pcr实验室认证体会

pcr实验室认证体会（共6篇）

pcr实验室认证体会 篇1

一、申请临床基因扩增实验实验收的目的

临床基因扩增实验室近年来在我国发展很快，基因诊断技术在疾病的预防、诊断、治疗方面起到了积极的作用。由于、基因扩增检测技术的应用对、实验室的环境条件、仪器设备、试剂耗材、人员技术能力和质量控制等方面要求严格，而一些实验人员对此不甚了解，加之利益的驱使，曾经在20世纪80年代，某些沿海省份的实验室未按要求规范设置，出现气溶胶污染，导致大规模假阳性结果报出，为临床诊断造成了极大的困难。临床基因扩增实验室为了规范实验室，保证基因扩增技术有效应用，防止假阴性、假阳性结果的报出，为临床出具合格而可靠的报告，申请临床基因扩增实验室的验收是必然而且也是必要的。

二、开展临床基因扩增实验的必备条件

根据卫生部2002年1月14日发布了卫医发[2002]10号《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（以下简称《办法》）及其附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》，及同年2月20日卫生部临床检验中心发布《临床基因扩增实验室工作规范》，明确规定临床基因扩增检验实验室开展PCR技术必需具备的条件：

（1）二级以上医院实验室，经卫生部临床检验中心验收合格；（2）从事基因扩增实验操作的人员必须经过培训并取得上岗证；

（3）使用经国家药品监督管理局批准的允许进入市场销售的商品试剂盒；

（4）开展卫生部允许开展的项目。具备了以上几条后，我们从事临床基因检测任务才是符合要求和规定并对临床出具的报告有保障的。

三、临床基因扩增实验室验收准备工作 1.硬件准备

（1）实验室整体布局：

根据《办法》要求，临床基因扩增检验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区，标本制备区，扩增产物分析区。由于我实验室使用的是罗氏公司的Lightcycler实时荧光定量扩增仪，扩赠后产物不需开盖处理直接检测，所以扩增区和扩增产物分析区合为一室，此区为负压。实验室设计时按照《办法》规定，三个区域相互独立，并有各自的缓冲区域（见图1）（2）各工作区域仪器设备

各工作区域的仪器设备及物品，包括椅子、办公用品、清洁用品等均不能拿出本区域，所有可移动物品均应有本区域的标示。

各区域应具备的设备配置为：屋顶紫外灯、近台紫外灯、一次性手套、一次性鞋套、工作服、废液缸、扫帚、拖把、废纸褛篓、微量加样器（覆盖1-1000μl），经高压处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）、笔、纸等。各工作区域的特殊配置包括：

（1）试剂贮存和准备区：2～8oC冰箱、漩涡震荡器、超净工作台。

（2）标本制备：2～8oC冰箱、-20oC冰箱、高速台式冷冻离心机、漩涡震荡器、金属加热模块、超净工作台。

（3）扩增及产物分析区：罗氏Lightcycler荧光定量核酸扩增仪、电脑、打印机。

同时：进入各工作区域必须严格按照单一流向，并用明显的箭头表示，个区域用不同的颜色以示区别。即试剂贮存和设备区（蓝色）→标本制备区（白色）→扩增及产物分析区（粉色）。2.软件准备：

（1）临床基因扩增实验室文件编写： 本实验诊断中心正在进行ISO15189实验室的认可工作，故质量手册同中心统一，其它文件包括：程序文件、标准操作程序（SOP）、相关图表等由本实验自己制定。制定的原则根据卫生部下发的两个文件，并结合本实际情况编写适合本实验实际情况编写适合本实验室的切实可行的文件，做到“写你所做的，做你所写的，记录你已做的”。具体编写内容如下：

①程序性文件：PCR实验室管理制度，PCR实验室人员管理制度，仪器设备的管理程序，PCR实验室仪器设备操作程序，PCR实验室仪器设备校准程序，PCR检验实验操作程序，实验室消耗品购买、验收及储存程序，PCR试剂购买、验收及储存程序，PCR检测标本的管理程序，PCR实验室记录控制程序，PCR检验结果报告的控制程序，PCR实验室室内质量控制程序，抱怨处理程序，实验室生物防护错施，实验室的清洁程序，实验室废弃物处理程序等。

②标准操作程序（SOP）：试剂准备区工作制度，样本准备区工作制度，PCR扩增区工作制度，半自动型蒸汽压力灭菌器标准操作程序，高速离心机的标准操作程序，恒温金属浴使用规程，漩涡震荡器标准操作程序，洁净工作台的标准操作程序，可调式加样器标准操作程序，恒温金属浴的校准程序，标本采集、运送、接收、保存的标准操作程序试剂准备的标准操作程序，核酸提取的标准操作程序，Lightcycler使用的标准操作程序，统计学者质量控制的标准操作程序，消耗品验收质检的标准操作程序。试剂质检的标准操作程序等。

③相关图表：PCR实验室工作人员一览表，实验室主要负责人简历表，PCR实验室工作人员档案，PCR实验室人员培训计划，仪器设备一览表，仪器设备损坏、故障、修理记录，仪器设备的报表申请表，仪器维护保养记录，Lightcycler荧光定量扩增仪维护保养记录，恒温金属校准记录，采购申请单，试剂领取验收记录，试剂质检记录，消耗品质检记录，消耗性材料领取验收记录，标本接收等记表，不合格标本记录，报告单发放接收登记表，特殊报告要求登记表，抱怨情况登记表，抱怨处理登记表，PCR实验室日常工作核查表，Lightcycler仪器使用记录，试剂使用记录，PCR实验室室内质量控制失控原因及纠正错施记录，样本处理记录，冰箱温度记录-试剂准备区，冰箱温度记录-样本准备区，环境温度记录-试剂准备区，环境温湿度记录-样本准备区，环境温度记录-PCR扩增区，PCR实验室日常工作核查表，紫外灯使用登记表，温度计校准记录，PCR实验室平面图等。（2）人员管理：

文件要在临床基因扩增实验室工作的实验人员必须经过培训并取得上岗证，所以在申请实验室验收前，要至少一名人员参加卫生部检验中心举办的临床基因扩赠实验室上岗培训班并取得上岗证。同时实验室还应该制定自己的培训计划，保证实验室人员能不断得到培训。（3）实验方面：

使用经国家药品监督管理批准的允许开展的项目。

四、临床基因扩增实验室验收申请

如果以上方面准备就绪后，就可以进行临床基因扩增实验室验收申请了，但以本人的经验，建议在实验室设计好后，先请验收专家进入实地看一下，并提出他们的宝贵意见，以免在验收时因离要求有差距而成耽误了验收，同时编写好的程序性文件和SOP文件也应请才、专家过目，得到认可后再提交申请，内容包括： 1.基因扩增检验实验室基本情况：

（1）实验室所属法人单位名称、地址、电话、联系人等。（2）实验室人呀情况和职称比例。2.应提供的资料

（1）《医疗机构职业许可证》复印件；

（2）拟设置基因扩增检验实验室医院的医疗卫生资源状况，对临床基因扩增检验的需求情况以及实验室运行的预测分析；

（3）拟设基因扩增检验实验室的设置平面图；（4）实验室主要负责人简历表；（5）实验室工作人员一览表；（6）主要仪器设备表；

（7）拟开展的临床基因诊断项目；

（8）实验室相关程序文件和标准操作程序（SOP）；（9）检验报告样单； 3.希望验收时间 4.声明

本实验室自愿申请卫生部临床检验中心组织的技术验收，并愿意承担下列义务：遵守《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因诊断实验室工作规范》及与关规定；不论能否获得通过验收，预付验收阶段的全部费用。

五、现场技术验收

当提交临床基因扩增检验实验室技术验收申请表后，大约两周时间内（视具体情况而定）卫生部临床检验中心会将临床基因扩增检验实验室收通知传真或邮寄至你处，告知验收工作的具体时间、专家组成员、验收程序及验收费用等。

在验收当天，专家组成员将对实验室布局、实验室设置及仪器设备配备情况、实验室表示、程序文件标准操作文件的编写、试验记录等情况进行验收，同时还会现场让实验室技术人员进行临床标本的操作，实验结果的正确与否也是实验室验收合格的依据之一。现场提问时专家会对你所编写的文件进行提问，主要涉及实验室污染、是内质控、标本的收集及保存等。验收结束后，专家会填写临床基因扩增检验实验室技术验收报告，对验收结果进行总结，提出整改要求和意见。

六、临床基因扩增检验实验室收体会 1.认真学习和领会卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》及其附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》，及卫生部临床检验中心发布《临床基因扩增实验室工作规范》的内容，并将以上两个文件的内容落室到自己所编写的程序文件和标准操作程序中。

2.实验室布局设计好后一定要请专家实地进行一下检查，如果条件不具备，也可以将实验室设计平面图寄给专家，因为每个实验室都有自己的具体情况，如果是新建的实验室可以按照卫生部临检中心提供的标准实验设计图来设计，如果是在老的实验室基础上改造，就应该多听一些专家的意见，以免在验收的时候因实验室设计不合理而耽误验收以至延误临床工作的开展。

3.程序性文件和标准操作程序编写时，最主要的是可操作性要强，尤其是SOP文件，使用频率很高，与实验室的日常工作密切相关，写的要具体一些，格式并不是很重要，主要是让第依次接触该SOP的人也能够按其完成相关操作。同时还要集注，该文件不是用来验收的。而是给自己实验室人员用的，要认识到文件对保证检验质量的重要性，这样在编写时就能更细化，更具体，更实用。文件的编写是整个实验室验收工作任务重要的一个环节，也是验收工作时检查的重点，所以在编写文件时要让每一个实验室的人员都参与进来，对所写的内容、程序和要求都要知道，并能遵守执行。在验收的时候，专家会对你所写的文件内容进行提问，如果一个实验室操作人员对其应该遵循的管理制度和SOP一无所知之甚少，这样对日常检验的质量控制也是没有好出的。文件编写好后，建议也请专家过目，得到首背后再提交认可申请。

4.文件编写好后，应该按其执行，做到“记录你所做的”简单的说就是将常规工作中所做的记录下来，一般说，需要记录的有临床标本接收中的饿患者个人资料、标本接收日期、标本状态、唯一编号等；检测前实验室的清洁；检测中实验记录，试剂厂家、批号、检测日期、检测结果、质控记录及分析、检测人（签字）、仪器运转情况等；检测后实验台面、仪器设备等的消毒和清洁、紫外线照射等。依次两次的记录并不难，难的是持之以恒。所以许多记录我们多记录我们可以把做到成表格的形式，记录时在相应的条款上打“√”就行了。

5.实验过程严把质量关。我们编写的质量手册的木的的是规格实验操作整个过程，做到实验过程有章可循，实验记录有据可查，保证实验结果的可靠性和准则性。由于基因扩增技术特殊性，即使严格按质量手册进行操作，也难免出现错误结果，因此包括试剂空白对照，阴性标本对照、临界值阳性标本对照等，分别监测试剂配制与加样过程中是否存在污染，标本核酸模板提取过程红是否存在污染，标本检测过程中是否在假阴性结果和结果是否准确等。

6.工作量少影响质量保证系实施。严格按临床基因扩增检验实验室技术要求通过验收的实验室，存在一定运行成本，需要有一定临床标本量的支持；如果某一医院医疗资源不足，标本来源不足以支持运行成本时，就会想方设法去减少运行成本（包括试剂成本和劳务成本），导致检验质量难以得到保证。因此建立了临床基因扩增检验实验室后，应根据本医院的情况，制定可行的试验方案（如实验周期、合理接受外来标本等），做到既保证临床标本结果的质量又不浪费成本。以上只是本人对临床基因扩增检验实验室技术验收及日常工作的一点体会，望和大家多多交流。参考文献

1.申子瑜，李金明.《临床基因扩增检验技术》，人民卫生出版社。

pcr实验室认证体会 篇2

2006年西北农林科技大学全面改进实验室环境,使实验室环境管理工作成为实验室规范化管理的重要内容。通过近1年的紧张工作,经过前期诊断、贯标培训、文件编写、体系运行、内部审核、管理评审、外部审核等环节,中国质量认证中心于2006年11月30日为西北农林科技大学教学实验室进行了“环境管理体系认证”,颁发了ISO14001认证证书。

在西北农林科技大学教学实验室“环境管理体系认证”过程中,提高了教学实验室环境管理的认识,取得了一些体会,在此进行交流,以供参考。

一、环境管理体系(Environmental management systems)标准(ISO14001)要求及使用指南概要

国际标准化组织(I S O)1993年6月成立了第207技术委员会(T C207),专门负责环境管理工作,主要工作目的就是要支持环境保护工作,改善并维持生态环境的质量,减少人类各项活动所造成的环境污染,使之与社会经济发展达到平衡,促进经济的持续发展。其职责是在理解和制定管理工具和体系方面的国际标准和服务上为全球提供一个先导,主要工作范围就是环境管理体系(EMS)的标准化,自1993年6月起,为了支持环境保护工作,改善并维持生态环境的质量,减少人类各项活动所造成的环境污染,使之与社会经济发展达到平衡,促进经济的持续发展,开始进行环境管理体系(EMS)的标准化。ISO14000目前已经颁布了将近10个独立的标准。环境管理体系是一个组织的整个管理体系当中的一个组成部分,包括为制定、实施、实现、评审和保持环境方针所需的组织结构、计划活动、职责、惯例、程序、过程和资源。

环境管理体系——要求及使用指南(G B/T24001-2004/ISO14001),是由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局和中国国家标准化管理委员会2005年实施的对ISO/TC207制定的关于环境管理的各种技术文件提供环境管理支持技术的指南。ISO14001是组织、规划、检查、评审环境管理运作系统的规范性标准,该标准包括5大部分,17个要素。

5大部分是指环境方针、规划、实施与运行、检查与纠正措施和管理评审,这5个基本部分包括了环境体系的建立过程和建立后有计划地评审及持续改进的循环,以保证组织内部环境管理体系的不断完善和提高。

17个要素是指环境方针、环境要素、法律与其他要求、目的与指标、环境管理方案、机构和职责、培训、意识与能力、信息交流、环境管理体系文件编制、文件管理、运行控制、应急准备和响应、监测、违章、纠正与预防措施、纪录、环境管理体系审核和管理评审要素等。

二、西北农林科技大学教学实验室环境管理体系认证过程

自从2006年西北农林科技大学实行环境认证以来,制定了环境管理体系认证工作计划,共分3个阶段:咨询阶段、认证阶段、取得证书阶段。

其中咨询阶段又分了8个亚阶段分别是:1.诊断:(1)了解目前环境管理体系现状,(2)对有关现场及各实验室进行初访);2.诊断结果(得出诊断结果);3.贯标培训:(1)人类社会的环境问题,(2)ISO14001标准讲解,(3)环境因素的识别方法;4.体系策划;5.初始环境评审;6.过程划分;7.文件编写;8.体系试运行。

2006年11月2日至3日,中国质量认证中心西北评审中心对西北农林科技大学教学实验室环境管理体系文件文审的基础上,对西北农林科技大学16个学院的教学实验室和实验室管理处的5个科室进行现场审核。审核结果认为,西北农林科技大学教学实验室环境管理体系达到规定的方针、目标和持续改进的能力;通过ISO14001:2004标准的实施及教学实验室环境管理体系文件的运行,提高了教学实验人员和管理人员的环境意识;通过相关法规和制度的贯彻和实施,使得教学实验室环境管理绩效明显提高;审核中未发现严重不符合项,教学实验室环境管理体系运行有效。

三、教学实验室推行环境管理体系的意义

环境因素具体到教学实验室主要有以下几个方面:(1)挥发性气体向大气的排放:氯仿、盐酸、冰醋酸、巯基乙醇等;(2)向水体的排放;(3)固体废弃物的管理;(4)土地污染:氢氧化钠的抛洒,浓硫酸和盐酸的泄漏,酚类、甲苯、二甲苯、EB、氯化汞、染料、巯基乙醇、组织培养基的处理等废物的排放;(5)噪声污染:超低温冰箱、通风橱噪声的排放;(6)能源与资源的消耗:超低温冰箱、人工气候箱、生化培养箱、冰箱、空调、震荡机、高压灭菌锅等电能的消耗和实验试剂、材料、水等资源的消耗。这些问题的解决不仅关系到师生的健康安全,而且关系到学校的环境美化及周围居民的健康安全。

自从2006年西北农林科技大学实行环境认证以来,从人员贯标培训、内审、外审、实验室自查各项工作的有序进行,找出了西北农林科技大学在教学实验室环境方面存在的问题,并进行彻底整改;增强了全体实验人员的环保和节能降耗意识,提高了整体素质;制定教学实验室环境管理文件,为西北农林科技大学建立健全了教学实验室环境管理体系;同时完善了教学实验室环境管理运行纪录,建立了长效运行机制。

通过I S O14001认证,有利于提高学校教职员工的整体素质和环境管理水平,节能降耗,合理利用资源;由对环境的事后治理转向事前预防与控制,从治标转向治本,从而实现环境优化;有利于学校从教育方式的粗放型管理向效益型管理转变,促使学校管理行为与教学发展水平同步,提高学校形象和知名度。

四、西北农林科技大学教学实验室环境管理体系认证的工作经验体会

1. 学校领导的重视是环境管理体系认证工作顺利进行的组织保证。在2006年的环境管理体系认证工作中,学校领导十分重视,多次召开有关会议,并在实验室现场办公,解决存在问题。学校相关领导与全体实验人员共同学习有关文件,不定期检查环境管理体系认证工作进展,并提出建设性意见。学校领导的重视和关心,为工作组的同志顺利完成环境管理体系认证树立了信心。

2. 职能处室的领导和指导,是环境管理体系认证工作规范完成的技术保证。自西北农林科技大学开展环境管理体系认证工作以来,特别是进入2006年7月份以后,西北农林科技大学实验室管理处的领导和负责同志多次来实验室指导环境管理体系认证工作,认真征求意见,了解存在问题,检查工作进展。实验室管理处的领导和负责同志的耐心细致工作,在规范完成环境管理体系认证工作方面,起到了技术保证作用。

3.提高全体实验人员的认识,是环境管理体系认证工作完成的基础保证。实验室在教学任务重、实验室类型多样、实验人员数量多、知识和学历层次又差别很大的情况下,面对环境管理体系认证这项新的工作内容,开展这项工作有一定的难度。在这种情况下,我们认真分析,理清工作思路,明确工作目标。提出具体的工作方法主要包括:(1)集中学习,统一思想,明确环境管理体系认证内容;(2)树立典型,以点带面,推动工作全面开展;(3)工作小组成员集中审查,提出下一步工作意见;(4)环境管理体系认证与管理结合,提出安全、节能降耗方案。

摘要：本文通过对环境管理体系标准(ISO14001)要求、使用指南和我校教学实验室环境管理体系认证过程的阐述,强调了教学实验室推行环境管理体系的重要性,总结了西北农林科技大学教学实验室环境管理体系认证的经验体会,为长期坚持这项工作打下了良好的基础。

关键词：环境管理体系认证,实验室,高校教学

参考文献

[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会.环境管理体系—要求及使用指南.中华人民共和国标准(GB/T24001-2004/ISO14001)

[2]王竹林,刘曙东.实验室环境管理体系建设[J].实验科学与技术,2007,6(5):139～141

PCR实验室工作制度 篇3

1.实验室内必须保持安静、整洁，不得大声喧哗，不得在室内从事与实验无关的事宜。2.禁止与实验无关人员出入，实验室主要通道入口及功能区域应有特殊的标志。3.实验室各区域有各自专用的实验设备和器材，包括工作服、拖鞋、洁净鞋，一次性消耗品、办公用品等，各有明显的标志，绝对不能混用。4.严格遵守人员及物品按单向流动，不得交叉混流。

5.严格按照基因检测操作规程进行实验和使用仪器设备，定期检测、校准并做好记录工作。6.每次基因检测中应设立阴阳对照。

7.实验室工作人员必须严格按照PCR实验室操作程序进行，实验开始前必须做好室内及工作台的清洁消毒，离心管、吸头等一次性用品需高压灭菌处理。

8.工作结束后必须立即应用10％次氯酸钠溶液消毒实验室台面，并用紫外灯照射实验室。试验中使用过的吸头，离心管等应送到指定的地点进行处理。

9.每日工作开始前需开启风机及空调系统，在运行30分钟后，记录各压差表数，如压差低于设定值的20％需及时清洗过滤系统，并填写相关记录表。如风机系统出现故障时，该实验室应停止使用。

PCR实验室规化设计说明 篇4

设 计 说 明

DNA检测室是一种特殊实验室，它不仅采用了获得诺贝尔奖的实时荧光定量PCR技术，尤其是对设计建造过程中的室内空气污染控制和操作流程过程中的交叉污染控制有着及其特殊和非常严格的要求；本设计专为刑侦技术DNA检测实验区室内空气污染控制环境建设提出了整体解决方案。此方案在为华北、东北、西北地区十余个地市级公安局设计中多次得到公安部二所数名领导、专家的支持和指导，并在与各局刑侦技术主管领导、法医和我公司专业技术人员等三方共同研究讨论过程中不断达到理念清晰、布局合理、设计规范、设置完善，即符合实际使用需求，又符合公安部系统刑侦技术DNA检测实验室验收及国家实验室认可、卫生部临床检验中心验收的硬件标准；由于各地客观条件有所不同，须在此整体解决方案的基本框架和原则内因地制宜。

参照标准：《法庭科学DNA实验室检验规范》公安部GA/T 383-2002 《法庭科学DNA实验室规范》公安部GA/T 382-2002 《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫医发[2002]8号文

《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10号文

《临床基因扩增检验实验室设置标准》卫医发[2002]10号文附件

《基因检验实验室技术要求》国家质监检验总局SN/T 1193-2003 《洁净室及相关受控环境-生物污染控制》国际标准 ISO 14698 《洁净厂房设计规范》国家标准 GB 50073-2001 《洁净室施工及验收规范》建设部 JGJ 71-90 《室内空气质量标准》国家标准GB/T 1883-2002 《实验室 生物安全通用要求》国家标准GB 19489-2004 《生物安全实验室建筑技术规范》国家标准GB 50346-2004 《病原微生物实验室生物安全管理条例》卫生部（2004-11-12）

《低压电气施工及检收规范》国家标准GB 50254-96 《通风与空调工程施工质量验收规范》 国家标准GB50043-2002 设计参数：洁 净 度——CLASS 7（主实验室）CLASS 8.3（辅助间）

换气次数——15h-1～25h-1（7级）8h-1～10h-1（8.3级）

温 度——20℃～22℃（冬季）24℃～26℃（夏季）

湿 度——30%～50%RH（冬季）50%～70%RH（夏季）

照 度——≥250Lux（操作区）≥150Lux（辅助区）

噪 音——≤60dB（A）

压 差——≤-5 Pa（负压间）≥ +5 Pa（正压间）

格局规划：实验室高度为2.6-3米，各功能间将根据其不可逆工艺流程、实际用途、设备摆放及人性化等因素通盘布局划分；

功能区分为：

一、普通实验区——法医物证常规检验室、法医物证存储室、受案室、检材室、骨骼提取实验室、数据比对分析室、紧急淋浴洗眼间、洁具间、洗衣间、测序仪专用UPS机房；

二、特殊实验区 / 污染控制区——更鞋 / 缓冲走廊、更衣 / 缓冲间、现场物证DNA提取间（30-50㎡）、嫌犯血样DNA提取间(15-30㎡）、试剂混配间(15-30㎡）、PCR扩增间(15-30㎡）、扩增产物测序间(15-30㎡）；

三、污染控制区基本格局

方案

1、各功能间相互串通，即用套间方式进行人流/物流，此案应严禁采用，首先从房间格局上避免交叉污染；

方案

2、设置独立缓冲间为最佳（尤其是DNA提取间、PCR扩增间、试剂混配间），且人流/物流分道，流程相临间应设置物流传递窗。

方案

3、设置共用缓冲间/缓冲走廊为亦可，操作流程：

完全双通道流程：

常规物证 → 物证存放

↑ 现场物证DNA提取 → PCR扩增 → 产物测序 ↑ ↗ ↗ ↘ 受案 → 检材 原始试剂混配 数据处理

↘ ↘ ↗ 嫌犯血样DNA提取 → PCR扩增 → 产物测序

简化双通道流程：

常规物证 → 物证存放

↑ ↗ 现场物证DNA提取 ↘

受案 → 检材 → 嫌犯血样DNA提取 → PCR扩增 → 产物测序 → 数据处理

原始试剂混配 ↗

单通道流程：

常规物证 → 物证存放

受案↑→ 检材 → DNA提取 → PCR扩增 → 产物测序 → 数据处理

原始试剂混配 ↗

气流组织：

1、原始试剂混配室应为正压间，在微环境百级超净台内操作，须防止其它程序功能间对本操作间的污染；

2、DNA提取室应为微负压间，须设置排风系统，以防止核酸提取时可能产生的气溶胶对人员的侵害和对其它程序功能间的扩散污染；

3、PCR扩增室应为微负压间，须设置排风系统，以防止大量扩增产物对其它程序功能间的扩散污染；

4、检测室应为微负压间，须设置排风系统，以防止扩增产物在电泳测序过程中的扩散污染；同时因3130分析仪散热量较大，会提高室内温度3-5℃；

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5、试剂混配室、DNA提取室、PCR扩增室、检测室如设置缓冲间，功能间内可均为正压，而在缓冲间内设置负压，气流从其双道门的门缝处分别向缓冲间内流动，用合理的气流组织方式避免各功能间的交叉污染；

6、高效送风口为顶送风，侧下回/排风（竖井、夹道、缓冲间）方式。

通风空调：特殊实验区各主要功能间采用非单向流、三级过滤、各自独立送/回风、集中（或独立）新/排风的净化系统，室内空调全部选用悬挂风管式商用空调，通过新风/送风/回风管道、风阀等连接悬挂式袋式中效净化加压风机箱，避免集中回风后再循环可能造成的空气交叉污染，同时亦可避免如采用全新风全排风方式而造成的室内热量/冷量大量流失、难以控制和洁净度无法保证的技术问题，从而提高制热/制冷效果，降低运行能耗；主要功能间内或其配套的缓冲间均加装排风装置，以防止室内污染空气外漏它屋而造成的交叉污染，达到置换室内空气。

电气照明：室内照明灯具采用了国内优质的防尘净化灯，为双管40瓦，在应急照明方面，采用了优质的应急净化灯，当遭遇临时停电或紧急事故断电时，部分净化灯管可迅速转入蓄电池供电，以保证每间自动开启一盏应急照明灯管，方便人员在15分钟内撤离，而平时，此应急净化灯与其它净化灯同样使用，无任何区别，省去了购买安装应急灯组的麻烦，使整个试验区内浑然一体、专业实用；功能间及缓冲间设UV灯。

室内电路上，均应采用达到国家标准的电气线缆，采用并联方式，主线使用班4～6MM2 线缆，插座及照明使用2.5 MM2 线缆，所有线路均为暗装，并使用PVC阻燃线管，接头在技术夹层中采用线盒安装，杜绝施工及维修中的安全隐患。配电柜及空气开关均使用国内著名厂家的元器件，寿命长、安全可靠，风机动力配电箱与空调、照明、插座等总配电箱将分别设置，各间净化风机箱与空调可依据使用需求即可集中操控，亦可单独使用。装修材料：特殊实验区搭建室内环境污染控制二级屏障——密闭间，其围护、吊顶全部采用厚度为50mm的EPS夹芯净化彩钢复合板（双面钢板厚度0.5mmEPS容重16Kg/m3），平整、无漏缝、易清洁、不发尘；

所有墙与顶、地、窗对接角均采用内圆弧（阴角）或外圆弧（阳角）和工艺，室内无死角、不集尘、易清洁；50槽、门框料、窗框料、圆弧角等结构件均选用净化专用铝型材料；

实验区域内地面全部选用纯进口国际知名品牌的优质复合型/通体型PVC地面，多层工艺处理，PVC无缝焊接，防渗漏、防腐蚀、易清洁、美观大方；

室内围护屏障所设固定采光窗/观察窗均采用净化专用铝型材、浮法玻璃制作，不可开启；室内门可通过尺寸为宽850mm、高1900 mm，负压较大的室门向外侧开启，正压室门向内侧开启，走廊或主通道门向外侧开启，门上均设置有长方形观察窗；

作为二级屏障以降低外环境空气或沙尘污染对室内的影响。

配套设备：本实验室内根据需要将可配备具有国家注册商标的“世安” 牌微环境百级生物型超净工作台、拥有国家专利的“世安” 牌补风型排毒通风柜、国内独家生产的“世安” 牌内排式净化捕尘柜、ⅡA型生物安全柜等作为微环境污染控制的一级屏障；超净工作台、净化捕尘柜、生物安全柜均选用世界著名品牌德国EBM风机，噪音低、体积小、风量均匀，及自主研发的程序控制器，选用0.3μm效率≥99.97％的高效过滤器；并与冰箱等其他落地设备、试剂柜/仪器台/操作台/电脑桌等现代实验室家具、PCR仪/测序仪/离心机/工作站/计算机等各种台式仪器及功能间格局等统一设计规划；尤其是美国ABI公司提供的测序仪和PCR仪对室内空气及温湿度的环境控制具有一定的要求；

各实验室间配备不锈钢传递窗作为物流专用单向通道，其具备双门机械联动互锁，双控紫外灭菌灯开关，传送便捷，人 / 物分流，从最大程度上降低交叉污染。

各功能间仪器、设备基本配置(参考)：

一、物证接案室

1、收案实验台

2、万向排气罩

3、立式更衣柜

4、卧式更鞋柜

5、液晶屏台式电脑

6、打印机

7、脚踏式不锈钢垃圾桶

二、检材准备室

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、柜式PP水槽洗涤台

3、双门试剂柜

4、常温冰柜

5、-40℃超低温冰箱

6、电热恒温冰箱

7、压力蒸汽灭菌锅

8、照像仪

9、通风柜（腐败物等）

10、液晶屏台式电脑

11、脚踏式不锈钢垃圾桶

三、核酸提取室（现场物证）

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、柜式PP水槽洗涤台

3、紧急洗眼器

4、手消毒/烘干器

5、ⅡA型生物安全柜/补风型通风柜/内排式净化捕尘柜（骨格粉碎提取等）

6、电冰箱

7、电热恒温水浴锅

8、纯水器

9、加样枪

10、定时恒温磁力搅拌器

11、电子分析天平仪

12、加湿器

13、液晶屏台式电脑

14、DNA扩增仪

15、冷冻离心机

16、高速离心机

17、振荡器

18、脚踏式不锈钢垃圾桶

四、核酸提取室（嫌犯血样）

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、柜式PP水槽洗涤台

3、电冰箱

4、加样枪

5、液晶屏台式电脑

6、ⅡA型生物安全柜/补风型通风柜/无管道净化通风柜

7、冷冻离心机

8、高速离心机

9、定时恒温磁力搅拌器

10、电子分析天平仪

11、电热恒温水浴锅

12、振荡器

13、脚踏式不锈钢垃圾桶

五、试剂混配室

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、柜式PP水槽洗涤台

3、电冰箱

4、加样枪

5、液晶屏台式电脑

6、生物型单面垂直送风百级洁净工作台

7、小离心机

8、不锈钢试剂配送车

9、脚踏式不锈钢垃圾桶

六、PCR扩增室

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、柜式PP水槽洗涤台

3、电冰箱

4、加样枪 5、9700扩增仪

6、液晶屏台式电脑

7、脚踏式不锈钢垃圾桶

七、产物测序室

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、柜式PP水槽洗涤台

3、电冰箱

4、加样枪 5、3130分析仪

及其专用UPS不间断电源（距检测室较近处设可散热UPS机房）

6、液晶屏台式电脑

7、小离心机 8、96孔平板离心机

9、脚踏式不锈钢垃圾桶

八、数据分析室

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、液晶屏台式电脑

3、打印机

pcr实验室认证体会 篇5

许

斌

（江苏省临床检验中心）质量管理的历史

1950年代临床实验室开始质量控制（Quality Control,QC）;1980年代参照工业的GMP管理思路建立良好实验室实践准则（Good Laboratory Practice,GLP）；进入质量保证（Quality assurance,QA）；1990年代实验室引入质量体系认证及实验室认可制度，实现全面质量管理（TQM，Total Quality Management）。质量体系认证——ISO9000（2000版）；实验室认可——ISO/IEC标准17025-2000《校准和检测实验室资格的通用要求》；ISO/DIS标准15189-1999“医学实验室的质量管理。” 美国临床实验室认证

•发证机构：HCFA（Health Gare Financing Administrations）,卫生保健署 •认证依据，CLOA38，行业认可，强制，体系+能力 •认证中介机构：

*JCAHO（Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations）卫生机构认可联合委员会

*CAP(College of American Pathologist)美国病理家学会

*COLA（Commission on Office Laboratory Accred-itation）

医生实验室认可委员会 我国实验室合格评定

•认可

*依据：ISO/IEC 17025，15189 *国家评审，自愿，体系+能力 •认证

*依据：ISO 9000：2000版 *中介机构，自愿，体系 •行业技术验收

*《临床实验室管理办法》，《江苏省医院检验科建设与管理规范》 *省、市临床检验中心，强制，体系+能力 4 PCR验收意义及验收依据

2002年开始的PCR实验室验收工作开创临床检验技术准入的先河、推动临床实验室标准化建设、规范检测市场、建立医疗事故预防机制。其依据为： 《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10号 《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫检字[2002]8号 《关于成立临床基因扩增检验专家组的通知》苏卫医[2002]42号 规定应具有的SOP（13个）

仪器设备的维护保养程序、仪器设备的校准程序、仪器设备的操作程序、临床标本收集程序、临床标本的处理（核酸纯化）程序、临床标本的保存程序、试剂的质检操作程序、消耗品购置验收和储存程序、废弃物的处理程序、内务管理程序、室内质量控制程序、核酸扩增及产物分析检测的操作程序、抱怨处理程序。质量管理体系

6.1 定义 在质量方面指挥和控制组织的管理体系。（Quality Management System）管理体系是指建立方针和目标并实现这些目标的体系。实验室通过把组织机构、职责、工作程序、质量活动过程和各类资源、信息等协调统一起来所形成的有机整体即为实验室的质量体系。

6.2 质量体系的文件构成 第一层：质量手册（纲领性文件）；第二层：程序性文件（体系要素的规定）；第三层：作业指导书（具体项目的操作指导）；第四层：记录包括表格、签名、原始记录、报告等质量记录和技术记录。

6.3 质量手册定义

GB/T6583定义：质量手册是阐明一个实验室的质量方针，并描述质量体系的文件。它既是质量体系的表征形式，又是质量体系建立和运行的纲领。它对实验室的组织结构（含职责）、程序、活动能力（过程）和资源作出规定，是实验室长期遵循的文件。

6.4 质量手册的分类

根据手册的内容和用途分为二类：质量保证手册——用于证明，供客户使用，质量管理手册——用于运行，供实验室内部使用。

6.5 质量手册的作用

编写质量手册的健全和完善质量体系的首要环节。根据实验室的内外因素合理调整、选择体系要素，分配和落实质量职责，理顺管理关系，明确管理责任，合理安排各类文件的层次，把实验室积累的经验变成法规性文件。协调各工作环节的准则。

内部质量审核的依据；对外证实实验室的质量保证能力，提高客户的信任度。

6.6 质量手册的特征

•以客户为关注焦点：以病人为中心，为临床服务 •领导作用：创造使员工能够充分参与实现目标的环境 •全员参与：各负其责

•过程方法：将资源和活动作为过程进行有效管理 •管理的系统方法：各个过程的有效连接 •持续改进：根据实际不断完善

•基于事实的决策方法：遵循科学，实事求是出报告 •与供方互利的关系：相互协作，共同获利

6.7 质量手册的结构 •封面

•批准页：包括实验室名称、标志，发行版次，生效日期，批准人签名，手册编号，受控状态。

•实验室公正性声明

•修订页：以表格描述修订序号、修订的章节条款和简要内容、批准人及日期。•目录：各章节条款的名称及页码

•前言：介绍实验室的一般情况和手册的适用范围以及手册中术语或缩略语的定义 •手册的管理：对手册的保存、分发、评审、修订以及保密作出规定 •质量方针及目标

•组织结构及人员责权利关系

•要素描述：由系列SOP文件对溯源、人、机、料、样、法、测等质量诸要素的陈述 •支持性文件：包括实验室平面图、人员一览表、仪器设备一览表、引用标准及参考文献等

6.8 标准操作程序

Standard Operational Procedure,简称SOP。程序的定义为：为进行某项活动所规定的途径。SOP是临床实验室内部以文件的形式对质量活动用规定的方法进行连续而恰当的控制。实验室的SOP应涵盖所有的质量活动，包括检测或校准计划、管理性程序、技术性程序、项目操作程序和记录表格等。由于影响每个实验室的质量活动的条件和因素不一样，一个SOP只在某个实验室内有效，而不一定适用于其他实验室。

6.9 标准操作程序的一般要求

•对完成各项质量活动的方法作出规定，每个SOP都应对一个或一组相互关系的活动进行描述；

•每个SOP应说明该项质量各环节的输入、转换和输出所需的文件、物资、人员、记录以及它们与有关活动的接口关系；

•规定开展质量活动的各个环节的物资、人员、信息和环境等方面应具备的条件； •明确每个环节转换过程中各项因素的要求，即由谁做、做什么、做到什么程序、达到什么要求，如何控制、形成什么记录和报告，以及相应的审批手续； •规定在质量活动中需要注意的例外或特殊情况的纠正措施； •SOP应简练、明确和易懂并且工作人员熟练掌握和严格遵守。

6.10 推荐PCR实验室质量手册目录 1.质量方针和宗旨 2.工作制度

2.1 实验室的设置、布局及组织结构 2.2 实验室内务管理制度 2.3 实验室的人员配置及管理制度 2.4 生物防护与安全制度 2.5 实验室废弃物处理制度 2.6 实验室清洁消毒制度 2.7 仪器设备的管理制度

2.8 仪器、试剂、耗材购置程序及管理制度 2.9 临床标本的管理制度 2.10 实验室记录的管理制度 2.11 质量控制工作管理制度 2.12 结果报告管理制度 2.13 岗位责任制 2.14 抱怨制度 3.操作指导书（SOP）3.1 消毒标准操作程序

3.2 超净工作台使用标准操作程序 3.3 超净工作台维护和保养标准操作程序 3.4 PCR仪使用标准操作程序 3.5 PCR仪维护和保养标准操作程序 3.6 台式离心机使用标准操作程序 3.7 高速冷冻离心操作标准操作程序 3.8 移液器使用标准操作程序 3.9 加样器校准标准操作程序 3.10 冰箱维护和保养标准操作程序 3.11 电热恒温水浴箱操作程序 3.12 电子天平使用和校正操作程序 3.13 可移动紫外消毒车使用操作程序 3.14 温度计校准程序 3.15 试剂的质检操作程序 3.16 标本唯一标识编号编制规则 3.17 临床标本的采集及处理操作程序 3.18 临床标本的保存程序

3.19 乙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序 3.20 室内质量控制标准操作程序 3.21 室间质评标准操作程序 4.引用图表

4.1 实验室组织结构图 4.2 实验室工作人员一览表 4.3 人员培训计划及培训记录表 4.4 主要仪器设备一览表 4.5 临床送检标本流程图 4.6 PCR扩增可接受标本记录表 4.7 PCR扩增拒收标本记录表 4.8 室内质控结果记录表 4.9 室间质控记录表 4.10 消耗性材料验收记录表 4.11 试剂验收记录表 4.12 故障处理表 4.13 仪器设备使用记录表 4.14 仪器设备维护保养记录表 4.15 实验室清洁消毒记录表 4.16 工作区温度、湿度记录表 4.17 抱怨记录表

4.18 标本超低温保存记录表 4.19 应急处理记录表 4.20 垃圾处理记录表 4.21 冰箱温度记录表 4.22 水浴箱温度记录表 4.23 移动紫外消毒车记录表 4.24 设备校正记录表 4.25 检测结果报告流程 4.26 报告单样张 6.11 文件格式 一 目的 二 范围 三 职责 四 工作流程 五 引用文件及表格

6.12 写作技巧

•目的：WHY，为什么要开展这项活动 •范围：WHAT，活动涉及的方面 •职责：WHO+WHAT，谁做，谁负责

•工作流程：列出活动顺序和细节，明确各环节“输入——转换——输出”，即做何事（WHAT）、何人做（WHO）、何时做（WHEN）、何地做（WHERE）、如何做（HOW）•引用文件和表格：

开展此项活动涉及的文件、标准以及使用的表格、证明文件和记录保存期 评审中常见问题

7.1 手册

文件不全，无系统性；质量要素描述不全；格式不对；与实际工作脱节；无现行有效性（无手签，各区无相应手册）；记录不全、不规范

7.2 人员

人员档案：每人一个档案袋，有关资格证书（如上岗证）、培训、技能和经历等。培训计划及实施记录：每人有、季度、月的培训内容及实施记录；内容包括外出学习、进修，内部质量手册学习、业务学习、新项目引进等。

7.3 设施与环境

通风、紫外、清洁、消毒的程序及记录、生物安全防护的程序及记录、生物垃圾的处理。

7.4 仪器设备

采购程序及验收标准；校准程序及状态标识，使用、维护、保养的程序及记录；档案：每个与检测质量相关的设备均应建档，内容包括：设备的名称；制造商名称、型号、序号或其它唯一性标识；接收日期和启用日期；）目前放置地点；接收时的状态（例如全新的、经改装的）；仪器使用说明书或其复印件；校准和/或检测的日期和结果以及下次校准和/或检测的日期；迄今所进行的维护和今后维护计划的细节；损坏、故障、改装或修理的历史。

7.4 料（试剂、耗品）

采购程序及领用记录，质检标准、程序及记录，应急程序；缺货、试剂变质；室内质控品。

7.5 样（品）

标本唯一编号，年月日项目顺序号；标本采集标准操作程序；标本接受（拒收）标准、交接记录；标本保存、销毁的程序及记录；标本处理标准操作程序

7.6（方）法

方法学的有效性——依据；SOP的合理性——生搬硬套；分区操作的协作——流程合理；质控点的安排——提取效率、扩增效率；基线的调整——CT值、本底荧光值。

7.7（检）测

•室内质控的SOP：耗品质检，试剂质检，质控方法（纠错措施），质控图。•室间质评的SOP：纠偏措施

7.8 报告

•发放范围：门诊、病区、外单位 •发放方式：保密、电子、邮件

•报告单的格式：唯一编号、检测下限、实验室申明 •审核、标准、不合格报告的处理

7.9 抱怨

•实验室服务、质量改进的依据

•对象：病人、医生、工作人员。SOP应明确方式、职责、反馈、记录。

摘自《2003年华东区临床检验中心协作线临床实验室质量管理

pcr实验室认证体会 篇6

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂:

(1)引物:半巢式PCR第一扩增上游引物5’GCCGACGGATTCCTGCGCTC3’,下游引物5’CGCTCCTCGCTGGCTCCA3’。第二扩增上游两条引物分别为5’AAAAACTCGCTTTCAGCAAGAAGAC3’和5’AAAAACTCGCTTTCAGCAAGAAGAT3’,下游引物为5’CGCTCCTCGCTGGCTCCA3’,分别构成C和T两个反应体系。引物由上海英骏生物公司合成。(2)TaqDNA聚合酶(MBI公司生产)、dNTP(MBI公司生产)、 100bp递增的DNA标记物(Marker)(Fermentas公司生产);(3)提取人外周血白细胞DNA的试剂:试剂1:10mM Tris ph7.6,10mM KCL;试剂2:10mM Tris ph7.6,10mM KCL,10mM MgCl2,0.5mM NaCl,0.5%SDS, 2mM EDTA。酚∶氯仿∶异戊醇混合液(25∶24∶1),均为上海生工生产。

1.1.2 主要仪器:

PE9600基因扩增仪(美国Perkin Elmer公司生产),Power Pac 3000型电泳仪和Gel Doc1000紫外图像分析系统和其配套的分析软件(美国BIO-RAD公司生产)。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA制备:用酚/氯仿法[5]从人外周血白细胞中抽取基因组DNA为模板。

1.2.2 首先以第一对扩增引物扩增出378bp的片断作为模板,再以半巢式引物(第二扩增引物)扩增出276bp的最终产物。(1)第一扩增反应体系组成:模板DNA 1.0μL,10×Buffer 5.0μL,上游引物(20mM)1.0μL,下游引物(20mM)1.0μL,TaqDNA酶(5U/μL)1.0μL,H2O 35.0μL,MgCl2 5.0μL,dNTP 1.0μL,构成50.0μL体系,退火温度为65℃[4]。(2)半巢式扩增体系组成:以第一扩增产物为模板1.01μL,10×Buffer 5.0μL,上游引物(20mM)1.0μL,P2(20mM)1.0μL,TaqDNA酶(5U/μL)1.0μL, Mg2+浓度及dNTP浓度使用浓度梯度摸索,加水构成50.0μL体系。

1.2.3 半巢式PCR循环程序:以上反应体系点离心2s后放在PE9600基因扩增仪中,94℃预变性5min,以94℃变性45s,退火45s(退火温度按梯度选择),72℃延伸45s的条件循环扩增,扩增次数进行摸索,然后72℃终末延伸5min。

1.2.4 半巢式PCR扩增产物分析:制备2%琼脂糖凝胶,加入0.5μg/ml溴化乙锭。PCR产物10μL和Marker 2μL分别加样,在100V电压下电泳40min,电泳结束后用Gel Doc1000紫外图像分析系统观察276bp的产物片断。

2 结果

2.1 条件初探

任选DNA模板4份,初试反应条件为DNA模板(约200ng)1.0μL,10×Buffer 5.0μL,上游引物(20mM)1.0μL,下游引物(20mM)1.0μL,TaqDNA酶(5U/μL)1.0μL, H2O 36.0μL,Mg2+(25mM)4.0μL,dNTP(10mM)1.0μL,构成50.0μL体系。退火温度58℃。结果表明:模板1出现相对应扩增产物,故选用模板1为实验模板作为研究实验条件之用,见图1。

2.2 退火温度

在55～67°C范围内以3℃递增设系列退火温度,反应时间均为45s。结果表明:退火温度为55℃、61℃、64℃时均有产物扩出,67℃时没有扩增产物。但55℃时产物量最多,见图2。考虑当退火温度低时,易有非特异性产物产生,故选58℃为最适退火温度。

2.3 扩增条件

同1,退火温度为58℃。设定系列Mg2+浓度梯度。在1.5～3.5mmol/L的浓度范围内,按0.5mmol/L递增浓度。结果示:Mg2+浓度在1.5～2.5mmol/L时,没有扩增产物。浓度在3.0mmol/L和3.5mmol/L时有产物,但在3.0 mmol/L时,产物量更多,故选择3.0mmol/L为最适Mg2+浓度。见图3。

2.4 dNTP浓度

在上述扩增条件下,dNTP浓度分别设为2.5、5.0、10.0mmol/L。结果显示:dNTP浓度在2.5mmol/L时,扩增产物量最多,故取2.5mmol/L为dNTP的最适浓度。见图4。

注:图1:1～4为模板DNA 1～4;

图2:退火温度:1:55℃,2:61℃,3:64℃,4:67℃;

图3:1～5:Mg2+浓度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mmol/L;

图4:1～3:dNTP浓度为2.5、5.0、10.0mmol/L。

2.5 扩增循环次数

在上述扩增条件下,扩增循环次数分别为30次、35次及38次。结果显示:扩增循环次数为30次时,第一扩增产物无显示,第二扩增产物为300～400bp间产物,说明产生了非特异性扩增,产物不完全。扩增次数为38次时,扩增产物没有35次时理想。故最佳扩增次数为第一扩35次,第二扩30次,见图5。

注:1为第一扩增产物,378bp;2、3为第二扩增产物C反应体系;4、5为T反应体系,为276bp终产物。

3 讨论

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。半巢式聚合酶链反应由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应,在第二轮扩增时采用半巢式,设计单条引物,另一条引物与第一轮扩增共用,效果优于单次扩增,因此试验的敏感性和特异性均增强。

半巢式PCR可用来检测DNA已知位点变异的方法,具有快速、检出率高的特点,不需要DNA探针分子杂交或限制性内切酶做酶切,不需标记引物,用电泳结果可直接判断基因型[6]。半巢式PCR,因非特异片段的种类是非常有限的,能够与第二对引物再次匹配的几乎不存在,因此,半巢式PCR检测的特异度高。在实验中,不适宜的条件均会影响实验结果。在进行批量实验前,需对实验方法的主要影响因素进行探讨,以保证实验结果的可靠性。

模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一。在研究中,笔者用紫外分光光度计在260nm和280nm处测定模板吸光度,证实从外周血抽取的DNA模板纯度和含量。

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40～60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度是引物的复性温度,它取决于引物的长度浓度和碱基的构成,也决定PCR的特异性。退火温度过高,扩增产物减少,而特异性提高;降低退火温度,可增加扩增量,但错配亦增多导致非特异产物增加,影响结果。在本研究中,通过电泳结果比较,选择58℃作为最适退火温度。

Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,镁离子浓度是影响TaqDNA酶活性的一个重要因素,镁离子浓度还影响模板和PCR产物的解链。只有游离的镁离子对TaqDNA聚合酶有激活作用Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。高浓度的dNTP会对反应起抑制作用,出现大量的非特异产物和错配现象;而dNTP的浓度过低,又会使扩增产物量减少,扩增效率降低。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。要使酶活性达到最高,除了镁离子浓度还要考虑dNTP的浓度。通过梯度浓度摸索,确定实验所需的最适Mg2+和dNTP的浓度,这是非常必要的。

扩增循环次数是保证产物数量的必须条件,循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。如果扩增次数不够,则第一次扩增产物量少,影响第二次扩增结果。而循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。通过不同循环次数的摸索,确定最适的扩增循环次数,是必需的。笔者认为第一次扩增35个循环、第二次扩增30个循环可得到较好的实验产物。

PCR实验易受到污染、聚合酶抑制剂、不适宜反应条件等因素的影响,出现假阴性或假阳性结果。所以,在批量实验前,摸索各种实验的最适条件,是非常重要的,也是实验成功的前提和关键。

摘要：目的:研究半巢式PCR方法检测FOXC2基因5’非翻译区C-512T多态性的实验条件。方法:对实验研究中的主要影响因素设置各系列浓度和梯度,进行PCR反应后观察电泳结果,选取最适条件。结果:最适温度为58℃,最适Mg2+浓度为3.0mmol/L,最适dNTP浓度为2.5mmol/L。最适扩增循环为第一次扩增35个循环,第二次扩增30个循环。结论:摸索最适实验条件是进行批量实验的前提和关键。

关键词：半巢式PCR,FOXC2基因多态性,实验条件

参考文献

[1]Farmer SR.The forkhead transcription factor Foxo1:apossiblelink between obesity and insulin resistance(J).Mol Cell,2003,4:119-129.

[2]Carlsson E,Almgren P,Hoffstedt J,et al.The FOXC2C-512Tpolymorphism is associated with obesity and dyslipidemia(J).Obes Res,2004,12:1738-1743.

[3]Carlsson E,Groop L,Ridderstrale M,et al.Role of the FOXC2-512C>T polymorphism in type 2diabetes:possible associationwith the dysmetabolic syndrome(J).Obesity,2005,29:268-274.

[4]Kovacs P,Lehn-Stefan A,Stumvoll M,et al.Genetic variationin the human winged helix/forkhead transcription factor geneFOXC2in Pima Indians(J).Diabetes,2003,52(5):1292-1295.

[5]段勇,王玉明,等.从血细胞快速抽提DNA的方法探讨(J).昆明医学院学报,1998,19(2):28.