EGFR基因（通用6篇）
EGFR基因 篇1
胃癌 (Gastric Carcinoma) 是消化系统最常见的恶性肿瘤[1]。武威又是全国胃癌高发地区, 为本地区首要死亡原因。表皮生长因子受体 (EGFR) 是HER-1的表达产物[2], 该基因定位于人第7号染色体的短臂, 含28个外显子[3]。研究证明:表皮生长因子受体家族在众多恶性肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用, 成为目前肿瘤研究新热点之一[4]。EGFR基因突变及其靶向治疗在许多肿瘤中的研究有大量报道, 有关胃癌中EGFR基因突变的研究报道尚较少。本研究旨在通过对检测胃癌EGFR蛋白表达与基因突变状况, 分析蛋白表达与基因突变之间的相关性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 胃癌病例收集
收集2010年3月~2012年5月甘肃省武威肿瘤医院病理科105例胃癌及癌旁组织 (以距离癌组织5cm视为正常组织) 石蜡包埋标本, 整理相关临床资料, 患者术前均未进行任何抗癌治疗。本组105例胃癌中:男性63例, 女性42例, 年龄30~82岁。所有病例均经2名高年资病理医师对HE切片依照国际抗癌联盟制定的分型及分级标准[5]进行组织学确诊。本组105例胃癌中包括印戒细胞癌6例, 粘液腺癌20例, 低分化腺癌48例, 中分化腺癌25例, 高分化腺癌6例。临床分期:0期2例, Ⅰ期24例, Ⅱ期42例, Ⅲ期31例, Ⅳ期6例。
1.1.2 主要试剂与仪器设备
蛋白酶K (Promega公司, 批号130103419H) 购自, PCR试剂盒 (上海捷瑞生物, 批号13040112) , 饱和酚、氯仿、硝酸银、丙烯酰胺、乙酸胺、溴化乙锭、苯甲基磺酰氟等均为国产。凝胶图象成像系统和PCR仪为BIO-RAD公司和PERKIN ELMER公司产品, 垂直电泳仪及水平电泳仪为国产。免疫组化试剂:SP试剂盒 (批号1303189902) 、鼠抗人EGFR单克隆抗体 (批号131105554F) 均购自福州迈新生物技术。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学 (SP法) 染色
标本用10%中性甲醛固定, 石蜡包埋, 切片厚度为4μm, 常规脱蜡。SP法检测EGFR蛋白的表达, 分别设立阳性、阴性和空白对照, 食管鳞癌组织作阳性对照, 肠黏膜组织作阴性对照, PBS代替一抗作空白对照。单克隆抗体1:40稀释。SP法阳性表达以半定量进行分析, 即:阳性细胞数占肿瘤细胞的百分比, 将免疫组化结果分为:<5%:0分;5%~50%:1分;51%~75%:2分;>75%:3分;着色定位于细胞膜和 (或) 细胞浆, 染色成棕黄色视之为阳性, 不着色:0分, 淡黄~黄色:1~2分, 棕褐色:3分;由高年资病理医师阅片后, 将两项分值相加:0~1分 (-) , 2分 (+) , 3~4分 (++) , 5~6 (+++) 。0~1分为阴性表达, 2~6分为阳性表达[11]。
1.2.2 DNA提取及EGFR基因目的片段扩增
用酚-氯仿法提取石蜡组织DNA后分别扩增EGFR基因外显子18~21。引物参照文献设计[6]。
1.2.3 EGFR基因目的片段SSCP-银染及DNA测序
分别对胃癌组织和正常胃组织EGFR基因18~21外显子的PCR扩增产物进行SSCP-银染。染色终止后观察电泳条带的异同, 若条带的位置发生移动, 或出现的条带增加及减少, 提示本样品可能存在突变。为进一步证明是否存在突变及了解突变类型, 将出现异常条带样本的PCR产物进行DNA测序。
1.3 统计学方法
使用SPSS13.0软件包, 因素相关分析采用Pearson等级相关分析, 不同组间率的比较采用χ2检验和Fish精确检验, 以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 胃癌组织EGFR蛋白的表达
105例胃癌患者中, 胃癌组织阳性表达49例, 表达率46.67% (图1) , 癌旁正常胃组织EGFR蛋白阳性表达8例, 表达为7.62% (图2) , 胃癌组阳性表达率明显高于正常组 (χ2=40.48, P=0.000) 。49例阳性表达的胃癌中, 年龄<60岁者18例, ≥60岁者31例。男性30例, 女性19例。印戒细胞癌1例, 粘液腺癌11例, 低分化腺癌28例, 中分化腺癌8例, 高分化腺癌1例。有淋巴结转移36例, 无淋巴结转移13例。0期0例, Ⅰ期7例, Ⅱ期14例, Ⅲ期24例, Ⅳ期4例;EGFR蛋白表达与患者的年龄和性别无相关性;而和临床分期、浸润深度、淋巴结转移及分化程度相关 (表1) 。
2.2 EGFR基因18~21外显子PCR扩增结果
扩增胃癌EGFR基因18~21外显子目的片段, 将PCR产物置于2%琼脂糖凝胶上电泳 (图3) 。
2.3 EGFR基因突变结果
105例胃癌组织中3例出现异常条带, 2例为19外显子 (图4) , 1例为21外显子 (图5) 。DNA测序证明:2例19外显子突变类型一致, 均为 (del E746→A750) 的缺失突变;1例21外显子突变为2573位碱基的点突变 (2573T→G) 。
3 讨论
表皮生长因子受体 (EGFR) 是原癌基因HER-1的表达产物, 长约118kb, 含有28个外显子[7]。EGFR与配体结合后激活了位于胞内区酪氨酸激酶的活性, 引起Ras/MAPK信号传导通路激活, 发挥相关生物学效应[8]。同时, 许多研究都表明EGFR与肿瘤的发生、发展密切相关, 与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及化疗药物的多重耐药等相关。在多种肿瘤中有EGFR蛋白存在过度高表达, 可能与基因扩增或突变有关[4]。主要在非小细胞肺癌、结直肠癌、头颈部鳞癌等肿瘤中有EGFR基因突变, 突变位点大都位于18~21外显子[9,10]。并且酪氨酸激酶抑制剂在非小细胞肺癌靶向治疗中已取得令人满意的疗效。
陈斌等[11]认为:胃癌中EGFR蛋白高表达, 与临床分期、浸润深度、淋巴结转移相关, 不与患者的年龄、性别、分化程度相关。有研究表明EGFR可作为胃癌短期预后的分子生物学指标[12]。Mikihiko Kimura[13]等研究发现, 在胃癌中EGFR高表达, 但是基因突变率低。本研究结果显示:胃癌EGFR蛋白存在高表达, 高于正常组, 有统计学意义 (P<0.01) 。其表达与临床分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移相关 (P<0.05) 而与患者的年龄、性别无相关性 (P>0.05) ;因此, 我们认为EGFR可以作为一个判断胃癌预后的生物学指标。而EGFR基因突变率低, 仅为2.86%。2例为第19外显子, 1例为第21外显子, 21外显子为2573位碱基的点突变 (2573T→G) , 2例第19外显子突变类型一致, 均为 (del E746→A750) 的缺失突变;这两种突变类型在胃癌研究的相关文献中未见报道。本研究显示:胃癌EGFR基因有突变, 但突变率低, 而且蛋白表达与基因突变无相关性。因此认为:EGFR基因突变在胃癌中发生机率小, 可能不参与胃癌的发生过程。胃癌EGFR蛋白过度表达与基因突变无关, 可能与EGFR的持续活化有关。而EGFR基因突变目前尚不能作为筛选酪氨酸激酶抑制剂 (tyrosine kinase inhibitors, TKI) 治疗胃癌的生物学指标, 其临床检测的必要性有待于进一步探讨。
摘要：目的:探讨胃癌表皮生长因子受体 (EGFR) 免疫组织化学表达与EGFR基因突变的关系及其临床意义。方法:对105例手术切除的胃癌组织应用免疫组化方法检测EGFR蛋白表达, 聚合酶链反应-单链构象多态性分析 (PCR-SSCP) 检测EGFR基因突变的情况, 分析EGFR蛋白表达与EGFR基因突变间的相关性。结果:免疫组织化学检测结果显示, 105例胃癌中49例EGFR阳性表达, 表达率为46.67%;而发生EGFR基因突变的仅3例, 突变率为2.86%。EGFR蛋白表达与其基因的突变无相关性 (P>0.05) 。结论:EGFR的蛋白表达与其基因突变无相关性, EGFR基因突变可能不是蛋白表达增高的主要机制, 不能作为筛选EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗胃癌的生物学指标。
关键词：胃癌,EGFR,基因突变,免疫组化
EGFR基因 篇2
关键词：乳腺癌,EGFR,表达,致病机制
众所周知, 乳腺癌是最常见恶性肿瘤之一[1]。近几年来通过采用手术、化疗、放疗、内分泌治疗、靶向治疗等综合治疗手段使乳腺癌的治疗情况得到了很大改善。但大多数患者还是会出现复发或转移、或发现时就已经出现多发转移, 其一般预后较差情况[2]。EGFR (表皮生长因子受体) 是表皮生长因子受体家族中的4个成员之一, EGFR的表达水平与乳腺癌淋巴结转移有关, 可为预测乳腺癌的淋巴结转移提供依据[3,4]。本文为此具体报道了乳腺癌中EGFR基因的表达和致病机制。
1 EGFR的生物学概述
表皮生长因子受体是含有1186个氨基酸的糖蛋白, 具有酪氨酸激酶活性。它在肿瘤的发生、增殖、侵袭过程中都起着重要作用, 传递肿瘤的“生长信号”。EGFR结合相应配体后与邻近的受体形成二聚体, 酪氨酸残基磷酸化而使酪氨酸激酶活化, EGFR再与信号转导途径的其他蛋白反应[5]。研究表明, 在人类约30%的常见肿瘤中, EGFR存在高表达或异常突变, 所以它的表达与疾病的发生和预后密切相关。常见的有EGFR信号系统受体的过量表达和 (或) 受体的改变, 但以前者更为多见[6]。
2 乳腺癌中egfr基因的表达
乳腺癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一, EGFR在正常乳腺组织、乳腺增生组织和乳腺癌组织中皆可有阳性表达, 染色细胞膜和 (或) 胞浆, 呈棕褐色, 但程度有所不同。有研究发现, 如果使EGFR在具有低转移力的人乳腺癌MTC细胞系中高表达, 可以明显增强MTC细胞的转移能力。还有研究乳腺癌原发灶EGFR的PU值与腋淋巴结转移程度相关, 随着淋巴结转移数目的增加, 其EGFR的PU值也越大, 其中≥10个淋巴结转移组的PU值最大, 无淋巴转移组最小, 差异具有显著性, 提示了EGFR对乳腺癌的淋巴转移起着一定的促进作用[7]。目前临床已经使用一些药物通过抑制EGFR和HER2来治疗乳腺癌。拉帕替尼可以同时作用于EGFR与HER2。拉帕替尼联合卡培他滨二线治疗HER2+晚期MBC的疗效已经确定。拉帕替尼、曲妥珠单抗联合化疗或内分泌治疗能明显提高疗效。新的一年中, 有望获得拉帕替尼联合紫杉醇一线治疗HER2+MBC的结果。同时, 拉帕替尼联合其他细胞毒药物、内分泌药物及靶向药物仍是研究热点, 部分结果也将发表。目前世界上将TEACH试验和ALTTO试验作为拉帕替尼治疗早期乳腺癌的临床试验。TEACH试验主要针对HER2+而未使用曲妥珠单抗治疗的患者, 用于检测使用拉帕替尼治疗HER2+乳腺癌患者的疗效。ALTTO试验也是针对HER2+的乳腺癌患者, 比较单用拉帕替尼、曲妥珠单抗及曲妥珠单抗联合拉帕替尼的疗效[9]。同时目前抑制表皮生长因子受体 (EGFR) 与配体的结合已成为临床上抗上皮细胞肿瘤的重要策略之一。而当EGFR抑制剂起到抗肿瘤效果的同时其生理作用导致的皮肤不良反应也接踵而至。
3 乳腺癌中egfr基因的致病机制
目前, EGFR的表达对乳腺癌发生、发展所起的作用仍不清楚, 存在很多争议。进一步了解EGFR表达对乳腺癌发生的调控机制可以为乳腺癌的治疗和预后研究提供生物学依据, 是目前仍需重点研究的科学问题。有研究者选取82名已经发生扩散的乳腺癌患者为研究对象, 对其局部扩散的组织进行取样分析, 研究这些组织中EGFR的表达情况。检测发现其中14人EGFR表达阳性, 而另外68人表达阴性。通过随访, EGFR表达阳性的患者在治疗后存活期达到9年的比例为43.0%, 而EGFR表达阴性的患者则为60.0%[8]。有研究报道EGFR-C与乳腺癌的血管生成和血道转移有关。EGFR-C可结合并激活EGFR-2, 可能有促进肿瘤血管生成的作用[8]。但也有报道EGFR蛋白过表达与乳腺癌局部淋巴结转移无相关性。而部分针对EGFR为靶向药物的研究已经进入临床试验阶段。有研究认为, EGFR过表达的乳腺癌MB-231细胞和HER-2过表达的KPL-4细胞比其他细胞对靶向EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂ZDl839更敏感[10]。在前瞻性研究中, 相比其它乳腺癌, IHC检测更多的化生癌过表达EGFR。因此, 患这种侵袭性乳腺肿瘤的病人对ZD1839的治疗更敏感, 这对将来的抗癌研究有很强的指导意义[11]。
EGFR基因 篇3
1 材料与方法
1.1 材料:
收集包头市各医院蒙古族肺腺癌患者石蜡包埋组织标本53例, 其中男性33例, 女性22例;年龄41~75岁, 中位年龄59岁。汉族肺腺癌患者石蜡包埋组织标本55例, 其中男性39例, 女性16例;年龄38~76岁, 中位年龄58岁。
1.2 方法
1.2.1 标本采集与DNA提取:
石蜡包埋标本中肿瘤组织占标本总体积的70%, 采用病理石蜡切片样品, 切取10张石蜡包埋标本切片, 每张面积>10 mm×10 mm、厚度5~10μm, (所用含有肿瘤组织的蜡块切片保存时间不超过两年) 。常规石蜡切片, 烤干后二甲苯脱蜡, 无水乙醇浸泡再流水冲洗, 干燥后显微切割去除坏死组织, 转组织于Eppendorf管中, 加消化缓冲液及蛋白酶K溶液, 然后60℃水浴8~16 h, 离心后取上清, 加酚/氯仿 (1∶1) 混匀, 离心取上清, 加无水乙醇, -20℃放置后再离心弃上清, 70%乙醇洗涤沉淀, 室温晾干后用dd H2O重新溶解沉淀, 取1μL测定浓度和纯度, 其余-80℃保存。
1.2.2 PCR扩增和测序:
实时荧光PCR扩增采用ARMS (amplification refractory mutation system, ARMS) 方法进行PCR扩增, 检测EGFR基因外显子18、19、20和21突变。用厦门艾德生物医药科技公司EGFR基因突变检测试剂盒进行检测, 实验具体操作步骤参照试剂盒说明书进行操作。采用Strata Gene MX3000P实时PCR仪进行扩增, 每次检测样品包括1个阳性质控品、1个NTC对照。如果Ct值为0或Ct值>30, 则实验结果判为野生型。所述荧光PCR的反应条件:95℃预变性5 min, 1个循环;95℃变性25 s, 64℃退火20 s, 72℃延伸20 s, 15个循环;93℃变性25 s, 60℃退火35 s, 72℃延伸20 s, 31个循环。
1.3 统计学分析:
采用SPSS 13.0统计软件进行χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
检测108例肺腺癌的样本, 包括53例内蒙古包头市蒙古族和55例汉族肺腺癌的样本。有46例EGFR基因突变, 总突变率为42.59%。其中蒙古族突变22例, 突变率为41.51%;汉族突变24例, 突变率为43.64%。见表1。
其中外显子18检测到EGFR基因突变1例, 为汉族;外显子19检测到EGFR基因突变34例, 其中蒙古族16例、汉族18例;外显子20检测到EGFR基因突变2例, 其中蒙古族1例、汉族1例;外显子21检测到EGFR基因突变9例, 其中蒙古族5例、汉族4例。外显子19和外显子21同时EGFR基因突变4例, 其中蒙古族2例、汉族2例。见表1。
在外显子19所检测到34例EGFR基因突变中共有8种不同的突变形式, 最常见核苷酸缺失起始位2235为14例, 其中蒙古族为6例, 汉族为8例;缺失起始位2238为5例, 其中蒙古族为2例, 汉族为3例。而核苷酸缺失终止位2249为9例, 其中蒙古族为5例, 汉族为4例。在外显子21所检测到9例EGFR基因突变中, 其位点为2573位的T由G取代, 导致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸变为精氨酸 (CTG→CGG, L858R) 的为8例, 蒙古族为3例, 汉族为5例, 二者的突变率无明显差异。
3 讨论
表皮生长因子 (EGF) 及其位于细胞膜上的受体EGFR是一种跨膜蛋白质, 是酪氨酸激酶erb B/HER家族的一个成员, 主要由细胞外的结合区, 跨膜区及酪氨酸激酶组成的细胞内区等3个区域组成。EGFR的异常可导致其下游信号途径的异常激活, 最终促使细胞的转化、增殖、抵抗细胞凋亡, 与肿瘤的发生、发展密切相关[3]。因此, EGFR成为肿瘤治疗的重要靶分子。EGFR-TKI可阻断EGFR诱导的体外肿瘤细胞的生长, 用于非小细胞肺癌的治疗。非小细胞肺癌对EGFR-TKI的敏感性与肺癌组织EGFR基因的突变呈密切相关。对药物敏感的突变位点主要集中在外显子18~21, 约90%的突变集中在第19和第21外显子, 通过结构分析表明, 该区域的突变改变了EGFR结构, 影响多种蛋白激酶的自身调节[4,5]。
大规模临床试验已表明酪氨酸激酶抑制剂gefitinib]和erlotinib[6,7,8]在晚期非小细胞肺癌中的疗效和生存上的优势。文献报道[9], 不同人种之间EGFR突变率不尽相同, 东亚人群EGFR突变率30%左右, 高加索人10%左右。Li等[10]通过对202例肺腺癌患者发现, 我国汉族人的肺腺癌EGFR突变率为75.3%。单莉等[11]通过对68例维吾尔族和70例汉族肺腺癌样本检测发现维吾尔族肺腺癌EGFR突变率明显低于我国汉族EGFR基因突变。而本研究显示, 内蒙古地区蒙古族肺腺癌EGFR突变与汉族肺腺癌EGFR突变表达无明显差异, 二者同样适用EGFR-TKI治疗。
肺癌组织EGFR基因的突变中约90%的突变集中在第19和第21外显子。本研究45例EGFR基因突变中检测到33例外显子19基因突变, 共有8种不同的突变形式, 最常见核苷酸缺失起始位2235为14例, 其中蒙古族为6例, 汉族为8例, 缺失起始位2238为6例, 其中蒙古族为3例, 汉族为3例, 而核苷酸缺失终止位2249为11例, 其中蒙古族为5 例, 汉族为6例, 二者均无统计学差异。在外显子21所检测到9例EGFR基因突变中, 其位点为2573位的T由G取代, 导致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸变为精氨酸 (CTG→CGG, L858R) 的为8例, 蒙古族为3例, 汉族为5例, 二者的突变率无明显差异。
EGFR基因 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择本院2012年1月~2013年6月收集的非小细胞肺癌手术后的肺癌组织200例作为研究对象, 男124例, 女76例, 平均年龄 (56±6.3) 岁, 其中腺癌患者64例, 鳞癌患者73例, 腺鳞混合型癌患者41例, 其他癌患者22例。
1.2方法
对肺癌组织中的DNA采用DNA聚合酶进行PCR扩增, 反应液里含有DNA4μl, 缓冲液5μl×10, d NTP5μl, 2.5 mmol/L, 上游和下游引物均1μl, 20 mmol/L, DNA聚合酶1μl, 使用DEPC-H2O补充至50μl, PCR反应条件为5 min, 95℃变性, 随后在95℃、72℃和57℃进行40个循环, 每个循环30 s, 随后在72℃时延伸7 min, 扩增产物经过1.6%, 100 V的琼脂糖凝胶电泳30 min, 随后进行EB染色摄片, 将阳性扩增条带经柱层析分离纯化后, 在ABI 3700型的DNA序列分析仪上进行基因测序。
1.3 统计学方法
应用SPSS11.0软件进行统计分析, 计数资料用率表示, 采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺癌突变和扩增情况
非小细胞肺癌中EGFR基因总的突变和扩增数为68例, 突变和扩增率为34%。
2.2 不同性别中的基因突变和扩增情况
观察发现, 女性肺癌患者的EGFR基因突变和扩增情况要多于男性肺癌患者, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。详情见表1。
2.3 分化不同肺癌中基因突变和扩增情况
非小细胞肺癌中EGFR基因突变和扩增情况在腺癌和腺鳞混合癌发生的情况较多。详情见表2。
注:男性与女性比较, aP<0.05
3 讨论
目前对于治疗肺癌的有效措施有限, 治疗肺癌的有效率较低, 虽然化疗和放疗的效果较好, 但是给予肺癌患者的负担太大, 甚至带来严重的毒副作用, 所以新的有效治疗方法是临床研究的方向, 近些年, 医学界的专家把重点放在了分子靶向治疗上, 尤其是其中的EGFR为靶点的分子靶向治疗, 希望可以从中寻找到治疗非小细胞肺癌的关键, 通过上述研究得出男性肺癌患者的外显子19突变和扩增例数为21人, 外显子21突变和扩增例数为11人, 两种外显子的突变和扩增占男性总人数的25.8%, 而女性肺癌患者的外显子19突变和扩增例数为28人, 外显子21突变和扩增例数为8人, 两种外显子的突变和扩增占女性总人数的47.4%。与董强刚, 韩宝惠, 黄进肃等[3]的176例非小细胞肺癌的EGFR基因突变分析研究的结果基本一致, 为临床提供理论依据。EGFR蛋白属于Erb B家族, 具有受体酪氨酸激酶活性[4]。编码酪氨酸激酶区的是第19~21号外显子[5]。所以通过聚合酶链反应扩增EGFR中的19~21号外显子, 在使用DNA测序法检测基因突变和扩增的情况, 是可以作为医务工作者治疗肺癌的病理指标, 值得进一步探讨研究。
摘要：目的 探讨非小细胞肺癌中EGFR基因突变和扩增的检测方法及其临床意义。方法 收集200例肺癌组织, 通过聚合酶链反应扩增DNA直接测序法检测肺癌DNA中EGFR基因突变和扩增, 重点是检测肺癌中EGFR外显子19~21在性别不同中的突变和扩增情况以及在分化不同的癌症中的突变和扩增情况, 同时分析其在临床中的意义。结果 经聚合酶链反应扩增DNA直接测序法检测发现, 非小细胞肺癌中EGFR基因总的突变和扩增数为68例, 突变和扩增率为34%, 肺癌中EGFR外显子20无明显突变和扩增情况发生, 外显子19突变和扩增情况最多有49例, 占总数的72.1%, 外显子21突变和扩增情况较多有19例, 占总数的27.9%, 其中女性肺癌患者的EGFR基因突变和扩增情况多于男性肺癌患者, 同时基因突变和扩增在腺癌和腺鳞混合癌中发生情况最多, 其他次之。结论 非小细胞肺癌中EGFR基因突变和扩增多发生于女性肺癌患者, 其中又以外显子19和21发生较多, 多发生伴有腺癌和腺鳞混合癌的情况下, 同时聚合酶链反应扩增DNA直接测序法技术稳定可靠, 为临床研究提供有效的依据。
关键词：非小细胞肺癌,基因突变,基因扩增
参考文献
[1]赵静, 朱焱, 张丽, 等.非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变检测及其临床意义.中华病理学杂志, 2011, 40 (10) :671-674.
[2]刘红雨, 李颖, 陈钢, 等.187例非小细胞肺癌中EGFR基因突变和扩增的检测及其临床意义.中国肺癌杂志, 2009, 12 (12) :1219-1228.
[3]董强刚, 韩宝惠, 黄进肃.等.176例非小细胞肺癌的EGFR基因突变分析.中华肿瘤杂志, 2006, 28 (9) :686-690.
[4]姜斌, 朱冠山, 刘峰.等.中国人非小细胞肺癌EGFR基因突变的研究.上海第二医科大学学报, 2005, 25 (11) :1148-1150.
EGFR基因 篇5
1材料与方法
1.1材料
C6细胞购于上海美轩公司;明胶购于美国BBI公司;PEG购于美国DOW公司;适配体TTA1(CCT-GCACTTGGCTTGGATTTCAGAAGGGAGACCC)、Tat
(KYGRRRQRRKKRGC)多肽购于上海生工公司。X-tremeGene转染试剂购于北京索莱宝公司;Trizol购于美国Invitrogen公司;逆转录试剂盒以及Real-time PCR试剂盒购于日本Takara公司;抗体购于美国Abcam公司;CCK-8试剂盒购于天津百萤生物公司;ANNEXINV/PI试剂盒购于北京拜尔迪生物公司。
1.2方法
1.2.1 SiRNA的设计与合成根据Genbank提供的鼠EGFR mRNA序列(NM＿031507.1),设计靶向EGFR mRNA的序列为5'-GGAATTATGACCTTTCCTT-3',阴性对照序列(Scramble)为5'-TTCTCCGAACGTGT-CACGT-3',委托上海吉玛公司合成相应siRNA。
1.2.2 TTAl-Tat-PEG-GS NPs/si RNA的结合及结合比例选择参考Wang等[17]及张龙等[18]方法合成GS NPs,依次修饰上PEG、TTA1、Tat,得到TTA1-TatPEG-GS NPs,再结合siRNA。琼脂糖凝胶电泳检测TTA1-Tat-PEG-GS NPs与siRNA的结合能力:两者分别以20:1、40:1、60:1、80:1、100:1的质量比制备悬液,均匀混合后上样至琼脂糖凝胶开始电泳,电压80 V,时间20 min。分别取上述TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA复合物悬液置于表面电位仪上,测定表面粒径、分散系数和电位。
1.2.3 C6细胞的转染实验分四组:Control组(正常培养的C6细胞),TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-3cr组(TTA1-TAT-PEG-GS NPs转染Scramble序列),TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组(TTA1-TatPEG-GS NPs转染EGFR干扰序列)及X-tremeGene/siRNA-FGFR组(X-tremeGene Reagent转染EGFR干扰序列)。取对数生长期细胞1.0×105/孔接种于6孔板中,待细胞贴壁达0.50融合度后,TTAl-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组及TTAl-Tat-PEG-GS NPs/siR-NA-EGFR组细胞更换无血清培养基,分别加入TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scramble及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR复合物(根据方法“1.2.2”结果确定结合比例),共培养10 h更换新鲜培养基继续培养。X-treme Gene/siRNA-EGFR组转染严格按照X-tremeGene说明书中操作指南进行。
1.2.4 Real-time PCR检测C6细胞EGFRmRNA水平转染48 h后,分别消化收集各组细胞,用Trizol试剂提取细胞总RNA,并按照TaKaRa试剂盒说明进行操作。实验均重复3次(扩增EGFR的引物为:上游5'-GCCACAGGTTCCGAGATGAA-3',下游5'-CCACG-TAGTTTCTGGGGCAT-3'。用β-actin作内参,其引物序列为:上游5'-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3',下游5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3')。
1.2.5 Western blot检测C6细胞EGFR蛋白表达水平转染72 h后,分别消化收集各组细胞,离心弃去上清后加入RIPA细胞裂解液以及蛋白酶抑制剂PMSF。置于冰上30 min,4℃、12 000 r/min离心15 min,取上清测定蛋白浓度。取50μg蛋白加入到上样缓冲液中,经100℃金属浴加热5 min变性后用SDS-PAGE电泳。常规转膜及封闭后,分别加入抗EGFR或β-actin的一抗,4℃育过夜。TBST洗脱10 min×3次,加入二抗室温孵育1 h,再用TBST洗脱10 min×3次。硝酸纤维素膜加入显色液后,ECL化学发光显像,图像分析仪分析结果。实验均重复3次。
1.2.6 CCK-8实验检测C6细胞增殖能力转染48 h后,分别消化收集各组细胞,调整密度至5×104细胞/mL,各取100μL细胞悬液/孔加入到5个96孔板中,每组设3个复孔。24 h后,取出1个96孔板,往每孔中加入10μL CCK8试剂,37℃培养箱中继续培养4 h,用酶标仪测定450 nm处吸光值。每隔24 h采用同样的方法取1个96孔板检测,连续测5 d。
1.2.7流式细胞术检测C6细胞的凋亡转染48 h后,分别消化收集各组细胞,调整密度至1×106细胞/mL,取0.5 mL细胞悬液,室温1200 r/min离心3 min,去上清后再用200μL预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬。加入10μL AnnexinV-FITC,室温避光反应15 min,室温1000 r/min离心5 min,洗涤1次,用500μL 1×结合缓冲液重悬细胞,加入10μL碘化丙啶(PI),4℃避光孵育30 min,用流式细胞仪检测分析凋亡情况。实验均重复3次。
1.3统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行数据处理,计量资料采用均数±标准差()表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 TTA1-Tat-PEG-GS NPs与siRNA的结合比例
当TTAl-Tat-PEG-GS NPs与siRNA的质量比为100时,TTAl-Tat-PEG-GS NPs可将siRNA完全结合(图1)。TTAl-Tat-PEG-GS NPs/siRNA的表面电位随着TTA1-Tat-PEG-GS NPs与siRNA质量比的增高而增加,同时粒径相应减小(表1)。TTAl-TatPEG-GS NPs/siRNA以100:1的质量比进行结合时,复合物粒径较小,表面电位较高,可完全结合siRNA。
2.2 Real-time PCR检测C6细胞中EGFR mRNA的相对表达量
Control组、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组、TTA1-Tat-PEC-GS NPs/siRNA-ECFR组及X-tremeGene/siRNA-EGFR组EGFR的mRNA相对表达量分别为(1.005±0.057)、(1.002±0.076)、(0.287±0.022)及(0.249±0.036)(图2)。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组表达水平较Control组及TTA1-TatPEG-GS NPs/siRNA-Scr组明显下调(P<0.01),而与X-tremeGene/siRNA-EGFR组差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3 Western blot检测C6细胞中EGFR蛋白的表达
TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组蛋白的表达水平较Control组及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组明显下调(P<0.01),抑制率约为0.70,而与X-tremeGENE/siRNA-EGFR组差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。
2.4 C6细胞增殖的检测
TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-ECFR R组细胞的增殖速度比Control组及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组显著减慢(图4)。从第3天开始TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组与Control组及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组之间差异有统计学意义(P<0.05),并随时间的延长差异增加(P<0.01)。而TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组与X-tremeGene/siRNA-EGFR组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
2.5 C6细胞凋亡的检测
Control组、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组、TTA1-Tat-PEG-GSNPs/siRNA-EGFR组及X-tremeGene/siRN A-EGFR组细胞早期凋亡率分别为(1.61±0.25)、(1.84±0.30)、(9.8 1±0.47)及(10.40±0.40)(图5)。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组凋亡率较Control组及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组明显增加(P<0.01),而与X-tremeGene/siRNA-EGFR组差异无统计学意义(P>0.05)。
3讨论
胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,其预后较差,致残率及病死率都很高[19]。胶质瘤发生与发展伴有多种基因改变,因此基因治疗提供了一种新的治疗策略[20]。在此研究的基础上,本研究提出一种由TTAl-Tat-PEG-GS NPs结合siRNA与胶质瘤细胞mRNA相互作用的模式。这是一种将具有高特异靶向胶质瘤的TTA1及Tat多肽同时作为靶向基团,连接至GS NPs纳米材料上,并对其进行PEG修饰,设计成新型的TTA1-Tat-PEG-GS NPs基因载体。
为了研究新型基因载体TTA1-Tat-PEG-GS NPs结合siRNA是否能影响胶质瘤细胞的生长和生存,本研究利用TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR转染C6细胞后,通过Real-time PCR、Western blot分别在mRNA水平与蛋白水平检测了其对EGR的干扰效果,随后通过CCK-8实验检测了细胞的增殖情况,并用流式细胞术检测了细胞的凋亡情况。结果显示:TFA1-Tat-PEG-GS NPs结合siRNA-EGFR转染C6细胞能够有效干扰ERGF的表达,EGFR表达下调后可明显降低C6细胞的增殖能力,并导致细胞凋亡率上升。
总之,本研究建立了一种新的基因载体TTA1-Tat-PEG-GS NPs,它具有体外转染细胞的能力,并具备靶向传递能力以及穿膜功能,这使TTA1-TatPEG-GS NPs有可能成为一种独特的基因传递载体,在胶质瘤的基因治疗中具有应用潜力。鲜见有文献报道以TTA1、Tat、PEG修饰的GS NPs作为基因传递系统在胶质瘤治疗的体内外实验中使用。然而,这种应用目前只用于体外胶质瘤细胞的siRN A传递,还没有用于体内胶质瘤动物模型。针对裸鼠原位胶质瘤模型的siRNA传递的更多研究是笔者正在起步的工作。
摘要：目的 探讨TTA1、Tat、聚乙二醇(PEG)修饰的明胶硅氧烷纳米粒子(GS NPs)结合siRNA-EGFR转染C6细胞,抑制其表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响。方法 根据鼠EGFR的mRNA序列设计合成siRNA-EGFR以及阴性对照siRNA-Scr(无意义序列)。TTA1-Tat-PEG-GS NPs通过静电作用结合siRNA。实验分4组:Control组、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组及X-tremeGene/siRNA-EGFR组。除Control组外,其余三组均在体外对C6细胞进行转染。Real-time PCR、Western blot分别检测细胞EGFR mRNA及蛋白表达情况;CCK-8法、流式细胞仪分别检测细胞增殖和凋亡情况。结果 与Control组及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组比较,TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组在体外细胞水平上能有效抑制C6细胞EGFR mRNA及蛋白的表达(P<0.01),同时抑制C6细胞的增殖(P<0.05或P<0.01)并促进其凋亡(P<0.01)。此外,X-tremeGene/siRNA-EGFR组和TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组在下调C6细胞EGFR水平、抑制细胞增殖及促进细胞凋亡方面差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TTA1-Tat-PEG-GS NPs可能成为一种新型的基因治疗载体,为胶质瘤基因治疗的进一步研究提供理论依据。
EGFR基因 篇6
1 材料与方法
1.1 病例资料
自2008年10月-2010年6月,在本院收治的IIIb～Ⅳ期肺腺癌患者42例,其中男性17例,女性25例,年龄30～83岁,<40岁者2例，40～49岁者10例，50～59岁者10例，60～69岁13例，≥70岁者7例，平均年龄(59.3±10.7)岁，中位年龄62岁。组织类型全为肺腺癌，所有患者均在知情同意后采集血样。
1.2 EGFR基因检测
经前臂静脉采集外周血液约5 m L,4℃放置过夜后离心分离血清。血清游离DNA提取后检测，检测内容：EGFR基因的外显子19(E19）和外显子21(E21）；检测方法：突变富集-液相芯片联用法；主要材料：surplexTM肿瘤靶向治疗靶标检测液相芯片（系列）；主要设备：液相芯片阅读仪；检测单位：广州益善生物技术有限公司。
1.3 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKi）的治疗
治疗方案是口服吉非替尼250 mg/d或厄罗替尼150mg/d，直至病情进展。治疗开始后前3个月每月评估疗效,随后每2个月评估1次。疗效评判标准依据实体肿瘤疗效评估指南。
1.4 统计学方法
统计学处理采用SPSS 13.0软件进行方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 42例肺腺癌患者外周血游离DNA的EGFR基因突变和临床情况见表1,总体EGFR基因检测结果：突变率47.6%（20/42例），E19缺失28.1%（11/42例），E21突变35.7%（15/42例）。42例中有11例长期大量吸烟（>400年支），突变型患者中仅3例，野生型有8例。
2.2 20例EGFR基因突变者，女性患者11例，占55.0%，服用TKIs疗效RR 60.0%(12/20)，DCR 85.0%(17/20)，TTP 72～637天，中位TTP172.5天；22例野生型服用特罗凯疗效RR 13.6%(3/22例)，DCR36.4%(8/22例)，TTP 36～221天，中位TTP 108天。组间ORR、DCR、中位TTP比较,差异存在统计学意义。见表2。
3 讨论
在晚期NSCLC的一线化疗后的总生存期（OS）是7.4～10.3个月，1年生存率为26%～43%，近年来疗效没有得到进一步的提高，因此在临床上需要一些新的治疗策略来改善患者的生存。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）的应用，为肺癌的治疗带来了新的希望。大量的临床研究证实，小分子TKIs药物（吉非替尼或厄洛替尼）对EGFR突变患者疗效较好。EGFR突变主要指19外显子的缺失和21外显子的点突变，占EGFR突变的绝大多数。IPASS研究、厄洛替尼西班牙SLCG研究、SATURN研究结果显示，EGFR突变的NSCLC患者在生存和缓解率获益令人印象深刻，毋庸置疑，EGFR突变是EGFR-TKIs个体化治疗的第一个明确靶点，也是NSCLC治疗的新里程碑。
但如何获取更准确，更简单易行的检测手段，一直是探讨的热点，近年国内外开始尝试血清循环DNA检测EGFR基因突变。业已证明,实体肿瘤(包括肺癌)患者的血循环中存在游离的肿瘤DNA,其来源主要是肿瘤组织中癌细胞凋亡后,癌细胞内的DNA释放入人体外周血,经癌组织来源的循环DNA中基因变异与循环血中DNA相一致,且肿瘤患者外周血游离DNA含量比正常健康人增高10倍[1,2]。EGFR基因突变是肿瘤特异性的体细胞遗传改变,这类突变基因仅存在于癌细胞中,体内所有正常细胞均属于野生型[3]。因而通过检测血清游离DNA的EGFR基因,可以筛选到这类肿瘤特异性的药效评估标志,从而为临床用药提供依据。最近,Kimura等[4]曾对27例Ⅲb～Ⅳ期非小细胞肺癌患者进行了血清EGFR检测,共检出突变13例(48.1%),吉非替尼的客观有效率为53.8%(7/13例),病情控制率为84.6%(11/13例),中位无进展生存时间为200 d,中位生存时间为611 d。而对EGFR野生型肺癌,吉非替尼的客观有效率为14.3%(2/14例),病情控制率为42.9%(6/14例),中位无进展生存时间为46 d,中位生存时间仅为232 d,2组间差异极为显著(P<0.01)。
本研究专门选择肺腺癌患者42例，血样中检出EGFR突变20例,突变率为50.0%,16例EGFR基因突变者进行TKIs靶向治疗,客观有效率为60.0%,疾病控制率为85.0%；TTP 72～637天，中位TTP172.5天。22例野生型TKIs治疗RR 13.6%，DCR 36.4%；TTP 36～221天，中位TTP 108天。突变型与野生型在客观疗效和疾病控制和中位TTP方面比较，差异有统计学意义。提示：依据外周血游离DNA中EGFR基因突变检测结果进行选择性靶向治疗,可以为部分肺腺癌患者提供了指导作用，尤其对于不耐受化疗兼无法获取组织学检测的腺癌患者，或多程放化疗后尚未使用TKi的肺腺癌病人。尽管尚存在一些需要解决的问题，但是由于晚期肺腺癌的组织难于获取，故外周血游离DNA中EGFR基因突变检测仍不失是一种临床治疗中可资参考的补充手段。而且血样采集方便，患者易于接受，该项技术值得临床应用。
参考文献
[1]张华,张国玲,许凯黎,等.卵巢癌血清3号染色体短臂基因杂合性丢失的研究[J].中华妇产科杂志,2002,37(5):298～300.
[2]BREMNES RM,SIRERA R,CAMPS C.Circulating tumor derived DNA andRNA markers in blood:a tool for early detection,diagnostics,and follow up[J].Lung Cancer,2005,49(1):1-12.
[3]董强刚,黄进肃,黄建,等.肺癌靶向治疗研究进展和我国肺癌的EGFR基因突变概况[J].肿瘤,2005,25(6):625-634.