脂代谢酶活性（精选6篇）
脂代谢酶活性 篇1
复合营养舔砖主要是利用糖蜜、尿素、谷物副产品、微量元素及维生素等经精心配比研制而成的一种块状添加剂,是牛、羊理想的补充饲料[1]。舔砖作为给牛羊等反刍动物补充矿物质元素和非蛋白氮的一种理想方式,已在世界发达国家畜牧业中得到广泛应用[2,3]。大量资料表明:补饲舔砖能明显改善牛、羊健康状况,加快生长速度,提高经济效益[2,4]。
舔砖一般分为矿物型和复合营养型2种。推广应用为牛羊补充综合性营养的复合营养舔砖,对于提高科学养牛养羊水平,促进畜牧业发展有重要意义。舔砖是根据生产实际需要,将牛羊所需的营养物质经科学配方和生产加工工艺加工成块状,放在有水源的地方或食槽边供牛羊舔食。
饲料进入反刍动物瘤胃后,营养物质首先被瘤胃微生物消化降解,准确测定其消化程度是评定营养物质代谢和需要的必要条件。目前,舔砖对瘤胃内的酶活性及消化代谢影响的报道较少。本文分析了复合营养舔砖在瘤胃内的消化代谢规律以及对瘤胃酶活性的影响,为进一步合理利用舔砖、促进舔砖的饲用效果提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物及试验设计
试验牛是装有永久瘤胃瘘管的公牛4头(丹麦红牛公与闽南黄牛母的杂种一代),体重为225 kg左右,在1.3倍维持需要的营养水平下饲养。采用反转试验设计,4个重复。预饲期15 d,预饲期结束后,试验牛复合营养舔砖的日采食量须达到500 g左右,舔砖的营养成分见表1,试验期5 d,中间过渡期15 d。试验期内每天供给舔砖自由舔食,对照期只补给500 g麸皮。预饲期间进行驱虫。日粮精粗比为1︰3.5,粗料为氨化稻草,日喂量3.5 kg/头。精料组成为玉米53%、豆粕18%、麸皮15%、菜籽饼10%、磷酸氢钙2%、食盐1%、添加剂1%,日喂量1 kg/头。日粮营养水平:综合净能(NE)19.43 MJ/kg、粗蛋白(CP)413 g、钙(Ca)9.21 g、磷(P)4.53 g。
1.2 复合营养舔砖的制作
1.2.1 复合营养舔砖主要原料及用量
糖蜜20%、尿素25%、食盐5%、骨粉l0%、水泥8%、麸皮25%、尿素缓释剂四硼酸钠2%、添加剂5%。
1.2.2 制作方法
首先要对尿素进行糊化。把玉米粉和尿素以75︰25的比例,在147℃下挤压糊化,烘干后粉碎,然后加入缓释剂。再按配方要求加入矿物质及其他各成分,混合均匀,最后加入适量水。选择适当的模具,机械挤压成形。
1.3 采样程序与测定方法
mg/100 mL
1.3.1 采样程序
在试验期的最后1 d饲喂舔砖后0 h、1 h、2 h、4 h、6 h采集各组牛瘤胃液样本,每次采集150 mL,用4层纱布过滤后,立即测定瘤胃液pH值,并冷冻保存50 mL瘤胃液(加0.2 M盐酸)用于NH3-N测定。剩下的瘤胃液装入保温瓶中,充入CO2备用。
1.3.2 测定项目及方法
采用pHs-3C酸度计进行pH值测定。NH3-N浓度采用氧化镁直接蒸馏法测定。瘤胃蛋白水解酶按文献方法测定[5]:以1 mL1%酪蛋白为底物,加入4 mL瘤胃液,38℃水浴条件下培养4 h,然后加入5 mL10%三氯乙酸除去未分解的酪蛋白,4 000 r/min离心15 min,取上清液1 mL,分别加入5 mL 0.4 mol/LNa2CO3溶液和1 mL Folin-酚试剂,混匀后显示15 min,在680 nm处测定吸光度,按同样操作绘制酪氨酸标准曲线,依标准曲线计算水解酪蛋白生成酪氨酸的μg数。每min催化酪蛋白水解生成1μg酪氨酸的酶量定义为1个酶活单位。瘤胃纤维素酶按文献方法测定[6]:以纯棉花在38℃瘤胃液中培养48 h的消失率代表瘤胃液中纤维素酶的相对活力。
1.4统计方法
用t检验对试验数据进行统计分析。
2结果与分析
2.1复合营养舔砖对瘤胃液pH值的影响
pH值是鉴定瘤胃代谢的重要指标,综合反映瘤胃微生物、代谢产物有机酸产生、吸收、排除及中和的状况。具体数值详见表2。
试验组和对照组瘤胃液pH值经t检验,差异不显著(P>0.05)。2组饲喂舔砖后,pH值在短时间内均下降,随后又缓慢升高。试验组pH值波动的幅度较大,这与复合营养舔砖的蛋白降解率较高有关。
2.2舔砖对瘤胃NH3-N浓度的影响
NH3-N浓度受饲喂饲料蛋白质的可溶性、进入瘤胃的唾液内尿素量、尿素经瘤胃壁的扩散量以及被瘤胃壁吸收速率等影响。瘤胃内NH3-N浓度变化见表3。
经t检验,采食1 h后2组瘤胃NH3-N浓度差异极显著(P<0.01),采食2 h、4 h后2组瘤胃NH3-N浓度均差异显著(P<0.05),其余时间段差异不显著。
因舔砖内包被有尿素,在饲喂舔砖后瘤胃NH3-N浓度迅速上升,于饲喂后1 h达到最高值,以后又迅速下降,试验组下降速度比对照组快,这与文献报道的结果一致[7]。NH3-N是瘤胃微生物蛋白质合成的主要氮源,NH3-N浓度升高,有助于改善过瘤胃蛋白的数量和质量。
2.3 舔砖对酶活性的影响
瘤胃液中蛋白水解酶是参与蛋白质合成与分解的重要酶类,催化尿素和日粮中的蛋白质分解产生氨、肽和氨基酸。纤维素酶活性则与粗纤维降解作用直接相关。由表4可见,舔砖对瘤胃内纤维素酶和蛋白水解酶活性没有显著影响,与前期的饲养试验结果相一致。
3 结论
1)饲喂舔砖后,瘤胃pH值在短时间内下降,随后又缓慢升高。pH值波动的幅度较大,这与复合营养舔砖的蛋白降解率较高有关。
2)舔砖对瘤胃内NH3-N浓度有较大影响,舔砖的粗蛋白含量高达38.7%,产生的NH3-N浓度比对照组高且差异显著,有助于改善草食动物的营养。
3)舔砖对瘤胃液蛋白水解酶和纤维素酶的活性没有显著影响,这表明每日饲喂500 g的舔砖对牛的消化代谢功能不会产生不良影响。本结论与复合营养舔砖对黄牛和水牛增重试验结果一致。
参考文献
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脂代谢酶活性 篇2
作 者：李时银 倪利晓 陈维 李来发 马振旄 LI Shi-yin NI Li-xiao CHEN Wei LI Lai-fa MA Zhen-mao 作者单位：李时银,陈维,李来发,马振旄,LI Shi-yin,CHEN Wei,LI Lai-fa,MA Zhen-mao(南京师范大学化学与环境科学学院,江苏,南京,210097)
倪利晓,NI Li-xiao(河海大学环境科学与工程学院,江苏,南京,210098)
脂代谢酶活性 篇3
关键词： 水稻； ICE1 基因；低温胁迫；耐冷性；膜质过氧化；抗氧化酶活性
中图分类号：Q943.2；S511.034 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0071-03
黑龙江省地处高寒地区，水稻（Oryza sativa L.）因受到低温冷害会导致减产甚至绝收，因此，冷害极大地限制了黑龙江省水稻产量的进一步提高。水稻整个生长发育过程中都存在低温冷害的可能，低温可导致水稻生长缓慢、发育不良，甚至停滞生长；特别在水稻扬花期遭遇低温容易导致花粉败育、受精不良、影响结实。在黑龙江省有限的积温条件下，低温会对水稻产量及其品质造成极大地不良影响。 ICE1 （inducer of CBF expression 1）基因是从拟南芥中克隆到的、能调节植株耐冷性的转录因子，在低温条件下可以活化ICE1蛋白，活化了的ICE1蛋白能激活 CBF3 基因表达，CBF3蛋白通过调控 CBF3 基因下游低温应答基因的表达，从而增强拟南芥的抗冷性 [1]。前期从拟南芥中克隆到了 ICE1 基因，并将其与35S 启动子连接，构建了植物表达载体pCAMBIA1300-35S- ICE1 ，导入垦鉴稻10号水稻植株中，从而获得转 ICE1 基因水稻的再生植株，并进行继代培养 [2]。本研究对转 ICE1 基因水稻耐冷性与膜脂过氧化和抗氧化酶活性的关系进行研究，以揭示转 ICE1 基因水稻膜脂特性及抗氧化酶活性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究采用转 ICE1 基因水稻垦鉴稻10号第4代T4-8和T4-9株系及未转基因水稻品种垦鉴稻10号（CK）为试验材料，转 ICE1 基因水稻株系来自黑龙江八一农垦大学生命学院分子生物学实验室，该实验室利用PCR检测目的基因的方法对转基因水稻的遗传稳定性进行检测，转基因水稻材料的 ICE1 基因稳定遗传 [2]。
1.2 试验方法
采用转 ICE1 基因T4-8株系、T4-9株系与CK水稻种子，在25 ℃恒温条件下浸种，播种在小培养钵中，每个品种（系）18个重复，共计54个处理。将培养钵置于光照培养箱中，[JP3]培养条件为温度25 ℃，光照16 h/d，照度250 μmol/（m2·s）， 相对湿度80%，培养期间浇灌Hoagland营养液。水稻幼苗培养4周后，放置4 ℃条件下进行冷处理，分别在0、2、4、6、8、10 d后停止冷处理，测定水稻植株中相对电导率、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）的活性。冷处理10 d非转基因水稻幼苗外观表现萎蔫，转基因水稻变化不大 [2]。
1.3 测定项目
水稻植株电导率的测定采用郝建军等的方法 [3]；水稻植株丙二醛（MDA）含量的测定参照王学奎等的方法 [4]；水稻植株酶活性的测定 [4]：超氧化物歧化酶（SOD） 活性的测定采用氮蓝四唑法（NBT），过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用紫外吸收法。
1.4 统计分析
试验数据采用 Excel 和 SPSS 13.0 软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 低温胁迫下转 ICE1 基因水稻电导率的变化
植物组织外渗液电导率的变化能够反映出细胞质膜的伤害程度和植物抗逆性的强弱。低温胁迫下，细胞膜的结构和功能会受到伤害，导致膜透性增大，电解质外渗，电导率增大 [6]。本研究水稻幼苗经低温处理后的相对电导率结果如图1所示，低温处理前（0 d），转 ICE1 基因水稻的相对电导率略低于CK，但差异不显著。低温处理后，转基因水稻与CK的相对电导率均增加，且随着低温胁迫时间的延长呈直线增加的趋势，相对电导率与处理时间的关系拟合的直线方程分别为y=5.072+7.674x，r=0.990（CK）；y=6.570+3.536x，r=0.989（T4-8）；y=5.563+3.609x，r=0.989（T4-9），CK增幅较大，T4-8、T4-9增幅相对较小。低温胁迫2 d，CK水稻相对电导率为22.51%，分别比T4-8、T4-9水稻高994、11.08百分点；低温胁迫10 d，CK水稻相对电导率达最大，为86.30%，[JP3]分别比T4-8、T4-9水稻高42.00、42.60百分点。方差分析结果表明，在低温胁迫期间，转 ICE1 基因水稻与CK之间的相对电导率差异显著，而T4-8与T4-9之间差异不显著。
低温胁迫后，转 ICE1 基因和非转基因水稻的电导率变化规律相同，其相对电导率均是随着低温胁迫时间的延长趋于增大，但分析数据结果表明，转 ICE1 基因水稻的相对电导率显著低于CK，说明低温胁迫下 ICE1 基因的导入保护了细胞膜，减少了细胞液的外渗，提高了水稻的耐冷性，使植株受伤害的程度较轻。由此可见，低温胁迫下 ICE1 基因具有增强水稻对低温冷害的抗御作用。
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2.2 低温胁迫下转 ICE1 基因水稻丙二醛含量的变化
植物在逆境条件下往往发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化的产物之一，其含量可以反映细胞膜脂过氧化程度及细胞遭受伤害的程度 [7]。本试验水稻幼苗经低温处理后的MDA含量如图2所示，低温处理前（0 d），转 ICE1 基因水稻的MDA含量与CK相近。在低温胁迫下，CK水稻中MDA含量随冷处理时间的延长呈线性增加的趋势，MDA含量与处理时间的关系可以拟合为直线方程：y=3.259+1.350x，r=0.980；低温处理2 d，转基因水稻中MDA含量略有增加，其后基本处于相对稳定状态。由图2可以看出，低温胁迫2 d，CK水稻中的MDA含量快速增加，与胁迫前相比提高了71.9%；而T4-8、T4-9水稻MDA含量与胁迫前相比分别提高291%、30.2%。低温胁迫10 d，CK水稻MDA含量最高达1531 μmol/g；而T4-8、T4-9水稻MDA含量分别为4.53、 4.63 μmol/g。低温处理前，CK与T4-8、T4-9水稻MDA含量差异不显著；低温处理后，CK与T4-8、T4-9水稻差异显著，T4-8、T4-9的MDA含量相差不大。由此可见，外源基因 ICE1 提高了水稻细胞膜脂的抗氧化能力。
一些试验结果证明 [8-10]，低温会使植物幼苗的MDA含量增加，从而促进膜脂过氧化过程，导致膜伤害。此外，MDA本身也是具有细胞毒性的物质，它与细胞体内的酶结合、交联后[CM（25]，会使之失去活性，从而进一步破坏膜结构。本试验中转ICE1 基因水稻在低温胁迫下MDA含量显著低于CK，表明低温胁迫下外源基因 ICE1 可能对膜保护系统发挥作用。
2.3 低温胁迫对转 ICE1 基因水稻SOD的影响
SOD是生物体内特异清除超氧阴离子自由基的酶，能催化超氧阴离子发生歧化反应，清除植物组织和细胞内的超氧自由基，减缓氧自由基对细胞膜的损伤，减轻活性氧对植物的危害。图3为低温胁迫下转 ICE1 基因与非转基因水稻SOD活性的变化。在低温胁迫期间，水稻中SOD活性呈规律性变化，低温胁迫初期，水稻中的SOD活性增强，低温胁迫2 d 3个品种（系）水稻中的SOD活性均达到最大值，分别为1163、17.55、17.61 U/mg，其后CK和转基因水稻的SOD活性均呈下降趋势。低温胁迫10 d，CK水稻SOD活性减至368 U/mg；而T4-8、T4-9水稻中的SOD活性与胁迫前相近。在整个低温胁迫期间，转 ICE1 基因水稻SOD活性均强于CK，且差异显著。表明在低温胁迫条件下， ICE1 基因的过量表达有助于增强SOD活性，增强水稻清除超氧自由基的能力，保护细胞膜，从而提高水稻的耐冷性。
2.4 低温胁迫对转 ICE1 基因水稻POD的影响
由图4可知，低温处理前，转基因和非转基因水稻的POD活性差异不大，低温处理后，非转基因水稻的POD活性显著增强，低温胁迫 2 d时达到最大值，为33.08 U/（mg·min），其后POD活性直线减弱，低温胁迫 10 d时减至 19.86 U/（mg·min）。[JP3]T4-8和T4-9水稻的POD活性在低温处理后虽然有所增强，但明显弱于CK，在低温胁迫 4 d时达到最大值，为19.41、19.53 U/（mg·min）， 其后POD活性处于相对稳定水平，低温胁迫 10 d时T4-8和T4-9水稻POD活性分别减至14.84、15.16 U/（mg·min）。方差分析结果表明，低温处理后T4-8和T4-9水稻POD活性均显著弱于非转基因水稻，但T4-8和T4-9之间差异不显著。由此推测，外源基因可能插入到影响POD基因表达的相关序列中， ICE1 基因可能削弱了原水稻植株中POD基因的表达，从而使转基因
水稻的POD活性低于非转基因水稻。
2.5 低温胁迫对转 ICE1 基因水稻CAT的影响
CAT是植物体内分解过氧化物、消除其对植物的危害、防止植物衰老的抗性酶，它可以促使H2O2分解为O2和H2O，防御细胞遭受H2O2的毒害。通过检测CAT活性可以看出， ICE1 基因的表达是否提高了水稻抵御过氧化氢的能力。由图5可知，随着低温胁迫时间的延长，水稻中的CAT活性表现为先增强后逐渐减弱，并且转基因水稻T4-8和T4-9的CAT活性均强于CK，其差异显著，而T4-8和T4-9之间差异不显著。低温胁迫前，转基因与非转基因水稻体内CAT活性均相对较弱，但T4-8、T4-9水稻CAT活性强于CK，分别比CK强14.88%、16.72%。低温胁迫2 d，CK水稻CAT活性达到最大值，为13.35 U/（mg·min），但弱于同期T4-8和T4-9水稻，其后CK水稻的CAT活性持续减弱，低温胁迫 10 d时减至最低值，为9.92 U/（mg·min）。T4-8、 T4-9水稻 CAT活性在低温胁迫 4 d时达到最大值，较同期CK强4815%、49.72%，其后T4-8、T4-9水稻CAT活性缓慢减弱，低温胁迫 10 d时分别减为11.8、12.2 U/（mg·min）， 但分别比同期CK强1.88、2.28 U/（mg·min）。以上结果表明， ICE1 基因过量表达能提高水稻体内的CAT活性，或促进CAT的合成，从而提高水稻清除H2O2的能力。
3 结论与讨论
植物体自身具有复杂的抗冷防御机制，在逆境条件下可以开启多个防御系统。1个基因可以调控多个防御应答机制，而1个应答机制也受多个基因的调控。在植物体内 ICE1 作为上游转录因子，可能调控多个级联反应，参与到耐冷机制中，从而使植株获得较高的耐冷性 [11]。
应用组成型启动子CaMV35S与 ICE1 基因构建植物表达载体， ICE1 基因可以在转基因植株内组成型表达。由试验结果可知，常温下转基因和非转基因水稻植株在表型上没有表现出明显的差异，两者抗氧化酶活性差异不大。由此可见，在正常生长条件下，过量表达 ICE1 基因对水稻植株的生长及生理指标影响不大。常温下可能 ICE1 基因表达产物不起作用或作用较弱，因此，过量表达 ICE1 基因没有产生级联反应，水稻植株的表型和体内生理指标没有表现出明显的差异。低温胁迫条件下，转基因水稻抗冷性增强，主要表现为转 ICE1 基因水稻的相对电导率远低于非转基因水稻；低温胁迫期间转基因水稻MDA含量变化不大，且显著低于非转基因水稻，说明 ICE1 基因的过量表达减轻了膜脂过氧化程度，抑制了MDA的积累，保护了细胞膜系统，减少了细胞内容物的外渗。SOD、POD和CAT是膜保护系统重要的3种酶，具有清除植物组织和细胞内的自由基，使植物体内自由基维持在一个较低水平，减缓自由基对细胞膜伤害的作用 [12]。本研究结果表明，低温胁迫期间，水稻中的SOD、POD、CAT活性表现为先增强后减弱，说明低温胁迫初期水稻启动了体内抗氧化系统，抗氧化酶活性增强，清除自由基能力提高了；随着胁迫时间的延长，抗氧化酶活性减弱，可能是因为随着低温胁迫的加剧，自由基产生量增加，对抗氧化酶造成伤害，抗氧化酶活性减弱，这又会加重自由基对植物细胞和组织的伤害。转基因水稻SOD、CAT活性均高于非转基因水稻，酶活性差异显著，在低温处理后期表现更为突出，说明在低温胁迫条件下， ICE1 基因过量表达并发挥了作用，通过提高抗氧化酶活性来提高清除自由基的能力，从而减轻自由基对植物细胞和组织的伤害。 ICE1 基因可能是通过一系列级联反应作用于抗氧化酶，从而维持植物较高的抗氧化酶活性，有利于细胞的正常代谢，最终表现出转基因水稻耐冷性增强。
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本研究中转基因水稻POD活性的变化趋势与SOD、CAT不同，虽然低温胁迫期间POD活性缓慢减弱，但低温胁迫后酶活性低于非转基因水稻。这暗示着外源基因 ICE1 的转入和过量表达对过氧化物酶活性产生了一定的影响。 ICE1 基因的转入可能插入到影响POD基因表达的序列内，影响了POD的表达，或者 ICE1 自身表达产物对POD活性有作用，从而使转基因水稻的POD活性弱于非转基因水稻；另外，也有可能与CAT活性有关，CAT和POD同为清除H2O2的主要酶类，CAT活性的增强影响了POD活性，CAT对低温胁迫表现敏感而POD表现不敏感。总体上看，POD的不敏感并没有影响转基因植株整体的耐冷性，低温胁迫条件下转 ICE1 基因水稻的耐冷性仍高于非转基因水稻。
综上所述，尽管在低温胁迫条件下转基因和非转基因水稻各种抗氧化酶活性的变化存在一定的差异，但转基因水稻整体表现出了明显的耐冷性，本研究结果表明，转 ICE1 基因水稻抗膜质过氧化能力高于非转基因水稻。本试验中转 ICE1 基因水稻膜脂过氧化酶和抗氧化酶活性方面的研究与前人的研究结果 [13]基本一致。
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脂代谢酶活性 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
玉米品种:金玉1号 (材料由东北农业大学植物生理实验室提供) 。
1.2 方法
1.2.1 试验材料培育
种子消毒后, 进行1 d的浸泡处理, 再将其放入25℃温箱中处理3 d。待玉米苗长出两片真叶, 将水倾出换入1/4完全培养液培养, 直至幼苗长出3片叶时, 去掉胚乳, 再进行缺素培养。
1.2.2 缺素处理方法
参照郝再彬, 苍晶《生理实验》[7]所示, 配制出完全培养液和缺素营养液 (见表1) , 分别装入500 mL的培养缸内, 选择发育一致的玉米幼苗移入各缸内培养, 每7 d更换一次培养液, 观察完全液 (对照) 和缺素液玉米的生长和发育, 培养时经常调整pH和充气, 待缺素症状出现后 (17 d) 对其进行生理指标测定。
注:每100 mL培养液中贮备液的用量/mL;-N表示培养液中缺少该种元素, 其它相同。
1.2.3 测定方法
参照郝再彬, 苍晶《生理实验》[7]。叶绿素含量测定:722-分光光度计-丙酮法;水溶性蛋白含量测定——考马斯亮蓝G-250法;超氧化物歧化酶 (SOD) 测定——NBT (氮蓝四唑) 法;过氧化氢酶活性测定——紫外吸收法;过氧化物酶活性测定——愈创木酚法;丙二醛 (MDA) 含量测定——硫代巴比妥酸 (TBA) 显色反应。
2 结果与分析
2.1 培养液缺素培养时植株表现的症状
培养液缺氮时玉米植株矮小, 生长缓慢, 叶片由下而上从叶尖沿中脉向基部黄枯;缺磷时幼苗叶尖和叶缘呈紫红色, 老叶变黄, 茎秆细小, 生长缓慢;缺钾时老叶边缘枯焦、发褐, 幼叶变黄, 植株矮小;缺镁时下部叶片平行叶脉间呈现淡黄色条纹, 进一步扩展到整个叶片纵向变黄, 甚至发白, 最后其边缘呈紫红色;缺钾老叶从尖端沿着叶缘向叶鞘逐渐变褐而枯焦, 并逐渐由叶缘向叶的中心扩展;缺钙的玉米植株幼叶变黄枯萎, 植株矮小;缺铁时新生叶片出现失绿, 脉间失绿, 发展至整个叶片淡黄或发白, 植株瘦小, 生长缓慢。
2.2 培养液缺素培养时玉米叶片叶绿素、蛋白质含量的变化
由表2可知, 营养液中缺少某一种元素叶绿素含量都有不同程度的降低, 其中缺氮、缺镁、缺铁下降显著, 这可能与氮、镁是叶绿素的组成成分以及铁能促进叶绿素的生物合成有关。其它缺素造成叶绿素含量降低, 可能是由于这些元素都不同程度的参与叶绿素的合成所致。缺氮、缺铁培养的营养液较用完全培养液蛋白质的含量下降显著, 其它缺素培养均有不同程度降低, 因为氮、铁是蛋白质合成的组成成分, 其它元素不同程度地促进植物对氮的吸收, 当磷、钾、镁缺少时, 导致氮循环不畅, 进而引起蛋白质合成受阻[8]。相关性分析表明:在叶绿素含量测定方面, 缺氮处理与完全培养液培养表现为极显著相关;在蛋白质测定方面, 缺磷、缺钾处理分别与完全培养液培养呈极显著相关, 缺镁处理与完全培养液培养呈显著相关。
2.3 缺素对MDA含量的影响
MDA是膜质过氧化的产物, 其含量的多少可代表膜损伤程度的大小[9]。由表2看出, 各缺素处理下, 丙二醛 (MDA) 的含量均高于完全培养液培养的植株, 这可能是不同缺素培养使叶片内自由基产生速率增加, 细胞质膜相对透性增大所致, 导致膜脂过氧化产物丙二醛 (MDA) 含量增多。
2.4 缺素对3种保护酶活性的影响
SOD、POD、CAT是植物在逆境条件下的三大主要保护酶系统。这些活性氧在植物体内不断生成, 同时又被SOD、CAT和POD等保护酶系统清除, 由于缺素造成植物营养不良, 进而对植物造成伤害, 所以, 这3种酶活性的大小可作为衡量作物抗逆性强弱的指标[1]。而SOD、CAT和POD活性表现为 (见表2) , 缺素培养液培养植株的生理指标略低于用完全培养液培养的植株, 这可能是缺素培养后, 引起生物体膜脂过氧化程度增高, 导致生物体内自由基的产生与消除的平衡被迫坏, 加速植株早衰。相关性分析表明, 缺镁处理与完全培养液培养超氧化物歧化酶 (SOD) 活性表现极显著相关;在过氧化酶活性 (CAT) 方面, 缺氮、缺钾、缺镁处理分别与完全培养液培养呈极显著相关, 缺铁处理与完全培养液培养呈显著相关。
注:*代表0.05水平显著相关, **代表0.01水平相关。
3 讨论
植物除了从土壤中吸收水分外, 还要从中吸收矿质营养和氮素, 以维持正常的生命活动。作物缺乏某种必须元素时, 便会引起生理和形态上的变化。如:氮、磷是蛋白质、核酸、磷脂的主要成分, 缺氮、磷时, 蛋白质、核酸、磷脂等的物质合成受阻, 同时叶绿素合成受限。钾在碳水化合物代谢、呼吸作用及蛋白质代谢中起重要作用, 生物体缺钾还会间接地影响光合作用。钙离子可作为磷脂中的磷酸与蛋白质的羧基间联结的桥梁, 具有稳定膜结构的作用。镁在核酸和蛋白质代谢中起重要作用。铁是合成叶绿素所必需的, 它又是许多酶的辅基, 如细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶等[10]。所以当培养液中缺少某种元素时均会使生物体蛋白质代谢降解加速, 含量降低;叶片绿色逐渐消失, 光合速率下降。又由于生物膜是由膜脂和蛋白质组成的连续的片层结构, 呈流动镶嵌模式。在膜上还存在有许多酶。缺素培养后, 膜失去适应力, 胞内物质发生泄漏, 膜功能受损, 使细胞中活性氧增多, 导致膜发生相变, 膜脂过氧化程度增高, 膜脂过氧化产物还会产生自由基, 如O2 -参与启动膜脂过氧化或膜脂肪脱脂作用[11]。通常, 细胞内产生的活性自由基会受到其植物体产生的保护酶调节与控制, 在逆境胁迫下和衰老过程中这些保护酶可清除过量的自由基 (如O2-由SOD清除, H2O2由CAT和POX等清除) , 维持代谢平衡, 保护细胞的正常结构, 因而植物能在一定程度上忍耐、减缓和抗御逆境胁迫, 延缓植物器官的衰老过程[12], 本研究在缺素培养过程中, SOD、POD、CAT活性降低, 说明植物体存在大量的自由基未来得及清除, 细胞膜受损, 导致植物体加速衰老[13]。所以合理施肥, 对延长玉米光周期、增加玉米产量具有重要的意义。
摘要：主要以玉米品种金玉1号为试材, 用水培法在苗期进行缺素 (N、P、K、Ca、Mg、Fe) 处理培养, 缺素症状出现后对其生理指标进行测量, 结果表明:在不同缺素培养下玉米叶片的丙二醛 (MDA) 含量显著增加, 产生的活性氧物质诱导超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化物酶 (POD) 活性以及过氧化氢酶 (CAT) 活性下降, 植株的叶绿素含量、蛋白质含量降低。
脂代谢酶活性 篇5
接受日期 :2009-09-21 基金项目 :“ 十一・ 五” 国家高技术(863 研究计划重大项目(编号 2006AA10A110 资助。
作者简介 :陈磊(1982— , 男 , 重庆长寿人 , 博士研究生 , 主要从事蔬菜栽培生理研究。E 2mail :leichennjau @1631com 3通讯作者 E 2mail :ylzhu @njau.edu.cn 氮素不同形态配比对菜用大豆生长、种子抗氧化 酶活性及活性氧代谢的影响 陈 磊 , 朱月林 3, 杨立飞 , 王 聪
(南京农业大学园艺学院 , 江苏南京 210095 摘要 :通过蛭石盆栽试验 , 研究了氮素不同形态配比对菜用大豆 [G lycine max(L.Merr.]品种 “ 理想 95-1” 生长、种 子抗氧化酶活性及活性氧代谢的影响。结果表明 , 营养液中适宜的硝铵比(75∶ 25 有利于菜用大豆的生长发育 , 植 株具有最大生物量;在高比例的硝态氮(100% 和铵态氮(75% 处理下 , 植株的干重、鲜重及产量均显著降低 , 以硝 铵比为 25∶ 75处理下尤为显著。在适宜的硝铵比(75∶ 25和 50∶ 50 处理下 , 菜用大豆种子具有较低的抗氧化酶活性 , 活性氧代谢产物 O 2Η、过氧化氢(H 2O 2 和膜脂过氧化产物丙二醛(M DA 含量也较低 , 表明植株受到的氧化胁迫程度 较低;而在硝铵比为 25∶ 75处理中 , 抗氧化酶活性最高 ,O 2Η
生成速率、H 2O 2和 M DA 含量也最高 , 表明过多的铵态氮 对细胞膜造成了伤害 , 所受的氧化损伤程度较重。关键词 :氮素形态;菜用大豆;抗氧化酶;膜脂过氧化
中图分类号 :S64317;S1431文献标识码 :A :505X(E ffects of nitrogen , antioxidant enzyme of vegetable soybean CHE N Lei , ZH U Y ue 2lin 3, Y ANGLi 2fei , W ANG C ong(College o f Horticulture , Nanjing Agricultural Univer sity , Nanjing , Jiangsu 210095, China Abstract :Using the vermiculite culture , the effects of ratios of NO-32N and NH +42N on plant growth , seed antioxidant enzyme activities and reactive oxygen metabolism of vegetable s oybean [G lycine max(L.Merr.cv.Li 2xiang 95-1]were studied.The results show that the appropriate ratio of NO-32N and NH +42N is about 75∶ 25which is beneficial to the growth and development of the s oybean , and produces the maximum plant biomass.Under the treatment of excessive NO-3(100% or NH +4(75% , both biomass production and yields are decreased obviously , especially for the NH +4(75% treatment.In the NO-3∶ NH +4treatments of 75∶ 25and 50∶ 50, the activities of antioxidant enzymes are low , and the O 2Η
producing rate , hydrogen peroxide(H 2O 2 and malondiadehyde(MDA contents are als o low , therefore the de 2gree of oxidative stress is com paratively low.H owever , under the NO-3∶ NH +4treatment of 25∶ 75, the antioxidant enzyme activities , the O 2Η
producing rate , H 2O 2and MDA contents reach to their highest values.These results indicate that ex 2cessive NH +4is harm ful to cell membrane integrity , resulting in severe degree of oxidative damage in the seeds of veg 2etable s oybean.K ey w ords :nitrogen forms;vegetable s oybean;antioxidant enzyme activity;membrane lipid peroxidation
硝态氮和铵态氮是蔬菜作物吸收的两种主要氮 素形态 , 但是不同蔬菜作物对这两种氮素形态吸收、还原、运输、分布和同化等方面是截然不同的 , 从而
对蔬菜的生长和代谢产生不同的生理效应 [1-2]。赵
建荣等 [3]研究发现 , 氮素形态显著影响菠菜营养品 质和抗氧化酶活性 , 在完全供应铵态氮时 , 膜脂过氧
植物营养与肥料学报 2010,16(3 :768-772 Plant Nutrition and Fertilizer Science 化 程 度 较 高。朱 祝 军 等 [4]也 发 现 , 在 550μm ol/(m 2・ s 的光照强度下 , 氮素形态显著影响了菜 豆植株生长和抗氧化系统 , 在供应铵态氮的植株叶 片中 , 抗坏血酸过氧化物酶(APX、单脱氢抗坏血酸 还原酶(MDH AR 和谷胱甘肽还原酶(G R 活性均显 著增强。但是 , 目前氮素形态对蔬菜作物生长发育 后期生理响应的研究较少 , 而研究氮素不同形态的 合理配比对实现作物高产有着重要的现实意义。为 此 , 开展了在自然光照条件下不同氮素形态对菜用 大豆生长、种子抗氧化酶活性及活性氧代谢影响的 研究 , 旨在探讨氮素形态与酶促抗氧化系统在菜用 大豆子粒膨大过程中的生理机制 , 以期为无土栽培 和田间条件下 , 提高菜用大豆产量而进行合理施用 氮肥提供理论依据。
1材料与方法 11
1试验设计
试验于 2008年 3月 6日至 58 1” [G lycine max 2951], 购自。3月 6日 , 大豆 种子直播于上直径 40cm、下直径 25cm、高 35cm 的 塑料盆中 , 蛭石作基质 , 浇足底水后 , 每盆播 6粒种 子。真叶展开后 , 每盆留 4株长势一致的幼苗 , 生长 期间每盆每 3d 浇 110L 含有氮素不同形态配比的 改良 H oagland 营养液。植株生长在自然光照下 , 昼 /夜温度为
(28~30 ℃ /(20~22 ℃ , 温室相对湿度为 60%~80%, 日 最 高 光 照 强 度 在
500~850μm ol/(m 2・ s 范围内(采用美国 LI-C OR 公司生产的 LI-190S B 传感器测定。
在总氮浓度均为 16mm ol/L 的前提下 , 试验设 4个硝铵比(NO-32N ∶ NH +42N 处理 , 分别为 100∶ 0、75∶25、50∶ 50和 25∶ 75。每处理 5盆 ,3次重复。此外 , 营养 液 中 均 加 入 7μm ol/L 硝 化 抑 制 剂 双 氰 胺(DC D。处理所用改良 H oagland 营养液 , 其大量元 素组成如表 1, 微量元素的含量分别为(μm ol/L :B 140(H 3BO 3、Cu 100(CuS O 4・ 5H 2O、Mn 36(MnCl 2・ 4H 2O、Zn 46(ZnS O 4・ 7H 2O、Fe 30(Fe 2E DT A 和 M o 1(H 2M oO 2。
4月 8日始花 , 此后一周内每天挂牌标记开花 期 , 并记录每天的挂牌数 , 以此确立每天的开花数。4月 11日花数最多 , 试验即以该天开花形成的种子 为研究对象。
表
1处理用营养液中大量营养元素的组成
T able 1 Components of m acroelements in the nutrition solution under different treatments 无机盐 Inorganic salt 硝铵比 NO-32N ∶ NH +42N(NO-3+4 100:075:2550:5025:75 Ca(NO 3 24*** K NO 351751400 MgS O 4210210210210 NH 4H 2PO 4010110110110 K H 2PO 4110000 K Cl 110213717717 NH 4Cl 0215611917 CaCl 20115017214 11
2测定项目及方法
423(, 取同一天开花(4月 1次 , 共取 7(NBT 光还 ](S OD 活性;愈创木酚 法 [5]测 定 过 氧 化 物 酶(POD 活 性;过 氧 化 氢 酶(C AT 活性按照 Cakmak 等 [6]的方法测定;抗坏血酸 过氧化物酶(APX 活性按照 Nakano 等 [7]的方法测 定;O 2 Η
生 成 速 率 按 照 王 爱 国 等 [8]的 方 法 测 定;H 2O 2含量按照林植芳等 [9]的方法测定;硫代巴比 妥酸法(T BA 测定丙二醛(MDA 含量 [10]。5月 16日(花后 35d 进行生物量(茎叶、根系和百粒种子干 鲜重 的测定。
试验数据用 S AS 软件进行单因素方差分析 , 并 用 Duncan ’ s 新复极差法进行多重比较。
2结果与分析
1氮素不同形态配比对菜用大豆生物量的影响 表 2可知 , 不同硝铵比对菜用大豆的生长影响 显著 , 随着营养液中铵态氮比例的适当增加(25% ~50% , 菜用大豆植株茎叶、根系和种子百粒鲜重 显著增加 , 但在硝铵比为 75∶ 25和 50∶ 50处理下无 显著差异。营养液中过高的硝或铵比里例(100% NO-32N 和 75%NH +42N 均显著降低了菜用大豆的 鲜重 , 尤以硝铵比为 25∶ 75时最为显著。不同处理 菜用大豆植株茎叶、根系和种子的干重均达到显著 差异水平。与鲜重的变化规律相似 , 随着营养液中铵 态氮比例的适当增加 , 菜用大豆干物重也逐渐增加 , 在硝铵比为 75∶ 25时 , 菜用大豆干物重达到最大值 ,平均单株茎叶和根系干重分别达到 12156和 3178g 967 3期
陈磊 , 等 :氮素不同形态配比对菜用大豆生长、种子抗氧化酶活性及活性氧代谢的影响
表
2不同硝铵比对菜用大豆生物量的影响
T able 2 E ffect of N O-32N and NH +42N ratios on biom ass of vegetable soybean
硝铵比
NO-32N ∶ NH +42N 鲜重 Fresh weight 干重 Dry weight 茎叶(g/plant Shoot 根系(g/plant R oot 百粒种子重(g 1002seeds wt.茎叶(g/plant Shoot 根系(g/plant R oot 百粒种子重(g 100-seeds wt.100∶ 060168±0132b 15117±0154a 58113±1141b 9130±0135c 2125±0136c 16190±0133c 75∶ 2566104±0169a 17117±0132a 66174±1132a 12156±0164a 3178±0164a 22167±0147a 50∶ 5064145±0153a 16102±0177a 63144±1118a 10172±0147b 3119±0147b 19142±0138b 25∶ 75
49192±0126c 11146±0146b 51128±1109c 6187±0142d 1156±0142d 13186±0124d
注(N ote :数据为平均数 ±标准差 , n =3;同一列的数据后不同小写字母表示处理间的差异达 5%的显著水平M ean ±S D , n =3.Different small letters in a column are significant difference at 5%level.3178g;种子百粒干重可达 22167g , 分别是硝铵比
为 100∶ 0、50∶ 50、25∶ 75处理的 1134、1117和 1164倍。21
2氮素不同形态配比对菜用大豆不同发育时期
种子抗氧化酶活性的影响
从图 1可知 , 花后 12到 18d , 不同硝铵比显著 提高了种子 S OD 活性(图 1A , 态氮比例的增加 ,S OD 25∶ 75时 , 天数的增加(到 铵态氮(50% S OD 活性;在硝铵 比为 50∶ 50和 25∶ 75时 , 菜用大豆种子 S OD 活性分 别下降了 2615%和 3614%。而在硝铵比为 100∶ 0和 75∶ 25时 , 菜用大豆种子均能维持较高的 S OD 活性。在不同硝铵比处理下 , 菜用大豆种子的 POD 表现为 先上升后下降的趋势(图 1B。在硝铵比为 25∶ 75和 50∶ 50时 ,POD 活性上升幅度较大 , 但是前者下降 速度较慢 , 后者下降速率快;在不同硝铵比处理下 , POD 活性在 18到 21d 期间达到峰值 , 与花后 12d 时 POD 活性相比 , 硝铵比为 100∶ 0、75∶25、50∶ 50、25∶ 75分别增加了 4817%、4617%、5712%和 5811%。C AT 活性方面(图 1C , 在硝
铵比为 50∶ 50和 25∶ 75条件下 , 菜用大豆种子的 C AT 表现为先上升后下降 再缓慢上升的趋势 , 而在硝铵比为 100∶ 0和 75∶ 25时 ,C AT 活性表现为先上升后下降的趋势。在花后 30d ,C AT 活性随着营养液中铵态氮比例的增加而
升高 , 在硝铵比为 25∶ 75时 , 菜用大豆种子的 C AT 活 性分别是硝铵比为 100∶ 0、75∶25、50∶ 50处理的 1187、1168和 1122倍。213 氮素不同形态配比对菜用大豆不同发育时期
种子 O 2Η
生成速率、H 2O 2和 MDA 含量的影响
表 3看出 , 在不同硝铵比处理下 , 菜用大豆种子 中 O 2Η
生成速率表现为先迅速增加而后维持在较高 水平。营养液中适当比例的铵态氮(25%~50%
显
图
1不同硝铵比对菜用大豆种子抗氧化酶活性的影响 Fig.1 E ffects of N O-32N and NH +42N ratios on the activities of antioxid ant enzymes in seeds of vegetable soybean 著降低了 O 2Η
生成速率 , 较高比例的铵态氮处理下 , O 2Η
生成速率显著升高。花后 30d 时 , 硝铵比为 75∶ 25时 , 菜用大豆种子中 O 2Η
含量最低 , 分别是硝铵比
为 100∶ 0、50∶ 50、25∶ 75处理的 0174、0188和 0170倍。H 2O 2含量方面 , 在硝铵比为 100∶ 0和 25∶ 75时 , 菜用
77植 物 营 养 与 肥 料 学 报 16卷
大豆种子中 H 2O 2含量表现为先迅速增加而后维持
在较高水平, 而硝铵比为 75∶ 25和 50∶ 50时 ,H 2O 2含 量表现为开始无明显变化而后缓慢增加。适当的硝 铵比(25%~50% 处理下 ,H 2O 2含量较低。MDA 含 量方面 , 在不同硝铵比处理下 , 菜用大豆种子中 MDA 含量的变化与 H 2O 2含量变化相似。花后 18 到 30d , 营养液中高比例的铵态氮(75% 和硝态氮(100% 均使菜用大豆种子中 MDA 含量显著增加。花后 30d 时 , 在硝铵比为 75∶ 25时 , 菜用大豆种子中 MDA 含量最低 , 分别是硝铵比为 100∶ 0和 25∶ 75处 理的 0155倍和 0143倍。
表
3不同硝铵比对菜用大豆种子 O 2Η 生成速率、H 2O 2和 MDA 含量的影响 T able 3 E ffects of N O-32N and NH + 42N ratios on O 2 Η
producing rate , H 2O 2and MDA contents in seeds of vegetable soybean 项目 I tem 硝铵比
-+花后天数 Days after flowering(d 12***0O 2生成速率 O 2Ηproducing rate [μm ol/(min ・ g , F M] 100∶ 01132a 2112a 1176b 1186b 2101b 2132a 2114a 75∶ 251104b 1147d 1141d 1160c 1144b 1181b 1159c 50∶ 500190b 1165c 1162c 1145c 1165c 1174b 1180b 25∶ 751125a 1190b 1199a 2103a 2128a a 2126a H 2O 2含量
H 2O 2content(μm ol/g , F M 100∶ 00193a 1114a 1b 125b 2b 2155b 75∶ 250179a 0185a 0c 21c 111118c 50∶ 500187a 111c c 1156c 1131c 25∶ 751a a a 3114a 3143a 3124a M DA 含量 M DA(μm ol/g , F a 032a 0135b 0141b 0150b 0158b 01a 0121a 0122b 0120c 0125c 0126c 0132c 500123a 0124a 0126ab 0127c 0128c 0131c 0136c 25∶ 75 0131a 0131a 0131a 0140a 0154a
0162a 0175a
注(N ote :同一列的数据后不同小写字母表示处理间的差异达 5%的显著水平Different small letters in a column are significant at 5%level.3讨论
适宜的硝铵比对植物的生长发育和丰产都是非
常有 利 的 , 如 小 麦(Triticum aestivum L.[12]、菜 豆(Phaseolus vulgaris L.[4]、菠菜(Spinacia oleracea L.等 [13]。然而 ,Britto 等 [14]和 Cao 等 [15]认为 , 在高比 例的硝态氮或铵态氮处理下 , 过多的能量消耗用于 NO-3或 NH +4的转移 , 从而导致蛋白质和糖类合成 的减少或植物体内激素平衡的失调和细胞分裂素含 量急剧下降 [16], 降低氮同化能力 , 从而影响作物的 丰产。本研究表明 , 在硝铵比为 100∶ 0和 25∶ 75时 , 菜用大豆生物量显著降低 , 在硝铵比为 25∶ 75时表 现尤为显著。上述结果与 T abatabaei 等 [11]在草莓上 的研究基本结果一致 , 但不同的是 T abatabaei 等发现 在硝铵比为 50∶ 50时草莓具有最大的生物量 , 而本 试验发现硝铵比为 75∶ 25时菜用大豆具有最大的生 物量 , 这可能是由于不同的作物对 NO-3或 NH +4的 敏感性和嗜好性存在差异。
植物受到干旱、盐渍、温度等胁迫时 , 活性氧代 谢平衡被破坏 , 产生 O 2Η、H 2O
2、・ OH、1 O 2, 从而加快 膜脂过氧化进程 , 导致一系列生理生化代谢紊乱。
Medici 等 [17]和 Nim ptsch 等 [18]证实 , 过多的硝态氮或 铵态氮易诱导植物抗氧化酶(S OD、POD、C AT、APX
和 G R 活性的升高 , 表明过多的硝态氮或铵态氮会 对植株产生氧化胁迫。寿森炎等 [19]研究发现 , 在自 然光强下 , 供应铵态氮的植株生长受到明显抑制 , S OD、G R 等抗氧化酶活性及 O 2Η
生成速率、H 2O 2和 MDA 含量显著高于供应硝态氮的植株。赵建荣和 秦改花 [3]研究表明 , 在增加铵态氮比例时 ,POD、S OD 和 C AT 活性有所降低 , 而在完全供铵时 , 其活性达 到最高 ,MDA 含量也最高。本研究结果表明 , 在自 然光照下 , 不同硝铵比对菜用大豆种子发育过程中 的抗氧化系统有显著影响。在不同硝铵比处理下 , POD 和 C AT 活性随着营养液中铵态氮比例的增加 而逐渐升高。然而 , 高比例的硝态氮处理下 , 菜用大 豆种子抗氧化酶(POD 和 C AT 活性却维持在较低水平。在种子发育后期(花后 18到 30d , 硝铵比为 25∶ 75时 S OD 在抗氧化过程中没有起到关键的作 用 , 该结果与 Rios 2G onzalez 等 [20]对玉米的研究结果 相似。营养液中过多的硝态氮或铵态氮均使菜用大 豆种子中 O 2Η
生成速率、H 2O 2和 MDA 含量显著增 加。对菜用大豆 , 营养液中适当的硝铵比能使种子 773期
陈磊 , 等 :氮素不同形态配比对菜用大豆生长、种子抗氧化酶活性及活性氧代谢的影响
维持较低的抗氧化酶活性 , 活性氧代谢产物 O 2Η、H 2O 2和膜脂过氧化产物 MDA 含量也较低 , 表明氧 化胁迫伤害较轻。而在硝铵比为 25∶ 75时 , 抗氧化 酶活性最高 ,O 2Η
生成速率、H 2O 2和 MDA 含量也最 高 , 说明过多的铵态氮对细胞膜造成了伤害 , 细胞抗 氧化酶系统开始起作用。
综上所述 , 与完全供应硝态氮处理相比较 , 硝铵 比为 75∶ 25和 50∶ 50时菜用大豆的生物量显著提 高 , 尤以硝铵比为 75∶ 25时更为显著;而且抗氧化 酶(POD 和 C AT 活性、O 2Η
生成速率、H 2O 2和 MDA 含量均维持在较低水平, 表明所受的氧化胁迫程度 最低。可见 , 不同硝铵比氮素营养对菜用大豆种子 发育过程中的抗氧化系统产生了显著的影响 , 说明 不同氮素形态处理下抗氧化系统和活性氧代谢与菜 用大豆丰产有着密切的相关性。关于这方面的分子 生物学依据 , 有待深入研究。参 考 文 献 : [1] D ong C X , Shen Q R , changes in of-3N NH +4].Pedosphere ,-[2] Lenka V , Edita , Olga V et al.G rowth and biomass allocation of sweet flag(Acorus calamus L.under different nutrient conditions[J].Hydrobiologia , 2004, 518:9-221 [3]
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脂代谢酶活性 篇6
1实验材料
1.1仪器设备
微型离心机(常州朗越仪器制造有限公司产,型号:MINI-10K),电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产,型号:AL204),旋涡混合器(常州朗越仪器制造有限公司产,型号:XH-C),立式超低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司产,型号:DW-86L386),实验室pH计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产,型号:FE20),高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司产,型号:LC3000)。
1.2试剂试药
人重组肝细胞微粒体CYP3A4(SPIBIO,批号:M41013),咪达唑仑注射液(江苏恩华药业股份有限公司,批号:20140607),1-羟基咪达唑仑(CeriLLiant,批号:FN08081402),卡马西平(中国食品药品检定研究院,批号:100142-201105),酮康唑(上海源叶生物科技有限公司,批号:SM0325YF13),NADPH(上海源叶生物科技有限公司,批号:WO1028EA14),乙腈(天津市大茂化学试剂厂,批号:20141021),甲醇(广东光华科技股份有限公司,批号:20140723),磷酸氢二钾(广州化学试剂厂,批号:20140701-2),三羟甲基氨基甲烷(上海源叶生物科技有限公司,批号:TA0429CA14),无水氯化镁(天津市福晨化学试剂厂,批号:20140412),碳酸氢钠(广州化学试剂厂,批号:20140701-1),银黄颗粒(河北国金药业有限责任公司,批号:4403073),牛黄上清丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂,批号:3015673),双黄连合剂(河南太龙药业股份有限公司,批号:1307001)。
2实验方法
2.1溶液配制
2.1.1咪达唑仑配制精密吸取咪达唑仑注射液360μL(相当于咪达唑仑1.8mg),置于5mL容量瓶中,用纯化水定容至刻度,摇匀,得到浓度均为1.0mmoL·L-1的储备液,置于4℃冰箱备用。精密吸取1mL于10mL容量瓶中,加入纯化水定容至刻度,摇匀,得到浓度为100μmoL·L-1的咪达唑仑溶液。
2.1.2 1-羟基咪达唑仑标准溶液配制精密吸取100μL1-羟基咪达唑仑于10mL容量瓶中,甲醇定容至刻度,得到1μg/mL的储备液,精密吸取1mL 100μL 1-羟基咪达唑仑储备液于10mL容量瓶中,甲醇定容至刻度,得到100ng/mL的储备液,置于4℃下保存待用。
2.1.3卡马西平内标溶配制精密称取10.0mg卡马西平于10mL容量瓶中,用乙腈定容得到1mg/mL卡马西平储备液,从储备液中精密吸取20.0μL到10mL容量瓶中,用乙腈定容得到浓度为2.00μg/mL的内标溶液,4℃下保存备用。
2.1.4磷酸盐缓冲液(pH=7.4)配制取磷酸二氢钾1.36g,加0.1moL·L-1氢氧化钠溶液79mL,用水稀释至200mL,即得PBS溶液。
2.1.5阳性抑制剂酮康唑配制精密称取酮康唑26.5mg于5mL容量瓶中,用PBS溶液(pH=7.4)溶解并定容至刻度,摇匀,得浓度为10.0mmoL·L-1的储备液,置于4℃冰箱备用。
2.1.6氯化镁溶液的配制精密称量47.5mg氯化镁于10mL容量瓶中,用PBS溶液(pH=7.4)充分溶解,定容摇匀,得到50.0mmoL·L-1的氯化镁溶液。
2.1.7 NADPH溶液配制精密称量8.3mg NADPH用PBS溶液(pH=7.4)稀释得到浓度为10.0mmoL·L-1的NADPH,现用现配,4℃冰箱避光保存。
2.1.8人重组肝细胞微粒体CYP3A4配制精密吸取100μL人重组肝细胞微粒体CYP3A4,置于1mL容量瓶,用PBS溶液(pH=7.4)配制成浓度为100pmoL·L-1的溶液,置于-20℃冰箱中保存。
2.2孵育体系与样品处理[4,5]
2.2.1孵育体系肝微粒体体外孵育体系的总体积为200μL:20μL CYP3A4(终浓度为10pmoL·L-1),20μL氯化镁(终浓度为5.00mmoL·L-1),10μL咪达唑仑(终浓度为5μmoL·L-1),剩余体积用PBS缓冲溶液(pH7.4)补充,37℃水浴中孵育5min后,加入20μL NADPH(终浓度为1.0mmoL·L-1)启动反应,反应5min。
2.2.2样品处理孵育结束后,立即向孵育体系中加入100μL冰乙腈(含内标物质卡马西平2μg/mL)终止反应,涡旋混合1min,-20℃下放置10min,10 000r/min高速离心10min,取上清液过滤,吸取20μL注入到HPLC仪中测定。
2.3色谱条件[6]
色谱柱KromasiL C18(250mm×4.6mm,5μm),流速为1.00mL/min,柱温为40℃,检测波长230nm,流动相:10.0mmoL·L-1醋酸铵缓冲液-甲醇(42∶58),进样量为20μL。
2.4分组与给药[7]
体外孵化反应分为阳性对照组、阴性对照组和试药组。阴性对照组中加入磷酸盐缓冲液(pH=7.4),阳性对照组中加入酮康唑溶液(0.0125、0.025、0.05、0.1、0.5、1.0、10、50μmoL·L-1);试药组给予以磷酸盐缓冲液(pH=7.4)稀释的不同浓度的中成药溶液。孵育体系总体积均为200μL,根据“2.2孵育体系与样品处理”项下进行反应并处理。将所有样品按“2.3色谱条件”项下进行测定,根据代谢产物1-羟基咪达唑仑的生成率可确定CYP3A4酶的相对活性(即试药组占阴性对照组生成率的百分比),计算半数抑制率(IC50)。
2.5标准曲线制备
取6只EP管,加入1-羟基咪达唑仑储备液,使1-羟基咪达唑仑的终浓度分别为10、20、50、100、200、500、1000ng/mL,按照体外孵育和样品处理方法“2.2孵育体系与样品处理”项操作,取上清液20μL进样,以1-羟基咪达唑仑和卡马西平的峰面积比值(Y)和含量(X)进行加权回归。
2.6酮康唑IC50的测定及抑制活性的评价
在肝微粒体孵育体系中阳性抑制剂酮康唑对CYP3A4介导的咪达唑仑1-羟基化反应有强抑制作用。阳性对照组中加入酮康唑溶液,使其终浓度为:0.025、0.1、0.5、1、10、50μmoL·L-1,根据“2.2孵育体系与样品处理”项下进行反应并处理,根据1-羟基咪达唑仑的生成率来确定CYP3A4酶的相对活性(即实验组占阴性对照组生成率的百分比),计算半数抑制率IC50。
2.7对rCYP3A4活性影响的初步筛选
2.7.1样品配制[7]根据说明书,分别取治疗量的银黄颗粒、牛黄上清丸、双黄连合剂,经处理后,分别置于100mL容量瓶中,加甲醇溶液定容至刻度,超声30min,滤过,滤液作为储备液。将中成药分为低、中、高剂量组,低、高剂量组则分别为中剂量组的1/2和2倍,并同时设置空白组。每个样品平行做3份。
2.7.2酶孵化条件反应体系中先分别加入PBS(pH=7.4)、咪达唑仑、氯化镁、rCYP3A4和待测药物的储备液,置于37℃水浴中预孵化振荡5min后,加入NADPH生成系统启动孵化反应。37℃水浴振荡反应5min后,加入冰乙腈(含内标物质—卡马西平2μg/mL)终止反应。涡旋混合1min,-20℃下放置10min,10 000rpm离心5min,取上清液过滤,吸取滤液20μL注入HPLC仪中,按“2.3色谱条件”项下色谱条件进样测定,测定咪达唑仑代谢产物1-羟基咪达唑仑的浓度。
2.7.3代谢产物测定使用HPLC仪按“2.3色谱条件”项下色谱条件进样分析,测定1-羟基咪达唑仑与卡马西平的含量,考察对CYP3A4活性影响较大的中成药。代谢产物1-羟基咪达唑仑的生成率越低,表示抑制作用越强。
2.8对rCYP3A4活性抑制作用强弱(IC50值)的计算
2.8.1酶孵化条件参见“2.7对rCYP3A4活性影响的初步筛选”项下“2.7.2酶孵化的条件”项操作。
2.8.2代谢产物测定参见“2.7对rCYP3A4活性影响的初步筛选”项下“2.7.3酶孵化的条件”项操作。
2.8.3 IC50测定通过体外初步筛选后,在固定CYP3A4浓度、探针底物咪达唑仑浓度和NADPH浓度的同时,改变待测中成药的浓度,测定不同浓度下中成药对1-羟基咪达唑仑生成率的影响,判断对CYP3A4的抑制程度,估计中成药对rCYP3A4活性的影响强弱。以中成药浓度对数值为横坐标(X),CYP3A4酶的相对活性(%)表示为纵坐标(Y),计算IC50值和95%的可信范围[8],计算公式为:Y=min×(max-min)/[1+10^(X-LogIC50)]。
3结果
3.1专属性考察
按“2.3色谱条件”项下色谱条件进样测定,1-羟基咪达唑仑、卡马西平的分离度好(>1.5),1-羟基咪达唑仑与卡马西平出峰时间分别在15.4min,8.6min。见图1、图2、图3。
3.2标准曲线
以1-羟基咪达唑仑和卡马西平的峰面积比(Y)和含量(X)进行加权回归,得到Y=0.001 2X+0.012 2(R2=0.997,n=6),表明1-羟基咪达唑仑在10~1 000ng/mL范围内与峰面积线性关系良好,结果见图4。
3.3阳性对照组酮康唑对rCYP3A4酶相对活性
计算IC50为0.065 38μmoL·L-1,95%区间:0.045 42~0.094 1符合文献[8]范围(0.06~0.16μmoL·L-1),表明所用的孵育体系可以满足CYP3A4酶抑制活性的评价及测定其他抑制剂IC50的要求。
3.4对rCYP3A4活性影响的初步筛选
由表3可看出:银黄颗粒、牛黄上清丸及双黄连合剂对CYP3A4酶表现出诱导作用。
4讨论
CYP3A4是肝脏和肠道重要代谢酶,含量可达到肝脏CYP450总量的60%,肠道CYP450总量的70%[9],是药物代谢的主角。中成药说明书中药物相互作用栏均未见报道,只是简单书写“如与其他药物同时使用可能会发生药物相互作用,详情请咨询医师或药师。”基于此,开展本研究对完善中成药的说明书有一定帮助作用,对临床合理用药提供了参考性依据。本实验结果显示,银黄颗粒、牛黄上清丸及双黄连合剂对CYP3A4有诱导作用,因此,在使用时可考虑其潜在的药物相互作用。
摘要：目的:探讨银黄颗粒、牛黄上清丸、双黄连合剂对CYP3A4活性的影响。方法:利用体外肝微粒体培育体系,以咪达唑仑作为探针底物,研究银黄颗粒、牛黄上清丸、双黄连合剂对人肝微粒体细胞色素P450_3A4(CYP3A4)活性的影响。结果:与空白组比较,银黄颗粒、牛黄上清丸、双黄连合剂对CYP3A4活性表现为诱导作用。结论:在与临床上经CYP3A4代谢的药物联合应用时,应警惕银黄颗粒、牛黄上清丸、双黄连合剂潜在的药物之间的相互作用。
关键词：银黄颗粒,牛黄上清丸,双黄连合剂,细胞色素P4503A4
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