长期毒性实验（通用6篇）
长期毒性实验 篇1
《本草纲目》记载苎麻叶性味甘,寒,无毒。归肺、脾、肾三经;具有凉血、止血、散瘀之效,主治咯血、吐血、血淋、尿血、肛门肿痛、赤白带下、跌扑瘀血、创伤出血、乳痈、丹毒等疾病。现代研究发现其主要成分为绿原酸、原儿茶酸、野漆树苷、芸香苷、叶黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、维生素 A以及钛、锰、锶、锌、钡等多种无机元素[1,2,3],并证实其具有清热解毒、活血化瘀、消肿止痛之功效[4],对肌腱、韧带、肌肉和关节等的急性软组织损伤及创伤性炎症治疗效果良好,但未见有关于其毒理学方面的研究报道。苎麻叶凝胶是药用植物苎麻[Boehmeria nivea(Linn.)Gaudich]干燥叶提取物的外用制剂。为了探索苎麻叶凝胶长期使用对各器官的系统影响,发现毒性靶器官,为临床试验的安全性提供科学依据。我们在前期开展皮肤急性毒性、皮肤刺激性和过敏性研究的基础上,进行了大鼠皮肤长期毒性实验研究,现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 药物与试剂
苎麻叶凝胶及凝胶基质:由天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)提供,批号20100612;硫化钠:天津市天力化学试剂有限公司,AR级,批号:20100408;甲醛:天津市天力化学试剂有限公司,AR级,批号:20100108;血常规试剂由拜耳医疗保健有限公司提供;生化试剂由北京利德曼生化股份有限公司提供;电解质试剂由上海迅达医疗器械有限公司提供;其他试剂均为AR级。
1.1.2 实验动物及环境
SPF级Wistar大鼠160只,雄性,体质量(180±20)g,由湖北省疾病控制中心实验动物中心提供,许可证号:SCXK(鄂)2008-0005。动物分笼饲养于空调室内,室温(22±2)℃,湿度(60±5)%,光照 12 h的明暗周期,换气扇通风,喂标准颗粒饲料,自由饮水和摄食。实验开始前饲养观察 1 周,挑选行为体征和外观形态无异常表现、健康活泼的大鼠用于正式试验。
1.1.3 仪器设备
电子秤:上海仪表厂;LDZ5-2型自动平衡离心机:北京医用离心机厂;ULTRACUT-R型超薄切片机:德国Leica公司;Q500型图像分析仪:德国Leica公司;Cell-DYN 3700五分类血细胞分析仪:美国雅培公司;ADVIA1200全自动生化分析仪:美国西门子公司。
1.2实验方法[5,6]
1.2.1 动物分组
参照《中药新药研究指南(药学 药理学 毒理学)》及《中药药理研究方法学》的要求,取160只Wistar大鼠,按照体重随机分成8组,完整皮肤凝胶基质对照组、完整皮肤苎麻叶凝胶低、中、高剂量组,破损皮肤凝胶基质对照组、破损皮肤苎麻叶凝胶低、中、高剂量组,每组20只,雌雄各半。
1.2.2 给药方法
苎麻叶凝胶低、中、高剂量组分别涂50%、100%、200%苎麻叶凝胶5.0g/kg(分别为临床成人用量的10、20、40倍),凝胶基质对照组涂凝胶基质5.0g/kg,每天2次,连续4周。涂药部位为大鼠背部脊柱两侧脱毛区(用8%硫化钠将毛脱掉,脱毛范围为30cm2,约相当大鼠体表面积的10%左右);破损皮肤组大鼠用细砂纸在脱毛部位造成擦伤,以皮肤出现轻度密集渗血点为度,即刻涂药,每组动物涂药后用无刺激性纱布加以固定。
1.3观察指标
1.3.1 一般情况观察
给药期间及恢复期每日观察记录大鼠外部体征、行为活动、尿、粪便性状、正常和破损的皮肤光泽和皮肤反应、口鼻眼分泌物及摄食量、饮水情况,每天测进食量1次,每周称体重1次。发现有中毒反应的动物应取出单笼饲养,重点观察。发现死亡或濒死动物应及时尸检,并进行病理组织学检查。
1.3.2 血液学指标分析
给药4周,于停药次日和停药 2周(恢复期)时,每组取一半的大鼠ip戊巴比妥钠30mg/kg麻醉,腹主动脉采血进行白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、中性粒细胞比率(NEU)、淋巴细胞比率(LYM)、噬酸性粒细胞比率(EOS)、噬碱性粒细胞比率(BASO)、单核细胞比率(MONO)检测。
1.3.3 血液生化指标分析
剩余全血以 3500r/min,离心10min,取上清检测血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆固醇(CHOL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、血糖(GLU)含量。
1.3.4 大鼠脏体比值变化及病理组织学检查
腹主动脉取血完毕,解剖取脑、心、肝、肾、脾、肺、肾上腺、卵巢、睾丸等主要脏器精密称重,计算脏器系数:脏器系数(g/kg)=脏器重量/体质量;取脑、心、肝、肾、脾、肺、肾上腺、卵巢、睾丸、附睾、胃、小肠及给药部位皮肤等主要脏器,多聚甲醛固定,HE染色进行组织病理学检查。
1.4数据统计分析
所有实验结果的数据以均数±标准差undefined表示,所有数据分析在SPSS13.0统计软件包上进行,以单因素方差分析进行多组间差异的比较,以Dunnett-t检验比较两组间均数的差异;P<0.05认为差异有统计学差异。
2 结果
2.1对大鼠一般状况的影响
苎麻叶凝胶各剂量组及凝胶基质对照组大鼠在给药及停药恢复期间,动物外观正常、活泼、被毛光泽、生长发育良好,外观行为活动正常,毛发光润,口、眼、耳、鼻均无异常分泌物,大小便颜色形状均正常, 苎麻叶凝胶各剂量组动物也未见有系统毒性症状出现,给药及恢复期间未出现动物死亡;破损皮肤均在给苎麻叶凝胶后第2天出现点状血痂,第7天内脱痂痊愈。
2.2对大鼠体质量的影响
苎麻叶凝胶3个剂量组给药及恢复期间,生长发育良好,体重增加正常,与凝胶基质对照组比较无显著差异(P>0.05)。实验结果表明,苎麻叶凝胶对实验大鼠体质量增长无明显影响,结果见表1。
2.3对大鼠进食量的影响
大鼠摄食量显示,苎麻叶凝胶各剂量组大鼠在实验期及停药恢复内摄食量虽有所波动,但与凝胶基质对照组比较无显著性差异(P>0.05),结果见表2。
2.4对大鼠脏器指数的影响
实验大鼠连续外用给予苎麻叶凝胶4 周和停药2 周, 苎麻叶凝胶低、中、高剂量组大鼠的主要脏器:脑、心、 肝、 脾、 肺、 肾、 肾上腺、卵巢(雌性)、 睾丸(雄性)等肉眼观察其位置、形态、色泽、硬度等均未见明显异常情况。苎麻叶凝胶各剂量组的上述脏器系数与凝胶基质对照组比较无显著性差异(P>0.05),结果见表3、表4。
2.5对大鼠血液学指标的影响
表5、表6显示,完整皮肤和破损皮肤实验大鼠在苎麻叶凝胶连续外用给药4周及停药 2 周后,苎麻叶凝胶各剂量组大鼠血液学指标(WBC、RBC、HGB、PLT、NEU、LYM、EOS、BASO、MONO)与凝胶基质对照组比较无显著性差异(P>0.05)。实验结果表明,苎麻叶凝胶外用对实验大鼠血液学指标变化无明显影响。
2.6对大鼠血液生物化学指标的影响
由 表 7、表8可知,完整皮肤和破损皮肤实验大鼠在给药4周和停药2周后,苎麻叶凝胶各剂量组大鼠血清中AST、ALT、TBIL、TP、ALP、CHOL、BUN、CREA和GLU等水平均在正常范围内,与凝胶基质对照组比较无显著性差异(P>0.05)。实验结果表明,苎麻叶凝胶对实验大鼠血液生物化学指标变化无明显影 响。
2.7组织病理学检查
苎麻叶凝胶各剂量组涂药部位的大鼠完整皮肤和破损皮肤肉眼观察均未见药物引起病变。将给药4周和停药2周后的实验大鼠涂药部位皮肤及脑、心、肝、肾、脾、肺、肾上腺、卵巢、睾丸、附睾、胃、小肠等各脏器作病理组织学检查,其组织结构均无退变、 坏死、 炎症反应、增生或其它异常变化,与凝胶基质对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
由研究可知,在本实验条件下,完整皮肤和破损皮肤大鼠经皮肤外用连续给予苎麻叶凝胶低、中、高剂量4周及停药2周后,苎麻叶凝胶各剂量组动物生长发育良好,行为活动正常,未出现异常死亡;动物体质量和进食量与凝胶基质对照组比较,均无显著性差异(P> 0.05);苎麻叶凝胶各剂量组血常规及肝、肾功能生化检测指标,与凝胶基质对照组比较,差异均无显著性(P>0.05),病理组织学检查结果,各实验组大鼠涂药部位皮肤及脑、心、肝、肾、脾、肺、肾上腺、卵巢、睾丸、附睾、胃、小肠等主要脏器均未见病理性损伤。
综上所述,苎麻叶凝胶长期毒性实验结果表明,苎麻叶凝胶按推荐临床剂量的20、40、80倍经皮肤给药4周,对完整皮肤和破损皮肤实验大鼠无明显毒性损害,未显示因蓄积对实验大鼠产生毒性反应。实验表明苎麻叶凝胶长期外用是安全的。
参考文献
[1]熊维新,李开泉.苎麻的药用开发价值[J].江西中医学院学报,2006,18(3):51-52.
[2]刘闯,邹坤,郭志勇,等.苎麻叶化学成分研究[J].中国中药杂志,2010,35(11):1432-1434.
[3]周媛,邹坤,汪鋆植,等.苎麻叶中总酚酸提取工艺的正交设计优化[J].时珍国医国药,2009,20(8):1867-1869.
[4]张宏岐,邹坤,汪鋆植,等.苎麻叶酚酸组分抗炎作用及其机理研究[J].中国民族医药杂志,2009,15(5):29-31.
[5]中华人民共和国卫生部药政局.中药新药研究指南(药学药理学毒理学)[M].北京:人民卫生出版社,1994,180-183.
[6]陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,2006:110-114.
祛脂保肝颗粒长期毒性的实验研究 篇2
1材料
1. 1实验药物袪脂保肝颗粒所需中药饮片( 泽泻、生荷叶、酒丹参、生白芍、炙黄精、郁金、炒莱菔子、炒决明子、生山楂、柴胡) : 均购于河北天元中药饮片有限公司,经鉴定为正品,符合质量标准; 按照研究拟定的工艺制备袪脂保肝颗粒, 实验时用温蒸馏水溶解,分别制成含颗粒1. 0 g/m L、0. 5 g/ m L、0. 2 g / m L的药液,分别相当于含原药材2. 0 g / m L、1. 0 g / m L、0. 4 g / m L。
1. 2实验动物清洁级SD大鼠80只,体质量120 ~ 140 g、 雌雄各半,由河北医科大学实验动物中心提供,许可证号: SCXK( 冀) 2008 - 1 - 003,合格证编号: 910068。大鼠标准饲料由河北医科大学动物实验中心提供。
1. 3主要仪器TDL – 5 – A型离心机: 上海安亭科学仪器厂生产; Yd - 1508B轮转式切片机: 浙江金华益迪医疗设备厂; CS - VI型摊片烤片机: 孝感市宏业医用仪器有限公司; BHS; 光学显微镜: Olympus日本; LEICA DFC420彩色数码照相系统: 莱卡公司; 日产MEK7222血细胞分析仪; 美国ACE全自动生化分析仪。
1. 4主要试剂门冬氨酸氨基转移酶( AST) 试剂盒、丙氨酸氨基转移酶( ALT) 试剂盒、总蛋白( TP) 试剂盒、白蛋白( ALB) 试剂盒、尿素氮( BUN) 试剂盒、肌酐( CRE) 试剂盒、 血糖( GLC) 试剂盒: 均购自北京北化康泰临床试剂有限公司。
2实验方法
2. 1动物分组及给药
参照《中药新药研究指南》( 药学、药理学、毒理学)[3]将80只SD大鼠,随机分为4组,每组20只,雌雄各半,分别为空白对照组,祛脂保肝颗粒高、中、低剂量组。每笼5只,雌雄分笼饲养,适应性喂养1周后开始实验。各组动物均按每次15 m L·kg- 1灌胃给予相应浓度药物,每日上、下午各1次; 祛脂保肝颗粒高剂量组( 颗粒30 g/kg·d- 1) 、中剂量组( 颗粒15 g/kg·d- 1) 、低剂量组( 颗粒6 g/kg·d- 1) ,空白对照组同法灌服蒸馏水,连续给药10周。最后一次给药后24小时,每组取10只( 雌雄各半) 进行检测,余下大鼠继续饲养恢复2周后,同法检测。
2. 2检查项目
2. 2. 1一般情况观察观察实验动物的进食量、外观体征、 行为活动、粪便性状及其他症状等,定期称量体质量,进行比较。
2. 2. 2血常规指标检测末次给药后,禁食24小时,水合氯醛麻醉后,腹主动脉取血,检测血常规各项指标: 红细胞计数( RBC) 、血红蛋白( Hb) 、白细胞计数( WBC) 、血小板计数( PLT) 等。
2. 2. 3血液生化学指标检测血液离心后取血清,采用全自动生化分析仪进行AST、ALT、TP、ALB、BUN、CRE、GLC测定。
2. 2. 4主要脏器观察及组织病理学检查各组动物处死后立即解剖,肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠等主要脏器形态、颜色、硬度有无异常变化,计算心、肝、脾、肺、肾等脏器系数并进行病理组织学检查。
2. 3数据处理数据以均数 ± 标准差( x ± s) 表示,组间比较采用单因素方差分析,应用SPSS17. 0版软件进行统计处理。
3结果
3. 1各组大鼠一般情况观察
实验期间,给药10周及恢复期大鼠一般情况均良好,进食量、外观体征、行为活动、粪便性状及其他症状等未见明显异常,体质量变化见表1 ~ 2。
3. 2各组大鼠血液常规指标的变化
各组大鼠在给药期和恢复期,其指标均在正常波动范围内,与空白对照组比较,无统计学意义( P > 0. 05) 。见表3。
3. 3各组大鼠血液生化指标的变化
各组大鼠在给药期和恢复期,其血液生化指标均在正常范围波动内,与空白对组比较,无统计学意义( P < 0. 05) 。 见表4。
3. 4各组大鼠主要脏器指数及组织病理学观察结果
给药期及恢复期各组动物的主要脏器,肉眼观察形态、色泽、硬度均无明显异常情况,光镜下检查亦未见异常。各组动物脏器系数与对照组比较均无统计学意义( P > 0. 05) 。结果见表5。
4讨论
现代研究表明,脂肪肝发病原因及机制复杂,其中酒精、 肥胖、高脂血症等是目前较为明确的危险因素。中医学认为饮食失节,恣意饮酒,可导致脏腑功能失调,主要涉及肝、脾二脏,肝失疏泄,脾失健运,湿痰瘀阻互结,痹阻肝脏脉络而成[4]。
祛脂保肝颗粒剂中泽泻、荷叶相伍,升清降浊,化湿祛痰; 柴胡、郁金相配疏肝解郁、理气化痰; 莱菔子、山楂共用消脂食、化痰浊; 芍药柔肝养肝; 黄精养阴护肝; 丹参理气血、化痰瘀、防肝变; 决明子润肠通便、清肝祛痰; 诸药合用,消导结合、通中寓补,共奏祛痰化瘀、疏肝养肝之效。
长期毒性实验 篇3
1实验材料
1.1 药物
复方氨基酸口服液, 深褐色液体, 实验时20倍浓缩, 人体推荐剂量为75ml/日, 浙江省中医药研究院制剂室提供。
1.2 动物
SD大鼠, 清洁级, 体重180～220g, 雌雄各半。由浙江省实验动物中心提供, 合格证号:医动字第22001001号。检测环境条件, 实验动物房合格证号为医动字第220010015号, 温度范围20～26℃, 相对湿度范围50%～70%。实验动物试验前在动物房环境中适应3天, 染毒前, 禁食过夜, 不限制饮水。
2实验方法
取SD大鼠80只, 雌雄各半, 随机分4组, 空白组, 低、中、高口服液组, 每组20只。低、中、高3个剂量分别按31.2、62.5、125.0ml/kg (相当于人体推荐剂量的25倍、50倍和100倍) 剂量灌胃, 空白组予等量生理盐水。每日1次, 连续灌胃30天。每周记录体重和进食量, 并计算食物利用率。 实验期末尾静脉取血用MEK-6318K全自动血球计数仪进行血液学检测; 断头取血分离血清, 用BECKMEN CX4 PR0全自动生化分析仪进行血生化检测。对每只大鼠进行脏器大体观察, 同时取肝、肾、脾、睾丸 (卵巢) 称重并计算脏体比, 并取肝、肾、脾、胃、肠、睾丸 (卵巢) 进行病理组织学检查 (石蜡切片, H-E染色, 光镜观察) 。
统计方法:全部实验数据采用SPSS/PC软件包 (单因素方差分析) 在微机上处理。
3结果
3.1 各组大鼠总食物利用率的测定 结果见表1。
从表1可知, 原始数据符合方差齐的要求 (P>0.05) , 各剂量组大鼠体重增重、进食量、总食物利用率和空白组比较差异均无显著性 (P>0.05) 。
3.2 各组大鼠一般状况及体重的变化 见表2。
在30天实验期间, 各组大鼠均未见异常症状和体征, 也无死亡。各组动物体重均有增加, 实验各时间点3剂量组大鼠体重和对照组比较差异均无显著性 (P>0.05) 。
3.3 各组大鼠血液学的变化 结果见表3。
从表3可知, 数值均在正常范围内。各剂量组大鼠血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数和空白组比较差异均无显著性 (P>0.05) 。
3.4 各组大鼠WBC分类的变化 结果见表4。
从表4可知, 数值均在正常范围内。各剂量组大鼠白细胞分类和空白组比较差异均无显著性 (P>0.05) 。
3.5 各组大鼠血生化指标的变化
结果见表5～6。由表5～6可知, 各组血生化指标与空白组比较无明显差异。
3.6 各组大鼠脏体比的变化 结果见表7。
从表7可知, 各剂量组大鼠肝/体、脾/体、肾/体、睾丸 (卵巢) /体比和对照组比较, 差异均无显著性 (P>0.05) 。
3.7 各组大鼠病理组织学变化
大体解剖未发现各脏器明显异常情况。主要脏器病理组织学检查发现:对照组有1只雄性大鼠肝脏局灶性肝细胞颗粒变性, 程度为轻度, 发生率为该组动物总数的5%。空白组有1只雄性大鼠肝脏可见小灶性炎细胞浸润, 程度为轻度, 发生率为该组动物总数的5%。空白组雌、雄性各有1只大鼠肝脏小叶中央静脉轻度充血, 发生率为该组动物总数的10%。高剂量组有1只雄性大鼠肝脏汇管区有少量炎性细胞浸润, 程度为轻度, 发生率为该组动物总数的5%。高剂量组雌、雄各有1只大鼠肝脏局部可见肝血窦扩张淤血, 程度为轻度, 发生率为该组动物总数的10%。高剂量组有1只雌性大鼠肾脏肾小管轻度肿胀, 伴透明管型, 发生率为该组动物总数的5%。高剂量组有1只雄性大鼠脾脏脾窦轻度扩张充血, 发生率为该组动物总数的5%。未见其它病理改变。
4结论
根据复方氨基酸口服液的给药途径, 并参考有关文献方法[2,3]进行了复方氨基酸口服液对大鼠30天喂养的长期毒性试验。结果表明:复方氨基酸口服液对动物的血液学、血液生化学及主要脏器系数均无明显不良影响, 对心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑、睾丸 (卵巢) 病理组织切片观察均无异常, 各剂量组各项指标均未见明显毒性反应, 说明复方氨基酸口服液长期服用安全无毒副作用。上述毒理学研究结果为复方氨基酸口服液的临床用药提供了一定的安全依据。
参考文献
[1]郑纯威, 陈宇, 丁华熳, 等.复方氨基酸口服液对小鼠免疫功能影响的实验研究.中国中医药科技, 2010, 17 (2) :108.
[2]中华人民共和国卫生部.保健食品安全性毒理学评价程序和检验方法规范.2003:117.
长期毒性实验 篇4
1材料
1.1 药物
一等人参、附子药材均从湖南省药材公司购置, 由湖南省中药超微工程技术研究中心鉴定符合《中国药典》2005版“人参、附子”项下规定, 并分别加工为传统饮片与超微饮片, 其中超微饮片由3种不同粒径的超微粉制备而成, 具体为参附汤超微饮片1由D90为18.75μm超微粉制备而成, 参附汤超微饮片2由 D90为37.5μm超微粉制备而成, 参附汤超微饮片3由D90为75.0μm的超微粉制备而成。取参附汤传统饮片, 用水煎煮2次, 过滤, 滤液浓缩至相当生药量为2.14g/ml;取参附汤超微饮片用水煎煮2次, 过滤, 滤液浓缩, 参附汤超微饮片1与超微饮片2浓缩至1.07g/ml, 参附汤超微饮片3浓缩至2.14g/ml。参附汤传统饮片推荐成人日用量为15g, 参附汤超微饮片成人拟日用量为7.5g。
1.2 动物
SD大鼠, SPF级, 由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供, 实验动物生产许可证号为SCXK (沪) 2003-0002, 实验动物合格证号为0029453。动物饲养室温20～25℃, 相对湿度50%～70%。全价颗粒饲料由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。
2方法
参照国家食品药品监督管理局2005年3月发布“中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则”的方法进行。
2.1 参附汤剂量设置
参附汤传统饮片:70kg成人日用量为15g (15g/70kg=0.214g/kg) , 200g大鼠相当于70kg人用剂量的0.018倍, 则大鼠的等效剂量约为0.214g/kg (按体表面积折算:15×0.018/0.2=1.35) 。给药剂量设置为21.4g/kg, 按体表面积折算为临床等效剂量的15.85倍, 按体重折算为100倍。
参附汤超微饮片:参附汤超微饮片1、参附汤超微饮片2、参附汤超微饮片3低剂量组给药剂量均设置为10.7g/kg, 按体表面积折算为临床等效剂量的100倍, 参附汤超微饮片3高剂量设置为21.4g/kg, 按体表面积折算为临床等效剂量的200倍。
2.2 动物分组、给药、饲养与抽样
取SD大鼠140只, 体重 (100±20) g, ♀♂各半, 按性别、体重分层随机分成6组, 各给药组雌雄各12只, 空白对照组雌雄各10只, 分开饲养, 每笼5～6只, 喂全价颗粒饲料, 饮冷开水;实验室温度22～25℃, 湿度50%～70%。实验室温度与湿度用专用表格逐日记录。
空白对照组给纯净水, 其余5组分别给参附汤超微饮片1、参附汤超微饮片2、参附汤超微饮片3低剂量均为10.7 g/kg, 参附汤超微饮片3高剂量为21.4g/kg;参附汤传统饮片组为21.4g/kg, 均灌胃给药, 体积为10ml/kg, 每天1次, 共给药12周。每周根据体重变化调整每只大鼠给药体积1次。
末次给药后, 参附汤超微饮片1、参附汤超微饮片2、参附汤超微饮片3低剂量组、参附汤超微饮片3高剂量, 以及传统组随机各取雌、雄各6只, 空白组各取5只, 夜间禁食, 自由饮水, 次日进行指标检测。剩余大鼠停药观察2周, 同法进行指标检测。
2.3 检测指标
2.3.1 脏器系数检测
颈椎脱臼处死动物, 取心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器, 用电子分析天平称重, 按下述公式计算脏器系数。脏器系数 (%) =脏器重量 (g) /体重 (g) ×100%
2.3.2 组织病理学检查
取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器用4%甲醛溶液固定, 进行病理检查。
2.4 统计分析方法
数据以undefined表示, 采用SPSS11.0软件包分析处理;方差齐时, 采用方差分析 (最小显著差法, LSD) , 不齐, 则采用近似方差分析 (Tamhane's T2) 。
3结果
3.1 参附汤超微饮片对脏器系数的影响 见表1。
3.2 参附汤超微饮片对主要脏器组织病理学的影响
肉眼:主要脏器外形、体积、色泽均属正常, 无充血、肿胀、坏死等异常现象。镜下:各组动物心脏结构正常, 无明显出血、坏死、炎症等病变;肝脏结构完整, 中央静脉、肝索、肝窦、肝门区结构正常, 肝细胞无变性、坏死、炎症及纤维化、淤胆等改变;肾脏皮、髓皮分界清楚, 肾小球囊及肾小管内未见血尿、蛋白尿, 小管上皮细胞无变性、坏死、脱落、炎症等改变, 参附汤传统饮片组6号动物髓质部4个小管内可见钙化物, 参附汤超微饮片1组54号动物髓质部多个小管内可见钙化物, 考虑为钙化性结石, 但无明显阻塞、扩张等改变;各组动物肺泡、支气管结构正常, 无出血、坏死, 但各给药组均可见轻微灶性间质性慢性炎症, 如参附汤传统饮片组4号、参附汤超微饮片3低剂量组17号、参附汤超微饮片2组33号及38号、参附汤超微饮片1组62号、参附汤超微饮片3高剂量组94号; 脾脏、脑等脏器未见特殊病变。停药2周后, 各实验组肺脏仍可见轻微灶性间质性慢性炎症。其余各脏器病理检查未见异常。
4讨论
给药12周和停药2周, 参附汤超微饮片1、参附汤超微饮片2、参附汤超微饮片3对大鼠脏器系数、组织形态学和组织病理学影响不明显, 表明参附汤超微饮片无明显毒性反应。 文献中报道:乌头碱主要毒性为致心律失常, 本实验中未出现, 可能因为本实验所用附子为制附子且剂量不大, 心脏毒性较小;参附汤超微饮片未同参附汤传统饮片一样经过久煎来解毒, 仅沸水浸泡20分种但未出现毒性, 可能为破壁粉碎后更容易使毒性很强的双酯类生物碱水解成毒性较小的单酯类生物碱, 而所含强心成分却变化不大;另外, 附子与人参相伍, 人参可以减低附子的毒性;也可能由于其他未知原因所致, 有待今后进一步研究。 参附汤传统饮片推荐成人平均每日用量为15g, 参附汤传统饮片组按体重折算相当于70kg成人日用量的100倍, 按体表面积折算相对于70kg成人日用量的15.85倍;参附汤超微饮片推荐成人平均每日用量为7.5g, 参附汤超微饮片1组 (D90为18.75μm) 、参附汤超微饮片2组 (D90为37.5μm) , 按体重折算相当于70kg成人日用量的100倍, 按体表面积折算相对于70kg成人日用量的15.85倍;参附汤超微饮片3低、高剂量 (D90为75.0μm) 按体重折算分别相当70kg成人日用量的100、200倍;按体表面积折算, 分别相当于70kg成人日用量的15.85、31.70倍。与参附汤传统饮片比较, 实验中未观察到不同粒径超微粉制成的参附汤超微饮片出现毒性反应, 可推广应用于临床。
摘要：目的:观察不同粒径的超微参附汤对大鼠灌胃给药的长期毒性反应, 评价其安全性, 为临床研究提供依据。方法:采用长期毒性实验方法观察超微参附汤对大鼠产生的毒性反应。结果:给药12周和停药2周, 超微参附汤对大鼠脏器系数、组织形态学和组织病理学无明显影响。结论:超微参附汤及传统饮片参附汤均安全。
长期毒性实验 篇5
为了将甘草总黄酮提取物更好地应用于临床, 本试验将其制成了混悬液, 并对该制剂进行了急性毒性试验、长期毒性试验, 以期为临床应用该药提供理论依据。
1 材料
1.1 药物
甘草总黄酮混悬液, 由吉林大学和平校区动物医学学院药理毒理学教研室研制, 该制剂是由甘草总黄酮提取物、氢化蓖麻油、单硬脂酸甘油脂、维生素E油及大豆油制成的深棕色混悬液, 甘草总黄酮混悬液中甘草总黄酮的含量不得少于30 mg/m L。
1.2 试验动物
清洁级昆明小白鼠, 体重为18~22 g, 雌雄各半;清洁级SD大鼠, 体重为130~150 g, 雌雄各半。试验动物均购自白求恩医科大学实验动物中心。
1.3 主要仪器
血液分析仪 (型号为poc H-100V) , 购自日本西斯美康公司;生化分析仪 (型号为Vet Test) , 美国爱德士公司生产;切片机 (型号为RM2255) 、包埋机 (型号为EG1150H) , 德国徕卡仪器有限公司生产。
2 方法
2.1 急性毒性试验
参照参考文献[5]进行急性毒性试验。给小白鼠一次性腹腔注射甘草总黄酮混悬液未测出半数致死量 (LD50) , 因此进行了最大给药量试验, 以评价甘草总黄酮混悬液的急性毒性。
取20只小白鼠, 雌雄各半, 腹腔注射甘草总黄酮混悬液, 24 h内给药3次, 按体重0.03 m L/g。在给药后1周内, 连续观察和记录小白鼠的精神状况、行为、饮水、食欲及死亡等情况。
2.2 长期毒性试验
参照参考文献[6]进行长期急性毒性试验。将80只SD大鼠随机分成4组, 即高、中、低剂量组和对照组, 每组20只, 雌雄各半。高、中、低剂量组SD大鼠分别按体重腹腔注射甘草总黄酮混悬液1.5, 0.75, 0.375 m L/kg, 对照组腹腔注射生理盐水, 每天给药1次, 连续给药35 d (共5周) 。给药结束后次日, 每组取10只大鼠 (雌雄各半) 处死取血, 检测血液生理、生化学指标, 并进行病理剖检和组织学检查。
2.3 统计学分析
试验数据以x±SD表示, 应用SPSS 13.0统计软件进行组间数据的显著性检验。采用t检验比较试验组与对照组间增重和血液生理、生化等指标的显著性差异。
3 结果
3.1 最大给药量试验结果
甘草总黄酮混悬液的最大给药量为4.5 g/kg时仍未出现任何毒性反应, 说明该药物对小白鼠无明显的急性毒性作用。
3.2 长期毒性试验结果
3.2.1 一般情况
试验期间各组大鼠活动正常, 毛发光润, 摄食、饮水和粪尿均正常, 未发现中毒症状, 未出现死亡。经统计学分析, 各剂量组大鼠的生长发育情况与对照组比较差异不显著 (P>0.05) 。说明甘草总黄酮混悬液对大鼠的生长发育无不良影响, 各组大鼠增重情况见表1。
3.2.2 对大鼠血液生理、生化指标的影响
经统计学分析, 甘草总黄酮混悬液各剂量组的血液生理、生化指标与对照组比较差异不显著 (P>0.05) , 说明甘草总黄酮混悬液对血液、肝功能和肾功能无不良影响, 结果分别见表2和表3。
3.2.3 病理剖检和组织学检查结果
给药结束后, 剖检大鼠, 肉眼未发现任何异常和可疑病变。取甘草总黄酮混悬液高剂量组和对照组大鼠的心脏、脾脏、肝脏、肾脏、睾丸及子宫组织进行病理学组织切片检查, 结果均未发现异常变化。
4 讨论
中草药主要来源于动植物, 具有天然性、无抗药性和残留性[7]。但中草药成分较复杂, 也决定了中药、天然药物制剂, 包括活性成分或组分、配伍后产生的新成分、体内代谢物、制备过程中的杂质、辅料及制剂的理化性质 (如p H值、渗透压等) 等均可能是产生给药部位毒性或溶血性反应的因素。因此, 为了指导临床合理用药, 提示临床应用时可能出现的毒性反应和程度、安全剂量或浓度、安全范围、临床研究监测指标、解毒或解救措施等, 应进行中药、天然药物制剂局部应用的毒性试验。
本研究从安全用药方面考虑, 对甘草总黄酮混悬液进行了毒理学研究, 以便为临床的进一步应用提供理论依据。本试验结果表明, 甘草总黄酮混悬液对小白鼠无急性毒性作用, 临床用药安全可靠;甘草总黄酮混悬液对大鼠体重、摄食、血液生理和生化指标的影响与对照组比较差异不显著;组织学观察心脏、脾脏、肝脏、肾脏、睾丸 (♂) 及子宫 (♀) 等组织亦均未发现异常变化。
摘要：为了确定甘草总黄酮混悬液的毒性, 试验采用小鼠急性毒性和大鼠长期毒性试验的方法对其进行了研究。结果表明:当甘草总黄酮混悬液的最大给药量为4.5 g/kg时未出现任何毒性;连续35 d腹腔注射甘草总黄酮混悬液, 高剂量组大鼠的临床症状、体重、血液生理生化指标与对照组比较差异不显著 (P>0.05) ;高剂量大鼠心脏、脾脏、肝脏、肾脏、睾丸 (♂) 及子宫 (♀) 等组织亦未发现异常的病理学变化。说明甘草总黄酮混悬液毒性低。
关键词：甘草总黄酮混悬液,急性毒性,最大给药量,长期毒性,临床症状,血液生理生化指标,组织学观察
参考文献
[1]WANG X, ZHANG H, CHEN L, et al.Liquorice, a unique guide drugof traditional Chinese medicine:A review of its role in drug interactions[J].J Ethnopharmacol, 2013, 150 (3) :781-790.
[2]王慧.黄酮类化合物生物活性的研究进展[J].食品与药品, 2010, 12 (9) :347-350.
[3]张佳莹, 魏苗苗, 初晓, 等.甘草黄酮对小鼠急性肺损伤保护机制的研究[J].中国农业学报, 2012, 28 (8) :56-62.
[4]邱家章, 邓旭明, 罗永煌.甘草查尔酮E对金黄色葡萄球菌的抗菌活性[J].中国兽医学报, 2012, 32 (8) :1194-1198.
[5]李建华.中药类急性毒性技术法与LD50值的分级[J].中草药, 1994, 25 (7) :388-389.
[6]黄芳华.中药新药申报材料中长期毒性试验的常见问题[J].中国新药杂志, 2004, 13 (7) :661-663.
对元肾颗粒长期毒性试验的研究 篇6
关键词：元肾颗粒,毒性实验,研究
1 试验目的
观察大鼠连续灌胃给予元肾颗粒3 个月所产生的毒性反应及程度,以评价其临床用药的安全性。
2 试验材料
( 1) 受试制剂: 元肾浸膏,每1g相当于6. 46g生药,成人日剂量19. 5g ( 相当于126g生药) ,昆明禾润药物开发有限公司提供,批号: 030226。
( 2) 动物: SD大鼠,雌雄各半; 雄性平均体重为103. 30 ± 7. 39g,雌性平均体重为99. 62 ± 8. 16g。由昆明医科大学实验动物学部提供, 合格证号: SCXK ( 滇)2011 - 0004。
( 3) 仪器: ALCYON 300 全自动生化分析仪,美国雅培公司生产。CL4 型半自动止凝血测定仪,德国BE公司产品。BP310S电子天平,北京赛多利斯天平有限公司生产。
( 4) 实验环境: 云南省中医中药研究院动物实验屏障系统,SPF级,合格证号: 滇实动证第2003002 号。
3 试验方法
3. 1 分组给药
大鼠随机分为4 组: 对照组元肾颗粒大、中、小剂量组。每组20 只,雌雄各半。大剂量组给予129. 2g生药/kg的元肾浸膏,该剂量为最高可灌胃剂量,相当于人临床拟用剂量的71. 8 倍; 中剂量组给予74. 8g生药/kg的元肾浸膏,相当于人临床用量的41. 6 倍; 小剂量组给予43. 2g生药/kg的元肾浸膏,相当于人临床用量的24 倍。大鼠适应试验环境一周后开始灌胃给药,每天2 次,连续3 个月,给药容量均为20ml/kg体重,每周按体重调整灌胃体积。给药3 个月后,每组杀检14 只( 雌、雄各7 只) ,进行各项指标检测,观察有无毒性反应。剩余大鼠停止给药3 周后杀检,以观察有无继发性不良反应。
3. 2 观察指标
( 1) 一般状态: 给药期间每日观察大鼠精神、行为、活动、排便等情况。给药期间及恢复期每日检测各只动物进食、进水量。
( 2) 体重: 给药期间和恢复期每周称体重一次。
( 3) 血液学检查: 大鼠给药期限结束后,放血处死,取血以止凝血测定仪测定血浆凝血酶原时间( PT) 、凝血酶时间( TT) 、活化部分凝血活酶时间( PTT) ,血球计数仪测定白细胞总数( WBC、) 和分类( 淋巴细胞百分数LY、单核细胞百分数M0、中性粒细胞百分数NE) 、红细胞总数( RBC) 、网织红细胞计数( RC) 、血红蛋白含量( Hgb) 、血小板计数( PLT) 、红细胞比积( HCT) 、红细胞平均体积( MCV) 、红细胞平均血红蛋白量( MCH) 、红细胞分布宽度( RDW) 、血小板比积( PCT) 、血小板分布宽度( FDW) 。
( 4) 血清生物化学检查: 上述大鼠取血样,离心分离血清,用全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶( LDH) 、a一羟丁酸脱氢酶( HBDH) 、谷丙转氨酶( ALT) 、谷草转氨酶( AST) 、碱性磷酸酶( ALP) 、肌酐( CR) 、尿素氮( BUN) 、血糖( GLU) 、总胆红素( TBIL) 、甘油三酯( TG) 、总蛋白( TP) 、球蛋白( GLB) 、尿酸( UA) 共计十三项。
( 5) 尸体解剖和脏器指数: 各组大鼠放血处死后,立即进行尸体解剖,肉眼观察各脏器有无病理改变,取出心、肝、脾、等16 个脏器,剥离后分别称重,并计算脏器指数( g/100g) 。
( 6) 病理组织学检查: 将上述脏器放入10% 中性甲醛溶液中固定,石蜡包埋、切片,经苏木素、伊红染色,再经脱水、透明、封固后光镜下观察; 先对大剂量组、对照组大鼠的脏器进行检查,如果大剂量组发现异常,再对中、小剂量组脏器进行病理组织学检查。
( 7) 统计学处理: 比较组间差异采用t检验。
4 试验结果
( 1) 一般状态: 三个给药组大鼠在给药期间,雄性大剂量组从给药第1 周起、中剂量组从给药第9 周起,进食量显著低于对照组; 雌性大剂量组从给药第8 周起、中剂量组从给药第10 周起,进食量显著低于对照组,恢复期各给药组大鼠的进食量与对照组无显著差异。给药组大鼠的饮水量仅雄鼠的个别周次与对照组有差异。未见行为活动、排便、分泌等方面的毒性反应,各组动物无死亡。
( 2) 体重: 给药期内,雄性大剂量组从第3 周起、中剂量组从第11 周起,雌性大剂量组从第13 周起,给药大鼠体重与对照大鼠体重相比即有显著差异; 恢复期内,给药组大鼠体重增长明显。
( 3) 血清生物化学检查: 给药3 个月后,大剂量组的LDH、ALT、 GLu、 CHOL. TG, 中剂量组的HBDH、 ALT、AST、IBIL、 TG、 UA, 小剂量组的HBDH、 ALT、 TBIL、DBIL,与对照组比较有显著性差异; 恢复期后各给药组对照组比较无显著差异。
( 4) 血液学检查: 给药3 个月后,中、小剂量组的TT、RDW、MPV、PDW与对照组比较有显著差异,其他血液学指标各组间无显著差异; 恢复期后,大、中剂量组的PTT与对照组比较有显著差异,其他血液学指标各组间无显著差异。
( 5) 尿常规检验: 给药3 个月及恢复期后,各组大鼠的尿常规检验未见显著差异。
( 6) 主要脏器检查: 元肾颗粒给药组与对照组大鼠在给药3 个月及恢复期结束后均进行尸体解剖,肉眼观察主要脏器未见明显异常。给药3 个月,大剂量组与中剂量组的心脏系数、肝脏系数、肾脏系数、脑系数、胃系数、肾上腺系数、睾丸系数,均高于对照组。恢复期结束后各给药组脏器指数与对照组比较无显著差异。
( 7) 病理组织学检查: 给药3 个月,大剂量组与对照组比较无显著差异。
5 结论