生物素分析方法研究

生物素分析方法研究（共10篇）

生物素分析方法研究 篇1

姜黄素是一种生物活性广泛的多酚类天然产物,具有杀虫、抑菌、抗病毒、消炎抗氧化、抗癌等多种生物活性,结构如图1。分子中的酚羟基、β-二酮结构及活泼亚甲基都具有很高的活性,但是它们的存在,使姜黄素在中性和碱性条件下不稳定。其衍生物1,4-戊二烯-3-酮类化合物同姜黄素一样有广泛的生物活性,然而稳定性更好,毒副作用更小。因此,以姜黄素为先导化合物对其进行结构修饰,期望得到更高活性的化合物,已经引起了国内外的广泛关注[1,2,3,4,5]。

1 姜黄素衍生物的合成及生物活性研究

1.1 姜黄素β-二酮的结构修饰

2011年,罗金香等[6]合成了4个新颖的姜黄素嘧啶酮衍生物1a~1d。初步的生物活性测定表明:所有目标化合物均表现出杀螨活性,且活性高于姜黄素。其中1a的活性最好,处理48 h后,对朱砂叶螨和柑橘全爪螨的触杀活性分别是姜黄素的4.34、3.55倍;处理72 h后,对朱砂叶螨和柑橘全爪螨的触杀活性分别是姜黄素的14.19、4.41倍。

2012年,Sahu等以[7]姜黄素为原料,分别与取代肼、取代苯甲醛反应,合成了含吡唑和亚苄基的姜黄素衍生物2a~2d和3a~3d,并测试了化合物对常见的细菌菌株的抑菌活性。初步活性数据表明:大多数化合物对上述细菌均有较好的抑菌活性,是姜黄素抑菌活性的4~16倍。

2013年,罗金香等[8]合成了含异噁唑和吡唑的姜黄素衍生物4和5a~5f,并对其进行了杀螨活性测试。测试结果表明:药剂浓度为1×10-3mol/L时,化合物对朱砂叶螨和柑橘全爪螨表现出较好的杀螨活性,均高于姜黄素;并且处理时间越长,活性越高。

2013年,Lal等[9]合成了6个姜黄素衍生物6a~6e,并对目标化合物进行了抑菌活性测试。数据表明:化合物6b~6e对金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌和大肠杆菌等细菌具有较好的抑制活性,6d和6e对绿色木霉菌和新弯月孢霉有较好的抑菌活性,且所有活性都至少是姜黄素的4倍。

1.2 姜黄素活泼亚甲基的结构修饰

2012年,Shi等[10]合成了化合物7和8,并进行抗肿瘤活性测试。研究结果表明:化合物对人类癌细胞株有一定的抑制活性。其中,化合物8对LNCa P和PC-3表现出较好的抑制活性,且高于姜黄素。

2013年,何利兵等[11]合成了姜黄素衍生物合物9a~9d,通过MTT测试了姜黄素及衍生物对结肠癌细胞株Lovo和SW480细胞毒性影。结果表明:化合物9a~9d和姜黄素均可以抑制结直肠癌细胞的增殖迁移力,促进结直肠癌细胞的凋亡,抑制作用明显优于姜黄素。

1.3 姜黄素酚羟基的结构修饰

2008年,Dubey等[12]合成了姜黄素衍生物10a~10c和11a~11b,并对化合物进行了体外抑菌活性测试。活性数据显示:所有化合物对小球菌、绿脓杆菌、腐生葡萄球菌、暗沟肠杆菌和大肠杆菌等细菌有一定的抑制效果。

2011年,赵言国[13]合成了6个姜黄素苯磺酸酯类化合物,并测定了化合物对朱砂叶螨若螨、雌成螨和螨卵的触杀活性。测试结果表明:化合物对朱砂叶螨的触杀活性均高于姜黄素;其中,化合物12b和12f的活性较为突出。

2 戊二烯酮类化合物的合成及生物活性研究

2.1 具有杀虫活性的1,4-戊二烯-3-酮类化合物

2010年,陈鹏丽[14]合成了一系列含肟醚结构的1,4-戊二烯-3-酮类化合物13a~13g,并对小菜蛾进行了杀虫活性测试。结果表明:浓度为100μg/m L时,化合物13a~13e和13g的校正死亡率分别为68%、68%、79%、68%、71%和71%,与商品药阿维菌素(校正死亡率82%)效果相当。

2.2 具有抑菌活性的1,4-戊二烯-3-酮类化合物

2008年,李少博等[15]合成了一系列1,4-戊二烯-3-酮肟脂类化合物14a~14b。采用生长速率法对目标化合物进行了小麦赤霉病菌、辣椒枯萎病菌、苹果腐烂病菌抑菌活性测定。结果表明:当药剂浓度为50 mg/L时,化合物对三种病菌的抑制率为42%~53%,与对照药剂恶霉灵的抑制活性相当。

2.3 具有抗病毒活性的1,4-戊二烯-3-酮类化合物

2009年,王振宁等[16]合成了一系列1,5-二取代吡唑基-1,4-戊二烯-3-酮类化合物15a~15f,并对其进行抗烟草花叶病毒的活性测试。结果表明:部分化合物有一定的抗烟草花叶病毒活性。

2011年,仇秋娟等[17]合成了11个不对称1,5-二芳基-1,4-戊二烯-3-酮肟酯类化合物,对目标化合物进行了抗黄瓜花叶病毒(CMV)测试。结果表明:浓度为0.5 mg/L时,所有化合物有一定的抗CMV活性。其中,16a、16e、17a对CMV的枯斑抑制率分别为41.3%、45.5%、46.9%,接近对照药剂宁南霉素的抑制活性。

2.4 具有消炎抗氧化活性的1,4-戊二烯-3-酮类化合物

2004年,Youssef等[18]合成了4个1,5-二苯基-1,4-戊二烯-3-酮衍生物18a~18d,研究发现:所有化合物在清除二苯基间三硝基自由基方面表现出较好的活性,抑制率均达90%以上。

2009年,Liang等[19]合成了一系列1,4-戊二烯-3-酮类化合物,用鼠巨噬细胞J774.1对目标化合物进行了诱导肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)分泌的活性测定。结果表明:目标化合物具有显著的抗炎活性,其中化合物19a、19b的抗炎活性高于姜黄素。

2.5 具有抗癌活性的1,4-戊二烯-3-酮类化合物

2011年,Yuan等[20]合成了1,4-戊二烯-3-酮类化合物20和21,并对化合物进行了抗癌活性测试。初步活性数据表明:化合物20和21对PC3、Bcap37和BGC823等恶性肿瘤细胞增殖有一定的抑制作用。初步机制研究的结果表明:他们是通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制癌细胞的生长。

2012年,Woo等[21]合成了含苯并咪唑基的1,4-戊二烯-3-酮类化合物22和23,并对化合物进行抗肿瘤活性测试。初步生物活性数据表明:所有化合物对人类癌细胞株都有较好的抑制增殖活性,且高于姜黄素。

3 结语与展望

综上所述,姜黄素衍生物同姜黄素一样都具有杀虫、抑菌、抗病毒、消炎抗氧化、抗癌等多种生物活性,尤其是1,4-戊二烯-3-酮类化合物具有更好的稳定性和更低的毒性。因此,以姜黄素为先导化合物,将在杀虫、抑菌、抗病毒、消炎抗氧化、抗癌等方面有较好活性的基团引入姜黄素结构中,以期得到更高活性的1,4-戊二烯-3-酮类化合物,为绿色仿生农药的设计合成提供理论支持。

摘要：姜黄素衍生物具有杀虫、抑菌、抗病毒、消炎抗氧化、抗癌等多种生物活性。概述了对姜黄素芳环及芳环上酚羟基、β-二酮、活泼亚甲基进行修饰,或者对去掉活泼亚甲基和一个羰基后的1,4-戊二烯-3-酮类化合物进一步修饰后,得到的化合物具有较高的生物活性,并展望了其未来的发展前景。

关键词：姜黄素衍生物,1,4-戊二烯-3-酮,生物活性

生物素分析方法研究 篇2

一、动物激素

1．氨基酸衍生物

①甲状腺激素：由甲状腺分泌的一组含碘的氨基酸衍生物，能促进新陈代谢和生长发育，尤其对中枢神经系统的发育和功能具有重要影响，提高神经系统的兴奋性。甲状腺激素分泌过多，导致甲亢；分泌过少，成年人导致粘液性水肿，婴幼儿时期就会患上呆小症；饮食中缺碘，会引起甲状腺增生肿大，称地方性甲状腺肿，俗称大脖子病，我国推广的食盐加碘为主的综合防治措施对预防碘缺乏症有较好效果，另外，常吃海带等含碘丰富的海藻对防治该病效果也

较好。

②肾上腺素：由肾上腺髓质分泌，能促进肝糖元分解为葡萄糖，从

而使血糖浓度升高。

2．多肽类

①促甲状腺激素释放激素：由下丘脑分泌的3肽，能促进垂体合成和分泌促甲状腺激素。

②生长激素释放抑制激素：由下丘脑分泌，能抑制生长激素的不适宜分泌，用于治疗肢端肥大症。早期从羊脑中提取，50万个羊脑才可提取5μg，如今利用转基因技术获取的工程菌发酵生产，7．

5L培养液就能得到5μg。

③促性腺激素释放激素：由下丘脑分泌的10肽，能促进垂体合成和分泌促性腺激素。④抗利尿激素：由下丘脑神经细胞分泌、垂体后叶释放，能促进肾小管和集合管对水分的重吸收，减少尿的排出。

⑤胸腺素：医疗上常从小牛等的胸腺中提取，能促进T淋巴细胞的分化、成熟，增强淋巴细胞的功能，临床上常用于治疗免疫功能缺陷或低下（如艾滋病、系统性红斑狼疮）的患者。

3．蛋白质类

①生长激素：由垂体合成和分泌，促进生长，主要促进蛋白质的合成和骨的生长。成年人分泌过多导致肢端肥大症；青少年时期分泌过多导致巨人症，分泌过少导致侏儒症。1982年，美国科学家将人的生长激素基因和牛的生长激素基因分别注射到小白鼠的受精卵中，得到了体型巨大的超级小鼠。

②促甲状腺激素：促进甲状腺的生长发育，调节甲状腺激素的合成和分泌。

③促性腺激素：促进性腺的生长发育，调节性激素的合成和分泌。

④催乳素：由垂体合成和分泌，促进乳腺的发育和泌乳。⑤胰岛素：由胰腺中胰岛B细胞分泌，调节糖类代谢，降低血糖含量，促进血糖合成糖元，抑制非糖物质转化为葡萄糖，从而降低血糖浓度。若B细胞受损，出现高血糖，导致糖尿。⑥胰高血糖素：由胰腺中胰岛A细胞分泌，促进糖元分解和非糖物质转化为葡萄糖，从而升高血糖浓度。

4．固醇类

①雄性激素：肾上腺皮质分泌少量，主要由睾丸分泌，促进雄性生殖器官的发育和生殖细胞的形成，激发并维持雄性第二性征。②雌性激素：肾上腺皮质分泌少量，主要由卵巢分泌，促进雌性生殖器官的发育和生殖细胞的形成，激发并维持雌性第二性征和正常的性周期。

③孕激素：由卵巢分泌，促进子宫内膜和乳腺等的生长发育，为受

精卵和泌乳准备条件。

④醛固酮：由肾上腺皮质分泌，促进肾小管和集合管对钠离子（Na+）的重吸收和钾离子（K+）的分泌。

4．信息素：是在同种昆虫及各种昆虫之间存在种种能起到传递信息的化学物质，称为信号化合物，由于这类化学物质起着在个体之间传递化学信息的作用，故称为信息素或“外激素”。根据其作用范围的不同，还可分为若干种，如性信息素、踪迹信息素、聚集信息素和报警信息素等，而当前应用最多的是性信息素。

二、植物激素

1．生长素：1934年由美国的郭葛鉴定为吲哚乙酸。分布很广，根、茎、叶、花、果实、种子和胚芽鞘中都有分布，且大多集中在生长旺盛的部位。生长素在植物体内含量极少，700万株玉米幼苗的茎尖，只含有1毫克的植物生长素，但是生长素对植物的生长却具有巨大的作用。促进扦插枝条生根，培育无根豆芽，促进果实发育，培育无籽果实，防止落花落果，盆景造型培育，绿篱修剪和果树整枝；植物组织培养中能影响植物细胞脱分化和再分化。2．细胞分裂素：是一类具有腺嘌呤环结构的植物激素。存在于正在进行细胞分裂的部位，主要作用是促进细胞分裂和组织分化，植物组织培养中能影响植物细胞脱分化和再分化。

3．赤霉素：是一类属于双萜类化合物的植物激素。一般在幼芽、幼根和未成熟的种子中合成。赤霉素的主要作用是通过叶片、嫩枝、花、种子或果实进入植物体内，传导到生长活跃部位发生作用，促进细胞伸长，从而引起茎杆伸长和植株增高；能打破种子、块茎或鳞茎等器官的休眠，促进发芽，能减少蕾、花、铃、果实的脱落。4．脱落酸：是一种具有倍半萜结构的植物激素。脱落酸在衰老的叶片组织、成熟的果实、种子及茎、根部等许多部位形成。脱落酸可以刺激乙烯的产生，催促果实成熟，它抑制脱氧核糖核酸和蛋白质的合成。其生理功能有：维持芽与种子休眠、促进果实与叶的脱

落等。

5．乙烯：广泛存在于植物体的多种组织中，特别是在成熟的果实中含量较多，主要作用是促进果实的成熟。

三、植物色素——植物细胞中的色素主要存在于叶绿体、有色

体、液泡等细胞器中。

1．叶绿素：存在于叶绿体中，含量较类胡萝卜素多，主要吸收红橙光和蓝紫光，包括叶绿素a和叶绿素b，其中叶绿素b为黄绿色，将所吸收的光能传递给少数特殊状态的叶绿素a；叶绿素a为蓝绿色，其中少数特殊状态的叶绿素a能接受大多数叶绿素a、全部的叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素传递的光能后被激发，释放出高能电

子，完成光电转换。2．类胡萝卜素：类胡萝卜素含量较叶绿素少，主要吸收蓝紫光，并可将所吸收的光能传递给少数特殊状态的叶绿素；类胡萝卜素包括叶黄素和胡萝卜素，其中叶黄素为黄色，胡萝卜素为橙黄色。3．花青素：存在于根、叶、花、果皮、种皮等的细胞液中。其颜色因酸碱度不同而异，在酸性条件下呈红色，在碱性条件下呈蓝色。4．藻红素：呈红色，存在于蓝藻和红藻的光谱色素，主要是吸收蓝绿光，所以红藻能生活在深海中。

四、动物色素

1．黑色素：动物，特别是脊椎动物皮肤或者头发里的深棕色的色素。由黑色素细胞合成的，广泛存在于人的皮肤、粘膜、视网膜、软脑膜及胆囊与卵巢等处。白化病人因基因不正常而缺少酪氨酸酶，不能将酪氨酸合成黑色素，患者表现出毛发白色，皮肤淡红色，畏光。人的头发基部的黑色素细胞衰老时，细胞中酪氨酸酶活性降

低，导致头发变白。

2．脂褐色：会随细胞衰老而在皮肤细胞逐渐堆积即形成老年斑。

五、维生素

1．维生素A：又名抗干眼病维生素，在动物性食物如肝脏、鱼肝油中含有，植物性食物中不含有，但胡萝卜等植物中的胡萝卜素可转变为维生素A，能促进人体生长发育、增强抵抗力。缺乏时易患

夜盲症、皮肤角质化等病。

2．维生素B1 ：又名硫胺素，主要含在稻麦等谷物种皮里，能维持人体正常的新陈代谢和神经系统正常的生理功能，人体内缺乏时会引起脚气病、神经炎等疾病。

3．维生素C：又名抗败血酸，多含在新鲜果蔬里，具有强还原性，能将I2还原成I-，在含有维生素C 的溶液中，加入淀粉溶液就可以用碘溶液来滴定被检测样品中的维生素C，缺乏时会引起坏血病

等疾病。

4．维生素D：属于固醇，在鱼肝油、蛋黄、肝脏等食物里含量较多，能促进小肠对Ca、P的吸收。缺乏时会得佝偻病、骨质疏松

症等疾病。

5．生物素：维生素H，肝、肾、酵母和牛乳中含量较多，是谷氨

酸的生长因子。

六、抗生素

原称抗菌素。由微生物（大多数是放线菌）产生的在低浓度下具有抑制或杀死其他微生物作用的化学物质。1929年英国学者弗莱明首先在抗生素中发现了青霉素。目前所用的抗生素大多数是从微生物培养液中提取的，有些抗生素已能人工合成，常用的抗生素有100多种。由于不同种类的抗生素的化学成分不一，因此它们对微生物的作用机理也很不相同，有些抑制蛋白质的合成，有些抑制核酸的合成，有些则抑制细胞壁的合成。

1．青霉素

①青霉素是最早发现并使用的一种抗生素，是由青霉菌产生的次级代谢产物，现在世界各国生产上使用的青霉菌菌种最初是在1943年从一个发霉的甜瓜上得来的，这种野生菌种产量只有20单位/毫升，目前经诱变育种获得的新菌种产量已经可以达到

50000—60000单位/毫升。

②多年的使用使得不少病原菌对青霉素产生了抗药性，目前科学家已设法通过有关的酶制剂来改造青霉素的分子结构，进而研制出新

型的青霉素。

③培养酵母菌和霉菌的培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线

菌的生长。

2．其他抗生素：链霉素、庆大霉素、四环素、土霉素、金霉素等。

七、毒素

为微生物次级代谢产物，许多微生物如细菌、真菌都能产生，有的积累在细胞内，有的排到细胞外。

1．外毒素：细菌（产毒菌）在生长过程中由细胞内合成后分泌到细胞外的毒性物质（化学成分是蛋白质）。能产生外毒素的细菌大多数是革兰氏阳性菌，少数是革兰氏阴性菌。将产生外毒素的细菌的液体培养物用滤菌器过滤除菌，即能获得外毒素。2．内毒素：由革兰氏阴性菌所产生、存在于菌体内的一类毒素，化学成分是磷脂-多糖-蛋白质复合物。是菌体细胞壁的组成成分。

八、干扰素和白细胞介素

属于效应T细胞释放的免疫活性物质——淋巴因子，能增强机体的免疫能力。

1．干扰素：机体免疫细胞产生的一种细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的低分子糖蛋白，干扰素在机体的免疫系统中起着非常重要的作用。

2．白细胞介素—2：由淋巴细胞产生，能促进淋巴细胞活化和增殖，20世纪90年代后期我国科学家完成了人的白细胞介素—2在大肠杆菌中的表达，生产的白细胞介素—2临床上主要用于治疗肿瘤和

感染性疾病。

九、营养素

1．微生物五大营养素：包括碳源、氮源、生长因子、水和无机盐。2．人体六大营养素：包括水、无机盐、糖类、蛋白质、脂肪和维

生素。

3．第七营养素：即指膳食纤维，主要包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶、琼脂等。膳食纤维就是不能被人体胃肠道消化吸收的植物食物的残余物质，20世纪 70年代以前，被认为是无价值的“废弃物”，现在它的价值重新被人们发现，甚至有人将它与碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、无机盐、微量无素等营养素并列，称之为“第七营养素”。其主要化学成分是非淀粉多糖和木质素。虽然不能直接为人体提供营养，但它却参与人体的一些生理活动，对人体的健康（如减肥、排毒养颜、降脂降糖、预防冠心病和胆结石症

等）有着举足轻重的作用。

十、矿质元素

是指除C、H、O以外，主要由植物的根系从土壤中吸收的元素。目前科学家确定的必需矿质元素有14种，大量元素：N、P、K、Ca、Mg；微量元素：Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Cl、Ni。矿质元素进入植物体后，有些仍然呈离子状态（如K）有些形成不稳定化合物（如N、P、Mg），它们都可被再度利用；有些形成难溶解的稳定化合物（如Ca、Fe），它们不能被再度利用。

十一、其他

1．秋水仙素：从百合科植物秋水仙的种子和球茎中提取出来的一种植物碱，在有丝分裂或减数分裂过程中，能够抑制纺锤体的形成，导致染色体不分离，引起细胞内染色体数目加倍。2．紫草素：生产上从大量培养的紫草愈伤组织中提取，是制造治疗烫伤和割伤的药物以及生产染料和化妝品的原料。3．纤维素：植物细胞内最重要的多糖之一，是植物细胞壁的基本组成成分。植物体细胞杂交时用纤维素酶、果胶酶分解植物细胞的细胞壁，分离出有活力的原生质体。

4．细胞色素C：在生物体有氧呼吸过程中起重要作用的一种蛋白质，约由100个氨基酸组成，通过人与多种生物的细胞色素C的氨基酸序列差异，可研究生物间亲缘关系。

5．尿素：为蛋白质代谢终产物之一，在肝脏中产生，通过肾、皮

肤等排出体外。

6．胆红素：红细胞中的血色素所制造的色素，红细胞有固定的寿命，每日都会有所毁坏。此时，血色素会分解成为正铁血红素和血红素。然后正铁血红素依酶的作用会变成胆红素，而血红素则会重

新制成组织蛋白。7．抗毒素：一类含有抗体的免疫血清制品。是将类毒素或毒素给马或其他大动物注射，使动物血清内产生大量抗体，然后将含有抗体的动物血清精制浓缩而成的，如破伤风抗毒素、肉毒抗毒素、白喉抗毒素及蛇毒抗毒素等。抗毒素实质上是抗体，可中和相应的毒

素，使其失去毒性。

8．凝集素：一类能够识别特异性糖并与之非共价结合的蛋白或糖蛋白，因其具有特定的识别受体，在免疫系统和发育过程中发挥了

生物素分析方法研究 篇3

【关键词】 心力衰竭；证素；证型分布

【中图分类号】R25622 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）24-0023-02

心力衰竭是指心排血量绝对或相对不足，不能满足机体代谢的需要，从而出现肺循环和体循环瘀血症状，是心血管疾病的最终阶段，为临床上常见病、多发病。古代文献并无心力衰竭相关的记载，根据临床表现将其归属于“心悸”、“胸痹”、“咳喘”、“水肿”等范畴。本病在辨证分型上尚缺乏规范化标准，各医家大多根据自己的临床经验辨证，使其易受医者主观因素的影响。故进行中医证候的规范化，建立统一的证候诊断标准，已成为本领域研究的主要内容。本文探讨其证素及常见证型，为进一步规范心力衰竭中医临床辨证提供依据。

1 方法

11 一般资料 选取2013年1月至2014年3月间就诊于江苏省中医院心内科病房的心力衰竭患者200例，其中男112例，女88例，年龄43～82岁，平均（63±078）岁。病程20天至25年，平均（523±012）年。

12 西医诊断标准 参照中华医学会心血管学分会制定的《慢性心力衰竭诊断与治疗指南》[1]进行诊断。

13 证素诊断标准 根据朱文峰《证素辨证学》[2]制定心力衰竭证素诊断标准如下：瘀：①心胸部刺痛，为固定部位刺痛，夜间较著；②唇色暗紫；③舌质紫暗，或有瘀斑，脉涩。痰浊：①胸闷痛；②体胖多痰；③身体困重；④面色暗；⑤舌淡紫，苔腻或滑，脉滑。阳虚：①胸痛绵绵，喜温喜按；②形寒肢冷；③腰酸膝软；④面色苍白；⑤泛吐清涎；⑥舌质淡胖，或有齿痕，苔薄白润，脉沉细。阴虚：①胸部隐痛；②五心烦热，午后低热，盗汗、口燥咽干；③舌红少津，少苔或无苔，脉细。气虚：①心悸气短；②神疲头晕；③舌淡，脉弱。根据心力衰竭的临床表现，得出病性证素，通过与病位证素的结合，分析总结常见中医证型分布。

13 统计频数、频率 将临床症状进行分类，应用SPSS180统计软件，计量资料采用均数±标准差表示；数据录入excel表格，统计其出现的频数、频率。

2 结果

21 病性证素分布 根据病性证素分析可得出心力衰竭的病性证素包括虚实两端；实证主要有血瘀、痰浊，虚证主要为气虚、阴虚、阳虚。具体见表1。

22 病位证素分布 心力衰竭的病位证素在心，可涉及脾、肺、肾。具体见表2。

23 证型分布 心力衰竭的证型主要为痰瘀互阻证、气虚血瘀证、气阴两虚证。具体见表3。

3 讨论

31 宏观病性证素 心力衰竭病性证素主要以血瘀、痰浊、气虚、阴虚、阳虚为主。《内经》云：“心者，五脏六腑之主”，“心主血脉”，表明心脏的主要功能是推动血液运行以濡养周身。气为血之帅，心气是血液运行的动力，气滞则血脉瘀滞，血液不能输布周身而出现心衰。瘀血碍气阻络，影响水液的正常输布，而成为痰饮。痰为有形之邪，或停滞于经脉或留于脏腑，阻滞气机，妨碍血行，而致血瘀。《素问·平人气象论》：“左乳之下， 其动应衣，宗气泄也”，认为心气虚是心衰的病理基础，心气虚无力推动血液的运行，是导致心力衰竭组织血流灌注不足与代谢需求不平衡的根本原因。心为阳脏，以“阳气”为用，心阳具有推动作用，心阳不足，心脏搏动迟缓而无力，可致血液运行失常，瘀阻心脉；阳虚气化不利，运水无力，可造成水饮内停[3]。阴阳互根互用，故阴血亏虚，血不养心，心阳（气）失用，而致心衰。现代亦有研究提出阴虚证的微观内在本质是神经内分泌细胞因子系统的长期慢性激活[4]。

【摘 要】 目的：探讨心力衰竭的证素及证型分布。方法：选择符合诊断标准的心力衰竭患者200例，统计病性证素、病位证素出现的频数、频率，将病性与病位相结合，统计分析常见证型。结果：心力衰竭的病位证素在心，可涉及脾、肺、肾；常见病性证素依次为血瘀、痰浊、气虚、阴虚、阳虚；证型主要为：痰瘀互阻证、气虚血瘀证、气阴两虚证、心肺气虚证、痰饮阻肺证、脾肾阳虚证。结论：当前心力衰竭的临床分型缺乏统一标准，证素辨证能够规范临床证型，以指导治疗。

【关键词】 心力衰竭；证素；证型分布

【中图分类号】R25622 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）24-0023-02

心力衰竭是指心排血量绝对或相对不足，不能满足机体代谢的需要，从而出现肺循环和体循环瘀血症状，是心血管疾病的最终阶段，为临床上常见病、多发病。古代文献并无心力衰竭相关的记载，根据临床表现将其归属于“心悸”、“胸痹”、“咳喘”、“水肿”等范畴。本病在辨证分型上尚缺乏规范化标准，各医家大多根据自己的临床经验辨证，使其易受医者主观因素的影响。故进行中医证候的规范化，建立统一的证候诊断标准，已成为本领域研究的主要内容。本文探讨其证素及常见证型，为进一步规范心力衰竭中医临床辨证提供依据。

1 方法

11 一般资料 选取2013年1月至2014年3月间就诊于江苏省中医院心内科病房的心力衰竭患者200例，其中男112例，女88例，年龄43～82岁，平均（63±078）岁。病程20天至25年，平均（523±012）年。

12 西医诊断标准 参照中华医学会心血管学分会制定的《慢性心力衰竭诊断与治疗指南》[1]进行诊断。

13 证素诊断标准 根据朱文峰《证素辨证学》[2]制定心力衰竭证素诊断标准如下：瘀：①心胸部刺痛，为固定部位刺痛，夜间较著；②唇色暗紫；③舌质紫暗，或有瘀斑，脉涩。痰浊：①胸闷痛；②体胖多痰；③身体困重；④面色暗；⑤舌淡紫，苔腻或滑，脉滑。阳虚：①胸痛绵绵，喜温喜按；②形寒肢冷；③腰酸膝软；④面色苍白；⑤泛吐清涎；⑥舌质淡胖，或有齿痕，苔薄白润，脉沉细。阴虚：①胸部隐痛；②五心烦热，午后低热，盗汗、口燥咽干；③舌红少津，少苔或无苔，脉细。气虚：①心悸气短；②神疲头晕；③舌淡，脉弱。根据心力衰竭的临床表现，得出病性证素，通过与病位证素的结合，分析总结常见中医证型分布。

13 统计频数、频率 将临床症状进行分类，应用SPSS180统计软件，计量资料采用均数±标准差表示；数据录入excel表格，统计其出现的频数、频率。

2 结果

21 病性证素分布 根据病性证素分析可得出心力衰竭的病性证素包括虚实两端；实证主要有血瘀、痰浊，虚证主要为气虚、阴虚、阳虚。具体见表1。

22 病位证素分布 心力衰竭的病位证素在心，可涉及脾、肺、肾。具体见表2。

23 证型分布 心力衰竭的证型主要为痰瘀互阻证、气虚血瘀证、气阴两虚证。具体见表3。

3 讨论

31 宏观病性证素 心力衰竭病性证素主要以血瘀、痰浊、气虚、阴虚、阳虚为主。《内经》云：“心者，五脏六腑之主”，“心主血脉”，表明心脏的主要功能是推动血液运行以濡养周身。气为血之帅，心气是血液运行的动力，气滞则血脉瘀滞，血液不能输布周身而出现心衰。瘀血碍气阻络，影响水液的正常输布，而成为痰饮。痰为有形之邪，或停滞于经脉或留于脏腑，阻滞气机，妨碍血行，而致血瘀。《素问·平人气象论》：“左乳之下， 其动应衣，宗气泄也”，认为心气虚是心衰的病理基础，心气虚无力推动血液的运行，是导致心力衰竭组织血流灌注不足与代谢需求不平衡的根本原因。心为阳脏，以“阳气”为用，心阳具有推动作用，心阳不足，心脏搏动迟缓而无力，可致血液运行失常，瘀阻心脉；阳虚气化不利，运水无力，可造成水饮内停[3]。阴阳互根互用，故阴血亏虚，血不养心，心阳（气）失用，而致心衰。现代亦有研究提出阴虚证的微观内在本质是神经内分泌细胞因子系统的长期慢性激活[4]。

【摘 要】 目的：探讨心力衰竭的证素及证型分布。方法：选择符合诊断标准的心力衰竭患者200例，统计病性证素、病位证素出现的频数、频率，将病性与病位相结合，统计分析常见证型。结果：心力衰竭的病位证素在心，可涉及脾、肺、肾；常见病性证素依次为血瘀、痰浊、气虚、阴虚、阳虚；证型主要为：痰瘀互阻证、气虚血瘀证、气阴两虚证、心肺气虚证、痰饮阻肺证、脾肾阳虚证。结论：当前心力衰竭的临床分型缺乏统一标准，证素辨证能够规范临床证型，以指导治疗。

【关键词】 心力衰竭；证素；证型分布

【中图分类号】R25622 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）24-0023-02

心力衰竭是指心排血量绝对或相对不足，不能满足机体代谢的需要，从而出现肺循环和体循环瘀血症状，是心血管疾病的最终阶段，为临床上常见病、多发病。古代文献并无心力衰竭相关的记载，根据临床表现将其归属于“心悸”、“胸痹”、“咳喘”、“水肿”等范畴。本病在辨证分型上尚缺乏规范化标准，各医家大多根据自己的临床经验辨证，使其易受医者主观因素的影响。故进行中医证候的规范化，建立统一的证候诊断标准，已成为本领域研究的主要内容。本文探讨其证素及常见证型，为进一步规范心力衰竭中医临床辨证提供依据。

1 方法

11 一般资料 选取2013年1月至2014年3月间就诊于江苏省中医院心内科病房的心力衰竭患者200例，其中男112例，女88例，年龄43～82岁，平均（63±078）岁。病程20天至25年，平均（523±012）年。

12 西医诊断标准 参照中华医学会心血管学分会制定的《慢性心力衰竭诊断与治疗指南》[1]进行诊断。

13 证素诊断标准 根据朱文峰《证素辨证学》[2]制定心力衰竭证素诊断标准如下：瘀：①心胸部刺痛，为固定部位刺痛，夜间较著；②唇色暗紫；③舌质紫暗，或有瘀斑，脉涩。痰浊：①胸闷痛；②体胖多痰；③身体困重；④面色暗；⑤舌淡紫，苔腻或滑，脉滑。阳虚：①胸痛绵绵，喜温喜按；②形寒肢冷；③腰酸膝软；④面色苍白；⑤泛吐清涎；⑥舌质淡胖，或有齿痕，苔薄白润，脉沉细。阴虚：①胸部隐痛；②五心烦热，午后低热，盗汗、口燥咽干；③舌红少津，少苔或无苔，脉细。气虚：①心悸气短；②神疲头晕；③舌淡，脉弱。根据心力衰竭的临床表现，得出病性证素，通过与病位证素的结合，分析总结常见中医证型分布。

13 统计频数、频率 将临床症状进行分类，应用SPSS180统计软件，计量资料采用均数±标准差表示；数据录入excel表格，统计其出现的频数、频率。

2 结果

21 病性证素分布 根据病性证素分析可得出心力衰竭的病性证素包括虚实两端；实证主要有血瘀、痰浊，虚证主要为气虚、阴虚、阳虚。具体见表1。

22 病位证素分布 心力衰竭的病位证素在心，可涉及脾、肺、肾。具体见表2。

23 证型分布 心力衰竭的证型主要为痰瘀互阻证、气虚血瘀证、气阴两虚证。具体见表3。

3 讨论

白杨素衍生物的合成及其活性研究 篇4

本实验中以白杨素为原料,先将其与溴乙酸乙酯发生取代反应,生成化合物1,然后在氢氧化钾的甲醇溶液中发生水解反应得到化合物2,接着将化合物2与苄胺发生酰胺缩合反应,从而得到白杨素的衍生物3。结构鉴定后对白杨素衍生物进行活性验证,本文以EC109、HepG2、SW480、Hela四种肿瘤细胞为研究对象,采用MTT方法测定其体外抗肿瘤活性,通过与白杨素抗肿瘤活性的对比从而评价白杨素衍生物的体外抗肿瘤作用。

1 实 验

1.1 实验仪器和材料

实验材料:白杨素(AR),阿拉丁试剂;丙酮(AR),国药集团化学试剂有限公司;甲醇(AR), 国药集团化学试剂有限公司;二环已基碳二亚胺(AR),阿拉丁试剂;二氯甲烷(AR),天津博迪化工股份有限公司;三乙胺(AR),阿拉丁试剂;苄胺(AR),阿拉丁试剂。

实验仪器:核磁(AM-400),Bruker;旋转蒸发仪(RE-52),上海亚荣生化仪器厂;电子天平(BP211D),Startoris;集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S),巩义市英谷华予电器厂制造;柱层析硅胶(100～200目,200～300目),青岛海洋化工厂。

1.2 实验方法

1.2.1 化合物1的制备

首先将白杨素(2.54 g;0.01 mol)和无水碳酸钾(1.66 g;0.011 mol) 一同加入至100 mL搅拌的丙酮溶液中,然后将溴乙酸乙酯加入溶液中,反应在一边加热一边搅拌的条件下进行加热回流,反应时间为6 h。反应结束后,冷却。将溶液抽滤,抽滤后将滤液浓缩,浓缩物用丙酮重结晶,过滤物真空干燥后得化合物1。产率:82%。

1.2.2 化合物2的制备

将化合物1(1.70 g;5.0 mmol)溶于120 mL甲醇中,往溶液中加入氢氧化钾(1.68 g;3 mmol)在加热搅拌下回流8 h,直到溶液中出现不溶于甲醇的黄色固体。抽滤,过滤物用甲醇洗涤,干燥。将干燥物溶于水中,然后用稀盐酸调节溶液pH,直至pH<2。将溶液抽滤,抽滤物真空干燥,得化合物2。产率69%。mp:284～289 ℃;1H NMR (400 MHz,d6-DMSO):δ:4.85 (s,2H);6.41 (d,J=2.2 Hz,1H),6.82 (d,J=2.1 Hz,1H);7.04 (s,1H);7.61 (m,3H),8.11 (m,2H),12.80 (s,1H)。

1.2.3 化合物3的制备

将二环己基碳二亚胺(0.75 g;3.372 mmol)和20 mL无水二氯甲烷溶液滴入产物Ⅱ(0.96 g;3.06 mmol)和无水二氯甲烷的40 mL的溶液中,整个过程在冰浴中进行,滴加完毕后,在冰浴下反应12 h。将冰浴撤去,加入分别加入含氮小分子化合物3.373 mmol和三乙胺(0.341 g;3.372 mmol),在常温下搅拌12 h后,溶液抽滤,将滤液浓缩物溶于乙酸乙酯100 mL,抽滤,滤液分别用稀碳酸钾溶液,饱和氯化钠溶液分别洗涤3次,有机相用稀盐酸溶液洗3次,合并有机相,正向硅胶分离,二氯甲烷洗脱。

1.3 MTT对所合成白杨素衍生物的活性检测

取对数生长期的EC109、HepG2、SW480、Hela细胞,RPMI1640 完全培养基调整细胞悬液浓度为1×104 /mL,接种于96孔板,100 μL/孔。分组:空白组、调零组、4个药物处理组(终浓度分别为6.25、12.5、25、50 μmol/L),每组浓度4个复孔,37 ℃、5%CO2恒温培养培养48 h。终止培养前4 h加入终浓度为5 mg/mL的MTT 10 μL/孔。结束培养时,吸去上清,加入150 μL DMSO,在1 h内用酶标仪在492 nm波长处测定吸光度值(OD值),计算IC50值。

2 结果与讨论

2.1 化合物3表征的数据

黄色粉末。产率21%。1H NMR(400 MHz,d6-DMSO):δ:4.24(s,2H); 4.74(s,2H);;6.47(s,1H);6.635(s,1H);6.83(s,1H);7.07(s,1H);7.29(m,5H);7.79(m,3H);12.72(s,1H)。13C NMR (400 MHz,d6-DMSO):δ:182.57,164.17,164.07,161.60,157.68,139.65,131.95,131.05,129.12,128.69,127.73,127.46,127.27,127.16,126.93,105.93,105.78,99.41,94.09,67.75,42.36。

2.2 白杨素以及白杨素衍生物的体外抗肿瘤活性

从表1中可以看出,化合物3抑制EC109肿瘤细胞的IC50值高于白杨素的IC50值;化合物3抑制HepG2肿瘤细胞的IC50低于白杨素的IC50值;化合物3抑制SW480肿瘤细胞对其的IC50低于白杨素的IC50值;化合物3抑制Hela肿瘤细胞的IC50值略高于白杨素的IC50值。

2.3 讨论

恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病,目前对癌症的治疗仍采用手术,放疗和化疗的综合措施,其中化疗在综合治疗中占有很重要的地位,但在临床上化疗药仍然在疗效,副作用以及肿瘤细胞的耐药等问题。从天然产物中分离有效单体,以明确其化学结构与药理活性关系,然后进行化学合成或对其结构进行改造,以增强其生物活性或减轻其毒副作用,这是近年来新药创制的重要途径之一。

天然及合成的黄酮抗肿瘤作用构效关系表明,C-7和C-5位有羟基或苯环上有3个羟基的活性最好[2,3]。但黄酮7-位羟基很容易被代谢而限制了它的临床应用[4,5],因此,C-5-位羟基是产生抗肿瘤活性的必须基团。本实验中将烷胺基,苄基以及哌嗪基等基团引入到白杨素的C-7位羟基上,但C-5位羟基由于与C-4位上的酮基形成氢键,形成了一个比较稳定的六圆环结构,因此该羟基上的氢原子核磁共振氢谱的位移往低场偏移,在化合物3的氢谱数据中,该氢原子的δ达到了12.72,由于该氢原子的稳定性,因此在第一步取代反应时修乙酸乙酯只与C-7位上的羟基发生了取代反应,而C-5位羟基并未发生反应。通过对白杨素与白杨素衍生物对EC109、HepG2、SW480、Hela四种肿瘤细胞的MTT增殖抑制影响数据显示:化合物3对HepG2细胞的增殖抑制作用较白杨素有明显增强,化合物3对SW480细胞的抑制作用较白杨素有明显增强,而对Hela和EC109肿瘤细胞的抑制作用较白杨素并无增强。

3 结 语

在本实验中合成的白杨素衍生物虽然已测得具有良好的体外抗肝癌和食管癌肿瘤增殖抑制的活性,但还有必要通过进一步药理实验对其进行作用机制更行深一步的研究,为进一步获得高效低毒的抗癌先导物提供有力的依据。

摘要：合成白杨素衍生物并对其进行活性评价。以5,7-二羟基黄酮为原料,通过取代、水解、酰胺缩合反应合成白杨素的衍生物,然后采用MTT比色法测定白杨素及白杨素衍生物对EC109(食管癌)、HepG2(肝癌)、SW480(结肠癌)、Hela(宫颈癌)细胞增殖抑制作用。合成的白杨素衍生物对HepG2、SW480肿瘤细胞的IC50值比白杨素的IC50值低。该衍生物对HepG2、SW480肿瘤细胞的抗癌活性较白杨素有一定程度的提高。

生物素分析方法研究 篇5

高效液相色谱法测定发酵液中生物素含量

采用高效液相色谱法测定发酵液中生物素的含量.结果表明,样品浓度在5～150 μg・mL-1范围内线性关系良好,最低检测限为0.01 μg・mL-1,精密度实验的RSD为0.21%,稳定性实验的`RSD为6.6%,发酵液在15 h内检测结果无明显差别,加样回收率在95%～102%之间.该方法简便、快捷、准确、重现性好,可用于发酵液中生物素的含量测定.

作 者：黄琴 丁安子 宋娟 HUANG Qin DING An-zi SONG Juan 作者单位：湖北工业大学,发酵工程省部共建教育部重点实验室,湖北,武汉,430068刊 名：化学与生物工程 ISTIC英文刊名：CHEMISTRY & BIOENGINEERING年，卷(期)：26(8)分类号：O657.7 Q563关键词：生物素 发酵液 高效液相色谱 含量测定

青蒿素类衍生物抗肿瘤研究进展 篇6

青蒿素分子含有过氧化物桥结构 (C-O-O-C) , 与二价铁反应生成自由基。完整的过氧化物桥结构是反应必须基团, 衍生物无此结构则无抗疟活性。三价铁离子和青蒿素之间的反应很慢。疟原虫体内亚铁离子以高浓度亚铁血红素分子的形式存在。青蒿素和疟原虫体内的亚铁反应生成自由基, 杀灭疟原虫, 起到抗疟效果, 自由基的细胞靶标以及生化反应目前还不清楚。有人提出过氧化物传递氧原子与螯合铁生成Fe (IV) =O, 生成的自由基通过烷基化作用以及破坏疟原虫的必要蛋白从而杀灭疟原虫。高压氧条件下或者添加阿霉素、咪康唑等自由基生成物都可以提高青蒿素类药物的抗疟活性[3]。

2 转铁蛋白和肿瘤细胞上的转铁蛋白受体表达

转铁蛋白 (transferrin, TRF, siderophilin) 是人体内一种重要的铁元素载体, 主要分布于血浆中, 负责运载由消化道吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。转铁蛋白分子量约7.7万, 为单链糖蛋白, 含糖量约6%[4]。转铁蛋白可以可逆地结合多价离子, 包括铁、铜、锌、钴等, 每一分子转铁蛋白可结合两个三价铁原子。由于转铁蛋白和铁的结合力很强, 血清中基本没有游离铁, 这是体内防御致病微生物的防御机制[4,5]。转铁蛋白受体含两个由二硫键连接的亚基。转铁蛋白受体插入细胞表面, 每分子包括胞内、胞外亲水部分及28个氨基酸残基的跨膜部分, N-端位于细胞内、C-端露在细胞表面与转铁蛋白结合。转铁蛋白受体在人体内广泛表达, 表达量有明显差别。转铁蛋白受体主要在调节细胞铁的摄取中发挥关键作用[6,7]。铁是所有生命细胞包括肿瘤细胞生长所必需的元素之一。机体内从氧化呼吸到能量代谢, 从叶酸代谢到DNA合成和修复等关键反应的多种催化酶均含铁。铁-转铁蛋白-转铁蛋白受体复合物的内吞作用是细胞铁摄入的主要途径。首先, 铁-转铁蛋白复合体 (holo-Tf) 与细胞表面转铁蛋白受体结合, 受体与holo-Tf的结合力很高, 比与不含铁转铁蛋白 (apo-Tf) 的结合力高几十倍, 因此只有holo-Tf能与受体结合。holo-Tf-转铁蛋白受体复合体成簇地聚集在细胞表面网络蛋白包被的凹陷部位, 小窝凹陷内吞从细胞膜上脱落进入细胞形成内吞小体;在质子泵的作用下, 利用ATP提供的能量, 质子进入内吞小体中, 使内吞小体中的pH降低到5~6, 在这种情况下, 三价铁与转铁蛋白的结合力减弱被释放。在内吞小体内, 释放出的三价铁在氧化还原酶的作用下还原为二价铁, 然后通过二价金属离子转运体转运至胞液中。apo-Tf-转铁蛋白受体复合体经囊泡外排回到细胞表面, 在细胞外生理pH下, apo-Tf与受体的结合力减弱释放, 转铁蛋白运送铁原子100~200次后失去活性。肿瘤细胞表面的转铁蛋白受体是正常细胞的2~7倍, 与转铁蛋白的亲和力是正常细胞的10~100倍, 因此肿瘤细胞内含有大量的亚铁离子[6,7,8]。

3 青蒿素及其衍生物的体、内外抗癌活性

正常细胞表面转铁蛋白受体很少, 细胞内亚铁离子含量少, 因此青蒿素可以选择性的作用于肿瘤细胞。青蒿素的体内、外抗癌活性研究国内外已有大量研究报道。Efferth研究显示, 在临床使用的青蒿素类抗疟药物中, 青蒿琥酯对肿瘤细胞的细胞毒作用最强[9]。Moore等将口服双氢青蒿素和硫酸亚铁合用于移植纤维肉瘤的大鼠, 观察对纤维肉瘤毒性作用, 合用后抗肿瘤作用明显。该实验先给大鼠口服硫酸亚铁, 6 h后口服二氢青蒿素, 连续给药10 d, 监测每个动物的肿瘤增长。合用组11 d后, 肿瘤增长率大大低于空白组 (P<0.025) , 合用组与两个单用组比较也差异有统计学意义 (P值都小于0.025) 。而肿瘤增长率在两个单用组和空白组之间的两两比较没差异有统计学意义[10]。Lai 等也报道青蒿素可以延缓大鼠乳腺瘤的增长。口服50 mg/ml 二甲基苯蒽 (DMBA) 诱导大鼠产生乳腺癌。DMBA处理日起, 用药组大鼠喂食含青蒿素0.02%的粉状鼠食, 对照组大鼠喂食不含青蒿素的粉状鼠食, 连续40周监测两组大鼠乳腺瘤的发展情况。用药组大鼠肿瘤生长比对照组明显延缓 (P<0.002) , 在监测期药物能够预防大鼠乳腺癌的发生 (对照组发生率57%, 控制组96%, P<0.01) 。与对照组大鼠相比服药组大鼠体内乳腺瘤数量更少 (P<0.002) , 尺寸更小。由于青蒿素是一种相对安全的药物, 高剂量没有发现副作用的发生, 此实验证实青蒿素可以有效预防肿瘤的发生[11]。青蒿素类药物还具有抗血管生成作用。移植人卵巢癌细胞HO-8910的裸鼠, 皮下注射青蒿琥酯, 肿瘤增长减慢, 微血管密度下降, 药物对实验动物没有明显毒副作用。皮下注射青蒿琥酯50 mg/ (kg·d) 和 100 mg/ (kg·d) 15 d, 肿瘤增长分别下降41%和62%。100 mg/ (kg·d) 组肿瘤微血管密度比对照组低4倍以上[12]。

4 青蒿素抗肿瘤作用的分子机制

由于G1期细胞的转铁蛋白受体表达和铁离子摄入都显著增多, 青蒿素类药物在此期抗细胞增值效应显著, 并引起细胞凋亡[13]。目前已发现了与细胞凋亡相关的30多种基因, 主要包括Fas家族、bcl-2家族和p53等。由于有些基因的表达具有细胞类型特异性, 所以不同类型的细胞凋亡相关基因也不完全相同, 其具体作用靶点和机制还有待进一步研究[14,15,16]。

6 临床应用

Berger 等2005年首次报道了两例长期使用标准化疗的癌症患者合用青蒿琥酯后的作用效果。单独使用标准化疗对葡萄膜黑色素瘤增长的抑制作用失效, 肿瘤转移。继续使用化疗的同时使用青蒿琥酯, 应用后耐受性良好, 除了单独使用标准化疗时出现的副反应外, 未见其他副反应发生。第一例患者单独使用弗替姆丁, 病情恶化, 添加青蒿琥酯后, 患者出现一次一过性反应。第二例患者起初使用抗黑色素肿瘤药氮烯咪胺, 肿瘤未得到有效控制, 合用青蒿琥酯后病情稳定, 脾脏和肺部转移的病灶逐渐消失, 患者在诊断为IV期黑色素瘤后生存了47个月, 而此病的生存中值是2~5个月。青蒿琥酯可能成为黑素瘤标准化疗中非常有前景的辅助用药, 而且对于其他肿瘤可能同样有效 [17]。张源才等于2004年6月至2006年2月采用B超引导下经皮肝穿刺瘤内注射青蒿琥酯治疗原发性肝癌15例, 疗效显著。隔日推注青蒿琥酯180 mg (3支) 1次, 5 d为1疗程, 1疗程结束后休息1周, 再进行第2疗程, 最长注射4疗程。半个月复查肝功、B超、AFP。每疗程结束后观察肿瘤大小, 其中8例发现肿瘤体积缩小, 高密肿瘤注射药物区域出现片状低无回声区, 患者疼痛减轻, 一般情况改善, 生活质量明显提高, 肝功检查未见恶化, AFP 9例下降。7例3个月内未明显增大, 全部患者疼痛均减轻。15例患者注射后均有不同程度胀痛, 数小时后消失, 无发热及肿瘤破裂、出血、气胸、胆瘘及黄疸[18]。青蒿琥酯有良好的耐受性并无严重副作用, 这些都将使其成为不久的将来临床试验的主要药品。

7 青蒿素-转铁蛋复合体

Lai等将青蒿素衍生物artelinic acid与含铁转铁蛋白 (holo-Tf) C结构域N-糖基链上的糖基共价结合生成artelinic acid-holo-Tf复合体, holo-Tf将青蒿素与三价铁同时运送至肿瘤细胞内, 在细胞内释放的三价铁转化为二价铁, 与结合在转铁蛋白上的artelinic acid反应生成自由基杀灭细胞。单独使用青蒿素类药物, 肿瘤细胞和正常细胞内青蒿素摄入量是相同的, 只是由于肿瘤细胞内亚铁离子含量增高, 使得青蒿素类药物具有靶向性。使用复合体后, 肿瘤细胞内青蒿素和铁离子浓度都比正常细胞增高, 从而增强了青蒿素对肿瘤细胞的细胞毒作用和靶向作用。将复合体作用于人白血病Molt-4) 细胞系和正常人淋巴细胞系的体外实验也证实:与青蒿素类药物相比复合体对肿瘤细胞的细胞毒作用更强, 对正常细胞的杀伤作用更小。另外青蒿素类药物在血浆中可快速消除, 口服青蒿素后峰浓度持续时间很短, 抗肿瘤作用有限。转铁蛋白是血液内含物质, 预计青蒿素-转铁蛋白复合体在体内的峰浓度持续时间会较长, 可以较多的进入肿瘤细胞。将复合体制备成静脉内注射或以喷雾剂的形式应用于人体都是比较好的剂型[19]。

8 展望

生物素分析方法研究 篇7

1 材料与方法

1.1 供试样品

供试样品Y24、Y25、Y26由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室合成, 经核磁共振光谱和质谱等方法确定结构和纯度。给药前先用DMSO溶解, 滤膜除菌后, 再用完全培养基配制成所需浓度。

1.2 仪器和试剂

CO2培养箱 (美国Thermo公司) ;超净工作台 (DL-CJ-1ND-Ⅱ, 北京东联哈尔仪器制造有限公司) ;酶联仪 (美国Bio-RAD公司) ;倒置显微镜 (日本Olympus公司) ;细胞培养瓶 (美国Corning公司) ;96孔细胞培养板 (美国Corning公司) ;电子分析天平 (上海天平仪器厂) ;微量加样器等。DMEM培养基和胎牛血清 (Gibco公司) ;双抗溶液 (Corning公司) ;胰蛋白酶 (TopBio公司) ;二甲基亚砜 (DMSO) ;MTT (AMRESCO) 等。

1.3 细胞株

人肝癌细胞株HepG2、人正常肝细胞L02细胞从解放军302医院肝衰竭研究室引进并自行传代培养。

1.4 方法

1.4.1 肝癌细胞HepG2和正常肝细胞L02的复苏与传代培养

分别将冻存于液氮中的细胞株取出, 放置于37℃水中快速解冻, 800rpm低速离心5min, 弃上清后各加入适量培养液 (含10%胎牛血清, 100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM) 制成细胞悬浮液, 在37℃5%CO2饱和湿度培养箱内培养, 待细胞贴壁铺满瓶底后, 用0.02%EDTA清洗细胞两遍, 再加入0.25%胰蛋白酶进行消化传代, 传代2~3次后细胞处于对数生长期后可供实验用。

1.4.2 MTT法检测马蹄金素衍生物对两种细胞的毒性及计算IC50

分别取对数生长期的HepG2和L02细胞消化、计数、制成细胞浓度为5×104个/mL的悬液, 按每孔100μL接种到96孔培养板中, 置于37℃5%CO2培养箱中培养24h。待细胞贴壁后换液加药, 供试品分别用DMEM培养液稀释成8个浓度:320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/mL, 分别加入96孔板中, 200μL/孔, 每浓度设6个复孔, 同时设立阴性对照组、溶媒对照组。96孔板置于37℃5%CO2培养箱中培养72h后, 每孔加入20μL MTT (5mg/mL) , 继续培养6h。1 200rpm离心5min, 弃上清液, 每孔加入200μL DMSO, 置摇床上震荡10min, 使结晶物充分溶解, 在490nm/630nm双波长下用酶标仪测定每孔的OD值, 各组OD值取均值后, 计算抑制率。半抑制率IC50通过Graphpad Prism5软件进行非线性拟合求得。实验重复3次, 取其平均值。

细胞增殖抑制率= (1-实验组OD值/溶剂对照组OD值) ×100%

1.5 统计处理

实验数据以均数±标准差 (±s) 表示, 采用SPSS13.0软件进行统计分析。进行单因素方差分析和方差齐性检验, 用t检验做组间两两比较, P<0.05表示有显著性差异, P<0.01表示有极显著性差异。

2 结果

2.1 马蹄金素衍生物体外对肝癌细胞HepG2的增殖影响

3个马蹄金素衍生物对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用 (见表1) :随质量浓度的增加抑制率增强, 其抑制作用呈一定的剂量依赖性, 马蹄金素衍生物Y24、Y25、Y26对肝癌细胞HepG2的细胞毒性用IC50表示, IC50值分别为51.59、29.51、6.37μg/mL。

(±s, n=6)

2.2 马蹄金素衍生物体外对人正常肝细胞L02的增殖影响

3个马蹄金素衍生物对正常肝细胞L02增殖的抑制作用 (见表2) :在同供试品同浓度下, 与作用于HepG2细胞相比较, 3个供试品均对正常肝细胞L02的细胞毒性较低, 而对肝癌细胞HepG2具有较强的增殖抑制作用, 供试品给药质量浓度≥10μg/mL时, 供试品对这两种细胞增殖影响差异具有统计学意义 (P<0.05) 。马蹄金素衍生物Y24、Y25、Y26对正常肝细胞L02的细胞毒性用IC50表示, IC50值分别为247.0、191.6、60.6μg/mL, 分别是肝癌细胞HepG2的4.79、6.49、9.51倍。

(±s, n=6)

注:在同供试品同浓度下, 与作用于HepG2细胞的比较, *P<0.05, **P<0.01。

3 讨论

MTT法是一种检测细胞存活和增殖的方法, 该方法具有灵敏度高、经济等特点, 已经广泛应用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、肿瘤细胞化学敏感性及放射性敏感性测定、免疫细胞生长增殖及毒性测定等[5,6,7]。本实验采用MTT法分析药物对肿瘤细胞HepG2和正常肝细胞L02细胞是否具有抑制生长增殖作用以及抑制作用的强弱。

初步体外抗肿瘤实验表明, 以马蹄金素为先导化合物, 通过对其进行了结构修饰, 设计合成的3个化合物对正常肝细胞L02的细胞毒性较低, 而对肝癌细胞HepG2具有较强的增殖抑制作用, 其中Y26对肝癌细胞HepG2的细胞毒性最高, IC50为6.37μg/mL。关于体外抗肿瘤效果的评价, 认为合成物时IC50为10μg/mL, 植物提取物时IC50为30μg/mL, 具有一定抑制作用[8]。鉴于Y26对肝癌细胞HepG2有较强的细胞毒性, 又对正常肝细胞L02的细胞毒性较低, IC50为60.6μg/mL, 是肝癌细胞HepG2的9.51倍。因此, 对Y26抗肿瘤作用的深入研究具有重要意义。以马蹄金素为母核, 进行化学结构修饰, 合成的马蹄金素衍生物可能成为一类具有开发前景的新型抗肿瘤药物的化合物。

摘要：目的:研究马蹄金素衍生物的体外抗肿瘤活性。方法:采用MTT法检测3个马蹄金素衍生物对人肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞L02细胞的生长增殖影响。结果:3个化合物对肝癌细胞株HepG2的细胞毒性IC50分别为51.59、29.51、6.37μg/mL, 而对正常肝细胞L02细胞的细胞毒性IC50分别为247.0、191.6、60.6μg/mL。3个化合物在给药质量浓度≥10μg/mL时, 对这两种细胞增殖影响差异具有统计学意义 (P<0.05) 。结论:3个化合物对正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2均有抑制作用, 对L02细胞毒性较低, 而对肝癌细胞HepG2具有较强的增殖抑制作用, 并且呈现出剂量-效应关系。其中Y26对肝癌细胞HepG2的细胞毒性最高, IC50为6.37μg/mL。

关键词：马蹄金素衍生物,MTT法,HepG2细胞,L02细胞,抗肿瘤

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生物素分析方法研究 篇8

但姜黄素水溶性差,疏水性强,25℃ 时其在水中的溶解度仅为6. 9 μg·m L-1[3],37℃ 时其在正辛醇 - 水体系中的油 /水分配系数为19204 ± 192( Log P为4. 210 ± 0. 005)[4]。姜黄素口服不易吸收, 生物利用度低[5],大鼠口服1. 2 g·kg- 1姜黄素,血浆中只含纳摩尔级的姜黄素[6],半衰期短[7],在体内的抗肿瘤活性偏低[8],限制了其临床应用,因此开发可提高姜黄素抗肿瘤活性的新剂型或其衍生物已经成为该研究领域的重点与难点,本文将近几年来国内外有关姜黄素治疗肿瘤方面的新剂型及其衍生物研究进展综述如下。

1新剂型

1. 1乳剂乳剂系指互不相溶的两种液体混合,其中一相液体以液滴状态分散于另一相液体中形成的非均相液体分散系统。乳剂的表面自由能高,属于热力学不稳定系统。药物制备成乳剂后,由于乳剂中液滴的分散度较大,生物利用度提高。李宏建等[9]将姜黄素制成磷脂复合乳剂,并模拟临床肿瘤患者临床化疗诱导小鼠S100细胞产生耐药性,结果显示姜黄素乳剂明显增加耐药肿瘤细胞凋亡促进因子Fas表达率、细胞凋亡率和降低抗凋亡基因bcl - 2及细胞黏附因子CD54表达,表明姜黄素可以降低化疗诱发的肿瘤细胞多药耐药的产生。Settacheewakul等[10]采用伪三元相图筛选最佳处方,当表面活性剂( 聚氧乙烯蓖麻油: 辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯为1: 1) 、油相 ( Labrafac PG: Capryol 90为1: 1) 的质量比为7: 3时,制备的姜黄素自微乳粒径在30 nm左右,且在6个月内较稳定,大鼠口服给药后显示,姜黄素自微乳的生物利用度较姜黄素水溶液提高14倍,表明自微乳给药系统是一种增强姜黄素生物利用度的有 效方法。Lee等[11]也采用伪三元相图筛选最佳处方,当水、表面活性剂( 卵磷脂: 吐温80为3: 10) 和油相( 油酸乙酯) 的质量比为10: 3. 3: 1时,制备的姜黄素乳剂在2个星期内较稳定。且无论在酸性或碱性条件下, 超声均大大增强姜黄素从微乳的释放,当超声频率40 KHz、强度9. 8W / cm2,用p H7. 4的PBS缓冲液稀释时,姜黄素乳剂初始释放率最高,达0. 11 μg/s。

1.2脂质体脂质体由磷脂和胆固醇组成,具有类似生物膜的双分子层。目前主要应用在: 1) 模拟膜的研究; 2) 制剂的可控释放和在体内的靶向给药; 3) 作为基因载体。脂质体组织相容性好、细胞亲和性高、具有靶向性与缓释性,虽然稳定性不够良好,但近年对脂质体的改良,仍是一种有前途的给药系统。顾吉晋等[12,13]采用薄膜分散法制备姜黄素脂质体,并采用孵育法对姜黄素脂质体进行卡波姆包衣,当卡波姆的质量浓度为5. 0 g·L- 1时脂质体最稳定,体外生物粘附性大,大鼠口服给药后显示,卡波姆包衣姜黄素脂质体相对生物利用度是普通脂质体的2. 22倍。Huanlei等[14]采用薄膜分散法制备了三甲基壳聚糖修饰的姜黄素脂质体,包封率86. 6% ,载药量2. 33% ,粒径657. 7 nm,Zeta电位15. 64 m V,体外释放结果表明,壳聚糖修饰对姜黄素脂质体的体外释放无明显影响,但是体内药动学结果表明,修饰后的壳聚糖生物利用度明显增大。吴青青等[15]采用乙醇注入法制备姜黄素脂质体,12小时姜黄素脂质体皮肤累积透过量和滞留量分别为姜黄素吐温 - 80溶液的2. 11和3. 05倍,表明姜黄素脂质体能促进姜黄素的经皮吸收,同时增加其在皮肤中的滞留量。李翀等[16]采用乙醇注入法制备姜黄素含醇脂质体,经四乙氧基硅烷溶胶凝胶反应于醇质体表面形成二氧化硅层,制得姜黄素硅醇质体。所制得硅 - 醇质体粒径478. 5 nm,多分散系0. 285,包封率80. 77% ,人工胃液下结构稳定,人工肠液下释放平稳,大鼠口服给药后生物利用度较姜黄素混悬剂或醇质体比明显增加。宏伟等[17]采用乙醇注入法制备长循环脂质体,制得的姜黄素长循环脂质体包封率接近90% ,平均粒径为136 nm,Zeta电位为 - 17. 7mv,4℃ 放置30 d包封率没有明显变化。Takahashi等[18]制备了姜黄素脂质体,并考察不同类型、不同用量卵磷脂其制备的影响,当选择卵磷脂SLP PC70用量为5% 时,姜黄素脂质体分散性较好,其结构属小单室泡囊,粒径263 nm,包封率68. 0% ,大鼠口服给药后生物利用度较姜黄素组或姜黄素与SLP - PC70混合组提高,且血浆抗氧化活性随着姜黄素血药浓度提高而增强。

1. 3微球微球是指药物分散或被吸附在高分子、聚合物基质中而形成的微粒分散体系。粒径一般在1 ~ 250 μm,其中粒径小于500 nm的微球又称纳米球或纳米粒。王海鸥等[19]采用W/O/W乳化溶剂挥发法制备姜黄素PLGA微球,工艺优化后,姜黄素PLGA微球形态圆整,表面光滑,粒径1151 nm,包封率59. 44% ,载药量1. 98% ,71小时体外释放77% ,具良好的体外缓释性能。Cao等[20]所制的姜黄素肺靶向明胶微球形态圆整,表面光滑,粒径18. 9 μm,包封率75. 5% ,载药量6. 15% ,在肺组织中的药物浓度显著高于姜黄素溶液,组织病理学研究亦表明其具有较高安全性。Li等[21]采用O/W乳化溶剂挥发法制备了磁性姜黄素PLA微球,微球磁含量12% ,具超顺磁,形态圆整、表面光滑,粒径范围为0. 55 ~ 0. 75 μm,载药量8% ,包封率24. 2% ,姜黄素以无定形状态存在磁性微球。在p H 7. 4的PBS溶液中,72小时仅释放49. 01% ,120小时基本释放完全,具明显缓释特性。Zhang等[22]以果胶酸钙和Eugragit - 100为内层酶敏感衣及外层p H敏感衣对微球进行包衣,制备了p H敏感 - 酶促发双重控制的结肠定位释药微球,体外释放实验表明,其在含大鼠盲肠内容物的模拟结肠液中释放较好,表明Eugragit - 100包裹的果胶酸钙姜黄素微球是一个潜在的结肠定位释药载体。

1. 4纳米粒纳米粒包括纳米囊与纳米球,注射纳米粒不易阻塞血管,可靶向于肝、脾和骨髓,亦可由细胞内或细胞间穿过内皮壁到达靶部位。功能医用高分子材料学研究的突飞猛进,使得近年来载药纳米粒子在提高难溶性药物溶解度、稳定性及生物利用度上倍受青睐。Guo等[23]采用静电纺丝法制备姜黄素 - 聚己内酯 - 聚乙二醇 - 聚己内酯纳米纤维( PCEC) ,粒径范围在2. 3 ~ 4. 5 μm,体外细胞毒性实验显示PCEC材料不影响脑胶质瘤9L细胞的生长,姜黄素原药的抗肿瘤活性在48小时就消失,而姜黄素PCEC纳米纤维的抗肿瘤活性明显延长,表明此复合物可用于脑肿瘤术后化疗。朱志新等[24]采用乳化溶剂挥发法制备了姜黄素 - 聚乳酸/羟基乙酸纳米粒 ( PLGA) ,形态圆整,粒径419 nm,载药量15. 8% ,药效学研究结果显示姜黄素PLGA纳米粒的治疗效果明显优于等剂量姜黄素混悬液组合5 - ASA组,表明姜黄素PLGA纳米粒对炎症部位具有一定的选择性聚集即靶向作用。张华等[25]采用溶剂蒸发技术制备姜黄素白蛋白纳米混悬剂( BSA) ,形态圆整,粒径245. 3 nm,包封率42. 39% ,Cur - BSA - NPs混悬剂中姜黄素以无定型存在或者被BSA包裹,72 h体外释放累积度为96% 。

1. 5聚合物胶束Chandana等[26]制备了姜黄素聚乙二醇 - 聚己内酯两亲性共聚物胶束纳米胶束( Me PEG - PCL) ,当Me PEG: PCL为40: 60时,其包封率60% ,粒径110 nm、Zeta电位 - 16 m V,纳米胶束生物利用度较姜黄素原药提高2. 95倍,细胞摄取也较姜黄素原药提高,纳米胶束与姜黄素原药对胰腺癌细胞株MIA Pa Ca - 2与PANC 1的IC50值分别为22. 8、24. 75 μm和13. 85、14. 96 μm,表明纳米胶束系统可用于癌症治疗的有效载体。Gou等[27]以两亲性共聚物聚乙二醇单甲醚 - 聚己内酯( MPEG - PCL) 为载体材料,采用一步沉淀法制备姜黄素MPEG - PCL胶束,为单分散性胶束,粒径27. 3 nm, 分散系数0. 097,包封率99. 16% ,载药量12. 95% ,姜黄素载药胶束较姜黄素原药显示出更强的抑制转基因斑马鱼血管生成作用,此姜黄素胶束在体内外均能保持对C - 26结肠癌细胞的毒性,抑制其生长,并显示出比姜黄素原药更强的抗结肠癌作用。Song等[28]以合成的聚乳酸聚乙醇酸 - 聚乙二醇 - 聚乳酸聚乙醇酸共聚物( PLGA PEG - PLGA) 为载体材料,采用透析法制备姜黄素PLGA - PEG PLGA胶束,此胶束Zeta电位 - 0. 71 m V,粒径26. 29 nm,载药量6. 4% ,包封率70% 。,血浆AUC( 0 -∞),t1 /2α,t1 /2β和MRT较姜黄素溶液分别提高了1. 31,2. 48,4. 54和2. 67倍,且此胶束在肺和脑分布较多,而肝和脾较少,表明PLGA - PEG - PLGA胶束可作为难溶性药物潜在的靶向载体。

2前药和药物大分子复合物

姜黄素具有邻二酚的结构,两个游离的羟基可以直接或通过连接臂与载体连接,是个很好的修饰位点。用小分子或大分子载体对姜黄素的酚羟基进行修饰制备得到的姜黄素前药能较好地解决姜黄素水溶性差、化学结构不稳定、生物利用度低等缺点。

2.1小分子修饰的姜黄素前药目前这方面的研究主要通过在姜黄素酚羟基位置引入内源性小分子,如氨基酸和胡椒醛等。

2. 1. 1氨基酸衍生物姜黄素具有B - 二酮基多酚环,包括2个阿魏酸( 4 - 羟基 - 3 - 甲氧基肉桂酸) 通过一个羧基碳原子的乙撑基相连[29],可以与N - 马来酰 - 甘氨酸、N - 马来酰 - 缬氨酸基团形成酯键,合成前药。陆鹏等[30]以姜黄素分子结构为基础,成功合成N - 马来酰 - L - 缬氨酸酯姜黄素、N - 马来酰 - 甘氨酸酯姜黄素,采用MTT比色分析法比较两种姜黄素前体药物作用于人膀胱癌EJ细胞及肾小管上皮HKC细胞6 ~ 24 h后,61. 71% ~ 65. 13% ( P < 01 05) 、10. 96% ~ 73. 01% ( P < 0105) ,呈浓度、时间依赖性。与同浓度姜黄素相比对肾小管上皮HKC细胞抑制作用降低,说明两者都能抑制人膀胱癌EJ细胞,同时姜黄素衍生物对肾小管上皮HKC细胞毒性作用小。

2. 1. 2胡椒碱衍生物胡椒碱具有广泛的药理作用,具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗抑郁作用,将胡椒碱与姜黄素联合用药可以提高生物利用度。Satyendra等[31]分别将甘氨酸、D - 丙氨酸、葡萄糖、乙酸和胡椒碱与姜黄素合成不同前药。Mishra等[32]设计合成姜黄素的胡椒碱衍生物作为抗肿瘤前药,以提高姜黄素的生物利用度。 Dubey等[33]通过姜黄素与脱去亚甲基的胡椒酰氯在吡啶中反应得到双酯衍生物作为姜黄素前药。

2. 2大分子修饰的姜黄素前药姜黄素的大分子载体材料通过负载多个姜黄素形成高分子量的多元酚,能放大姜黄素的药理活性,同时,大分子量的药物载体能够增加药物的作用时间和选择性,控制药物的释放,药效持久稳定。另外,能被动的积聚在肿瘤部位,存在一定的肿瘤靶向性,大分子修饰的姜黄素前药主要有PEG修饰、胆固醇等细胞膜成分修饰、表面活性剂修饰等。

2. 2. 1PEG修饰的姜黄素前药姜黄素酚羟基位置引入内源性小分子,如氨基酸,合成氨基酸衍生物,如N - 马来酰 - L - 缬氨酸酯姜黄素只是改善了姜黄素的脂溶性问题,但并未改变其水溶性差的问题,聚乙二醇( PEG) 修饰剂是p H中性、无毒、具有良好亲水性和生物相容性的高分子物质,是被FDA批准的极少数能作为体内注射药用的聚合物之一[34]。广泛用于半衰期段的药物,具有增强滞留时间,增加被动靶向的作用。许多研究表明PEG分子量的大小对其在体内滞留时 间有关[35]。 Ahmad等[36]将分子量 分别为750和3500Da的PEG偶联到姜黄素表面,在p H7. 4的PBS溶液中,降解时间不同,但是普遍都较快,分别为60和200 min,以PC - 3前列腺癌细胞、结肠癌LS - 174T细胞、MIN胰腺癌Bx PC - 3胰腺细胞为模型细胞,经过体外细胞培养发现,750 Da PEG偶联的姜黄素前药仅对PC - 3前列腺癌细胞有作用,但仍较游离姜黄素要高出两倍; 3500 Da PEG偶联的姜黄素前药对PC - 3前列腺癌细胞、MIN胰腺癌BxPC - 3胰腺细胞IC50值较游离姜黄素小2 ~ 3倍,而对其余两种细胞作用与游离姜黄素相当。

2. 2. 2胆固醇等细胞膜成分修饰的姜黄素前药胆固醇在肿瘤细胞形成的过程是必须的,是肿瘤细胞膜的成分,细胞可以通过LDL内吞作用或自身从头合成得到。LDL( 1500个胆固醇) 连接疏水核心作为胆固醇运输和细胞摄取载体。Peacock等[37]合成碳硼烷胆固醇共轭物,作为癌症靶向制剂。以大鼠9L脑胶质瘤细胞为模型细胞,考察其抗肿瘤活性,体外实验结果表明,胆固醇碳硼烷共轭物可以促进细胞对药物的吸收。余美荣[38]在此基础上,合成了胆固醇姜黄素共聚物,结果表明,该共聚物可以促进肿瘤对姜黄素的摄取,延长药物作用时间。

2. 2. 3表面活性剂修饰的姜黄素前药通过一般的剂型改变,如制备成纳米粒、微球、脂质体,虽然给以改善其体内的吸收,但是会存在包封率、载药量低等问题。制成PEG修饰的姜黄素前药也存在容易降解的问题。Manju等[39]将PVP修饰到姜黄素表面,进行制剂学及体外抗肿瘤活性考察。所得制剂粒径22. 4 nm,在p H7. 4条件下,稳定存在8 h,体外抗肿瘤活性实验表明,其对肿瘤细胞的增殖抑制作用与浓度呈负相关。

3结论

相较于传统的姜黄素制剂,姜黄素靶向制剂克服了姜黄素在应用上的很多不足,如水溶性差、稳定性差、见光易分解,生物利用度低、半衰期等,提高了姜黄素的各种药理活性作用,降低毒副作用。

生物素分析方法研究 篇9

自然界中能够自身合成斑蝥素的昆虫主要存在于芫菁科中,蜡蝉科及拟天牛科中的部分种类也可以自身合成斑蝥素。除此之外,自然界中其他一些昆虫可以通过从产斑蝥素的昆虫或其尸体的血淋巴中来摄取斑蝥素,以利于保护自己。斑蝥具有多种药理作用,尤其在治疗梅核气、斑秃、风湿痛、尖锐湿疣、肿瘤、肝炎等一些疑难杂症时疗效甚好,但其有效成分斑蝥素的剧毒性限制了它在临床上的应用。近年来,毒副作用小的斑蝥素衍生物如去甲斑蝥素、斑蝥酸钠等被陆续大量地合成并开始应用于临床治疗。斑蝥素及其衍生物抗肿瘤的机制主要包括诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制细胞增殖,抑制肿瘤细胞蛋白质合成,抗肿瘤细胞侵袭和转移,升高白细胞数量及提高机体免疫力等。

1 斑蝥素及其衍生物

1.1 斑蝥素

斑蝥素(Cantharidin,CA)是传统中药斑蝥抗肿瘤的有效成分,是一种半萜烯毒素物质,化学名称为六氢-3a,7a-二甲基-4,7-环氧异苯并呋喃-1,3-二酮,分子式为C10H12O4,分子量为196.20。斑蝥素可溶于二甲基亚砜(DMSO)和乙醇,部分溶解于丙酮,极微溶解于热水和乙醚,不溶于冷水,性微寒。

药理作用研究表明斑蝥素主要用于肝癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌、前列腺癌等癌症的治疗,常与其他抗肿瘤药物配合起来使用。芫菁科成虫受到惊扰时,一种奇臭的黄色黏稠淋巴毒液在关节处分泌出来,这就是含有树脂、蚁酸、脂肪油、斑蝥素等物质的血淋巴液,其中斑蝥素的含量只占到大约1%~1.2%[2]。斑蝥素毒性却相当大,可将高等动物的细胞组织破坏,人体皮肤接触后很快就会红肿、起水泡。

1.2 去甲斑蝥素

去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)为斑蝥素的衍生物,化学名称为外-1:2-顺-3:6-氧桥-六氢化邻笨二甲酸酐,分子式为C8H8O4,分子量为168.15。据报道,NCTD是我国首先合成的具有较强抗肿瘤活性和独特升高白细胞的新型抗肿瘤药物。去甲斑蝥素比斑蝥素少了两个甲基,其毒性明显比斑蝥素低,而抗肿瘤作用优于斑蝥素[3]。

1.3 斑蝥酸钠

斑蝥酸钠(Sodium cantharidate,SCA)是斑蝥素与氢氧化钠共热时水解生成的一种半合成药物,分子式为C10H12Na2O5,分子量为258.1。斑蝥酸钠与斑蝥素相比,其毒性、刺激性都较低。它具有分子量小、易进入细胞、抗肿瘤作用强等特点[4]。SCA对多种恶性肿瘤总缓解率都较高,尤其对肝癌、乳腺癌等疗效显著,并可提高患者免疫力和生活质量[5]。

1.4 去甲斑蝥酸钠

去甲斑蝥酸钠(Sodium demethylcantharidate,SDCA)是斑蝥酸钠化学结构中去除二甲基后人工合成的一种化合物,其某些作用机理与阿霉素相似[6]。化学名称为1,2-顺-3,6-氧桥-六氢化邻苯二甲酸钠盐,分子式为C8H8O5Na2,分子量为230.14。它具有分子量小、产生细胞毒作用早、抗肿瘤作用强等优点。

1.5 甲基斑蝥胺

甲基斑蝥胺(Methylcantharidinimde,MCA)是斑蝥素的一类亚胺类衍生物,其毒性远比斑蝥素小。MCA在临床上用于治疗原发性肝癌,其机理主要是干扰肝癌细胞的核酸和蛋白质合成,增强机体巨噬细胞的吞噬作用,从而杀伤肿瘤细胞。

2 斑蝥素及其主要衍生物的作用机制

2.1 斑蝥素的作用机制

几乎所有癌基因、抑癌基因的生物学效应,最终都归结到细胞周期的机制。癌基因、抑癌基因的变异,导致细胞周期失控、无限增殖,形成克隆群体———肿瘤。因此,细胞周期调控是当前肿瘤研究的热点[7]。研究表明,斑蝥素能引起肿瘤细胞周期阻滞,对多种肿瘤细胞都有抑制作用[2,8]。

2.1.1 促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖

斑蝥素能抑制肿瘤细胞的蛋白质合成,影响RNA和DNA的合成及细胞周期的进程,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖。它是一种特异性的蛋白磷酸酶抑制剂,能抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性,引起细胞周期阻滞,最终使细胞发生凋亡[9]。斑蝥素影响有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路,使细胞外信号调节激酶(ERK)和phos-ERK的表达下降,抑制p34cdc2,使MPF(有丝分裂促进因子)活性下降,引起细胞周期G2/M的阻滞,抑制肿瘤细胞增殖[10]。

陈宽穗[11]研究表明,斑蝥素使人前列腺癌PC-3细胞周期停滞于G2/M期,增加细胞内Ca2+浓度,促进NO生成,而Ca2+和NO浓度升高会诱使线粒体膜电位下降,活化胱天蛋白酶3(Caspase-3),因而诱导细胞通过线粒体途径发生凋亡。斑蝥素还影响线粒体膜的通透性,使氧化磷酸化的偶联过程增强,从而影响癌细胞的能量代谢平衡,缓解和控制癌变的发生。斑蝥素还可通过抑制某些能量代谢基因,如抑制脂肪酸β-氧化以及三羧酸循环中的某些关键基因、抑制电子传递链中复合体成分以及ATP合成酶基因表达、抑制在细胞内能量代谢中易位酶的表达,导致癌细胞凋亡。

2.1.2 抗肿瘤细胞侵袭和转移的作用

斑蝥素还有较强的抗肿瘤细胞侵袭和转移的作用。科研人员应用蛋白印迹的方法检测斑蝥素对NF-кB(P65)、FAK蛋白表达和FAK磷酸化水平的影响,结果表明,斑蝥素使NF-кB(P65)蛋白表达水平明显下降,上调FAK表达,下调FAK磷酸化水平,从而抑制肿瘤细胞的运动、侵袭和粘附能力[12],这是斑蝥素抗肿瘤细胞转移的机制之一。另外,研究还发现在NF-кB的活性被阻断后,VEGF、IL-8和MMP-9这3个主要的促血管生成因子会明显地被抑制,从而减少肿瘤组织中新生血管的形成,并调控肿瘤侵袭转移相关基因VEGF的转录表达,减少肿瘤侵袭和转移的发生[13]。

2.2 去甲斑蝥素的作用机制

去甲斑蝥素是由呋喃与马来酸酐通过Diels-Alder加成反应后经催化加氢合成得到的一种新化合物。NCTD能诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖,有抗肿瘤细胞侵袭和转移的能力,并具有升高白细胞的作用。

2.2.1 诱导细胞凋亡

去甲斑蝥素可诱导肿瘤细胞凋亡,使之阻滞于细胞周期的G2/M期,抑制细胞分裂和增殖,如抑制人肝癌细胞BEL7402、卵巢癌AO和乳腺癌MCF-7等多种癌细胞的生长。Chen等[14]对NCTD作用于人肝癌细胞HepG2的研究结果表明,NCTD通过细胞外信号调节激酶和c-Jun氨基末端激酶信号通路,即激活Caspase-9,ERK,JNK,AP-1和NF-κB,诱导HepG2细胞凋亡。李先茜等[15]研究发现,NCTD作用于人肝癌细胞SMMC-7721后,Caspase-3酶活力明显升高,Bax对Bcl-2的蛋白表达量的比率明显增加,通过内源性线粒体信号转导途径诱导细胞凋亡。在NCTD诱导人白血病细胞HL-60凋亡的研究中也发现,它抑制HL-60在S期的DNA合成,细胞阻滞于G2/M期和S期,抑制肿瘤细胞增殖[16]。去甲斑蝥素抑制癌细胞脱氧核糖核酸复制,增加放化疗的敏感性,对肿瘤治疗具有积极意义。

2.2.2 抗肿瘤细胞侵袭和转移

赵泽明等[17]研究表明,NCTD抑制荷瘤鼠胆囊癌移植瘤MMP-2(基质金属蛋白酶),促进nm23(肿瘤转移抑制基因)、TIMP-2(组织抑制因子)表达,抑制胆囊癌细胞的迁移和运动能力。在NCTD影响乳腺癌细胞侵袭转移的研究中,它通过抑制PKCζ信号传导途径而明显抑制乳腺癌细胞株的细胞侵袭和迁移能力,与PKC抑制剂联用,可以增强对肿瘤的疗效[18]。Yeh等[19]进行了NCTD抗人肝癌细胞Huh7转移的研究,结果表明NCTD通过降低NF-κB结合DNA的活性而抑制ERK1/2磷酸化,引起MMP-9和uPA(尿激酶型纤溶酶原激活剂)表达下调,从而肝癌细胞迁移和侵袭。

2.3 斑蝥酸钠的作用机制

斑蝥酸钠是斑蝥素的一种衍生物,是较理想的一种抗肿瘤药制剂。已有研究表明,SCA抑制肿瘤细胞核酸和蛋白质的合成,降低cAMP磷酸二酯酶的活性,影响细胞信号通路,诱导细胞凋亡,杀死肿瘤细胞。梁枫等[20]用不同剂量SCA作用24h均能明显地抑制胃癌BGC823细胞的生长,诱导细胞凋亡、出现典型的凋亡峰,使细胞增殖阻滞于G1期。斑蝥酸钠也具有升高白细胞的作用。目前已应用于临床的抗癌中药斑蝥酸钠维生素B6注射液(艾易舒)的疗效已得到肯定。魏素菊等[21]通过体外实验研究艾易舒对经植物血凝素活化的人外周血淋巴细胞分泌白介素的影响,结果表明SCA能通过促进淋巴细胞分泌IL-2增强机体的免疫功能,减轻化疗副作用,提高疗效;通过抑制IL-8的分泌,抑制新生血管的生成,从而抑制肿瘤转移。SCA能通过降低肝癌HepG2细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达,抑制肿瘤血管生成,从而抑制肝癌细胞增殖[22]。

3 其它衍生物的抗癌作用

去甲斑蝥酸钠可提高腹水肝癌H22细胞线粒体的呼吸抑制率及溶酶体酶活性,阻滞细胞周期于M期,抑制细胞分裂;能抑制癌细胞DNA合成,但对正常骨髓细胞不抑制,并能升高白细胞数量。去甲斑蝥酸钠可阻滞人肝癌HepG2细胞于G0/G1期,抑制肝癌细胞增殖[23],去甲斑蝥酸钠注射液对于缓解中晚期原发性肝癌的临床症状有疗效。甲基斑蝥胺对动物实体瘤作用优于斑蝥素,毒性较低。它对肝癌细胞的核酸和蛋白质合成有干扰作用,能增强机体巨噬细胞的吞噬作用,对肿瘤细胞的抑制和杀伤作用。斑蝥素的另一种衍生物羟基斑蝥胺药理作用与斑蝥素相似,但其毒性仅为斑蝥素的1/500,目前主要是以片剂或针剂的形式而用于原发性肝癌的治疗。

4 讨论

生物素分析方法研究 篇10

1 仪器与试药

1.1 仪器:

TG13M毛细管血液离心机 (湖南星科科学仪器公司) ;SB-5200DTN超声波清洗机 (宁波新芝生物科技股份有限公司) ;Spring实验室纯水机 (厦门锐思捷科学仪器有限公司) ;P230高效液相色谱仪 (大连依利特分析仪器有限公司) ;JA1003N电子精密天平 (上海佑科仪器仪表有限公司) ;E2000制冷色谱柱温箱 (上海子期实验设备有限公司) ;DC0515低温恒温槽 (上海平轩科学仪器有限公司) ;AT-950制冷加热色谱柱恒温箱 (杭州瑞析科技有限公司) ;TΜ-1901双光束紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司) 。

1.2 色谱柱:

奥泰公司C18色谱柱 (250 mm×4.6mm, 5μm) 。

1.3 对照品:

多西环素购自中国药品生物制品检定所。

1.4 试剂:

甲醇为色谱纯;水为纯化水, 其它试剂均为分析纯。

1.5 试药:

多西环素注射液 (四川荟森药业有限公司) 。

2 测定方法确定

2.1 色谱条件

依据查阅文献及考查的结果, 确定色谱条件如下。流动相:二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氢二铵溶液-0.05mol/L草酸铵溶液 (用氨试液调节p H值为8.0) (30:5:65) , 检测波长:280nm, 流速:1.0ml·min-1。柱温:35℃。理论板数按多西环素峰计算应不得低于3000。

2.2 对照品溶液的制备

多西环素对照品溶液:精密称取多西环素对照品适量, 置容量瓶中, 加流动相制成每1m L含3.0μg的溶液, 即得。

2.3 给药及供试品溶液的制备

分别采用5%多西环素注射液、10%多西环素注射液、20%多西环素注射液按20mg/kg的剂量单次耳缘静脉注射及颈部肌肉注射给药, 给药前采空白血浆, 给药后15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、360分钟、8小时、16小时、32小时、64小时、128小时取血样, 准确吸取1.0m L血浆, 加人200tx L的提取液, 混匀, 高速离心十五分钟, 吸取上清液经0.2毫升, 用微孔滤膜过滤, 取续滤液, 既得。

2.4 专属性试验

取空白血样, 照2.3项下供试品溶液的制备方法制成阴性液, 依上述方法测定, 结果在多西环素出峰处阴性液无色谱峰, 结果阴性试验没有干扰, 表明本方法专属性良好。

2.5 精密度试验

精密称取多西环素对照品适量, 加流动相制成每1m L含3.0μg的供试品溶液。照上述色谱条件, 精密吸取10μl, 连续进样6次, 记录峰面积。结果, RSD=0.66%, 表明本方法精密度良好。

2.6 对照品的线性考察

精密称取多西环素对照品5.0mg, 置100ml容量瓶中, 加入流动相使溶解并稀释至刻度, 摇匀, 分别精密吸取0.1、0.2、0.4、0.6、1.2、1.6、2.0m L, 置于10m L量瓶中, 加空白血浆至刻度, 摇匀。分别精密上述溶液吸取10μL, 注人液相色谱仪, 依照2.1项下的色谱条件测定, 记录色谱峰。以峰面积 (Y) 为纵坐标, 对照品进样量 (X) 为横坐标, 绘制标准曲线, 计算回归方程。结果表明, 多西环素在0.5~10μg·m L-1范围内呈良好的线性关系。

2.7 重现性试验

称取同一批的多西环素注射液样品6份, 按测定方法项下的方法制备供试品溶液, 测定含量, 并计算样品的RSD值, 结果RSD为0.65%, 结果表明此方法的重现性良好。

2.8 准确度试验

取空白血浆及对照品溶液, 制备多西环素低、中、高三浓度的标准血浆样品, 每一浓度平行操作5份, 代人线性方程计算浓度.以测得值与加入值的比值, 计算回收率, 平均回收率分别为98.55%, RSD为0.56%。

3 讨论

分别考察0.067mol·L-1磷酸二氢铵溶液-乙腈-三乙胺 (60∶40:0.01) , 0.05mol·L磷酸盐缓冲溶液一甲醇一磷酸 (50:50:0.01) , 二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氢二铵溶液-0.05mol/L草酸铵溶液 (用氨试液调节p H值为8.0) (30:5:65) , 甲醇-水-磷酸 (47:53:0.2) , 甲醇-水 (40∶60) 不同比例的流动相, 结果以二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氢二铵溶液-0.05mol/L草酸铵溶液 (用氨试液调节p H值为8.0) (30:5:65) 为流动相, 供试品各峰分离效果最好, 故选用, 二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氢二铵溶液-0.05mol/L草酸铵溶液 (用氨试液调节p H值为8.0) (30:5:65) 为流动相。肌注10%和20%多西环素注射液的主要药物动力学参数分别为:AUC为 (76.32±19.21) 和 (89.23±10.12) mg·h·L-1, 达峰时间 (t) 为 (1.03±0.31) 和 (1.28±0.25) h, 生物利用度 (F) 为 (50.11±9.13) %和 (65.12±5.89) %, 结果表明1 0%和2 0%多西环素注射液肌注后吸收较快, 消除缓慢, 消除半衰期延长, 给药后72h仍能达到对常见病原菌的有效血药浓度。

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