细胞毒性试验

细胞毒性试验（精选9篇）

细胞毒性试验 篇1

香烟中含有害化学物质3 000余种, 致癌物质30多种, 每年都有近百万人死于与吸烟相关疾病, 癌症尤其是肺癌与香烟毒性密切相关[1,2]。人在吸烟过程中, 香烟烟雾的水溶性部分更容易被肺泡表面的粘液溶解和吸收, 据此推测, 香烟烟雾的水溶性部分可对身体各器官系统造成损害, 而这一推测已得到初步证实[3]。目前, 国内外检测香烟毒性研究仅限于对香烟中单一毒物和单因子检测评价, 对香烟中综合毒性快速检测报道较少。为了解香烟烟雾毒性对人体产生的危害, 笔者2006年研究建立了一种简单快速的生物学检测香烟毒性方法[4], 该实验研究的是香烟中所有毒物产生的综合毒性, 通过对小鼠腹腔注射一定剂量香烟烟雾水溶物 (water - soluble contents of cigarette smoke, WSCCS) , 观察WSCCS对小鼠各系统产生的作用[5], 根据小鼠出现的不同症状和死亡时间推断被检香烟的毒性强弱。该方法可用来对市售香烟的毒性进行快速检测, 但此法需要大量小鼠, 受动物保护法的约束, 且检测条件严格, 不易掌握。为此笔者依据细胞毒 (中性红法) 原理, 拟通过体外试验研究, 取代生物学检测方法。现将试验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 中性红、固定液 (1%CaCl2-1%福尔马林水溶液) 、抽提液 (1%醋酸-50%乙醇水溶液) 、香烟烟雾提取液 (CSE) 。

1.1.2 细胞株 仓鼠肺细胞 (V79细胞) 。

1.1.3 仪器 Spectramax plus384酶联免疫光谱分析系统。

1.2 方法 (中性红法)

1.2.1 香烟样品的选择和受试物

采购市售100种香烟, 提取香烟水溶液, 根据体内试验 (染毒方式为腹腔注射) 结果, 制成低毒、中毒、高毒3个浓度组, 每个浓度组为10支香烟提取物的平均浓度。

1.2.2 香烟烟雾提取物的制备

将点燃的香烟与2支串联的吸收管相接, 再连接空气取样仪。2支吸收管各装5 ml MEM培养液, 提取香烟烟雾中的物质。采样器流量0.1 L/min。一次燃烧2支香烟, 收集提取液 (定为原液) , 冷藏备用。

1.2.3 接种细胞

用胰蛋白酶将贴壁培养的细胞消化下来并吹打均匀, 再用培养液将其配制成细胞浓度为105cell/ml的细胞悬液。将此细胞悬液加入96孔板, 100 μl/孔 (最外一圈孔不加) (图1) , 将培养板放入CO2培养箱 (5% CO2、37℃) , 培养24 h。

1.2.4 处理

根据试验设计在细胞培养24 h后向培养板中加入不同浓度的香烟烟雾提取液100 μl (每个浓度加6孔作为平行样) , 空白对照加100 μl培养液, 溶剂对照加100 μl溶剂, 阳性对照加100 μl 10 g/L十二烷基磺酸钠溶液。分别在第12、24、48 h这3个时间点测其细胞毒性。

1.2.5 测定

处理结束2 h前每孔添加中性红溶液 (250 μg/ml) 50 μl, 继续培养2 h使存活细胞吸收色素。培养结束后, 倒去培养液, 加入固定液150 μl, 固定1 min。除去固定液, 加入抽提液100 μl, 室温放置20 min。轻轻摇晃使色素均匀析出, 使用Spectramax plus384酶联免疫光谱分析系统测定吸光度 (波长540 nm) 。

注:所有着色的孔均于第1天接种细胞 (100 μl/孔) 。○:不接种细胞 (测定时加抽提液100 μl作为本底值) ;● :空白对照 (第3列, 加培养液100 μl) ;●:溶剂对照 (第4列, 加溶剂100 μl) ;●:处理组 (加不同浓度受试物溶液100 μl, 第5、第6列低毒, 第7列中毒, 第8列高毒;●:阳性对照 (第9列, 加1%十二烷基磺酸钠溶液100 μl) 。

1.3 统计学处理

采用SAS软件进行分析, 多组间均数比较用方差分析。

2 结果

如表1所示, 同一时间点、不同毒性的CSE对V79细胞的半数抑制浓度 (IC50) 表现均为由高向低, 即低毒组香烟IC50最高, 细胞毒性小, 高毒组香烟IC50最低, 细胞毒性大 (P<0.05) ;不同时间点比较, 各浓度组IC50值只是随着毒性作用时间的延长, 同时有所增大, 结果依然表现为低毒组>中毒组>高毒组 (P<0.05) 。本实验结果判定的最佳时间是12～48 h。

注:1) 与低毒组比较:P<0.05;2) 与中毒组比较:2) P<0.05。

3 讨论

细胞毒试验系国内外专家认同的一种传统体外实验, 国外已将其用于多种领域, 我国目前还未普遍开展, 仅在免疫学应用较广, 对香烟毒性检测报道较少。笔者依据细胞毒 (中性红法) 原理, 在北京疾控中心的大力帮助下, 首次在国内用于对香烟毒性快速检测的研究, 收到满意效果。本次试验结果证实, 体外细胞毒性试验应用于香烟毒性快速检测, 技术较为先进, 方法操作简便, 易于推广, 保护节约了动物, 可为疾控同道们提供技术参考。

本次试验结果表明, 不同品牌香烟毒性差别显著。在各不同时间段观察CSE对仓鼠肺细胞 (V79细胞) 作用, 发现低、中、高3个香烟组的IC50变化是有规律性的, 即由高向低发展变化, 在有限观察时间内, 该规律变化主要与受试物毒性有关。

笔者2006年曾研究建立了一种简单快速的生物学检测香烟毒性方法;2008年, 依据细胞毒试验技术原理, 又研究建立了一种新的体外检测香烟毒性的试验方法。采用两种技术方法同时对同一种香烟水溶液的毒性进行测试, 经统计学处理, 两者检测香烟毒性结果没有显著差异, 验证了细胞毒试验检测香烟毒性的技术是科学稳定的。两者相比, 相同点都是对香烟水溶液中毒性强弱检测评价, 都具有简单快速、结果直观、可信性强等特点。不同之处一是体外实验, 一是体内试验, 结果判定方法不相同。

香烟中的有毒有害毒物已严重危害人们的身心健康, 由此引发的多种疾病屡有发生, 及时、准确、快速检测香烟中的毒性, 是预防控制吸烟中毒的重要手段。国内外学者已经通过多种技术手段, 证实了香烟烟雾中有化学毒物几千种, 只有对香烟烟雾直接检测, 才能比较客观、科学地说明香烟对机体毒作用的大小。自从1959 年Russell 和Burch 提出“3R”观念后, “减少、改进和取代”动物实验的呼声和行动越来越多, 具有灵敏度高、成本低、耗时短的细胞毒性实验在筛选毒物方面的应用越来越多[6]。笔者建议政府验证推广这一技术用于对市售香烟毒性筛查, 早日将香烟食品化管理, 为烟民吸食低危害香烟提供技术支持。

参考文献

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细胞毒性试验 篇2

对古冶炼废渣中重金属进行总量分析,针对古冶炼废渣长久堆放后废渣浸出液的急性毒性进行探讨.结果表明:废渣中残留重金属(Zn+Pb)平均含量高达6.97%,经几百年风化与雨水淋滤.其中1.71%以上的.Zn+Pb已经释放到周围环境中.古冶炼废渣浸出能力减弱,废渣中Zn仅部分点位有极少量浸出,Pb的浸出量甚至在检出限以下,Cr和Cd也仅有少量浸出.根据急性毒性试验结果,样品采用限度试验法进行急性毒性试验.急性毒性试验结果表明废渣水浸液小鼠急性经口LD50(半数致死量)大于20 mL/kg・bw.在实验过程中小白鼠没有出现死亡,行为也未见异常,但小白鼠体重增长明显下降.实验结束时对小鼠作肝、肾脏解剖学检查,未发现肝、肾器官异常改变,与对照组比较无明显差异.说明古冶炼废重金属含量依然很高,虽然经长时间风化淋滤其浸出毒性降低,但是急性毒性危害仍然存在.

作 者：李东伟 何岸宁 徐中慧 高先萍 Li Dongwei He Anning Xu Zhonghui Gao Xianping 作者单位：李东伟,Li Dongwei(重庆大学资源及环境科学学院,重庆,400030;重庆大学西南资源开发及环境灾害控制工程教育部重点实验室,重庆,400030)

何岸宁,徐中慧,He Anning,Xu Zhonghui(重庆大学资源及环境科学学院,重庆,400030)

高先萍,Gao Xianping(重庆市固体废物管理服务中心,重庆,400013)

细胞毒性试验 篇3

细胞毒性是医疗器械生物相容性评价的重要项目之一。GB/T16886.5-2005《医疗器械生物学评价—体外细胞毒性试验 (ISO 10993.5:1999, IDT) 》中给出了浸提液法、直接接触法、滤膜扩散法等方法的原则, 并简要介绍了细胞毒性可定性或定量评价, 但该标准并未给出各方法的标准操作程序 (SOP) 。MTT法是一种经典的定量细胞毒性试验方法, GB/T14233.2-2005给出了该方法的SOP, 目前国内广泛采用这一方法对医疗器械进行细胞毒性评价。我国尚未转化的ISO10993-5:2009 (以下称2009版国际标准) 较1999年版本发生了较大变化, 新版标准具体化了细胞毒性试验方法, 在附录c中详细给出了MTT法细胞毒性试验的SOP, 该SOP与GB/T14233.2-2005给出方法有较大不同。不同的MTT试验方法对同一待检物会是否能得出一致的结果是本研究要解决的问题, 这关系到能否对待检物做出客观科学的评价。

1 材料与方法

(1) L929细胞系 (ATCC) , MEM细胞培养基, 3- (4, 5-二甲基噻唑-2) -2, 5-二苯基四氮唑溴盐 (简称MTT) 。

(2) 取100μL浓度为1×104/m L, 1.5×104/m L, 2×104/m L, 5×104/m L, 8×104/m L, 1×105/m L, 2×105/m L的L929细胞分别接种于96微孔板中, 相当于每孔分别接种细胞数约1×103, 1.5×103, 2×103, 5×103, 8×103, 1×104, 2×104, 培养4 h~120 h, 每24 h以MTT掺入的方式监测细胞增殖情况并绘制生长曲线。

(3) 同一被检物分别应用GB/T14233.2-2005及ISO10993-5:2009给出的MTT试验方法检测其细胞毒性。

2 结果与讨论

2.1 不同起始细胞密度L929细胞生长曲线测定

当接种浓度较低为1×104/m L, 1.5×104/m L, 2×104/m L时, L929细胞在72 h之前都处于增殖缓慢状态;在8×104/m L, 1×105/m L两个个浓度下, 细胞在生长24 h后进入对数生长期, 并在72~96 h进入平台期;2×105/m L浓度组细胞贴壁后即进入对数生长期, 48 h起即进入平台期。如表1, 不同起始接种浓度L929细胞随培养时间生长增殖情况, 以酶标仪570nm与630nm测定吸光度差值表示;图1直观显示了细胞生长曲线。

细胞生长进入对数生长期之前, 对生长环境的变化反应较敏感, 因此为排除细胞本身生长带来的干扰, 细胞毒性试验应选择处于对数生长期阶段给予刺激物, 以真实反应待检物对细胞生长的抑制程度, 这一点在2009版国际标准中特别进行了强调。

2.2 同一被检物细胞毒性试验

选取一高分子材料分别应用GB/T14233.2-2005及ISO10993-5:2009给出的MTT试验方法检测其细胞毒性, 结果如下:

(1) GB/T 14233.2-2005中8.5.6 a) 方法:L929初始接种浓度为1×104/m L, 生长24 h后加入待检物浸提液, 培养72 h, 细胞相对增殖率为15.9%, 可判为有毒性。

(2) ISO 10993-5:2009附录c方法:L929初始接种浓度为1×105/m L, 生长24 h后加入待检物浸提液, 培养24 h, 细胞相对增殖率为94.3%, 可判为无毒性。

同一待检物以不同MTT试验方法得到完全不同的细胞毒性结果, 对需做出依据试验结果做出合格判断的机构来说会带来很大困惑。

从图1生长曲线可以看出GB/T 14233.2-2005方法要求接种细胞的初始浓度较小, 细胞在生长24 h后还未进入对数生长期, 对任何因素的变化都会有较敏感的反应, 可能会放大待检物微小的细胞抑制作用;而在ISO 10993-5:2009方法中, 细胞初始接种量是GB/T 14233.2-2005的10倍, 24 h后细胞已进入对数生长期, 可较客观地反应待检物对细胞生长的影响。

根据细胞生长曲线, 还有一个需要特别注意的问题:“加入待检物后, 细胞还应培养多久?是不是越久越能反应出待检物的毒性?”

2009版国际标准规定:在待检物作用24 h后细胞读取结果, 这时候对照组细胞仍应处于对数生长期, 实验组与处于对数生长期的对照组相比较得到其真实增殖率;如果待检物加入后培养48 h或更长时间, 从图1可以看到, 这时候对照组已开始进入平台期, 进入平台期后细胞的增殖会受到抑制并开始凋亡, 而当待检物对细胞只有抑制作用而非杀伤作用时, 实验组细胞生长达到平台期的时间会延后, 经过较长时间的培养后, 实验组细胞的增殖程度可能反而会赶上或超过对照组, 当计算相对增殖率时会得到假阴性结果, 也就是说有时延长培养时间反而不能反映出待检物的细胞毒性。

综上, MTT试验的标准操作规程 (SOP) 需明确规定合理的细胞初始接种量及待检物加入后的培养时间, 不能在SOP中出现弹性的要求, 如“加入待检物后培养时间不小于24 h”, 或“培养24~72 h”;当细胞相对增殖率超过100%时, 要特别密切关注试验的原始吸光值, 分析结果是否合理;如应用编好的程序直接读取细胞相对增殖率, 不记录原始吸光值度, 则会产生较大风险。

3 结论

应依据所应用细胞系生长特性, 选择MTT法细胞毒性试验条件, 并应标准化, 随意改变试验条件会得到不同的试验结果, 不利于对医疗器械细胞毒性进行客观、科学的评价。

摘要：细胞毒性是医疗器械生物相容性评价的重要项目之一。四唑盐MTT法是经典定量细胞毒性试验方法, 该实验研究了细胞浓度、培养时间对试验结果的影响。结果表明应用不同试验条件的MTT法对同一待检物会得到不同的细胞毒性结果, 因此标准化MTT试验方法对医疗器械细胞毒性试验评价非常重要。

关键词：MTT法细胞毒性试验,细胞生长曲线,L929细胞系

参考文献

[1]GB/T 14233.2-2005医用输血、输液、注射器具检验方第2部分:生物学试验方法[S].

细胞毒性试验 篇4

来源: CDE 作者: 审评四部 王庆利 时间: 2002-11-28 15:23:18审评四部王庆利

摘要：日本是受沙利度胺危害最大的国家，对其具有深远的影响。直至近日，日本对药物生殖毒性的要求依然是ICH三方最为严格的一方。1963年日本制定了最初的胎儿试验法，1965年进行了修订。1975年进行了全面修订，制定了所谓的三段生殖发育毒性试验法，并在1984年和1988年进行了部分修正。在1993年接受ICH生殖毒性指导原则。其后日本对生殖毒性试验方面进行了深入的研究，特别是在雄性生育力试验方面作出了积极的探索，其研究的相关结果被纳入了ICH指导原则中。2002年日本发布了生殖发育毒性试验的最新版本，本文介绍了该指导原则的主要内容。关键词：日本 药物生殖毒性试验 技术指导原则

基本目的利用哺乳动物检验药物可能存在的一些对生殖发育的不良影响，并公开这些不良的影响，以用于对人的生殖发育的安全性/危险性的评估。试验方案三段试验方案是最实际的选择，通过限定给药时间来识别有可能发生损害的生殖发育阶段，该方法在一般情况下几乎对所有的药物都有效。但应根据药物特点、适应症、适用人群、药代动力学资料、其他药理毒理资料等方面进行科学灵活的考虑，如单一试验方案或两段试验方案等。无论选择何种研究方案，必须能充分暴露和评价药物的生殖毒性，并应说明选择的依据。试验动物不同的动物种属对药物的反应有很大差别，为了充分暴露毒性，更准确地外推至人，最好尽可能选用多种动物。但是从经济或其他的理由来看，选择多种动物是不现实的。在选择试验动物的时候应考虑：①是否宜于做为人类疾病模型。②受试物的代谢方式与人相类似。③由于在生殖毒性试验开始之前就清楚受试物在人体的代谢方式往往是很困难的，故通常使用那些操作比较容易，而且对其一般的代谢方式和生殖生理非常熟悉的动物。④对动物自发畸形的了解和对已知的能诱发生殖毒性物质的敏感性。大鼠作为试验动物使用的历史很长，有关其生殖生理的知识及其一般代谢方式已经相当清楚，具有性成熟期、妊娠期和哺乳期都比较短的优点，是生殖毒性研究中获得经验最丰富的动物，背景资料较多。由于致畸敏感期毒性导致的毒性后果相对更严重，日本对致畸敏感期试验特别重视，认为使用多种动物进行试验，在结果类推于人时，能够提供更为充实的试验结果支持。因此，要求啮齿类动物和非啮齿类动物要分别使用一种以上。家兔是首选的非啮齿类动物。家兔体形较大，胎仔观察比较容易，给予可致胎儿畸形的药物酞胺哌啶酮，可引起和人类似的畸形。同时，该段试验使用家兔经验丰富，背景资料较多。动物数未说明具体动物数的要求。应考虑：①动物对受试物的敏感性，②所采用试验方法，③所要求的精确性等。但通常每组16～20只动物用于评价，国内外取得了一致。给药途径和频率原则上是使用与人相同的给药途径。有多种给药途径时，首先应考虑能够出现最强反应的给药途径。选择与临床不同的给药途径时，应提供依据。①经口给药，通常使用胃管强制给药。掺食法由于动物的摄取忌避，往往达不到所期待的剂量，或是给药的剂量不准确，一般不采用。②注射给药必须注意受试物的性状及其局部毒性。静脉注射要注意注射的速度和防止药液的泄漏。使用稳定的注射速度是重要的。腹

披针叶黄华碱体外细胞毒性的研究 篇5

1 材料

1.1 试剂

黄华碱、四氢脱氧阿艮亭碱, 为笔者自披针叶黄华中分离而得;羟喜树碱 (规格为5 mg) , 黄石李时珍药业集团生产;胎牛血清 (FBS) , 杭州四季青公司生产;Hyq改良型RPMI-1640培养基, 海克隆生物化学制品 (北京) 有限公司生产;DMEM培养基, 青岛蓝雁绿检生物技术有限公司生产;四甲基偶氮噻唑蓝盐 (MTT) 、二甲基亚枫 (DMSO) , Amresco公司产品;胰蛋白酶、青霉素, 华北制药有限责任公司产品;链霉素, Gibco公司产品;96孔细胞培养板, Costar公司产品。

1.2 仪器

酶联免疫检测仪, 中国烟台艾德康生物科技有限公司生产;倒置显微镜, 日本奥林巴斯光学工业株式会社生产;CO2培养箱, 立德泰勀 (上海) 科学仪器有限公司生产;显微照相机, 中国杭州数明科技有限公司生产。

1.3 细胞株

SW480细胞、BHK细胞, 购自中国上海酶联生物科技有限公司。

2 方法

2.1 细胞的培养

SW480细胞使用RPMI-1640培养液培养, BHK细胞使用DMEM培养液培养, 并加入10%胎牛血清、1%抗生素 (青霉素和链霉素各10 000 U/mL) , 于37 ℃、5%CO2、100%湿度条件下培养。每2 d传代培养1次, 使细胞保持在对数生长期。黄华碱、四氢脱氧阿艮亭碱、羟喜树碱3种待测样品分别用DMSO溶解, 并以PBS溶液配制成1 mg/mL储备液, 于-20 ℃保存。测试前再用PBS溶液稀释成终浓度为0.1 mg/mL的待测溶液。用PBS溶液将MTT配成浓度为5 mg/mL的母液, 于4 ℃避光保存[5]。

2.2 细胞体外毒性试验 (MTT法)

2.2.1 原理

MTT可被活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原成蓝紫色结晶物甲攒, 而死亡细胞无此功能, 通过测定反应产物甲攒颜色的深浅来反映活细胞数量的变化。蓝紫色结晶物可以溶于DMSO中成为蓝紫色溶液, 溶液颜色深浅与活细胞数量成正比, 可用酶标仪在波长为490 nm处测定OD值, 比较阴性对照组与药物组的OD值得出抑制率[6,7,8]。利用此原理可测定经抗肿瘤药物作用后肿瘤细胞吸光度值的变化, 并计算出肿瘤细胞存活率, 从而推测肿瘤细胞对某种抗肿瘤药物的敏感程度。

2.2.2 药液配制

生物碱均用PBS溶液稀释, 溶液设6个浓度梯度, 黄华碱的6个浓度梯度为0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/mL, 四氢脱氧阿艮亭碱的6个浓度梯度为0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 mg/mL, 羟喜树碱的6个浓度梯度为0.031, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg/mL, 用无菌过滤器过滤后使用。

2.2.3 试验分组

选取96孔细胞培养板的第1, 2列为空白组, 第3, 4列为阴性对照组, 第5～10列为药物组和阳性对照组。空白组:只加培养基不加SW480细胞或BHK细胞。阴性对照组:加培养基和SW480细胞或BHK细胞, 但不加药物。药物组:加培养基和SW480细胞或BHK细胞, 培养24 h后添加生物碱。阳性对照组:加培养基和SW480细胞或BHK细胞, 培养24 h后添加抗癌药羟喜树碱。

2.2.4 操作

取对数生长期的SW480细胞或BHK细胞用于试验, 在96孔细胞培养板的第1列和第2列每孔加入150 μL DMEM培养基, 第3～10列每孔加入150 μL生长良好的SW480细胞或BHK细胞 (每孔约含2×104 个细胞) , 在37 ℃、5 %CO2和100%湿度条件下培养24 h;第1～4列每孔加入20 μL PBS溶液, 第5～10列每孔加入20 μL不同浓度样品, 每种样品设6组浓度, 每组浓度设8个平行孔, 继续培养48 h;然后每孔加入5 mg/mL 的MTT溶液20 μL继续培养4 h;弃去培养液, 各孔分别加入DMSO 150 μL, 振荡10 min待结晶完全溶解后, 用酶标仪于波长为490 nm处测定OD值[9,10], 并计算细胞生长抑制率。 计算公式:细胞生长抑制率= (阴性对照组OD值的平均值-药物组OD值的平均值) /阴性对照组OD值的平均值×100 %[11,12]。

3 结果与分析

试验采用MTT法测试了3种化合物对BHK细胞、SW480细胞的细胞毒性, 根据酶标仪测出96孔细胞培养板OD值并计算出药物各种浓度对2种细胞的抑制率, 结果见表1。

由表1可知:当黄华碱浓度为2, 1, 0.5 mg/mL时对BHK细胞有抑制作用, 当浓度小于0.5 mg/mL时抑制作用很弱;当黄华碱浓度为2 mg/mL和1 mg/mL时, 对SW480细胞有较好的抑制作用。

四氢脱氧阿艮亭碱各浓度组对BHK细胞均表现一定抑制作用, 当浓度为8 mg/mL和4 mg/mL时对BHK细胞有很强的抑制作用, 细胞生长抑制率分别为53.6 %和36.6 %, 低浓度组对BHK细胞也有一定抑制作用。四氢脱氧阿艮亭碱浓度为8 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL时均对SW480细胞有强抑制作用, 当浓度为1 mg/mL时对SW480细胞仍有27.9 %抑制率, 浓度为8 mg/mL时抑制率高达81.6 %。

羟喜树碱各浓度组对BHK细胞和SW480细胞均有很强抑制作用, 各浓度组对细胞生长抑制率均在20.0%以上, 最高可达52.3%, 抑制率随着药物浓度的增加而升高。

各药物作用后细胞的变化见182页彩图1～4。

4 结论

试验应用MTT法测定了黄华碱、四氢脱氧阿艮亭碱和羟喜树碱对正常BHK细胞和SW480癌细胞的体外细胞毒性作用。结果发现, 四氢脱氧阿艮亭碱表现出较强的抑制癌细胞生长活性, 随着药物剂量的增加, 抑制率也明显升高。羟喜树碱对2种细胞的毒性作用明显, 无论是对BHK细胞还是对SW480细胞在各浓度组均有较好抑制。黄华碱对BHK细胞毒性低, 浓度为2 mg/mL时对SW480细胞抑制率为20.7%, 有一定的抑制效果。

参考文献

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[11]王惠兰, 刘影, 张小茗, 等.大蒜素与顺铂单独及联合应用对子宫颈癌裸鼠移植瘤生长的影响[J].中华妇产科杂志, 2006, 41 (8) :566-567.

细胞毒性试验 篇6

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验细胞选取L929小鼠成纤维细胞株,购自中国科学院上海细胞所。主要药品与试剂:RPMI1640培养液(GIBCO,USA),胎牛血清(杭州四季青生物工程公司),MTT(AMRESCO,USA),DMSO(AMRESCO,USA)。

1.2 试验方法

1.2.1 MTT(四唑盐)比色法

取无菌型与消毒型医用超声耦合剂,按照1 mg/mL、5 mg/mL、25 mg/mL、100 mg/mL及200 mg/mL的比例分别加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,并置于37 oC放置24 h制备浸提液。取高密度聚乙烯浸提液作为阴性对照品;5%的DMSO溶液作为阳性对照。将培养至近汇合的L-929细胞消化,稀释为1×104 U/mL与1×105 U/mL,分别接种于96孔培养板中,每孔加入100μL。在37 oC、5%CO2培养箱中培养24 h,待细胞贴壁后将每孔中原培养液吸除。空白对照组加新鲜培养液200μL,各组加样品200μL:阴性与阳性对照样品浸提液,置CO2培养箱中继续培养。于更换培养液后的24 h将细胞接种密度为105个的培养板取出,置倒置显微镜下观察细胞形态。并每孔加入20μL质量浓度为5 g/L的MTT溶液,继续培养4 h后弃去孔内液体,加入200μL DMSO,置振荡器上振荡10min后,选择570 nm在ELX800UV型酶标仪上测定光密度(optical density,OD)值,按以下公式计算相对增殖率(relative growth rate,RGR):RGR=试验组吸光度值/对照组吸光度值×100%,并判定细胞毒性级别。

于更换培养液后的72 h将细胞接种密度为104个的培养板取出重复以上MTT试验。

1.2.2 琼脂覆盖法

将培养至近汇合的细胞稀释成2.5×105 U/mL接种于6孔培养板中,设阴性对照组、阳性对照组及样品组,每组设3个平行样,各孔加入2 mL,放于CO2培养箱中培养至近汇合状态。将溶化的琼脂培养基与2倍浓缩的含10%血清的RPMI 1640培养基等比混合制成混合琼脂培养基,使琼脂的最终浓度为2%。弃去上清后每孔加入2 mL混合琼脂培养基,待琼脂层凝固后,分别加入2 mL新鲜配制的0.01%中性红活体染色剂,置于暗处染色20 min后取出,吸除多余的染色剂,分别取无菌型及消毒型医用超声耦合剂均匀涂布于无菌滤纸片上并放置于固化的琼脂层上,样品约覆盖细胞层表面十分之一,阴性对照选用直径约5 mm、厚约2 mm的高密度聚乙烯圆片,阳性对照选用直径约5 mm用20%苯酚溶液浸湿的医用明胶海绵,置CO2培养箱中继续培养24 h后于倒置显微镜下观察细胞溶解及褪色的情况,并对细胞毒性的级别进行判定。

1.3 数据处理

数据以平均值±标准误(Mean±SEM)表示,用计算机统计软件包Statistica对数据作Students’t检验,确定差异显著性。

2 结果

2.1 MTT(四唑盐)比色法

表1、表2分别为无菌型医用超声耦合剂在不同的浸提比例情况下,不同接种密度对L-929细胞增殖度的影响与细胞毒性的级别。由表1可以看出,在细胞接种密度为104 U/mL时,超声耦合剂对L-929细胞的增殖率存在影响。在浸提比例为1 mg/mL、5 mg/mL时,细胞毒性反应为1级、2级,而当浸提比例超过5mg/mL时,耦合剂对细胞的毒性作用极其显著,达到3、4级。表2显示,当细胞密度为105 U/mL时,浸提比例达200 mg/mL时,无菌型超声耦合剂才对细胞有显著的毒性作用,细胞毒性达3级。

2.2 琼脂覆盖法

表3显示,用琼脂覆盖法检测无菌型医用超声耦合剂的细胞毒性为1级。

3 讨论

临床操作中,普通(外用)耦合剂需与皮肤、探头辐射面密切接触,故除声学特性外,耦合剂还须满足不刺激皮肤、不损坏探头、不脏污衣物的要求。随着医学的发展,医用超声耦合剂的配方已几经更新换代,现国内正式生产的产品多为卡波姆凝胶型,除了在完好皮肤上使用的通用型制剂外,还有用于腔内和术中的无菌型凝胶制剂,少数企业已研制生产了消毒型制剂。为了保证临床使用的安全性,新版的医用超声耦合剂标准按照生物学评价的思路,将老版本上的“卫生要求”改为了“生物相容性”,分别对细胞毒性、皮肤致敏和刺激作出了要求。可见,医疗器械生物安全性评价在产品性能指标中占有十分重要的地位。标准中要求用直接接触法检测耦合剂的细胞毒性,但是该方法对材料的要求较高,耦合剂产品为凝胶状无固定形状,并且具有一定的水溶性,故采用该方法在实际操作中会出现很多问题。

本试验采用的MTT比色法是浸提液法的一种,用于细胞毒性的定性和定量评价,该法对受试材料溶出物的毒性检测敏感性较高,也比较符合动物体内的毒性试验结果[2]。结果显示,医用超声耦合剂对L-929细胞具有毒性作用,且与其产品类型及添加成份相关,并表现出一定的剂量依赖性。利用MTT法检测耦合剂的细胞毒性时,同一浸提比例的试验结果在不同的细胞接种密度及作用时间下显示出较为明显的差异。如在浸提比例为1 mg/mL、5 mg/mL及25 mg/mL时,细胞接种密度为1×104 U/mL、作用时间为72 h无菌医用超声耦合剂的细胞毒性分别为1、2、3级,而密度为1×105 U/mL、作用时间为24 h均未表现出细胞毒性。这些结果提示,细胞毒性检测结果与浸提液制备方法、细胞接种密度以及浸提液作用时间密切相关。浸提液制备方法直接决定了作用于细胞的毒性物质的多少,而细胞接种密度关系到细胞对一定量的毒性物质的敏感程度。本研究试验结果显示,在同一浸提比例下,细胞接种密度大的所反映出的毒性作用小,即高接种密度降低了细胞对毒性的敏感程度。当毒性物质的量一定而细胞接种密度适宜时,作用时间越长,试验组与空白对照组的正常细胞差距越大,表现出的毒性作用越明显。

本试验采用的另一种方法琼脂覆盖法是间接接触法的一种,该方法对材料的要求比直接接触法低,使用的材料范围广,其缺点是受溶出物在琼脂上扩散程度的影响,当溶出物分子量小,易溶于水,其敏感性就高,反之则低[2]。该方法是一种定性评价方法,在结果判定时褪色区域的大小及溶解细胞的比例都是通过试验者的观察实现的,受到一定的主观影响。在本试验中,结果显示该无菌型耦合剂体外细胞毒性为1级,但不能对其结果作出量化的比较。

由此可见,各类型细胞毒性检测试验的原理与方法各不相同,而各方法中又有很多影响检测结果的参数,根据试验材料本身的理化性质、毒性作用强弱及其用途正确的选择试验方法及相关参数十分重要。孙皎认为,生物学评价试验的现行标准不完善,生物学评价试验的方法和评判依据主要参照现行的相关标准文件,而标准推荐的方法并非一定代表当今生物学和医学领域中最先进、最有效和最适合的检测手段[5]。对于医用超声耦合剂产品而言,如何更科学、更准确的评判其细胞毒性的方法尚有待进一步的研究和明确。

摘要：应用MTT比色法和琼脂覆盖法检测无菌耦合剂的细胞毒性。MTT比色法检测时,同一浸提液在细胞接种密度高时,毒性级别低,反之亦然。同一材料琼脂覆盖法检测的细胞毒性结果与MTT法的结果也不一致。由于MTT比色法具有定量评价的优点,更适合耦合剂的细胞毒性检测,但是必须明确试验条件以及浸提液制备方法。建议进一步完善医用超声耦合剂体外细胞毒性检测方法。

关键词：医用超声耦合剂,细胞毒性,琼脂覆盖法,MTT比色法

参考文献

[1]国家食品药品监督管理局.YY0299-2008医用超声耦合剂[S].

[2]贾文英,史弘道.细胞毒性试验评价医用装置生物相容性的研究概况[J].实用美容整形外科杂志,2001,12(5):253-255.

[3]由少华.解读GB/T16886《医疗器械生物学评价》系列标准[J].中国医疗器械信息,2005,11(1):15-19.

[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T16886.5-2003医疗器械生物学评价第5部分体外细胞毒性试验[S].

细胞毒性试验 篇7

关键词：细胞毒性药物 (CD) ,静脉药物配置中心 (PIVAS) ,职业危害,防护措施

细胞毒性药物 (Cytotoxic drugs, CD) 是指在生物学方面具有危害性影响的一类可有效杀伤免疫细胞并抑制其增殖的药物。多为临床常用的抗肿瘤药物, 这类药物一旦通过皮肤接触或吸入等方式摄入低剂量就能造成包括生殖、泌尿及肝肾系统的毒害, 具有致癌、致畸、生殖毒性[3]。药物配制不当时, 其悬浮粒或液滴溢出, 经呼吸道或皮肤沾染低剂量下就可以对人体器官产生危害。在传统的配制环境中, 护理人员是高危人群。目前, 建立对细胞毒性药物集中配制机构是有效降低职业危害的方法。静脉药物配置中心 (Pharmacy intravenous admixture services, PIVAS) 是根据国际标准建立的集临床药学与科研为一体的医疗机构。它是在符合GMP标准、依据药物特性设计的操作环境下, 由受过培训的药学技术人员, 严格按照操作程序, 进行包括全静脉营养液、细胞毒性药物和抗生素等静脉用药的配置, 为临床药物治疗与合理用药服务[4]。我院是肿瘤医院, 细胞毒性药物使用较广泛, 2005年11月成立静脉药物配置中心运行至今, 为有效降低细胞毒性药物对药护人员造成的职业危害起到了重要作用。但PIVAS药护人员在调剂和配置过程中, 每天集中接触大量的细胞毒性药物等, 所受的职业危害仍然相对较大。本文结合药物配置中心的具体工作, 依据相关管理制度及安全操作规程、规范, 对照配置过程中存在的问题, 完善防护措施, 最大限度地减少细胞毒性药物对药护人员造成的职业危害。

1 资料与方法

1.1 一般资料

我院PIVAS建立于2005年11月, 目前配有19名药护人员, 其中药师7名, 护士12名;男4名, 女15名;年龄21~48岁, 平均年龄 (26.3±10.2) 岁。均有较好的医、护、药理论基础和较强实践操作技能, 经过专业培训考核合格后上岗, 健康状况良好。药师负责进药、审方、摆药及核对, 护士负责药物配制及核对。中心配备有10万级洁净间、万级配置间和百级生物安全柜。

1.2 方法

依照卫生部《静脉用药集中调配质量管理规范》[1]及《静脉药物配置中心实用手册》[2]有关静脉药物配置中心工作流程、管理制度、安全操作规程、规范, 对细胞毒性药物配置过程中存在的问题进行持续改进。

2 配置过程中存在的危害

2.1 对层流台的认识不足致违规操作

护士不遵守生物安全柜操作规程, 操作时阻挡回风口;配置室护士频繁走动、打开传递窗等影响净化环境空气流向、流速及室内空气压力, 使生物安全柜内不能维持相对负压, 有毒药物气雾污染配置环境。

2.2 药物配置过程中的接触与暴露

护士在药物配置打开安瓿时药粉或药液、玻璃碎片飞溅;药瓶溶解前未减压排气, 拔针时药液喷出;意外针头刺伤;容器渗漏或破裂;药物溢出到生物安全柜内或其他配置环境中;护士在连续操作过程中被接触药液的手套污染治疗台、推车、凳及生物安全柜等。

2.3处理废弃物过程中的接触与暴露

药品空安瓿、西林瓶、注射器及使用过的治疗巾、手套等未按照要求严格封闭处理, 接触过细胞毒性药物的抹布重复使用或暴露在室内空气中, 不正确清除溅出或溢出药物等都会造成环境污染。

3 防护措施

3.1 正确使用生物安全柜

生物安全柜依据药物特性而设计, 考虑到安全柜内垂直风的压力不能大于配置间内空气压力, 防止混有药物气雾的空气流入室内, 安全柜吸风口应保持通畅, 经过过滤处理后空气方能排出室外。因此, 护士要严格遵守操作规程, 配置操作前30 min必须启动净化装置包括净化环境及生物安全柜, 操作时各类物品必须严格有序、标准统一地放置于生物安全柜内, 物品占地必须控制最小化, 生物安全柜内操作时必须在规定区域内进行, 任何物体都不能阻挡吸风口, 以保证空气流通一致性, 维持相对负压, 防护玻璃开启不超过18cm, 防止药液溅。操作完毕后对生物安全柜应进行彻底清洁, 先用蒸馏水擦洗, 再用75%乙醇擦拭, 防止药液残留。当生物安全柜内的药物溢出时, 在清除掉溢出药物和清洗完药物溢出的地方后, 应该对整个安全柜的内表面进行另外的清洁, 使用工作手套将任何碎玻璃放入位于安全柜内的防刺容器中, 安全柜的内表面, 包括各种凹槽内都必须用清洁剂彻底清洗, 如果溢出药物污染了高效微粒气体过滤器, 则整个安全柜都要封在塑料袋中, 直到过滤器被更换。

3.2 加强仪器设备监测与维护

每天记录配置室内空气、压力差和温湿度, 每周清洗回风口及初级过滤器材, 保证最佳的换风次数及进口、回风作用, 每年定期由专业人员监测净化环境进风次数、风速大小及空气微粒数、空气压力差等, 并每月用采点法对净化环境的空气进行细菌培养, 根据结果决定高效过滤器更换时间, 确保配置环境的安全。

3.3 严格执行细胞毒性药物安全操作

(1) 配制前准备, 药师接收医嘱信息排药核对后, 在细胞毒性药物标签上贴上区分标记, 配置人员必须穿无纤维防渗透隔离衣、戴口罩、化学防护目镜及戴双层手套 (聚氯乙烯手套外再套一层乳胶手套) 。配制前操作台铺设一块一次性无菌布, 以便吸收溢出的药液。 (2) 规范配置流程, 配置全过程 (包括打开安瓿、摇匀、混合等) 要在生物安全柜内进行, 不得越过玻璃屏障在安全柜外抽药或加药。打开粉剂安瓿时, 用无菌纱布包裹, 以免药物气雾飞溅。溶解粉剂药物时, 溶媒应沿瓶壁缓慢注入瓶底, 待药粉浸透后再晃动。使用大容量注射器抽取药液, 所抽药液不宜超过注射器容量的3/4, 防止药液外溢。切割安瓿时应轻弹其颈部, 打开安瓿时应垫以纱布, 以防割破手套。操作结束后, 应将废弃物置专用封闭袋中, 送到指定处集中处理。

4 结果

通过对静脉药物配置中心进一步安全管理, 强化了各项规章制度, 提高了细胞毒性药物配制人员职业暴露防范意识, 无1人发生与细胞毒性药物有关的职业伤害, 未发生与细胞毒性药物有关的环境污染。

5 讨论

目前, 细胞毒性药物已在临床广泛应用, 它在发挥作用的同时也非选择性的对配置者产生伤害, 操作人员自身防护未引起足够的重视。因为细胞毒性药物对职业人群的危害作用绝大部分是滞后、潜在的具有不确定的近期和远期毒性[5]。我院依规每年定期为接触细胞毒药物药护人员进行体检, 合理安排休假, 护士怀孕和哺乳期可考虑暂时脱离接触药物的环境。

防护知识的缺乏将直接影响专科护理人员对于细胞毒性药物知识的掌握。调查显示, 护理人员对细胞毒性药物安全防护认知程度低, 且不了解细胞毒性药物配制的合适环境, 尤其对细胞毒性药物的药理相关性知识的掌握比较欠缺[6], 因此, 进行专职培训, 制定接触细胞毒性药物操作规程及安全防护措施, 是提高护理人员职业暴露防范意识的关键。我院通过对静脉药物配置中心在配置细胞毒性药物过程中存在的安全问题, 依照卫生部《静脉用药集中调配质量管理规范》及《静脉药物配置中心实用手册》有关工作流程、管理制度、安全操作规程、规范, 进行持续改进, 进一步完善了安全管理, 强化了各项规章制度, 提高了细胞毒性药物配制人员职业暴露防范意识, 从而最大限度地减少细胞毒性药物对药护人员造成的职业危害。

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部.静脉用药集中调配质量管理规范[M].北京:人民卫生出版社, 2010.

[2]蔡卫民, 袁克俭, 主编.静脉药物配置中心实用手册[M].北京:中国医药科技出版社, 2005.

[3]潘慧, 张渊, 郭彦琨, 等.常用细胞毒性药物的配伍稳定性及使用安全性探讨[J].中国药师, 2011, 14 (10) :1526-1529.

[4]刘艳秋, 陈东海.静脉药物配置中心抗肿瘤药物管理体会[J].现代医院管理, 2012, 10 (1) :59-60.

[5]强兰君.配置细胞毒药物的职业防护[J].护理研究, 2010, 24 (2) :528-529.

柞蚕幼虫急性毒性试验研究 篇8

虽然柞蚕幼虫的食用现今较为普遍,但还未被国家定为普通食品,它的食用对机体是否有毒性,未见资料报道。急性毒性试验是毒理研究的早期阶段,对明确新资源食品的毒性很有意义。为了进一步探索柞蚕幼虫的食用安全性,我们进行了柞蚕幼虫的急性毒性试验[4,5],给柞蚕幼虫综合利用及开发新资源食品提供毒理学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

取吉林省蚕业科学研究院柞蚕实验种场5龄后期的柞蚕幼虫,饥饿12 h后,-18℃冷冻,再经冷冻干燥,粉碎后即为试验样品。

1.2 实验动物

SPF级ICR小白鼠20只,雌、雄各半,体重18.0～22.0 g,饲养温度20～22℃,相对湿度55%～65%。

1.3 测定方法

依据《食品安全性毒理学评价程序和方法》(GB15193.1～15193.21—2003)中GB15193.3—2003急性毒性试验的最大耐受剂量法。

试验设20.0 g/KgBW一个剂量组,取16.7 g受试物溶于蒸馏水至50 mL容量瓶混匀定容,采用经口灌胃方式给予受试物,间隔4 h二次灌胃,每次灌胃量为0.3 mL/10 gBW。

将小鼠禁食16 h(当日16时30分至次日8时30分),不限制饮水,按体重要求选用雌、雄小鼠各10只,称重、染号、经口灌胃给予受试物。

灌胃后观察14 d,主要观察小鼠的中枢神经系统及躯体运动有无改变姿势、叫声异常、运动失调等;胃肠系统有无气胀,腹泻或便秘等。记录出现中毒症状的时间。如果动物有死亡,记录死亡数、死亡时间,对死亡动物做大体解剖。在第14天称量体重,计算增重。

2 试验结果

将试验结果统计列表,见表1。

由表1可见,受试柞蚕幼虫粉灌胃小鼠,试验期间各组小鼠无改变姿势、叫声异常、运动失调等;胃肠系统无气胀,腹泻或便秘等,未见中毒症状、死亡数为零。

3 结论

经口给予雌、雄小鼠20.0 g/kgBW柞蚕幼虫粉,小鼠不出现死亡,则可认为柞蚕幼虫对小鼠的经口急性毒性最大耐受剂量大于20.0 g/kgBW,即雌、雄性小鼠:MTD>20.0 g/kgBW。按我国食品毒理急性毒性分级[3],该样品属无毒级,表明了柞蚕幼虫的食用安全性。

参考文献

[1]辽宁省蚕业科学研究所.中国柞蚕[M].辽宁:辽宁科技出版社,2003.

[2]苏秀榕,李太武,欧阳芬.柞蚕蛹蛾营养成分的分析[J].蚕业科学,1996,22(4):265-266.

[3]田兰英,朱兴友,刘隽彦,等.柞蚕幼虫营养成分研究[J].北方蚕业,2011,32(3):11-12.

[4]胡福良,陈盛禄,林雪珍,等.工蜂幼虫和蛹的急性毒性试验[J].养蜂科技,1999(4):2-3.

纳米雄黄的急性毒性试验研究 篇9

1 材料

1.1 试验动物与饲养管理

6~8周龄SPF级Balb/c小鼠80只, 体重为20~22 g, 雌雄各半, 生产许可证号为SCXK (甘) 2009-0004, 使用许可证号为SYXK (甘) 2009-0005, 由兰州大学基础医学院实验中心提供。小鼠饲养于兰州大学基础医学院实验中心SPF屏障环境内, 饲喂北京科澳协力饲料有限公司生产的SPF鼠料, 饮用水经杭州洁达净化科技有限公司生产的实验动物饮用水处理器处理。小鼠自由采食和饮水;所用垫料经高压灭菌, 每周更换2次;饲养室内每次换完垫料后用84消毒液对地板及所用器具消毒, 并且每周用紫外线照射消毒1次。在试验前连续观察7 d, 确定临床健康即可进行试验。

1.2 主要仪器与试剂

全自动生化分析仪, 日本株式会社日立高新技术科技有限公司生产;超净工作台, 苏州净化设备有限公司生产;光学显微镜, 日本Olympus公司生产;恒温气溶摇床, 丹麦Heto公司生产;手提式不锈钢蒸气消毒器, 上海审安医疗器械厂生产;电热恒温培养箱, 上海一恒科技有限公司生产;血液生化检测试剂盒, 北京柏定生物工程有限公司生产。

1.3 纳米雄黄

雄黄原药粉, 西安中药集团公司生产, 采用球磨法制成纳米微粒[3]。称取纳米雄黄4 g, 加入10 m L用KCl饱和的硝酸溶液, 置于恒温气溶摇床上摇至溶解;再用Na OH调p H值至7.2左右, PBS定溶, 配成浓度为2 mg/m L的储存液, 过滤除菌, 4℃保存, 备用。

2 方法

2.1 预试验

预试验前对小鼠进行7 d的喂养试验, 观察期内小鼠自由采食和饮水, 每日空腹称重, 确定临床健康。预试验旨在找出受试物的0, 100%估计致死量, 以此确定正式试验分组的组距[2,4]。预试验时将小鼠随机分成4组, 每组5只, 各组经口灌胃等体积不同浓度药物, 组间给药浓度以约1.56倍递增。4组分别为对照组、药物1组 (32.00 mg/kg) 、药物2组 (50.00 mg/kg) 、药物3组 (78.00 mg/kg) 。每个药物组灌胃1次, 对照组灌胃等体积的纯化水, 试验时间为7 d。

2.2 正式试验

2.2.1 分组

正式试验时将Balb/c小鼠随机分成6组, 即5个不同剂量的给药组和1个空白对照组, 每组10只, 雌雄各半。

2.2.2 急性毒性试验

灌胃前禁食、不禁水8 h, 用金属灌胃针头一次性经口灌胃等体积不同浓度药物, 每只小鼠按10 g体重给药0.2 m L, 空白对照组小鼠灌胃等体积的生理盐水[5,6]。

2.2.3 临床表现

给药后观察小鼠的精神状态、饮食情况、被毛光泽度、死亡情况等临床表现, 前3 d每隔3 h观察1次, 3 d以后每隔6 h观察1次, 连续观察7 d。

2.2.4 剖检变化

及时剖检死亡小鼠, 记录病变情况, 试验结束后用颈椎脱臼法处死小鼠, 解剖, 观察有无肉眼可见的病理变化, 必要时进行病理组织学检查, 快速取所有小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏, 制作石蜡切片, 显微镜下观察各脏器的病理变化并采集图片。

2.2.5 各剂量组小鼠体重变化

试验开始前和试验结束后分别称量各组小鼠体重, 记录数据。

2.2.6 各剂量组小鼠脏器系数变化

试验结束后用颈椎脱臼法处死小鼠, 在超净工作台上无菌操作依次取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、左肾、右肾, 分别用滤纸吸去各脏器表面的血液后称其湿重, 计算脏器系数, 计算公式:脏器系数=脏器绝对重量/体重×100%。

2.2.7 血液生化指标的检测

在试验结束前最后1天, 各组小鼠称完体重后从眶后静脉窦采血, 静置2 h后离心分离血清, 然后用全自动生化分析仪检测血清中的总胆红素 (TBIL) 、白蛋白 (ALB) 、总蛋白 (TP) 、谷丙转氨酶 (ALT) 、肌酐 (CREA) 、谷草转氨酶 (AST) 、碱性磷酸酶 (ALP) 、葡萄糖 (GLU) 、尿素 (BUN) 、肌酸激酶 (CK) 、胆固醇 (CHO) 、三酰甘油 (TG) 、钠 (Na) 、钾 (K) 、氯 (Cl) 共15项血液生化指标。

3 结果

3.1 预试验结果

通过预试验初步确定纳米雄黄的致死剂量范围在32.00~78.00 mg/kg之间, 根据预试验的给药剂量可得正式试验的剂量比 (r) 。, 式中:r表示相邻两组剂量的比值;a表示受试物的最大剂量;b表示受试物的最小剂量;n表示组数, 根据上式可得纳米雄黄正式试验的剂量比约为1.25。预试验结果见表1。

3.2 急性毒性试验结果

参照预试验结果, 按照约1∶1.25的等比级数设置剂量组, 分别为32.00 mg/kg、40.00 mg/kg、50.00 mg/kg、62.50 mg/kg、78.13 mg/kg, 按此剂量组进行急性毒性试验。采用改良寇氏法计算LD50及LD50的95%可信限[4]。经计算, 纳米雄黄的LD50=38.38 mg/kg, LD50的95%可信限为33.52~43.94 mg/kg。因此, 纳米雄黄对小鼠的经口LD50为1~50 mg/kg, 根据《兽药试验技术规范汇编———新兽药一般毒性试验技术要求》中规定, 经口LD50在<1 mg/kg以下为极毒, ≥1~<50 mg/kg为剧毒, ≥50~<500 mg/kg为中等毒, ≥500~<5 000 mg/kg为低毒, ≥5 000 mg/kg以上为实际无毒。据此判定纳米雄黄属于剧毒范畴[3]。纳米雄黄对Balb/c小鼠死亡率的影响见表2。

3.3 观测指标

3.3.1 临床表现

在试验期间, 空白对照组和给药组小鼠均自由采食和饮水。试验过程中空白对照组小鼠体重逐渐增加;给药组小鼠体重在1~3 d时有所下降, 此后又逐渐回升。1~3组小鼠在灌胃后略有不适, 采食量、饮水量及活动量减少, 24~48 h恢复正常。4~5组小鼠在灌胃后精神倦怠, 活动量减少, 被毛竖立, 光泽度降低, 死亡前不吃不喝呈蜷缩状。4组小鼠灌胃2~3 d后存活, 采食量、饮水量均呈增加趋势, 活动增多, 毛色光泽度转好。以78.13 mg/kg剂量灌胃后小鼠在48 h内全部死亡。剖检死亡小鼠, 大多数小鼠胃体膨大, 胃内充满气体, 内容物较稀;肠管内充满液体, 拉黄色、脓样粪便, 肠系膜血管扩张、充血。个别小鼠肝脏肿大, 颜色变淡, 质脆;肺脏充血;其余脏器无明显眼观变化。第8天颈椎脱臼法处死全部存活小鼠, 剖检, 对比给药组和空白对照组小鼠的各器官发现, 无明显眼观病变。

3.3.2 各组小鼠体重变化

第1天和第7天, 各剂量组小鼠体重与空白对照组比较发现, 1~4组小鼠差异不显著 (P>0.05) , 5组小鼠差异极显著 (P<0.01) 。

3.3.3 各组小鼠脏器系数变化

与空白对照组比较, 1~3组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏系数差异不显著 (P>0.05) ;4组小鼠的肝脏、脾脏、肺脏系数差异显著 (P<0.05) ;5组小鼠肝脏、脾脏系数差异极显著 (P<0.01) , 而肺脏系数差异显著 (P<0.05) , 结果见表3。

3.3.4 血液生化指标检测

注:与空白对照组比较, *表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) , 无肩标表示差异不显著 (P>0.05) 。

与空白对照组比较, 4组TP含量差异显著 (P<0.05) ;2~4组ALT活性差异极显著 (P<0.01) ;1~4组ALP活性差异极显著 (P<0.01) , 结果见表4。

3.3.5 病理组织学变化

与空白对照组比较, 1~3组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏在显微镜下未见任何异常。4~5组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏在显微镜下有病变。空白对照组小鼠各器官的病理组织学变化见207页彩图1。

4组 (62.50 mg/kg) 小鼠心肌细胞轻度颗粒变性, 横纹模糊, 间质水肿;肝细胞体积增大, 胞浆疏松, 肝血窦受压变窄;脾脏的红髓、白髓及其边缘区结构清晰, 脾脏轻度淤血, 有许多中性粒细胞浸润;肺脏部分区域肺泡扩张, 肺脏萎陷, 腔内出血;肾脏近曲小管中度颗粒变性, 见207页彩图2。

5组 (78.13 mg/kg) 小鼠心脏的间质增宽, 心肌纤维横纹模糊不清, 间质水肿、无炎性细胞侵润;肝细胞肿胀, 体积增大, 胞浆疏松淡染, 肝窦受压变窄, 颜色变淡;脾脏轻度淤血;肺泡壁血管扩张淤血, 弥漫性片状出血;肾脏管腔形状不规则, 上皮细胞肿胀, 胞浆呈颗粒状, 颜色变淡, 见207页彩图3。

4 讨论

4.1 纳米雄黄对小鼠临床表现的影响

选用SPF级近交系Balb/c小鼠是因为其遗传基因纯合, 个体差异小, 试验结果准确可靠[5,6]。在整个试验期间, 除62.50 mg/kg、78.13 mg/kg剂量组的小鼠在灌胃后活动量减少, 精神倦怠, 被毛竖立, 光泽度降低, 死亡前呈倦卧状;其他组个别小鼠给药后有比较轻微的上述症状, 24~48 h后与空白对照组相比无异常表现。本试验采用改良寇氏法计算纳米雄黄对小鼠经口LD50为1~50 mg/kg, 口服属于剧毒范畴。提示纳米雄黄口服的毒性很高, 兽医临床应用存在巨大的风险, 有待进一步研究。

注:与空白对照组比较, *表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。

4.2 纳米雄黄对小鼠体重的影响

动物体重的增长情况是毒理试验中常用于综合反映动物全身健康状况的基本指标, 它可以反映受试药物对机体的影响[4]。1~4组与空白对照组相比差异不显著 (P>0.05) , 5组与空白对照组相比差异极显著 (P<0.01) ;5个剂量组体重增重幅度有差异, 为空白对照组>1组>2组>3组>4组>5组, 总体来看, 随着药物剂量的增大, 对动物体重增长有一定抑制作用。

4.3 纳米雄黄对小鼠脏器系数的影响

由于动物脏器重量随机体增重幅度发生改变, 动物脏器系数也是毒理试验中常用于综合反映毒性的评价指标[4]。1~3组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏系数与空白对照组相比差异不显著 (P>0.05) ;4组的肝脏、脾脏、肺脏系数与空白对照组比较差异显著 (P<0.05) ;5组的肝脏、脾脏系数与空白对照组比较差异极显著 (P<0.01) , 而肺脏系数差异显著 (P<0.05) 。5组小鼠脾脏系数处于相对增高的水平, 组织学病变可见小鼠脾脏有淤血现象, 这与实际报道相符合[4];肝脏系数与空白对照组相比有明显差异, 组织学也见病理性变化, 说明口服高剂量纳米雄黄对肝脏有一定程度的影响。

高剂量 (62.50 mg/kg、78.13 mg/kg) 纳米雄黄对肝脏有明显的毒副作用, 且肝脏的病变程度与药物剂量有关, 大剂量长期服用可引起肝脏颗粒变性、肝细胞坏死及慢性中毒性肝硬变。低剂量 (32.00 mg/kg、40.00 mg/kg、50.00 mg/kg) 时病变轻微, 空白对照组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏在显微镜下几乎未见任何异常, 因此临床应用纳米雄黄时尽量使用小剂量, 不宜长期连续服用。

各剂量组小鼠肺脏所呈现的各种共同病变, 与空白对照组无明显差别, 小鼠出现的临床表现可能是向胃内灌注药液及生理盐水时少量被吸入气管的慢性刺激所致, 与药物的毒副作用无关[7]。

4.4 纳米雄黄对小鼠血液生化指标的影响

血液生化指标是毒理学试验中经常测评的指标, 通过衡量机体血液各成分在受试药物作用下有无改变, 从而确定受试药物的毒性大小[4]。从试验结果直观分析可知, 随着药物剂量的增大, 肝脏功能的检测指标TP、ALT、ALP会相对增大, 说明如对试验动物长期、大剂量饲喂该药物, 可能存在潜在的危险性, 这有待进一步研究及临床应用加以证实。

在小鼠急性毒性试验中, 每只小鼠口服剂量为78.13 mg/kg时, 相当于常规临床使用剂量的10~20倍, 32.00 mg/kg剂量相当于常规临床用量的4~8倍。在急性毒性试验过程中, 1组 (32.00 mg/kg) 与空白对照组比较, 小鼠平均摄食量差异不显著, 其他指标正常。目前, 雄黄的临床使用剂量为32.00 mg/kg的1/4~1/8, 本次急性毒性试验结果提示, 在此剂量下口服应用该药物的毒性会相应降低。大剂量或长期使用该药可能会产生较大的毒性作用, 有待进行亚慢性毒性试验、慢性毒性试验及安全性评价[8], 更加准确地掌握该药的毒性作用, 为纳米雄黄的兽用临床推广奠定基础。

A.心脏;B.肝脏;C.脾脏;D.肺脏;E.肾脏。

A.心脏;B.肝脏;C.脾脏;D.肺脏;E.肾脏。

A.心脏;B.肝脏;C.脾脏;D.肺脏;E.肾脏。

摘要：为了检测纳米雄黄的毒性, 对其药物安全性作出客观评价, 试验按照约1∶1.25等比级数设置5个药剂量组和1个对照组, 准确测定纳米雄黄的LD50, 并对试验组Balb/c小鼠的临床表现、体重变化、脏器系数、血液生化指标及组织学变化进行统计分析。结果表明:口服纳米雄黄的急性毒性很高, 属于剧毒范畴, 临床应用有较高的风险。

关键词：纳米雄黄,急性毒性试验,LD50

参考文献

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