结冷胶种子（共3篇）
结冷胶种子 篇1
结冷胶 (gellan gum) 是美国Kelco公司20世纪80年代继黄原胶之后开发的食品微生物多糖之一, 某些特性优于黄原胶。美国FDA和欧洲等国家都批准了结冷胶在食品中的应用, 1996年中国也批准了结冷胶作为食品添加剂在食品中的应用[1]。相对于其他胶体, 结冷胶具有良好的风味释放性、较高的热稳定性、在口中易融化、透明度高、凝胶的时间和温度可以调控、凝胶不易受p H值影响、产品稳定、多样的质构特性等优点[2]。2005年之前, 我国的结冷胶市场几乎完全被美国凯可公司垄断, 同时高昂的市场价格限制了它在国内的广泛应用[3]。我国科研院所从1995年起开始研究结冷胶发酵生产技术, 1997年完成中试鉴定[4]。目前, 国内外学者针对结冷胶的生物合成开展了很多研究, 主要集中在培养基配方和发酵工艺条件的优化方面, 也有研究者在对结冷胶发酵动力学和代谢途径进行分析的基础上, 改进生产工艺, 提高结冷胶产量[5,6,7,8]。但昂贵的生产成本, 造就了昂贵的产品, 这也是为何在我国结冷胶生产企业不断增加而结冷胶价格依然居高不下的原因。该文在优化结冷胶种子配方的基础上, 对氮源做了进一步的调整, 通过依次减去配方中的氮源进行试验, 并利用廉价的氮源代替价格昂贵的牛肉膏等物, 最终得到了一个只用一种廉价氮源进行种子培养的配方, 在不影响发酵结果的基础上, 为生产节约了大量的成本。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌种和试剂。
试验用菌种为结冷胶菌种G7.5-1 (实验室保藏) ;主要试剂有牛肉膏、鱼蛋白胨、豆粉 (自制) 、蔗糖、葡萄糖、KH2PO4、KCl、Ca CO3, 试验所用的试剂均为分析纯。
1.1.2 培养基。
种子培养基的成分分别为葡萄糖、Na Cl、鱼蛋白胨、牛肉膏, 其含量分别为1.0%、10.5%、0.6%、0.3%。p H值为7.0~7.2。发酵培养基的组成成分为蔗糖、氮源鱼蛋白胨、无机盐KH2PO4和Ca CO3, 含量分别为2.75%、0.25%、0.10%、0.12%。
1.1.3 仪器。
电子天平 (精确到0.001 g) , 电子显微镜, CX21FS1 (日本OLYMPUS公司生产) ;DV-II型粘度计 (美国Brook field) , LS-30型立式压力蒸汽灭菌器 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂) , 微生物发酵罐 (江苏科海) , HIQ-150型生物摇床 (武汉江城生物科技有限公司) ;精密酸度计 (PHS-3C型, 上海大普仪器有限公司) ;均质机, 质构仪 (BROOK FIELD CT3型) 等。
1.2 试验方法
1.2.1 培养方法。
(1) 种子液制备:种子采用二级培养, 一级种子为原配方, 二级种子为改变组分后的配方。一级种子的制备方法为取本试验室保存的结冷胶菌种菌悬液0.5 m L, 接入装有100 m L种子培养基的250 m L三角瓶中, 置恒温摇床培养, 转速260 r/min, 温度 (30±1) ℃;二级种子的制备为将培养好的一级种子接入装有100 m L种子培养基的250m L三角瓶中2.5 m L, 置恒温摇床培养, 转速260 r/min, 温度 (30±1) ℃, 过程中观察记录种子培养时间以及菌体形态。 (2) 发酵摇瓶培养:取5 m L活化好的种子液, 接入装有100 m L发酵培养基的500m L三角瓶中, 转速260r/min, 温度 (30±1) ℃, 摇床培养。 (3) 中试培养:10 L种子罐装培养基8 L, 接种量1% (V/V) , p H值7.00~7.20, 温度 (30±1) ℃, 调节转速和空气流量控制溶氧, 过程添加20%Na OH溶液控制p H值;50 L发酵罐装培养基为40 L, 接种量5% (V/V) , p H值7.00~7.20, 温度 (30±1) ℃, 调节转速和空气流量控制溶氧, 过程添加20%Na OH溶液控制p H值。
1.2.2 测定方法。
还原糖测定 (GB50097-85) ;发酵液粘度测定:除有说明外, 在25℃、4号转子、30 r/min条件下测定;胶体收率测定:采用乙醇沉淀法。
2 结果与分析
2.1 豆粉代替鱼蛋白胨试验结果
种子培养基各组分不变, 使用1.0%豆粉代替鱼蛋白胨进行培养, 试验结果见表1。可以看出, 豆粉代鱼蛋白胨配方, 无论从培养时间还是从发酵结果来看, 结果都很好。
2.2 只用牛肉膏的试验结果
将种子培养基中的鱼蛋白胨去掉, 其余各组分不变, 进行培养, 试验结果见表2。可以看出, 只加牛肉膏配方, 无论培养时间还是发酵结果, 结果都很好, 并且种子液培养到11h时依然有絮状物存在, 不利于后续试验进行。
2.3 只加鱼蛋白胨的试验结果
将种子培养基中的牛肉膏去掉, 其余各组分不变, 进行培养, 试验结果见表3。可以看出, 只加鱼蛋白胨的配方, 无论从培养时间还是从发酵结果来看, 结果都和原配方基本一致。
2.4 只加豆粉的试验结果
将种子培养基中的牛肉膏与鱼蛋白胨去掉, 只加入1.0%豆粉, 其余各组分不变, 进行培养, 试验结果见表4。可以看出, 只加豆粉的配方发酵结果并不好, 这可能和配方中总氮的含量有关。
2.5 几种配方的对比试验
将原配方、只加蛋白胨配方、只加豆粉的种子配方进行对比试验, 同时根据氮含量换算将豆粉的配比改成2.4%, 试验结果见表5。可以看出, 增加用量后的豆粉配方的试验结果和其他2个配方相比不相上下, 甚至比只加鱼蛋白胨结果要好, 如果再从成本方面考虑的话, 那么只加豆粉的结果最好。
2.6 50 L发酵罐中试试验结果
利用摇瓶优化得到的种子配方在50 L发酵罐中发酵生产, 发酵罐搅拌速度120~250 r/min, 温度30℃, p H值控制在7.0~7.2, 如有必要加入氢氧化钠溶液调整, 发酵结果见表6。可以看出, 改变配方后的种子对发酵的结果完全没有影响, 而且在种子的培养过程中由于溶氧和p H值的有效调控, 种子罐种子的培养时间可以缩短1~2 h, 有效地提高了生产效率。
3 结论与讨论
通过多次试验得出的结冷胶种子的最佳生产配方为:一级种子配方葡萄糖1.0%, Na Cl 0.5%, 鱼蛋白胨0.6%, 牛肉膏0.3%;二级种子配方为:葡萄糖1.0%, Na Cl 0.5%, 豆粉2.4%, 此配方对最终的发酵结果完全没有影响, 并且大大的降低了结冷胶生产成本。仅鱼蛋白胨和牛肉膏2项, 每年就可节约成本40余万元。
摘要：通过优化结冷胶种子的配方, 在不影响发酵结果的前提下, 得到了能有效降低成本的种子配方。一级种子配方为:葡萄糖1.0%, NaCl 0.5%, 鱼蛋白胨0.6%, 牛肉膏0.3%;二级种子配方为:葡萄糖1.0%, NaCl 0.5%, 豆粉2.4%。
关键词：结冷胶种子,配方优化,成本降低
参考文献
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[6]HUANGJIN, JIANGSHU, XUXIAO-QIN, et al.Effects of car-bon/nitrogen ratio, Dissolved Oxygen And Impeller Type On Gellan Gum Production In Sphingomonas paucimobilis[J].Ann Microbiol, 2012, 62 (1) :299-305.
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结冷胶发酵工艺优化 篇2
目前已商业开发应用的微生物多糖主要有黄原胶(Xanthan gum)、结冷胶(Gellan gum)、凝胶多糖(Curdlan)、葡聚糖(Dextran)、茁霉多糖(Pullulan)、小核菌葡聚糖(scleroglucan)等,但被国际食品立法机构允许用作食品添加剂的微生物多糖迄今为止还只有黄原胶和结冷胶2种[2]。其中结冷胶是美国Kelco公司继黄原胶之后开发成功的又一种微生物多糖,其凝胶性能比黄原胶更为优越,如凝胶形成能力强、透明度高、耐酸耐热性能好、稳定性强、具有良好的热可逆性等。结冷胶不仅是一种凝胶体,而且也是一种具有纤维性状、粘弹特性和良好风味释放性的多糖聚合体[3]。
结冷胶过去称多糖PS-60,1988年被日本政府批准作为食品添加剂,1992年被美国FDA许可应用于食品饮料中,欧共体于1994年将其正式列入食用安全代码(E-418)表中,我国在1996年批准其作为食品增稠剂、稳定剂使用(GB2760—1996)。结冷胶已作为乳化剂、悬浮剂、增稠剂、稳定剂,胶凝剂、成膜剂和润滑剂等广泛应用于食品、制药等多个领域,是目前最有发展前景的微生物多糖之一[4]。国际市场上美国Kelco公司一枝独秀,国内浙江中肯、河北鑫合、浙江天伟等公司进行了工业化生产,因而研究开发结冷胶高水平菌种、发酵、提取、精制、复配工艺[5]具有重要现实意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种。伊乐假单胞菌(Pseudomonas elodea),中科院微生物所保藏。
1.1.2 仪器设备
TU-1810PC型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);NHL-Ⅲ型全自动发酵系统(南京金昶电子);DZKW-4型电子恒温水浴锅(上海科析试验仪器厂);SCT-3A快速水分测定仪(湘仪天平仪器厂);AB104-N型电子天平[Mettler Toledo Instr.(Shanghai)Ltd.];DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司);DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)等。
1.1.3 培养基。
固体种子培养基:蔗糖2.5%,蛋白胨0.5%,牛肉膏0.3%,酵母膏0.1%,琼脂1.8%,蒸馏水配制,pH值7.0,113℃灭菌20 min,分别摆斜面、倒平皿。
母瓶培养基:蔗糖2.5%,蛋白胨0.5%,牛肉膏0.3%,酵母膏0.1%,蒸馏水配制,pH值7.0,113℃灭菌20 min。
种子罐培养基:液糖(按葡萄糖计)2.0%,酵母膏0.2%,Na2HPO40.05%,MgSO4·7H2O 0.01%,KH2PO40.05%,软化水配制,pH值7.0,113℃灭菌30 min。
发酵罐培养基:液糖(按葡萄糖计)3.0%,酵母膏0.2%,Na2HPO40.05%,MgSO4·7H2O 0.01%,KH2PO40.05%,软化水配制,pH值7.0,113℃灭菌30 min。
1.2 试验方法
1.2.1 培养条件。
母瓶培养:250mL锥形瓶装液量为50 mL,转速220 r/min,(30.0±0.5)℃;种子罐培养:5 L发酵罐装培养基为4 L,接种量1%,(30.0±0.5)℃,转速300 r/min,通气比1 min-1[1 min-1表示1 m3/(m3·min),即每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值,下同],罐压0.05 MPa,培养16 h,以10%的接种比接入发酵罐。
发酵罐培养:30 L发酵罐装培养基为17 L,接种比10%,28~30℃,转速200~400 r/min,通气0.2~1.0 min-1,控制溶氧5%以上,流加NaOH溶液控制pH值6.5~7.5。
1.2.2 发酵液菌体浓度测定
以发酵液OD520表示发酵液菌体浓度。若待测液浓度过高超出此范围,可适当稀释至0.15~1.20范围内再测[6]。
1.2.3 发酵液中残留萄葡糖测定。发酵液稀释100~200倍,1 0 000 r/min离心1 0 min,取上清液,用DNS法测定发酵液中残留葡萄糖的含量[7]。
1.2.4 粗胶含量测定
20 mL发酵液加3倍体积90%乙醇沉淀产物,收集沉淀,加2倍体积90%乙醇洗涤沉淀2次,再收集沉淀,于60℃烘干至恒重,称重(粗胶重),再按下式进行计算:
1.2.5 纯胶含量测定
取5.00 mL混合均匀发酵液于50 mL离心管中,加水至50 mL,将发酵液与水混合均匀并调节平衡,将离心管放入离心机中,以12 000 r/min离心30 min。离心结束后把离心上清液缓缓倒入150 mL 95%(v/v)酒精中,摇匀后静止30 min。再将沉淀出结冷胶的酒精溶液倒入垫有1层快速定性滤纸的布氏漏斗中,打开真空泵抽滤至近干,将滤纸上的胶小心取下(避免滤纸带入胶中)放入快速水分测定仪上已恒重并去皮的铝盘中。开启水分测定仪对沉淀物进行恒重(恒重条件为105℃,60 s内稳定)。读取水分测定仪上的固形物重量并按下式进行计算:
纯胶含量(%)=[结冷胶重量(g)/发酵液体积(mL)]×100
2 结果与分析
2.1 优化结冷胶发酵曲线
经配方和工艺优化,采用蔗糖作碳源、大豆粉作氮源,30 L发酵罐中装料17 L,转速300 r/min,29℃,发酵培养基接种量10%,结冷胶发酵菌体浓度(OD520)和粗胶含量变化曲线见图1。
由图1可知,经配方和工艺优化后,发酵罐中OD520值自10 h开始快速增长,30 h后OD520值增长减慢,并进入稳定期,最高值达到22.83,与此相应,发酵液粗胶含量自26 h开始快速增长,并在58 h达到最高值2.16 g/100 mL,远高于原配方工艺平均水平1.22 g/100 mL。
2.2 发酵罐(30 L)生产结冷胶试验
采用优化的发酵工艺在5 L→30 L发酵罐中二级发酵生产结冷胶,结果见表1。
由表1可知,结冷胶发酵种子罐OD520值对发酵罐最终胶含量有明显影响,当种子罐OD520值达到9.60时,发酵罐粗胶含量可达1.72 g/100 mL,并且发酵液纯胶含量与粗胶含量之比达到98.3%,而在粗胶含量1.51 g/100 m L发酵罐中,纯胶含量只有1.43 g/100 mL,发酵液纯胶含量与粗胶含量之比为94.7%,说明随着发酵液结冷胶含量的提高,原来经离心沉淀于粗胶中的部分物料转化为结冷胶,从而不仅提高了胶产量,也提高了纯胶含量与粗胶含量之比,更有利于结冷胶提取工序的生产。
3 结论与讨论
试验得到发酵罐优化后的碳氮源组成为蔗糖3%、黄豆粉0.5%;优化后培养条件为30 L发酵罐中装料17 L,转速300 r/min,通气比1 min-1,罐压0.05 MPa,温度(29.0±0.5)℃,发酵培养基接种量10%,流加10%Na OH自动控制发酵液pH值在6.5~7.5之间,发酵周期56~62 h;优化后发酵罐粗胶含量从1.22 g/100 mL提高到1.72 g/100 mL,平均提高了40.98%,最高达到2.16 g/100 mL。
结冷胶是目前国际上性能最为优越的生物胶之一,具有独特的理化性质和全面的功能,集增稠、悬浮以及乳化稳定等功能性质于一身,已广泛用于食品、饮料、化妆品、洗涤剂、陶瓷、石油开采、化工涂料等20多种行业。然而,由于目前对结冷胶生物合成机理缺乏完整的认识,加上发酵生产中产物浓度低、转化率低及提取费用昂贵等因素,严重限制了结冷胶的应用。
因此,建议从以下3个方面开展工作:一是对结冷胶生物合成进行分子水平上的研究,逐步揭示结冷胶生物合成途径中基因产物的作用机理,提高结冷胶的产率和糖转化率;二是通过基因工程和传统诱变筛选技术获得高产量菌种;三是通过发酵工艺和配方改进提高结冷胶产率、糖转化率,降低生产成本,从而使其在各个领域得到更广泛的应用。
参考文献
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[2]胡国华,马正智,吴彬.浅论我国国产结冷胶发展现状与前景[J].中国食品添加剂,2008(增刊1):58-60.
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我国结冷胶产业发展现状及展望 篇3
作为一种复杂的新型亲水性胶体,结冷胶进入中国市场的时间并不长,美国斯比·凯可(CP Kelco)公司在国内的推广价格高达450~500元/kg。由于该胶体生产和应用难度都非常大,使国内对结冷胶的推广受到一定限制,导致结冷胶目前在中国市场应用不是很广泛,现针对结冷胶在中国的发展现状及未来趋势进行探讨,以为结冷胶产业的发展提供依据。
1 结冷胶在中国的基本生产情况
结冷胶在中国发展起步并不晚,国内无锡轻工大学(现江南大学)从1995年起开始研究结冷胶发酵和生产技术,并于1997年完成中试鉴定,为国内结冷胶生产技术的源头,目前国内生产企业使用的发酵菌株和发酵工艺基本都源于江南大学。但是结冷胶的大规模工业化生产依然存在许多困难,主要表现在发酵产率低、发酵过程中通气搅拌能耗高、产物提取繁杂、产品澄清困难等,这直接导致其生产成本较高,损害了企业结冷胶生产的积极性。目前美国斯比·凯可公司及国内几个主要的结冷胶生产厂家如浙江中肯、浙江天伟与河北鑫合都面临着这些问题。
在提取阶段,发酵液中结冷胶的有效回收及纯化非常重要。由于发酵终点时粘度可高达6 000~8 000cp,如果想获得澄清型的产品,则必需将其他成份(包括菌体碎片、代谢副产物如PHB等)从产品中剔除,否则只能得到非澄清型产品。生产澄清型产品比较困难,因为胞外多糖包裹细胞以粘性聚合物形式形成网状结构,故难以将其与菌体有效分离,普通的稀释、离心、过滤均难以奏效,需通过特殊的工艺及设备才能实现。
目前国内生产企业的结冷胶提取工艺与美国斯比·凯可公司完全不同,凯可公司的低酰基清型结冷胶生产流程如图1所示[3,4],可见若按美国斯比·凯可的生产流程,在后提取阶段中,采用先脱酰并用有机溶剂絮凝沉淀的方法,会直接导致溶剂成本过高,在生产规模不大的情况下,这种提取方式生产出来的结冷胶产品很难具备市场竞争力。因此,目前国内部分生产厂家拥有自己独特的后提取方式,避免了溶剂成本过高的问题,并申请了相关专利,说明我国在比较复杂的微生物多糖提取方面具有较强的技术实力。
2 结冷胶在中国市场的现状
2005年之前,国内结冷胶市场基本都被美国斯比·凯可垄断,而2005年之后,随着国内厂家的技术进步和市场推广力度的增强,国产结冷胶生产在市场上的份额越来越大,到2009年美国产结冷胶在国内市场上的占有率已经压缩到很小的程度,同时国内生产的结冷胶也部分出口到东南亚国家以及美国。说明目前国内结冷胶生产技术已经达到较高的水平,生产的结冷胶初步具备了在国际市场上与美国斯比·凯可公司竞争的实力。
近年来,国内市场对结冷胶的需求量快速增长,国内结冷胶的需求总量2006年为80t,2007年为120t,2008年总量在180t左右,2009年的市场增长率依然迅猛,预计年需求总量在260t以上。
如在欧美市场上主要应用于甜点凝胶、饮料、软糖和乳制品。而亚洲市场有其自身的特点,比如日本主要用于多层果冻和吸吸果冻上,韩国主要用在面制品,东南亚主要用于悬浮饮料。在国内市场,目前结冷胶最主要的用途也是在悬浮饮料上,大约占总体用量的50%以上,同时在果冻和软糖上也有一定用量,而目前空气清新剂方面结冷胶的用量开始日益增长。
3 结冷胶在中国市场应用中存在的问题
3.1 结冷胶销售价格依然偏高
由于国内结冷胶的生产规模小,能耗成本高,目前的市场销售价格相对于其他亲水胶体依然比较高,达到250~260元/kg。因此,在市场推广方面遇到比较大的阻力。食品生产企业迫于成本压力,只能在小部分凝胶食品或添加量非常小的饮料上应用结冷胶的优良特性。因此,如何降低结冷胶市场价格,帮助食品企业用结冷胶替换其他亲水胶体是结冷胶生产厂家必须面对的问题。
3.2 国内厂家结冷胶规格型号比较少
目前,美国斯比·凯可公司拥有的结冷胶规格比较多,依照用途分类,主要有以下几种,具体见表1。而且美国斯比·凯可公司在KELCOGEL誖规格的基础上进一步根据应用于食品体系的不同,开发了多种型号,以方便客户的选择,具体型号见表2。
相比较而言,国内结冷胶生产厂家所能提供的结冷胶规格要单一的多,只能提供KELCOGEL誖F’即低酰基透明型号结冷胶,高酰基产品和复配产品基本不能生产。目前国内也有部分厂家投入大量资金研发结冷胶新型号并取得了一定突破,预计在不久之后能有新规格型号面世。
3.3 结冷胶使用比较复杂,基础及应用研究亦不够深入
结冷胶生产厂家经常要面对客户对结冷胶提出的不同问题,从多年市场推广经验看,多数国内消费者对结冷胶的使用方法很难把握。结冷胶是一种比较复杂的胶体,在应用过程中需考虑到外加离子的种类和浓度、螯合剂、食品体系的p H范围、添加糖类的品种和范围等[5,6],因此,只有在充分了解结冷胶性能的基础上才能正确使用结冷胶产品。而国内目前对结冷胶的基础研究及应用研究都做的很不够,目前只有浙江工商大学及上海师范大学对结冷胶的应用及复配做了一些基础研究工作并有文献报道,而很多结冷胶应用技术都掌握在少部分专业复配厂家的手中。复配厂家出于对自身利益的保护,不会在业内交流结冷胶应用心得和技巧,这种局面不利于结冷胶在中国市场的推广。因此,如何使大专院校和结冷胶生产厂家成为结冷胶技术研究和推广的主体,是目前国内结冷胶行业亟待解决的问题。
4 展望
作为一种发酵法生产的微生物多糖,相对于海藻胶或动物胶、植物胶,结冷胶品质更稳定,供应更有保证,同时可以提供从脆性到弹性的广泛质构。结冷胶具有出众的凝胶特性,在食品工业中必将得到更加广泛地应用。近年来,琼脂、卡拉胶、海藻酸钠等海藻胶质量和产量的大幅波动,给用户使用带来诸多不便。而由于结冷胶来源的天然性、性能的优越性、用途的广泛性、资源的稳定性,决定了结冷胶在食品工业中具有重大应用价值。
结冷胶的生产、销售及售后服务都对技术支持有极高的要求,因此如果新的胶体企业没有自己的核心技术而盲目上马该项目,势必会造成不必要的损失。目前国内几家结冷胶生产企业的产能已经超过了市场需求,所以当前国内企业面对的首要问题是如何进一步提升产品质量,在国际市场中提升其市场份额,释放过剩产能。
随着国内结冷胶产业的起步,国外竞争对手势必采用新的手段与国内厂家竞争,这一点必须引起国内企业的重视。面对国外的技术封锁和产品压力,只有国内更多的同行团结起来,共同解决结冷胶生产和应用中的问题,拓展产品应用领域,开发国际市场,才能更好地促进我国结冷胶行业的健康发展。
参考文献
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