊 名:中国环境科学 ISTIC PKU英文刊名:CHINA ENVIRONMENTAL SCIENCE年,卷(期):200626(2)分类号:X524关键词:生态风险 遗传毒性 SOS/umu 太湖 多环芳烃(PAHs)
骨水泥的遗传毒性研究 篇3
关键词:骨水泥,细菌回复突变试验,小鼠淋巴瘤细胞试验,遗传毒性
骨水泥主要用于脊柱成形术中椎体病理性骨折的固定[1]。为确保产品的使用安全,本文按照医疗器械产品检测的相关标准及要求[2,3,4],采用细菌回复突变试验(Bacterial Reverse Mutation Assay,Ames test)[5]和小鼠淋巴瘤细胞试验(Mouse Lymphoma Assay,MLA)[6]对骨水泥进行了遗传毒性检测。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品与对照品
骨水泥由法国Teknimed SAS公司生产、北京劲健昌达医疗科技有限公司提供,批号:043Z/0836,型号:Opacity+(货号:T040320Z);1套骨水泥包括27.2 g粉体和9.2 g液体,粉体含49.5%聚甲基丙烯酸甲脂、0.5%过氧化苯甲酰、45.0%氧化锆、5.0%羟磷灰石,液体含99%甲基丙烯酸甲脂、1%N-N二甲基苯胺和20 ppm氢醌。供试液制备:将粉体按照0.2 g/m L浸提比例加入介质二甲基亚砜(DMSO),在37℃±1℃、水浴摇床18~20 r/min条件下浸提24 h±1 h,所得浸提液再与其液体混合,以此混合液作为供试液。阴性对照品(即浸提介质):DMSO,TEDIA生产。阳性对照品:叠氮钠(Na N3),MERCK-Schuchardt生产;9-氨基吖啶(9-AA),ACROS ORGANICS生产;2-氨基蒽(2-AA),Fluka生产;呋喃基糠酰胺(AF-2)、苯并芘(B[a]P),日本和光纯药工业株式会社生产;甲基甲烷磺酸酯(MMS)、环磷酰胺(CP)及突变选择剂三氟胸苷(trifluorothymidine,TFT),均购自SIGMA。
1.1.2 菌株与细胞
Ames试验选用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型(his-)菌株(S.typhimurium)TA98、TA100、TA1535、TA1537和大肠杆菌色氨酸营养缺陷型(trp-)菌株(E.coli)WP2 uvr A,菌种引自日本(株)生物科学中心(JBS INC.),经本实验室分离筛选、扩大培养、特性鉴定合格者置-80℃超低温冰箱保存;试验前定量接种细菌冻融液,水浴摇床37℃、120r/min培养10h;培养结束,测定新鲜菌液光密度(OD),经计算确认活菌数浓度达1×109/m L以上的菌液用于试验。MLA选用小鼠淋巴瘤细胞L5178Y tk+/--3.7.2C,细胞引自日本国立医药品食品卫生研究所,经过纯化及支原体检查,合格者扩大培养置液氮保存,复苏后传代5次以内使用。
1.1.3 培养基与试剂
Ames试验:营养肉汤(CM0067 Nutrient broth No.2),英国OXOID生产;琼脂粉(Agar Powder),购自日本;MLA:完全培养基由RPMI 1640培养基(GIBCO)、Na HCO3(北京化学试剂公司,终浓度0.2%W/V)、青链霉素混合液(Key GEN,终浓度1%)、丙酮酸钠(Amresco,终浓度200μg/m L)配制而成,根据用途不同分为含10%马血清(传代、处理培养)、20%马血清(96孔板培养)和不含马血清(稀释)的培养液;TFT,终浓度3μg/m L。
1.1.4 代谢活化剂
a:AF-2 0.1μg/皿;b:AF-2 0.01μg/皿;c:Na N3 0.5μg/皿;d:9AA 40μg/皿;e:B[a]P 5μg/皿;f:2AA 1μg/皿;g:2AA10μg/皿
*compared with negative control,P<0.01
*compared with negative control,P<0.01
*compared with negative control,P<0.01RSG%=(DCG1×DCG2)treatment/(DCG1×DCG2)N.CDCG1=cells density at d 1/cells density at d 0;DCG2=cells density at d 2/cells density at d 1.PE0(2)=-ln(EW/TW)/1.6,EW:empty well;TW:total well.RS0(2)=(PE treatment/PE N.C)×100%.RTG=RS2×RSG×100%.MF(×10-6)=-ln(EW/TW)/2000/PE2.SC%=(SC+SC/LC)/(LC+SC+SC/LC)×100%.
S9由苯巴比妥钠与β-萘黄酮联合诱导处理大鼠肝而获得,本实验室自制。Ames试验用S9混合液(S9 mix)中的S9含量为10%[7];MLA所用S9在处理液中的终浓度为2%,检测时与180mg/m L的Glucose-6-Phosphate、25 mg/m L的NADP、0.15 mol/L的KCl等辅助因子溶液,按2∶1∶1∶1(m L)的比例配制成S9 mix。
1.2 方法
1.2.1 细菌回复突变试验[7]
采用标准平板掺入法。设立骨水泥(粉体浸提液与其液体混合物)3个剂量组25、50、100µL/皿,检测同时设立DMSO溶媒(阴性)对照组及阳性对照组,每组平行3皿,在-S9和+S9条件下同时检测;平板置37℃培养48h,计数回变菌落数,实验数据以(χ—±s)表示。若在-S9和/或+S9条件下,所设剂量范围内,一株以上试验菌的回变菌落数呈现剂量相关性增加,或一个以上剂量诱发的回变菌落数呈现可重复性并有统计学意义时,判为阳性;反之,则为阴性。
1.2.2 小鼠淋巴瘤细胞试验[8,9]
设立骨水泥(粉体浸提液与其液体的混合液)终浓度0.125%、0.25%、0.5%(V/V)3个浓度组,检测同时设立DMSO溶媒(阴性)对照组和阳性对照组(+S9:CP;-S9:MMS);每组平行2支处理管,+S9/3 h、-S9/3 h、-S9/24 h三种处理条件下的检测分别进行。+/-S9条件下的3 h处理,各组供试液-细胞处理液于37℃振荡培养箱中作用3h;-S9条件下的24h处理,各组供试液-细胞处理液于37℃、5%CO2孵箱中静置作用24h;处理、清洗后的细胞于37℃、5%CO2孵箱中培养2d进行表达,制备检测接种效率的PE0、PE2平板,于37℃、5%CO2孵箱分别培养9~10d、7~8d;检测基因突变频率的MF平板于表达结束后制备,37℃、5%CO2孵箱培养12d。培养结束,计数含与不含接种效率细胞克隆的孔数并计算PE0和PE2、细胞相对存活率(RS%)、相对悬浮生长率(RSG)、相对总生长率(RTG);观察并分别计数含有突变细胞大集落(LC)、小集落(SC)及大、小集落(LC/SC)并存的孔数,计算基因突变频率(MF)以及小集落突变百分率(SC%)。采用“Poisson分布两样本均数的比较”方法,将处理组的突变率与溶媒对照组进行比较、分析。如果一个或多个浓度组出现浓度依赖性和/或可重复性的突变率增加,且任意浓度组MF值>阴性对照组MF值+126(总体评价因子,GEF)[10,11],则判定为阳性结果;反之,则为阴性。
2 结果
2.1 细菌回复突变试验
如表1所示,+/-S9条件下,DMSO阴性(溶媒)对照组的回变菌落数平均值均在文献[12]报道的背景数据范围内,阳性对照组诱发的回变菌落数均达到阴性对照组的3倍以上,显示出明显的诱变能力;骨水泥(粉体浸提液与其液体混合物)的3个剂量组中,50、100µL皿剂量组在加入磷酸缓冲液或S9混合液后略有乳白色沉淀产生,培养48h后未见沉淀和抑菌作用,诱发五株菌的回变菌落数对比阴性对照组均无明显增加。
2.2 小鼠淋巴瘤细胞试验结果
如表2~4所示,阴性对照组的PE、MF均在本实验室的背景数据范围内(PE:50~160%;MF:110×10-6~250×10-6);阳性对照组诱发的MF达到阴性对照组的3倍以上(P<0.01),并以小集落突变体为主。骨水泥(粉体浸提液与其液体的混合液)各浓度组,在三种处理条件下得到的RTG均>20%,符合本试验方法中细胞毒性小于90%的要求;-S9/24 h处理条件下,0.5%(V/V)浓度组诱发的MF明显增加(P<0.01)为454,但未超过阴性对照组MF值348与126之和474,其他处理条件下诱发的MF未见明显增加(P>0.05)。
3 讨论
合成冰片的短期遗传毒性测试研究 篇4
1 材料与方法
1.1 受试物
合成冰片由云南三木 (集团) 有限公司思茅香料厂提供, 滇卫药准字: (90) 56-001, 研细粉过140目筛, 以二甲基亚砜 (DMSO) 或羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 配制。
1.1.2 试验菌株
采用TA97、TA98、TAl00和TAl02四株标准菌株 (北京军事医学科学院惠赠) 。经鉴定菌株遗传特性均符合试验要求。
1.1.3 试验细胞株
中国仓鼠肺成纤维细胞由北京军事医学科学院毒物药物研究所惠赠, 经细胞株染色体核型鉴定合格。用pH7.2、含10%胎牛血清的RPMI-l640培养液 (GIBCO-BRL公司) , 37℃、5%CO2条件下培养。
1.1.4 试验动物
ICR小鼠 (SPF级) , 18~22g, 雌雄各半。北京维通利华实验动物技术有限公司提供, 合格证号SCXK11-00-0008。
1.2 方法
1.2.1 Ames试验
培养基、增菌培养、肝脏微粒体酶混合液 (S9mix) 的组成均按Maron修订方法进行。采用平皿掺入法, 合成冰片受试浓度设置为250、50、10、2和0.4 (μg/皿) 。同时设溶剂对照、空白 (自发回变) 对照、阳性诱变剂对照[敌克松 (50.0μg/皿) 作用于四种菌株 (-S9) , 活化试验中2-氨基芴 (20.0μg/皿) 作用于TA97、TA98、TAl00, 1、8-二羟基蒽醌 (50.0μg/皿) 作用于TAl02], 按规定重复试验。用SPSS10.0统计软件计算回复突变菌落数平均值undefined。如在某一个测试浓度诱发的回复突变菌落数为自发回变的2倍或2倍以上, 判为阳性反应[2]。
1.2.2 染色体畸变试验
根据细胞毒性测定结果, 合成冰片在2~125 (μg·ml-1) 间IC50为85.74μg·ml-1 (y=0.04271+0.00216x, r=0.9523) 。故设80、40、20、10、5 (μg·ml-1) 5个剂量, 阴性对照为DMSO, 阳性MMC 0.25μg·ml-1 (-S9) 、CP 20μg·ml-1 (+S9) , 及空白对照组 (+/-S9) 。每组3个平行样。为避免S9mix处理时间过长对细胞的影响, 选择24h收获细胞, 收获前6~10h加入秋水仙碱 (终浓度0.2μg·ml-1) , 制备染色体标本。每个标本观察100个中期分裂相细胞, 统计染色体畸变率, 记录畸变类型:数目异常 (P) 、缺失 (D) 、碎片和粉碎化 (F) 、单体断裂 (B) 、环状染色体 (R) 、染色单体易位 (T) 。判断标准:细胞畸变率<5%为 (-) , >10%为 (+) [3,4]。
1.2.3 微核试验
合成冰片用1%CMC—Na水溶液稀释至0.2g生药/ml;以4.881、3.661、2.746、2.060、1.544和1.158 (g/kg) ig小鼠;ICR小鼠按体重随机分组, 共设6组, 每组10只 (雌雄各半) 。并根据预试验结果确定剂距。使用《NDST新药统计程序》软件用Bliss法计算LD50及95%可信限[5]。
据预试验结果选择给药24h作为制备骨髓标本时相点。以LD50的1/2、1/4、1/8设置剂量。阴性对照 (等体积1% CMC-Na) ;阳性对照 (0.06g/kg·bw腹腔注射环磷酰胺) 。采用一次染毒方法[4], 制备骨髓涂片后每个动物标本随机镜检1000个嗜多染红细胞 (PCE) , 计算微核发生率。同时注意区分成熟红细胞 (NCE) 与PCE[5], 如图:
图1所示:a为NCE、b为PCE。图2所示:箭头所示为PCE中的微核。以正常小鼠微核率最大值均小于4‰作为判断结果的参考值。
2 结果
2.1 Ames试验
如表1所示, 合成冰片5个剂量组 (+/-S9mix) 均为阴性。
注:以上结果为6个平皿均值, 0表示自发回变
2.2 CA试验
合成冰片剂量组染色体分散良好, 畸变染色体少见 (图3) 。
而MMC和CP对照组畸变染色体多见 (图4、5) 。
表2显示除阳性对照组外, 其他各组的染色体畸变率均<5% (+/-S9mix) 。表明合成冰片对CHL细胞染色体无损伤作用。
2.3 微核试验
小鼠灌胃合成冰片LD50值为2.983 (2.538~3.507) g/kg。各剂量组PCE/NCE在正常值范围。由表3显示, 各剂量组微核发生频率雌鼠与雄鼠比较差异无显著性, P>0.05;合成冰片微核率与阴性对照组比较差异无显著性, P>0.05。提示微核试验结果阴性。
注:与CMC-Na组比较﹡P<0.01
3 讨论
近年中药安全性问题越来越受到重视, 而有关中药的短期遗传毒性测试研究报道日渐增多。冰片是复方丹参滴丸、速效救心丸等年销售额过亿的中成药大品种的主要成份, 在临床和制药行业颇受关注, 对其安全性进行深入研究有较重要意义。因此本研究选用了Ames试验、CA试验、MN试验这三个测试系统来检测合成冰片的诱变性, 这也是目前中国和欧共体制定的遗传毒性评价方案中的标准组合试验[6]。本试验组合的三个测试系统结果均一致, 提示合成冰片无致突变性, 对遗传物质无损伤作用。为合成冰片的应用提供遗传毒理安全性实验数据。
参考文献
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人参粉剂安全性及遗传毒性研究 篇5
1材料与方法
1.1 受试物
人参全身(包括根、须)以粉碎机粉碎过100目筛作为受试物。
1.2 实验动物
由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供的健康清洁级ICR小白鼠、Wistar大白鼠。动物合格证号:SCXK—(吉)2003—0001。试验前饲养观察3 d。
1.3 化学试剂
环磷酰胺由FLuka公司提供,批号为1320778。
1.4 实验方法
参照文献[5] 进行
1.4.1 急性毒性试验
采用最大耐受量(MTD)试验。称取12.7 g受试物溶于50 ml蒸馏水中,最大溶解浓度为25.4%。间隔5 h 3次经口灌胃给予,试验连续观察14 d,记录大、小鼠中毒表现及死亡情况。
1.4.1.1 小鼠急性毒性试验
每次灌胃容量为0.4 mL/10g总灌胃容量为1.2 mL/10g,累计剂量为30.5 g/kg。
1.4.1.2 大鼠急性毒性试验
每次灌胃容量为2 ml/100g,总灌胃容量为6.0 ml/100g,累计剂量为15.2 g/kg。
1.4.2 骨髓细胞微核试验
设10.16、5.08、2.54 g/kg 3个受试物剂量组,阴性对照组(蒸馏水)和阳性对照组(环磷酰胺40 mg/kg),采用间隔24 h 2次经口灌胃法进行试验。选用体重25~30 g的小鼠50只,雌雄各半,随机分为以上5组,各组小鼠每次灌胃量为0.4 ml/10g,于第末次灌胃后6 h,颈椎脱臼处死小鼠,取股骨以小牛血清稀释涂片,甲醇固定,Giemsa染色。在光学显微镜下,每只动物计数1 000个嗜多染红细胞(PCE),微核发生率以含微核的PCE千分率计,每只动物记数200个PCE,计算PCE与成熟红细胞(RBC)比值,并进行统计分析。
1.4.3 小鼠精子畸形试验
设10.16、5.08、2.54 g/kg 3个受试物剂量组,阴性对照组(蒸馏水)和阳性对照组(环磷酰胺40 mg/kg)。选用体重25~35 g的小鼠25只,雄性,随机分为以上5组,各组每次灌胃量为0.4 ml/10g,连续灌胃5 d,于末次灌胃后第30天处死小鼠,取附睾制片,甲醇固定,伊红染色,在光学显微镜下,每组计数5只动物,每只动物计数1 000个结构完整的精子,计算畸变精子发生率,并进行统计分析。
1.5 统计学方法
数据处理采用SPSS 11.5统计分析软件,以双侧t检验、χ2检验对试验数据进行分析。以P<0.05差异有统计学意义。
2结果
2.1 急性毒性试验
大、小鼠经口灌胃给予受试物,观察2周未见小鼠有任何异常中毒症状,死亡数为零。大、小鼠经口急性毒性MTD分别大于15.2、30.5 g/kg,属于无毒级。
2.2 遗传毒性试验结果
2.2.1 骨髓细胞微核试验
与阴性对照组相比:10.16、5.08、2.54 g/kg 3个剂量组的微核率差异无统计学意义(P﹥0.05);与阳性对照组相比,微核率差异有统计学意义(P<0.01);各组动物PCE/RBC差异无统计学意义(P﹥0.05)。说明人参粉剂对小鼠骨髓PCE无致微核作用及未见细胞毒性作用,见表1。
2.2.2 小鼠精子畸变试验
与阴性对照组相比10.16、5.08、2.54g/kg 3个剂量组小鼠精子畸形率差异无统计学意义(P﹥0.05);与阳性对照组相比,小鼠精子畸形率差异有统计学意义(P<0.01)。说明人参粉剂对雄性小鼠生殖细胞无致突变作用,见表2。
注:RBC—成熟红细胞;与阴性对照组比较,aP<0.01。
注:与阴性对照组比较,aP<0.01。
3 讨论
依据《食品安全性毒理学评价程序和方法》的要求,急性毒性试验我们选用了大、小鼠2种动物,结果雌雄两性大、小鼠MTD分别大于15.2、30.5g/kg,属于无毒级。
小鼠骨髓细胞微核试验主要是对染色体结构完整性改变进行评估,而小鼠精子畸形试验所反映的遗传学终点主要是对生殖细胞的遗传性进行评估,精子畸形率增高本身有生殖毒理学意义[6],有研究表明,高剂量的人参具有一定的遗传毒性,人参在剂量为20.0 g/kg时,可以明显增加小鼠骨髓微核数及小鼠精子畸变数[7]。而在本研究中,人参的高剂量为10.16 g/kg,低剂量为2.54 g/kg,在试验剂量范围内未发现人参对小鼠骨髓嗜多染红细胞有致突变作用,也未发现对小鼠精子的损伤作用,因此人参粉剂在10.16~2.54 g/kg剂量范围内无遗传毒性是安全的,作为保健食品具有广泛的应用前景。
参考文献
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铅及其化合物遗传毒性的研究进展 篇6
1 铅及其化合物的一般毒性作用
铅及其化合物对人体各组织均有损害作用,神经系统、血液系统和肾组织为主要的靶器官。低浓度铅接触即可损害中枢神经系统的整体功能,使神经传导速度减慢,造成行为、意识及神经效应改变。铅可以影响血液卟啉代谢,抑制血红素的合成,并可与铁、锌、钙等元素拮抗,诱发贫血。铅对肾组织的损害出现较早,主要是影响肾小球滤过和肾小管重吸收,影响正常生理功能。以往认为,骨骼是铅的储存器官,铅不影响骨的生理功能及代谢过程。然而,通过对铅作业人群的流行病学调查发现,铅可对人群骨密度、骨代谢产生影响,导致骨质疏松、腰椎骨折等,提示骨骼也是铅的靶器官[1,2]。
2 铅及其化合物的遗传毒性作用研究
铅及其化合物的一般毒性作用研究较为深入,但对其致癌、致畸和致突变性的研究尚无定论。国际癌症研究中心(IARC)将铅划分为“对人类可能是致癌物”,即对人类致癌性证据有限,对实验动物致癌性证据并不充分,或指对人类致癌性证据不足,对实验动物致癌性证据充分;将铅的无机化合物划分为“对人类很可能是致癌物”,即对人类致癌性证据有限,对实验动物致癌性证据充分。近年来,对铅及其化合物的遗传毒性研究在实验室的基础性研究和人群的流行病学研究方面均有了新的发现。
目前,大多数研究都采用各种遗传学终点试验来评价铅及其化合物的遗传毒性作用。具有代表性的遗传学终点试验包括染色体畸变、姐妹染色单体交换、微核试验和利用单细胞凝胶电泳测定技术(彗星试验)检测DNA损伤等。
2.1 细胞水平的实验研究
细胞水平的实验研究通常用于探索铅及其化合物与遗传毒性作用之间的剂量-效应关系。Bonacker等[3]和冀琛等[4]利用V79中国仓鼠成纤维细胞研究发现,氯化铅和醋酸铅可诱发细胞微核的形成,且呈剂量依赖性;进一步染色后观察微核形态并计算微核着丝粒阳性率发现,氯化铅和醋酸铅具有一定的致非整倍体毒性。铅通过抑制微管蛋白合成干扰了细胞微管功能, 可能是诱发微核的机制之一。
2.2 动物水平的实验研究
Alghazal等[5]在Wistar大鼠的饮用水中加入三水合醋酸铅发现,与对照组相比,实验组大鼠的骨髓红细胞微核数目明显增加,且雄性大鼠的微核红细胞与正常红细胞的比率下降。
除此之外,动物实验可进一步探索铅及其化合物的遗传毒性作用的靶器官和蓄积作用。Valverde等[6]采用小鼠醋酸铅吸入模型探索铅的遗传毒性损伤,利用彗星试验检测小鼠不同器官的DNA断裂情况。研究发现,一次性醋酸铅吸入后仅小鼠的肝和肺出现DNA损伤;而持续的醋酸铅吸入可造成除睾丸外的所有器官DNA损伤。该结果表明,醋酸铅吸入可导致系统性DNA损伤,但肝和肺可能是铅的致DNA断裂性的敏感靶器官。Yuan和Tang等[7]在第1代小鼠的饮水中加入了1 μg/ml醋酸铅并繁育了2代小鼠,取外周血细胞做彗星试验发现,虽然第1代小鼠的外周血中未发现明显的DNA损伤,但第2代和第3代小鼠的DNA损伤较对照组小鼠有显著性差异,表明铅具有很强的遗传毒性蓄积作用。
2.3 人群水平的实验流行病学研究
人群实验流行病学研究通常利用遗传终点试验来评估铅及其化合物对职业暴露人群与非暴露人群的潜在不同的遗传影响。
到目前为止,绝大多数研究均表明,与对照人群相比,职业性铅暴露人群的DNA损伤情况明显增加[8,9,10]。过伟军等[11]对25名铅作业工人和25名对照组人员的外周血淋巴细胞进行微核实验和彗星试验发现,与对照组人员相比,铅作业工人的血铅水平和外周血淋巴细胞微核形成率明显增加,彗星试验显示平均尾长和平均尾相均明显高于对照组,说明铅作业工人已出现不同水平的遗传毒性效应。同样,在印刷厂工人、蓄电池生产工人和再生铅回收工人的职业性铅暴露的相关研究中也取得了类似的结果[12,13,14,15]。
Wiwanitkit等[16]在对32名男性交通警察血铅水平和姐妹染色单体交换率的研究中发现,铅接触可引起姐妹染色单体交换的发生,且两者呈正相关关系,高浓度铅暴露更易引起姐妹染色单体交换。
Shaik等[8]在蓄电池厂工人外周血淋巴细胞中观察到了显著的染色体畸变,经测定该工厂工人血铅水平为218~891 μg/L,其均值大于400 g/L,提示高浓度铅暴露也可引起染色体畸变。Madhavi等[17]对铅作业工人的研究也得到了类似的结果,并进一步分析认为吸烟可增加染色体畸变率。
此外,流行病学研究也证实铅与某些癌症的发生有关,比如胃癌、肺癌和膀胱癌等,其机制可能与促有丝分裂、基因转录异常、过氧化损伤及其他间接遗传毒性机制有关[18]。
2.4 T细胞受体基因突变检测(T-cell receptor mutation assay)
T细胞受体(T-cell receptor, TCR)基因突变检测是体细胞基因突变试验中较常用的一种。TCR的表达与外周血淋巴细胞表面CD3分子有关,编码TCR的基因发生突变将导致淋巴细胞表面TCR/ CD3表达的缺失。应用抗-CD3和抗-CD4单克隆抗体进行双色免疫荧光标记,用流式细胞术可检测T 淋巴细胞突变率。
在铅及其化合物的遗传毒性研究中应用该技术的报道尚不多见。García-Lestóna等[19]对葡萄牙铅酸蓄电池工厂工人的研究发现,70名工人的外周血TCR基因突变率明显高于同工厂的行政人员,彗星试验结果则无显著性差异。与此不同的是,过伟军等[11,12,13]的研究中,蓄电池厂铅作业的25名工人的TCR基因突变率未见改变,而微核试验和彗星试验结果表明铅作业工人可检测出遗传损伤。其原因可能是T细胞受体基因突变可反映数月至数年前有害因素引起的遗传毒性损伤,而彗星试验通常反映近期的DNA损伤且易被修复。
虽然,关于铅的遗传毒性作用的研究已有很多,但对其分子机制目前知之甚少,多数研究认为铅并不直接作用于遗传物质,而是有赖于间接作用。铅能够取代DNA的加工和修复过程中所需酶中的钙和(或)锌,从而抑制DNA的修复;铅和其他DNA损伤因素结合,如吸烟或紫外线,其联合遗传毒性明显增强。此外,铅暴露也可使氧自由基水平提高引起氧化应激,从而产生间接遗传毒性[19]。总之,铅及其化合物的遗传毒性及机制有赖于科学家的进一步的深入研究。
摘要:铅广泛用于工业生产中,是常见的环境污染物质和职业性有害因素。铅及其化合物对机体的各个组织均有毒性作用,影响人体正常的生理功能。然而,对其致癌、致畸和致突变作用的研究较少,且存在争议。该文对铅及其化合物的遗传毒性最新研究做一文献综述。
饮用水有机提取物遗传毒性的研究 篇7
1材料与方法
1.1主要仪器与主要试剂荧光显微镜(Nikon E600),生物显微镜(cx-21),电泳仪(北京六一仪器厂)。XAD-2树脂、乙二胺四乙酸二钠、正常熔点和低熔点琼脂糖、Tris、Trition X-100溴化乙锭、肌胺酸钠(Sigma公司),鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型突变菌株TA98与TA100(哈尔滨医科大学提供)。
1.2水样的采集与处理采集某水源水与管网末梢水各1500L,静置沉淀泥沙后,采用XAD - 2大孔树脂富集其中的有机物。控制流速2~3L/min,每柱过水样250L。将有机提取物用正己烷和丙酮的混合液(1: 1)洗脱,旋转蒸发仪浓集后分别用玉米油、二甲基亚砜定容,冰箱贮存备用。
1.3试验方法
1.3.1 Ames试验采用平板掺入法[3]进行试验。菌株选用TA98与TA100经四步法鉴定,各项生物学指标符合要求后进行试验,阳性对照选用敌克松(62.5μg/ 皿),同时设自发回变组。两组样品浓集物以DMSO为溶剂,每组设4个剂量,分别为1L/ 皿、3L/ 皿、5L/ 皿和7L/ 皿。取不同浓度样品浓集物0.1m L,制备好的新鲜菌液0.1m L,加入融化好且温度适宜的顶层培养基中,混匀后铺平于37℃温箱中孵育48h,观察每平皿的回变菌落数。如回复突变菌落数超过阴性(溶剂)对照两倍及以上,并有剂量- 反应关系,就可确定受试物为致突变阳性。样品每个染毒剂量设3个平行皿,试验进行2次,最后以6皿均数的致突变率(MR值)表示。
1.3.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验选用体重在18~22g的清洁级昆明种小鼠80只(购于哈尔滨兽医研究所,合格证为SCXK(黑)2011-007)。观察一周合格后将小鼠随机分为8组,每组10只,雌雄各半。分别为样品组、阴性对照组(玉米油)和阳性对照组(环磷酰胺0.06mg/g)。样品组剂量为0.125,0.250, 0.500L/g.。采用30小时染毒法进行试验,染毒6h后处死,取股骨骨髓涂片,空气中干燥,甲醇固定后用Giemsa染液染色,每张片子检查1000个嗜多染红细胞(PCE)计数微核,并计算微核细胞率(‰)。
1.3.3小鼠原代肝细胞凝胶电泳试验首先将小鼠处死制备细胞悬液。按照悬浮染毒方法进行染毒[4]。先用PBS液调细胞浓度至105~106个/m L,加入不同浓度的样品100μL,使终浓度为每管含0.125,0.250, 0.500L水样,每个剂量组设2个平行样,同时设溶剂对照(DMSO100μL)和阳性对照重铬酸钾(K2Cr2O70. 2 mmol/L 100μL)。样品混匀37℃恒温水浴,振荡染毒一小时,收集染毒后细胞,再用PBS液重悬确保细胞浓度达到104~105个/m L用于彗星试验。在荧光显微镜下观察记录拖尾细胞数、拖尾长度,每个剂量随机观察50个细胞,计算细胞的拖尾率和平均尾长。
1.4数据统计方法采用SPSS13.0软件进行数据分析。用CASP软件计算肝细胞凝胶电泳试验拖尾率。
2结果
2.1 Ames试验自发回变组和阳性对照组的菌落数均在正常值范围,样品结果存在剂量- 反应关系,差异有统计学意义,试验结果成立。TA98菌株在末梢水有机浓集物浓度为7L/ 皿剂量时致突变率(MR值) >2,试验结果为阳性。TA100菌株在两组样品四个剂量范围水源水有机浓集物在四个浓度范围致突变率均<2,致突变结果为阴性。经氯化消毒处理后样品遗传毒性增加。见表1。
注:a MR>2
2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验两组样品随着染毒剂量的增高,小鼠骨髓细胞微核数也增多。末梢水在最高染毒剂量下,雌雄和雄性小鼠骨髓细胞微核数均明显增高,与阴性对照组差异,有统计学意义(P<0.01),而水源水在高、中、低三个染毒剂量所产生的微核数与阴性对照组均无差异。见表2。
注:a 与阴性对照比,P<0.01
2.3小鼠肝细胞凝胶电泳试验溶剂对照组有少量细胞出现DNA损伤,而阳性对照组细胞DNA损伤严重。末梢水在为中、高剂量范围时,细胞拖尾率和细胞尾长与溶剂对照比较差异,有统计学意义(P<0.01),水源水仅在高剂量时,细胞拖尾率和拖尾细胞尾长与溶剂对照组间差异有统计学意义。见表3。
3讨论
在本试验的剂量条件下,三项试验结果均显示末梢水在高剂量下具有遗传毒性,其活性明显高于水源水,主要是移码型突变。水源水只在单细胞凝胶电泳试验最高剂量时出现阳性结果,说明单细胞凝胶电泳试验在检测水质遗传毒性时比Ames试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验敏感。虽然其他两项试验为阴性结果,但存在随着试验剂量的增加遗传毒性也增加现象,说明水源水受到有机物污染,在高剂量接触时也具有潜在的致突变性。研究结果表明,在本实验剂量范围内经过氯化消毒处理后,末梢水致突变性增强,这也与国内其他报道结论一致[5,6]。另外,末梢水致突变性增强也不排除管道存在二次污染的可能。因此,要改进水处理方法,提高有机物去除效果,探讨更加科学合理的水处理工艺、保障饮水安全。这是涉及我国人口健康素质和国家发展的重要问题,有必要从国家安全性的角度去重视饮水安全问题。
注:a 与阴性对照比,P<0.01。
摘要:目的 检测某水源水及经常规处理后的管网末梢水的遗传毒性,了解氯化消毒前后水质遗传毒性变化。方法将水样经XAD-2树脂柱富集其中的有机物,正己烷和丙酮的混合液(1:1)洗脱,旋转蒸发仪浓集后分别用玉米油、二甲基亚砜定容,冰箱贮存备用。利用成组生物试验(Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠肝细胞凝胶电泳试验)从不同的遗传学终点检测其遗传毒性。结果 水源水只在单细胞凝胶电泳试验最高剂量时出现阳性结果,其他两项试验为阴性结果,末梢水以上三项试验结果与阴性对照有显著差异,均为阳性结果。结论 在本实验剂量范围内经过氯化消毒处理后的管网末梢水有遗传毒性。
遗传毒性 篇8
1 材料与方法
1.1 实验材料
取同一批次的生大黄中药材 (产地为甘肃) 400g平均分为四组, 处理因素分别为清炒法、清蒸法、醋炒法和醋蒸法四种。实验设计主要试剂包括二甲基亚砜和敌克松等均购自Sigma制药, 甲基磺酸甲酯、溴化乙锭和曲拉通等药品购自河北石药集团。实验菌株为组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌TA97、TA100、TA98和TA102等 (购自山东省疾病预防控制中心) , 经过专家鉴定结果符合实验要求。对菌株进行培养的培养基制作方法与高建波、刘云文献[4]一致, 在此不再赘述。实验用小鼠购自中国医科大学实验动物研究中心 (为昆明种雄性小鼠) , 体重范围为24~26g, 平均体重范围为 (25.01±0.81) g, 所有小鼠在常规喂养1周后进行实验。
1.2 大黄炮制方法
四份大黄 (各100g) 分别用清炒法、清蒸法、醋炒法和醋蒸法方法进行炮制, 清炒法是通过中火力度将大黄的表面炒至焦黄色, 取出放凉备用;清蒸法是将大黄加热蒸透 (一般蒸40min左右) , 取出后在室温条件下放凉备用;醋炒法是先将大黄加醋搅拌均匀 (加醋比例为每100g大黄拌入18g醋) , 闷透后放在锅中翻炒, 翻炒至大黄表面为焦黄色时取出放凉备用;醋蒸方法为先将大黄加醋搅拌均匀 (加醋比例为每100g大黄拌入18g醋) , 放入锅中加热蒸30min左右时取出放凉, 干燥备用。
1.3 Ames实验
污染物致突变性实验方法参照柴宝娟、李祥、陈建伟等[5]文献中的标准平皿掺入法, 受试物生大黄浓度梯度为0.05、0.10、0.50、2.50、5.0ms/表面皿对突变性进行检测, 分别通过四种方法加工后的大黄均采用毒性最强的5.0ms/表面皿的浓度进行实验, 代谢活化组设阳性对照2-AF, 20μg/表面皿, TA100非代谢活化时阳性对照叠氮钠 (NaN3) 50pg/表面皿, 其它菌株非代谢活化时阳性对照Dexon50μg/表面皿, 阴性对照二甲基亚砜 (DMSO) 0.1mL/表面皿。
1.4 统计学方法
选择SPSS19.0统计学软件包进行分析, 符合正态分布的计量资料表示方法为均数加减标准差 (±s) , 多组完全独立样本计量资料的组间比较方法选择方差分析, 两两比较方法选择LSD检验, 以P<0.05为差异具有统计学意义, 双变检验方法比较组间差异性是否具有统计学意义。
2 结果
清蒸[TA102的S9阳性值为 (250.1±8.0) , 阴性值为 (244.5±9.1) ]和醋蒸[TA97的S9阳性值为 (245.7±8.0) , 阴性值为 (165.9±9.1) ]的大黄样品除醋蒸样品在代谢非活化条件下呈阳性以外, 对于菌株TA97、TA98、TA100、TA102的致突变性都呈现阴性结果, 而清炒和醋炒大黄的结果仍呈现阳性, 因此, 通过Ames实验结果表明清蒸炮制法与醋蒸炮制法对大黄的减毒作用比较明显, 而清炒炮制法与醋炒炮制法对大黄的减毒效果不明显, 具体数据统计结果, 见表1。
3 讨论
大黄一般被认为毒性较低, 临床应用比较安全, 但服用过量可引起中毒, 尤其是后下大黄毒性较大, 可引起恶心、呕吐、头昏、腹绞痛、黄疸等。曾有报道[6], 30名受试者每日服大黄3次, 3g/次, 共5日, 所有受试者均产生一系列胃肠反应, 主要表现为腹泻、腹痛、呕吐、恶心、肠鸣, 其中3例因严重腹泻、腹痛、呕吐而被迫卧床休息, 经对症处理后缓解。国外曾报道[7]1例长期服蒽醌类泻药, 导致结肠膨胀, 手术切除结肠标本可见变黑, 肌层神经元消失, 平滑肌萎缩, 因此, 大黄在应用前需进行炮制以达到减毒增效的目的。
污染物致突变性实验一般被用来进行环境毒理学实验分析, 由本研究数据统计结果可以看出, 对大黄中药材的清蒸法和醋蒸法两种加工方法能有效降低大黄遗传毒性, 董菊文献[8]研究中得出以下推论:大黄在经过加工和炮制的过程中, 以结合方式存在的蒽醌类物质减少, 而游离状态的蒽醌类物质增大, 因此, 泻下作用有所减弱。魏高文等[9]应用高效液相色谱法证明了以结合方式存在的蒽醌物质中有一部分会转化为游离状态 (表现为结合蒽醌峰面积减少, 同时游离状态蒽醌物质的峰面积明显增大) 。笔者在以上文献研究的基础上, 结合自身实践经验, 分析原因如下:清蒸法和醋蒸炮制方法能使大黄药材在高温环境作用下, 使蒽醌化合物的苷键发生断裂, 产生毒性较弱的游离态蒽醌物质, 降低大黄的遗传毒性。
表1显示了清蒸方法处理大黄后的毒性略高于醋蒸, 主要原因是大黄中药材在酸性条件下, 部分蒽醌类物质可被还原为蒽芬或其它互变异构体 (如恩酮等物质) , 使氧化过程相对降低。总之, 清蒸法和醋蒸法两种炮制方法对大黄遗传毒性能起到明显降低的结果, 而清炒和醋炒法并无明显的减毒效果。通过对大黄药材的蒸煮加工, 能明显降低大黄的遗传毒性, 这为大黄在临床应用中的减毒作用奠定了一定的基础, 然而, 本研究仅是对单纯的大黄中药材进行研究, 关于大黄复方制剂的减毒还需进行进一步的实验研究。
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